一種聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本領(lǐng)域?qū)儆诨蜣D(zhuǎn)染試劑領(lǐng)域，涉及一種聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]基因轉(zhuǎn)染是將具有生物功能的核酸分子轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)的作用位點，并使核酸在細胞內(nèi)維持其生物功能。由于自由的核酸分子在組織或細胞中易被核酶降解，組織靶向性差，且核酸分子自身帶有負電荷，細胞滲透能力差。開發(fā)具有選擇性、安全性和高效性的基因轉(zhuǎn)染試劑是核酸分子應(yīng)用的關(guān)鍵。目前，研究和臨床應(yīng)用中常用的載體大致分為病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體因其高效而倍受關(guān)注，但其負載量低、特異性不強、安全性差和無法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等缺點，給實際應(yīng)用帶來很大障礙。
[0003]非病毒載體主要包括陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體。陽離子聚合物和陽離子脂質(zhì)體基因載體相對于病毒載體具有一定優(yōu)勢，然而其負載核酸后表面仍然帶有正電荷，血清穩(wěn)定性差、細胞毒性大、轉(zhuǎn)染效率低，并且其在轉(zhuǎn)染過程中需要更換培養(yǎng)基，操作也比較復(fù)雜ο
[0004]如常用的商售陽離子脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000 (Invitrogen)和聚醚酰亞胺(PEI)具有良好的基因復(fù)合能力和內(nèi)涵體逃逸能力，但是其細胞毒性大(存活率〈50% )，在血清中穩(wěn)定性不好，因此轉(zhuǎn)染效率也較低，并且在轉(zhuǎn)染過程中需要更換培養(yǎng)基，操作也比較復(fù)雜。
[0005]CN 103194489 A公開了一種新型陽離子脂質(zhì)體核酸類藥物制劑，及其制備方法和應(yīng)用，所述陽離子脂質(zhì)體包含陽離子脂質(zhì)、輔助脂和聚羧基甜菜堿中性脂質(zhì)和冷凍保護劑。所述陽離子脂質(zhì)體核酸類藥物制劑包含用聚羧基甜菜堿中性脂質(zhì)修飾的陽離子脂質(zhì)體和核酸類藥物制劑工作液。在該專利中，所述聚羧基甜菜堿成分為聚羧基甜菜堿中性脂質(zhì)修飾的陽離子脂質(zhì)體，其必須含有陽離子脂質(zhì)、輔助脂等成分才能發(fā)揮作用，成分比較復(fù)雜，制備方法復(fù)雜。
[0006]因此，本領(lǐng)域中需要生物毒性小，在血清中穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染效率更高并且操作簡單的基因轉(zhuǎn)染試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑及其制備方法和用途。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)染制劑具有優(yōu)異抗非特異性蛋白吸附性能和高基因轉(zhuǎn)染效率，并具有pH響應(yīng)性，具有顯著的血液穩(wěn)定性，顯著提高了核酸的基因轉(zhuǎn)染效率。
[0008]為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]第一方面，本發(fā)明提供一種基于聚羧基甜菜堿分子的基因轉(zhuǎn)染試劑，所述基因轉(zhuǎn)染試劑包含聚羧基甜菜堿聚合物、復(fù)合緩沖液和基因轉(zhuǎn)染工作液。
[0010]聚羧基甜菜堿聚合物的每個單體單元側(cè)鏈都有一個陰離子基團(羧酸根基團)和一個陽離子基團(季胺基團)并且總體表現(xiàn)中性。在酸性條件下，聚羧基甜菜堿分子的陰離子基團(羧酸根基團)可以質(zhì)子化，使聚羧基甜菜堿帶有正電荷，可以利用靜電相互作用與負電荷的核酸作用，高效負載核酸分子形成復(fù)合物。當復(fù)合物恢復(fù)生理條件下，聚羧基甜菜堿分子去質(zhì)子化使復(fù)合物表面接近中性，同時可利用陽離子和陰離子基團與水分子的靜電相互作用吸附大量水分子，在復(fù)合物表面形成水合層，有效抵抗非特異性蛋白質(zhì)，具有顯著的血液穩(wěn)定性，從而顯著提高核酸的基因轉(zhuǎn)染效率。
[0011]優(yōu)選地，所述聚羧基甜菜堿聚合物為R_PCBn，所述R為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1，2-油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1，2-十八?；?sn_甘油(DG)、膽固醇、α -十六烷基丙三醇醚(HGn)、2-溴異丁酸乙酯(EBiB)、1-溴乙基苯(l_PEBr)、2_溴-2-甲二硫代苯甲酸枯酯(CBD)、三硫代碳酸酯(TTC)或二硫代苯甲酸氰基異丙酯(CPDB)中的任意一種，優(yōu)選為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、2-溴異丁酸乙酯(EBiB)或2-溴-2-甲二硫代苯甲酸枯酯(CBD)中的任意一種，進一步優(yōu)選為2-溴-2-甲二硫代苯甲酸枯酯(CBD);
