專利名稱：：千金藤堿及其鹽酸鹽在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及千金藤堿及其鹽酸鹽的用途，尤其涉及千金藤堿及其鹽酸鹽在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。
背景技術(shù)：
：乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一種世界性疾病。發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界無癥狀攜帶者(HBsAg攜帶者)超過2.8億，我國(guó)占1億以上。對(duì)慢性HBV感染，病毒復(fù)制指標(biāo)持續(xù)陽性者，抗病毒治療是一項(xiàng)重要措施。目前抗病毒藥物，效果都不十分滿意。應(yīng)用后可暫時(shí)抑制HBV復(fù)制，停藥后這種抑制作用消失，使原被抑制的指標(biāo)又回復(fù)到原水平。有些藥物作用較慢，需較長(zhǎng)時(shí)間才能看到效果。千金藤堿(C印haranthine)是從防己科千金藤屬植物的塊根中提取分離出的一種生物堿，其加鹽酸成鹽可得一種雙芐基異喹啉類單體化合物，即鹽酸千金藤堿(C印haranthineHydrochlori，CH)，其分子式為C37H38N2062HC1，結(jié)構(gòu)式如下已知千金藤堿/鹽酸千金藤堿除了有升高由于化療導(dǎo)致的白細(xì)胞減少外，還具有抗腫瘤作用，逆轉(zhuǎn)化療引起的多藥耐藥，而且在抗炎鎮(zhèn)痛，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等方面也具有很好的治療效果；據(jù)報(bào)道千金藤堿還可抑制SARS-CoV病毒引起的細(xì)胞病變作用，抑制HIV-I復(fù)制，抑制HSV-1對(duì)Vero細(xì)胞的致病變作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供千金藤堿及其鹽酸鹽的一種新用途，即在制備藥物中的應(yīng)用。實(shí)際上，本發(fā)明是以千金藤堿或鹽酸千金藤堿為有效成分制備成抗乙肝病毒藥物，可采用常規(guī)的制備工藝，制備成不同的藥物劑型供患者使用，如制成口服劑型、膠囊、粉劑、針劑等劑型。千金藤堿或鹽酸千金藤堿對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，根據(jù)細(xì)胞存活率，計(jì)算藥物CH對(duì)細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC5。)為2.09WmL—、熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CH能抑制細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA合成(P<0.01)，并呈劑量依賴性，劑量大于0.5PgmL—1時(shí)能對(duì)細(xì)胞上清液中HBVDNA的抑制率超過50%。計(jì)算CH的半數(shù)抑制率IC5。為0.324WmL—、治療指數(shù)TI=TC5。/IC5。=6.45,2.0<TI<10.0。因此可以認(rèn)為CH有較強(qiáng)的抑制HBVDNA合成作用，為有效低毒類藥物。1.千金藤堿和鹽酸千金藤堿制備方法將地不容塊根粉用稀酸浸泡提取,提得的酸水液用堿溶液調(diào)節(jié)呈堿性，濾集析出的粗生物堿，再經(jīng)苯加成精制后過氧化鋁柱，減壓蒸干溶劑得千金藤堿，千金藤堿溶解后與濃鹽酸反應(yīng)即得鹽酸千金藤堿粗品，將析出的鹽酸千金藤堿粗品重結(jié)晶精制，真空干燥即得鹽酸千金藤堿金藤堿原料藥(參見l.黃加鑫，陳嫵.地不容中生物堿的分離與鑒定，藥學(xué)學(xué)報(bào),1979，14(10):612616;2.陳正慶,楊素聆，丁緒亮.地不容的非酚性生物堿，南京醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1985，5(3):203208;3.TheMerckIndex(13版),No.l997.)。2.鹽酸千金藤堿注射劑制備方法-取按重量份計(jì)注射用原料藥1份，用200份的5(TC的水混勻使溶解，過濾，灌封，滅菌，檢漏，即得鹽酸千金藤堿注射劑(規(guī)格10mg/2mL)。3.鹽酸千金藤堿凍干粉針劑的制備取按重量份計(jì)鹽酸干金藤堿110份，用10004000份的5060。C的水混勻使鹽酸千金藤堿溶解，再加入凍干賦形劑(如甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖或乳糖等)10400份混合均勻后，過濾除菌，測(cè)鹽酸千金藤堿含量后凍干，即制得鹽酸千金藤堿凍干粉針劑。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面以鹽酸千金藤堿的藥理試驗(yàn)及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。l.主要試驗(yàn)材料①H印G2.2.15細(xì)胞株由廣州暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地提供，本研究室自行傳代培養(yǎng)供實(shí)驗(yàn)使用。實(shí)驗(yàn)藥物鹽酸千金藤堿由河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化室制備(制備方法如上所述)。②主要試劑拉米夫定(3TC，賀普丁片)，葛蘭素-史克制藥(蘇州)有限公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，Hyclone?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司；FBS，Hyclone?