專利名稱：：三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種種質(zhì)鑒定方法，特別是一種三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定方法。
背景技術(shù)：
：三疣梭子蟹CP的'似^rw/a加)，俗稱海蟹或大蟹，屬于甲殼綱，十足目，梭子蟹科。它廣泛分布在中國南北沿海，是中國大型海洋經(jīng)濟(jì)蟹類，是沿海重要的漁業(yè)資源。生活在中國近海不同海區(qū)的三疣梭子蟹由于生活環(huán)境的不盡相同，水文因素的差異以及各海區(qū)地理位置的不同造成三疣梭子蟹分屬于各個(gè)不同的種群。對產(chǎn)于中國四大海區(qū)的大連、東營、連云港、舟山、湛江五個(gè)典型群體進(jìn)行有效的鑒定或鑒別，對于三疣梭子蟹的增養(yǎng)殖親本選擇和資源保護(hù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前常用來進(jìn)行評價(jià)生物遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定的分子標(biāo)記均具有一定程度的缺陷，如RAPD技術(shù)(隨機(jī)擴(kuò)增序列多態(tài)性DNA，RandomamplifiedpolymorphicDNA)，常因RAPD引物過短10個(gè)堿基、退火溫度過低一般36-37°C，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的一些非特異結(jié)果，其可靠程度和真實(shí)性是主要的缺陷；而AFLP技術(shù)(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，Amplifiedfragmentlengthpolymorphism),又因操作條件復(fù)雜如要求酶切、成本相對較高而限制了其廣泛的應(yīng)用，微衛(wèi)星技術(shù)因分子標(biāo)記難以篩選，要求技術(shù)和設(shè)備高尖而限制其廣泛的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速、經(jīng)濟(jì)、相對準(zhǔn)確和操作簡便的三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定方法；用于對我國主要海區(qū)(大連、東營、連云港、舟山、湛江五個(gè)典型海區(qū))的三疣梭子蟹種質(zhì)鑒定。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定方法，其特點(diǎn)是，其步驟如下，(1)取至少30個(gè)待測樣品梭子蟹進(jìn)行7個(gè)形態(tài)學(xué)參數(shù)的測定，分別測定其背甲長CL、背甲寬CW、內(nèi)背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節(jié)長ML、第5步足趾節(jié)寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個(gè)參數(shù)；然后以背甲長CL參數(shù)值作分母、其余6個(gè)參數(shù)值作分子，獲得6個(gè)比例參數(shù)值X1:CW/CL;X2:ICW/CL;X9:AW/CL;X14:亂/CL;X17:5PW/CL;X19:OCS/CL;(2)將X,、X2、X9、X14、Xn和Xw6個(gè)比例參數(shù)值分別代入下列方程中進(jìn)行結(jié)果判定-YzsH).07010X廣0.52105X2隱1.14342X9+1.30263Xw-0.22921Xn-1.13982X19-2.62019Yd尸1.70164X廣1.49333X2-1.89597X9+0.65353Xw-0.32891Xn-1.31352Xw-3.66955Y,yg4.03275X廣2.37031X2+0.71223X9+0.72934X,4-0.59053Xn+4.01213Xw-5.20638Yd廣0.94429X廠1.55943X2+0.11175X9隱0.74477Xw+1.87868Xn+0.49741X19-2.92971Yzj二隱2.85322Xi+4.81737X2+1.39575X9-1.43024X!4隱0.82160Xn-2.15829Xw-6.13701(3)根據(jù)所得Y值的最大值出現(xiàn)頻率最多的群體即為待測樣品梭子蟹所處的來源。以下對發(fā)明人所作的研究試驗(yàn)進(jìn)行闡述。一、樣本采集。采集的試驗(yàn)材料均取自天然海區(qū)，分別是大連海區(qū)(dl)、東營海區(qū)(dy)、連云港海區(qū)(lyg)、舟山海區(qū)(zs)和湛江海區(qū)(zj)這5個(gè)海區(qū)的雌性三疣梭子蟹，各種群取樣時(shí)間、地點(diǎn)和數(shù)目見表l，所得到的樣本快速低溫運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并在第一時(shí)間對其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的測量。