[0012]優(yōu)選地，所述聚羧基甜菜堿聚合物的聚合度η為1?500的任意整數(shù)，例如，聚合度 η 可以為 2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、38、40、44、48、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、480 或 490，優(yōu)選為 1 ?100 的任意整數(shù)，進一步優(yōu)選為5?50的任意整數(shù)，更優(yōu)選為10?30的任意整數(shù)。
[0013]優(yōu)選地，所述復(fù)合緩沖液為pH值小于7.4的緩沖液，例如pH值為7.2,7.0,6.8、6.5、6.2、6.0、5.8、5.6、5.5、5.2、5.0、4.8、4.5、4.3、4.0、3.7、3.5、3.2、3.0、2.8、2.6、2.4 或2.0的緩沖液，優(yōu)選為pH值為2?7的緩沖液，進一步優(yōu)選為pH值為2?6的緩沖液，更優(yōu)選為pH值為3?5的緩沖液。
[0014]優(yōu)選地，所述復(fù)合緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩沖液、鄰苯二甲酸-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液或硼酸-硼砂緩沖液中的任意一種，優(yōu)選為甘氨酸-鹽酸緩沖液、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或Tris-鹽酸緩沖液中的任意一種，進一步優(yōu)選為乙酸-乙酸鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或Tris-鹽酸緩沖液中的任意一種，更優(yōu)選為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。
[0015]優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)染工作液為超純水、磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水中的任意一種或至少兩種的組合，進一步優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液(PBS)和/或生理鹽水，更優(yōu)選為生理鹽水。
[0016]優(yōu)選地，所述聚羧基甜菜堿聚合物:復(fù)合緩沖液=lmg: (0.1?100)mL，例如所述聚羧基甜菜堿聚合物:復(fù)合緩沖液可以為lmg:0.lmL、lmg:0.3mL、lmg:0.5mL、lmg:0.8mL、lmg:lmL、lmg:1.5mL、lmg:2mL、lmg:3mL、lmg:4mL、lmg:5mL、lmg: 10mL、lmg:20mL、lmg:30mL、lmg:40mL、lmg:50mL、lmg:60mL、lmg:70mL、lmg:80mL、lmg:90mL 或 lmg:100mL，優(yōu)選為 lmg: (0.5 ?50) mL，更優(yōu)選為 lmg: (0.5 ?5)mL。
[0017]優(yōu)選地，所述復(fù)合緩沖液:基因轉(zhuǎn)染工作液=lmL: (0.1?100)mL，例如所述復(fù)合緩沖液:基因轉(zhuǎn)染工作液可以為 lmL:0.lmLUmL:0.3mL、lmL:0.5mL、lmL:0.8mL、lmL:lmL、lmL:1.5mL、lmL:2mL、lmL:3mL、lmL:4mL、lmL:5mL、lmL:8mL、lmL: 10mL、lmL:20mL、lmL:30mL、lmL:40mL、lmL:50mL、lmL:60mL、lmL:70mL、lmL:80mL、lmL:90mL 或 lmL:100mL，進一步優(yōu)選為lmL: (0.1?50) mL，更優(yōu)選為lmL: (2?10) mL。
[0018]第二方面，本發(fā)明提供一種聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑，所述基因轉(zhuǎn)染制劑包含第一方面所述的基因轉(zhuǎn)染試劑和待轉(zhuǎn)染的核酸；
[0019]優(yōu)選地，所述基因轉(zhuǎn)染制劑中聚羧基甜菜堿聚合物與待轉(zhuǎn)染的核酸的N/P比為(0.1 ?100):1，例如 0.1:1、0.2:1、0.5:1、0.8:1、1:1、2:1、5:1、8:1、10:1、13:1、15:1、18:1、20:1、25:1、28:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 或 100:1，優(yōu)選為(0.2 ?30):1，更優(yōu)選為(0.5 ?20):lo
[0020]第三方面，本發(fā)明提供了如第二方面所述的聚羧基甜菜堿基因轉(zhuǎn)染制劑的制備方法，所述方法包括以下步驟:
[0021](1)將聚羧基甜菜堿聚合物與復(fù)合緩沖液混溶得到共混溶液；
[0022](2)將步驟⑴得到的共混溶液與有待轉(zhuǎn)染的核酸分子復(fù)合形成復(fù)合液；
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