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司；胰蛋白酶，美國(guó)Amersco公司；MTT,美國(guó)Sigma公司；G418，美國(guó)irwitrogen公司；HBV核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒，深圳匹基生物工程股份有限公司；乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒，上海科華生物技術(shù)有限公司；乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒，上海科華生物技術(shù)有限公司。③主要儀器及器皿生物安全柜Hfsafe-1200TEClassIITypeB2，香港力康發(fā)展有限公司；水套式二氧化碳培養(yǎng)箱HF160W，香港力康發(fā)展有限公司；酶標(biāo)儀168-1000XC，美國(guó)BIORAD;熒光PCR檢測(cè)儀，美國(guó)RocheLightCyclerl.5;全自動(dòng)滅菌器HVE-50，日本HIRAYAMA;96孔培養(yǎng)板，24孔培養(yǎng)板，50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國(guó)corning公司。2.鹽酸千金藤堿(CH)對(duì)細(xì)胞的毒性試驗(yàn)根據(jù)Mosmann建立的MTT比色法檢測(cè)藥物對(duì)H印G2.2.15細(xì)胞的毒性。細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，加入0.25%胰蛋白酶，消化后加入培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，濃度為1X105個(gè)/mL后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔100ul，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，置C02培養(yǎng)箱(37°C,5.0%C02)中培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞長(zhǎng)成單層后加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基，并設(shè)不含藥物的正常細(xì)胞為對(duì)照組。連續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，每孔加入MTT10ul，于C02培養(yǎng)箱(37°C，5.0%C02)中繼續(xù)培養(yǎng)。4小時(shí)后，棄去上清液，每孔加入DMS0200ul，用微量振蕩器充分震蕩，使結(jié)晶紫充分溶解。用酶標(biāo)儀(檢測(cè)波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)630nm)讀取各孔0D值，記錄結(jié)果。計(jì)算CH對(duì)H印G2.2.15細(xì)胞的抑制百分率抑制百分率二空白對(duì)照孔0灘—給藥孔0灘空白對(duì)照孔OZ)值由表可以看出鹽酸千金藤堿給藥組對(duì)細(xì)胞有一定的毒性。根據(jù)細(xì)胞存活率，計(jì)算藥物CH對(duì)細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC5。)為2.09Hg，mL一1。表lCH對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用(^±s，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注A:CH5.0嗎.mL";B:CH2.5ng.mI/1;C:CHl.25ng.mI/1;D:CH0.63^mL";3.藥物對(duì)HBV抑制實(shí)驗(yàn)選擇小于CHTCs。的一系列濃度l^g.mL—1,0.5Pg.ml/1，0.25PgmL1，0.125PgmL—i作為試驗(yàn)濃度，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中HBVDNA以及表面抗原和e抗原的影響。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2.2.15細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按照2Xl()4個(gè).mL—工的濃度接種于24孔板，每孔lmL，每個(gè)濃度3個(gè)孔。ld后待細(xì)胞貼于孔底，吸去舊的培養(yǎng)基，加入含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基，并設(shè)加完全培養(yǎng)基的細(xì)胞為正常對(duì)照，之后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況可適當(dāng)更換培養(yǎng)基。收集第三天、第六天、第九天的細(xì)胞上清液，于-2(TC保存。用ELISA方法測(cè)定第三天、第六天、第九天的e抗原和表面抗原，用熒光定量PCR方法測(cè)定第九天的HBVDNA拷貝值。①CH對(duì)H印G2.2.15細(xì)胞上清液中HBeAg和HBsAg的影響a)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:從冷藏環(huán)境中取出試劑盒，在室溫下平衡30分鐘，同時(shí)將濃縮洗滌液稀釋20倍。b)加待測(cè)標(biāo)本加入待測(cè)標(biāo)本每孔0.05mL，并設(shè)HBeAg和HbsAg陽性對(duì)照及陰性對(duì)照各2孔，空白對(duì)照1孔。c)加酶結(jié)合物每孔0.05mL，空白對(duì)照孔不加，充分混勻，置恒溫箱中37。C孵育30min。