表1三疣梭子蟹樣本生物學(xué)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>采用游標(biāo)卡尺、分規(guī)、直尺等測量工具，精確到0.2mm,選取三疣梭子蟹背甲、前額裂片、腹甲、步足和螯肢部位，測量參數(shù)為23個(gè)可量性狀，共測得3496個(gè)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，測量部位見附圖。測量形態(tài)性狀標(biāo)識如下1.CW(Carapacewidth):背甲寬；2.ICW(Internalcarapacewidth):內(nèi)背甲寬；3.8CW(Carapacewidthatspine8):第8對棘的背甲寬；4.CL(Carapacelength):背甲長；5.PWC(Posteriorwidthofcarapace):背甲底寬；6.FW(Frontalwidth):前額寬；7.FMSH(Frontalmedianspineheight):前額中間棘的高；8.DFLS(Distancebetweenfrontallateralspines):前額側(cè)棘之間的距離；9.DFMS(Distancebetweenfrontalmedianspines):前額中間束束之間的距離；10.SW(Stemumwidth):腹甲寬；11.AW(Abdomenwidth):腹部寬；12.3PML(3rdperiopodmeruslength):第3步足長節(jié)長；13.5PL(5thperiopoddactyllength):第5步足趾節(jié)長；14.5PW(5thperiopoddactylwidth):第5步足趾節(jié)寬；15.DL(Dactyllength):螯肢指節(jié)長；16.PD(Propodusdepth):螯肢掌節(jié)厚；17.0PS(Outerpropodussprine):螯肢掌節(jié)上外面的棘；18.IPS(Innerpropodussprine):螯肢掌節(jié)上里面的棘；l義ICS(Innercarpussprine):螯肢腕骨上里面的棘；20,OCS(Outercarpussprine):螯肢腕骨上外面的棘；21.PL(Propoduslength):螯肢掌節(jié)長；22.PW(Propoduswidth):螯肢掌節(jié)寬；23.ML(Meruslength):螯肢長節(jié)長。三、數(shù)據(jù)處理。為消除蟹體規(guī)格大小對參數(shù)值的影響，先將每只蟹的所有參數(shù)分別除以背甲長(CL)予以校正，得出22個(gè)形態(tài)學(xué)比例性狀，使用STASTISTICA99，editkm軟件中的判別分析方法對5個(gè)三疣梭子蟹群體進(jìn)行逐步判別分析，建立判別方程。對所有樣本進(jìn)行逐個(gè)判別。判別準(zhǔn)確率的計(jì)算公式為判別準(zhǔn)確率P,(%)=判別正確的數(shù)目/實(shí)測數(shù)目乂100判別準(zhǔn)確率P2(%)=判別正確的數(shù)目/判別數(shù)目乂100綜合判別率/,一其中，Ai為第i個(gè)種群判別正確的梭子蟹數(shù)目，Bi為第i個(gè)種群實(shí)際判別的梭子蟹數(shù)目，k為種群數(shù)。判別方程如下Yz產(chǎn)0.33514Xi+2.27668X2+0.29775X3+0.7074X4......-0.3334X22-4.13686Yd產(chǎn)2.36822X廣2.34319XrH).27807X3-0.53283X4......-0.41483X22-5.04868Y,yg^0.12102X廣0.72597X2+0.3214Xr0.99157X4......+1.71947X22-7.29^9Yd廣1.01375X廣1.96828X2+0.91468X3+1.4451X4……-0.12343X22-4.70165Yzj二2.76002Xi+5.75857X2-1.53328Xr0,73471X4......-0.83617X22-7.%712將23個(gè)參數(shù)的校正值分別代入上述判別函數(shù)中，比較函數(shù)值的大小，被判個(gè)體值最大的即歸屬于所對應(yīng)的群體。公式中XiX22分別代表CW/CL、ICW/CL、8CW/CLIPS/CL，各函數(shù)的自變量和常數(shù)項(xiàng)見表2，應(yīng)用公式所作的判別分析結(jié)果見表3。判別準(zhǔn)確率Pi為90%100%，判別準(zhǔn)確率P2為87.1%100%，5個(gè)地理種群的綜合判別率為94.74%。表25個(gè)地理種群三疣梭子蟹形態(tài)判別公式各項(xiàng)系數(shù)及常數(shù)項(xiàng)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Xi4ML/CL0.472041.282042.14098-1.03185-2.07459xlsFVV/CL0.11762-1.01562-1.094871.130380.429275PL/CL-0.3237-0.297720.324230.30925-0.11098xl75PW/CL-0.245950.20411-0.659691.70778-0.91718x"3PL/CL0.55847陽0.43娜-0.733260.48437-0.00978OCS/CL-1.08363-0.857224.47227-0.23359-2.21012ICS/CX-0.05961-0.37961-0.346851.00294-0.33903OPS/CL-0,82939-0.946730.49S74-0.263971.0848IPS/CL-0.3334-0.414831.71947-0.12343-0.83617常數(shù)-4.13686-5.04868-7.29909-《70165-7.96712表35個(gè)地理種群三疣梭子蟹判別分析測試結(jié)果種群/群體樣本數(shù)目判別準(zhǔn)確l率(％)預(yù)測分類(個(gè))PiP2zsdllygdyzjzs30卯87.1272010dl2290.91卯.91220000iyg3193.551001029013396.9781.08100320zj3610097.3000036合計(jì)15294.743119283737以上所述的建立判別方程所使用的計(jì)算應(yīng)用軟件為STATISTICA99'EDITION。由美國StatSoft,Icn.公司提供，公司地址2300East14thStreet;網(wǎng)址:http:〃statsoft.com。下面對該軟件應(yīng)用步驟進(jìn)行舉例說明1、首先將測定的數(shù)據(jù)輸入MS-Excd中，建立5個(gè)種的xls文件；2、然后將這22個(gè)性狀除以CL，建立5個(gè)種除以CL的xls文件；3、將步驟2的xls文件數(shù)據(jù)輸入(拷貝)到STATISTICA99'EDITION軟件中，建立5個(gè)種除以CL的STA文件；4、對步驟3的STA文件數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以較正數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)STA文件，其具體實(shí)現(xiàn)過程是打開步驟3中建立的STA文件，點(diǎn)STATISTICA軟件中的工具欄中的"Analysis"，彈出小對話框，選擇"DataManagement/MFM"，出現(xiàn)一個(gè)界面，點(diǎn)擊"DataManagement/MFM"，出現(xiàn)一個(gè)新的界面，點(diǎn)擊"Standardizedvariables"則完成數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果則建立一個(gè)"standard.STA"文件；5、打開步驟4建立的"standard.STA"文件，運(yùn)行STSTISTICA軟件中的工具欄中"分析"工具欄，彈出一個(gè)對話框，點(diǎn)擊"DiscriminatntAnalysis"判別分析工具欄，然后點(diǎn)擊"SwitchTo"進(jìn)行判別分析，出現(xiàn)另一對話框，點(diǎn)擊對話框中的"Variables",選定組變量"1POPU"和自變量(2-22個(gè))后，點(diǎn)擊"OK"，彈出新的對話框，選"Method:"中的"Backwardstepwise","Displayofresults"的"Ateachstep"則為逐步判別分析，再點(diǎn)"OK"，則出現(xiàn)一個(gè)結(jié)果對話框，點(diǎn)擊該結(jié)果對話框的"Classificationfunctions"則出現(xiàn)判別方程中的各變量對應(yīng)的系數(shù)，點(diǎn)擊結(jié)果對話框的"Classificationmatrix"則出現(xiàn)判別的結(jié)果，即判別的正確率數(shù)據(jù)；6、依次運(yùn)行上述結(jié)果對話框中的"Next"按鈕，則出現(xiàn)一組變量對應(yīng)的系數(shù)和判別正確率結(jié)果，這樣經(jīng)過16步后，測量的22個(gè)變量中，僅有Xj、X2、X9、X14、Xn和X^這6個(gè)變量作為判別的依據(jù)，且判別的正確率仍較高，顯示為有效。繼續(xù)往下判別則結(jié)果不理想，因此，將這6個(gè)變量作為最終的結(jié)果。四、逐步判別分析結(jié)果的得出。為更細(xì)致的判別哪幾個(gè)比例性狀在三疣梭子蟹判別分析上貢獻(xiàn)的大小，以上對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步判別分析，最終的判別結(jié)果是在進(jìn)行完16步逐步判別分析之后得出的，檢驗(yàn)出CW/CL、ICW/CL、AW/CL、ML/CL、5PW/CL和OCS/CL這6個(gè)比例形狀對判別分析的貢獻(xiàn)較大。對這6個(gè)比例形狀建立了5個(gè)地理種群的判別方程，公式中Xi、X2、X9、X14、X17、X19分別代表CW/CL、ICW/CL、AW/CL、ML/CL、5PW/CL和OCS/CL各函數(shù)的自變量和常數(shù)。判別方程如下Yz^0.07010X廣0.52105X2-U4342X9+1.30263X!4-0.22921Xn-U3982X19-2.62019Yd尸1.70164X廣1.49333X2-1.89597X9+0.65353X!4-0.32891Xn-1.31352X!9-3.66955Y^4.03275X廣2.37031X2+0.71223X9+0.72934Xi4國0.59053Xi7+4.01213Xw-5,20638Yd廣0.94429X廣l.55943X2+0.11175X9-0.74477X14+1.87868X17+0.49741X19-2.92971Yz廣-2.85322X!