d)洗板棄去反應(yīng)板各孔內(nèi)液體，拍干；用洗滌液注滿每孔，靜置5-10s，棄去孔內(nèi)洗滌液，拍干，如此反復(fù)五次，拍干。e)加顯色劑先加顯色劑A，每孔0.05mL，再加顯色劑B，每孔0.05mL;充分混勻，放置37'C避光孵育15min。f)終止反應(yīng)每孔加入終止液0.05mL，混勻。g)測(cè)定用酶標(biāo)儀讀數(shù)，選擇雙波長(zhǎng)450/630mn，讀取各孔OD值。h)結(jié)果判定首先按照COV邱月性對(duì)照平均OD值X2.l計(jì)算Cutoff值，如果標(biāo)本0D值》C0V為陽性，標(biāo)本0D值《C0V為陰性。通過ELISA試劑盒測(cè)定CH對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌表面抗原和e抗原的影響，發(fā)現(xiàn)CH四個(gè)劑量組都對(duì)表面抗原和e抗原都有一定的抑制作用，并且有濃度和時(shí)間依賴性(見表2、表3)。CH作用的第九天，lpgTnL"劑量組對(duì)表面抗原的抑制將近一半，對(duì)e抗原的抑制作用也達(dá)到了40%。表2CH在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)HBsAg的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3CH在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)HBeAg的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>②用熒光定量PCR法測(cè)CH對(duì)H印G2.2.15細(xì)胞中HBVDNA拷貝數(shù)的影響HBV"DNA檢測(cè)有助于判斷HBV感染者病毒復(fù)制程度及傳染性大小，較靈敏評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效。a)樣本處理取100ul各藥物處理組的細(xì)胞上清液，分別加入0.5mL離心管中；向各管中加入100ulDNA提取液I，振蕩混勻，13000rpm離心10min;吸棄液體；再加入25ulDNA提取液II，振蕩混勻至沉淀完全溶解，2000rpm離心10sec，沸水浴10min;13000rpm離心10min，保留上清液備用。b)擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備從試劑盒中取出HBVPCR反應(yīng)液、Taq酶，室溫融化并混合均勻后，2000rpm離心10sec。設(shè)所需要的Roche毛細(xì)管管數(shù)為n(n-樣本數(shù)+2管陰性對(duì)照+1管強(qiáng)陽性對(duì)照+1管臨界陽性對(duì)照+4管陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品)可每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配置如下表4:表4反應(yīng)體系配置試劑HBVPCR反應(yīng)液Taq酶用量17.8ul0.2ul計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積離心管中，充分混勻均勻，2000rpm離心10sec，向設(shè)定的Roche毛細(xì)管中分別加入18ul。c)加樣樣本和陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品使用前室溫解凍，震蕩混勻。在所設(shè)定的n個(gè)Roche毛細(xì)管中分別加入5.1步驟中處理過的樣本，陰性對(duì)照，強(qiáng)陽性對(duì)照和臨界陽性對(duì)照上清液以及陽性工作標(biāo)準(zhǔn)液(5.0X104copies/mL，5.OX105copies/mL,5.0X106copies/mL，5.0X107copies/mL)2ul，蓋緊管蓋，連同Roche專用金屬反應(yīng)管套放在離心機(jī)中，于2000rpm離心10sec。將毛細(xì)管排好放入熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)。d)PCR擴(kuò)增循環(huán)條件設(shè)置見表5，選擇儀器F1通道進(jìn)行檢測(cè)。表5PCR擴(kuò)增循環(huán)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>e)結(jié)果判斷按照試劑盒說明書設(shè)定結(jié)果分析條件。若樣本拷貝值在5.0X102copies/mL5.0X107copies/mL，測(cè)定結(jié)果有效，可直接使用相應(yīng)的拷貝數(shù)，若樣本拷貝數(shù)超過這個(gè)范圍，需要稀釋，測(cè)定結(jié)果以稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正。f)計(jì)算ICs。按照下式計(jì)算化合物對(duì)HBVDNA的半數(shù)抑制率IC5。抑制百分率二-對(duì)照孔膠層拷貝數(shù)-Xl(K)%g)計(jì)算治療指數(shù)(TI):計(jì)算TI=TC5。/IC5Q。TK1.0表明受試樣品無效，L0《TI《2.0為低效有毒即弱陽性，2.0<TI<10.0為有效低毒即陽性，TI>IO.O為高效低毒即強(qiáng)陽性。熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)(參見表6和圖1)，CH能抑制細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA合成(P<0.01)，并呈劑量依賴性。劑量大于0.5PgmL—1時(shí)能對(duì)細(xì)胞上清液中HBVDNA的抑制率超過50%。計(jì)算CH的ICs。為0.32扭gml/1,所以治療指數(shù)TI=TC5。/IC5。=6.45,2.0<TI<10.0。認(rèn)為CH在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中有較強(qiáng)的抑制HBVDNA合成作用，為有效低毒類藥物。表6CH給藥后第九天對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBVDNA拷貝數(shù)的影響(;±sX105,n=3)分組劑量HBVDNA拷貝值(X105copies)抑制率(％)正常對(duì)照037.68±5.3103TClOpg.mr17.68±0.94*79.62CHI8.94±0.98*76.27CHIlHg'ml陽i11.43±3.25*69.67CH20.5(ig.mr116.24±4.25*56.90CH30.25wml隱120.65±3.39*45.21與正常對(duì)照組細(xì)胞HBVDNA拷貝數(shù)比較，*P<0.01從以上結(jié)果可以得出本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于-1.本發(fā)明對(duì)已知鹽酸千金藤堿/千金藤堿(素)挖掘了新的醫(yī)藥用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。2.本發(fā)明的鹽酸千金藤堿/千金藤堿(素)安全低毒，穩(wěn)定性好，藥理作用強(qiáng)，預(yù)示著很好的藥用前景。3.本發(fā)明的產(chǎn)品原料來源豐富、廉價(jià)、毒副作用小，制備工藝簡(jiǎn)單，并可做成口服劑型、注射劑型、片劑等，使用方便。4.本發(fā)明采用國(guó)內(nèi)外通用的H印G2.2.15細(xì)胞株在體外來檢測(cè)鹽酸千金藤堿/千金藤堿(素)抗乙肝病毒作用，通過一系列實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，鹽酸千金藤堿具有明顯的抗乙肝病毒效果。圖1CH給藥后第九天對(duì)H印G2.2.15細(xì)胞上清液中HBVDNA拷貝數(shù)的影響(3TC:,g'mL—1，CH1:2PgmL—1,CH2:lPgml/1，CH3:0.5PgmL—1，CH4:0.25WmL-1)具體實(shí)施例方式實(shí)施例1鹽酸千金藤堿注射劑制備方法量取注射用水1500mL，加熱至約50°C，加入10.0g的注射用原料藥，溶解。加入O.1%的針用活性炭，攪勻，保溫15分鐘，過濾。用適量注射用水洗滌后，加至2000mL，G4垂熔玻璃漏斗精濾，灌封，滅菌，檢漏，即得鹽酸千金藤堿注射劑。(規(guī)格10mg/2mL)。實(shí)施例2千金藤堿供試液制備方法將千金藤堿用適量0.lmol/L鹽酸溶解，用蒸餾水配制成5mg/mL,用1.Omol/LNaOH調(diào)節(jié)PH至3.54.0并稀釋至所需濃度。實(shí)施例3鹽酸千金藤堿凍干粉針劑制備取注射用鹽酸千金藤堿(素)原料1.1克(純度99%)，加入注射用水(50°C)1000mL，攪拌溶解，再加甘露醇10克，攪拌使溶解，0.22gm的微孔濾膜過濾除菌，測(cè)鹽酸千金藤堿(素)含量達(dá)到標(biāo)示量的99%以上即分裝，2mL/瓶。進(jìn)行冷凍干燥，凍干條件為凍干溫度-20-35°C，真空度50200Pa，時(shí)間24小時(shí)。然后出箱，封口，檢漏，貼標(biāo)簽。實(shí)施例4鹽酸千金藤堿片劑制備鹽酸千金藤堿500mg,乳糖3.0g，淀粉1.28g，羥基丙酰纖維素200mg和硬脂酸鎂20mg，混合，制粒，壓片(規(guī)格每片100mg)。實(shí)施例5鹽酸千金藤堿膠囊制備鹽酸千金藤堿500mg，乳糖2.5mg，淀粉1.75mg，結(jié)晶纖維素240mg和硬脂酸鈣10mg，混合，充填于囊形成膠囊(規(guī)格每粒10mg)。權(quán)利要求1.千金藤堿及其鹽酸鹽在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽酸千金藤堿在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于，制備藥物的劑型是口服液、膠囊、散劑、片劑、針劑中的任意一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽酸千金藤堿在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于，鹽酸千金藤堿用于制備抗乙肝病毒的凍干粉針劑。全文摘要本發(fā)明涉及千金藤堿及其鹽酸鹽在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。即以千金藤堿或鹽酸千金藤堿為有效成分制備成抗乙肝病毒藥物。本發(fā)明研究表明，CH對(duì)細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC₅₀)為2.09μg·ml^-1；CH能抑制細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA合成(P＜0.01)，并呈劑量依賴性，劑量大于0.5μg·mL^-1時(shí)能對(duì)細(xì)胞上清液中HBVDNA的抑制率超過50％，CH的IC₅₀為0.324μg·mL^-1，治療指數(shù)TI＝6.45，2.0＜TI＜10.0，CH有較強(qiáng)的抑制HBVDNA合成作用，為有效低毒類藥物。本發(fā)明開拓了千金藤堿及其鹽酸鹽新的醫(yī)藥用途，其制備原料來源豐富、廉價(jià)、毒副作用小，制備工藝簡(jiǎn)單，并可做成口服劑型、注射劑型、片劑等，使用方便。文檔編號(hào)A61P1/00GK101507725SQ20081023732公開日2009年8月19日申請(qǐng)日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者劉晨江,張潁君,楊崇仁,江金花,王一飛,王東陽,王慶端,趙志鴻,鄭立運(yùn),錢垂文申請(qǐng)人:河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院