+4.81737X2+1.39575X9-1.43024X!4-0.82160Xn誦2.15829X,9隱6.13701由這六個(gè)比例性狀對三疣梭子蟹進(jìn)行判別，對測量數(shù)據(jù)按上述公式進(jìn)行預(yù)測分類，結(jié)果見表4，判別準(zhǔn)確率Pi為63.64%94.44%，P2為67.74%96.97%，綜合判別率為82.24%。因此，上述判別方程是可靠的,可以作為判別這5個(gè)典型三疣梭子蟹群體的參考依據(jù)。表45個(gè)地理種群三疣梭子蟹逐步判別分析測試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>圖l一圖7為三疣梭子蟹形態(tài)學(xué)測量位點(diǎn)圖。具體實(shí)施例方式以下參照附圖，進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。實(shí)施例l。參照圖l-7。一種三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定方法，其步驟如下，(1)取至少30個(gè)待測樣品梭子蟹進(jìn)行7個(gè)形態(tài)學(xué)參數(shù)的測定，分別測定其背甲長CL、背甲寬CW、內(nèi)背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節(jié)長ML、第5步足趾節(jié)寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個(gè)參數(shù)；然后以背甲長CL參數(shù)值作分母、其余6個(gè)參數(shù)值作分子，獲得6個(gè)比例參數(shù)值XCW/CL;X2:ICW/CL;X9:AW/CL;X14:ML/CL;X17:5PW/CL;X19:OCS/CL;(2)將XpX2、X9、X14、Xn和X^6個(gè)比例參數(shù)值分別代入下列方程中進(jìn)行結(jié)果判定Yzs-0.07010X廣0.52105X2-1.14342X9+1.30263XM陽0.22921Xn-l.13982X19-2.62019Ydrl.70164X廣1.49333X2-1.89597X9+0.65353Xw-0.32891Xn隱1.31352Xi9-3扁55Y)yg:1.03275Xr2.37031X2+0.71223X9+0.72934X4-0.59053Xn+4.01213X!9陽5.20638Yd廣0.94429X廣1.55943X2+0.11175Xr0.74477Xi4+1.87868Xn+0.49741X19-2.92971Yz廣-2.85322X!+4.81737X2+1.39575X9-1.43024Xw-0.82160Xn隱2.15829Xw-6.13701(3)根據(jù)所得Y值的最大值出現(xiàn)頻率最多的群體即為待測樣品梭子蟹所處的來源。實(shí)施例2。參照圖l-7。一種三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定方法，其步驟如下，1.采集來的野生雌性三疣梭子蟹樣本應(yīng)在冷藏條件下測定，且樣本數(shù)至少要30個(gè)以獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。2.數(shù)據(jù)測定分別測定背甲長CL、背甲寬CW、內(nèi)背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節(jié)長ML、第5步足趾節(jié)寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個(gè)性狀，以上6個(gè)性作分別比上背甲長CL，獲得6個(gè)比例性狀。各性狀的測定部位見圖1。3.結(jié)果的給出將測定的6個(gè)比例性狀帶入下列5個(gè)方程中，公式中XpX2、X9、X14、X17、X,9分別代表CW/CL、ICW/CL、AW/CL、ML/CL、5PW/CL和OCS/CL各函數(shù)的自變量和常數(shù)。判別方程如下Yz^0.07010X)陽0.52105X2-U4342X9+1.30263Xi4-0.22921Xn-U3982X19-2.62019YdH.70164X廣1.49333X2-1.89597X9+0.65353Xw-0.32891Xn-1.31352Xw-3.66955Y!y^l.03275X廣2.37031X2+0.71223X9+0.72934X!4-0.5卯53Xn+4.01213X!9-5.20638Yd廣0.94429X廣1.55943X2+0.11175X9-0.74477XM+1.87868Xn+0.49741X19-2.92971Yzj:-2.85322X!+4.81737X2+1.39575X9-1.43024XM-0.82160Xn-2.15829Xi9-6.13701每一個(gè)樣本的6個(gè)比例性狀帶入上述5個(gè)方程后得出Yzs、YdI、Ylyg、Ydy、Yzj這5個(gè)數(shù)據(jù)，其中值最大的即判別為該樣本為相應(yīng)的群體。如這個(gè)數(shù)值中Y^最大，則該樣本來自連云港群體，其余如L最大則代表樣本為舟山群體，Ydl代表大連群體，Ydy代表東營群體，Yzj代表湛江群體。對30個(gè)樣本判定到不同群體中，統(tǒng)計(jì)其概率或頻率，出現(xiàn)頻率最高的那個(gè)群體即代表樣本的來源。如測定了30個(gè)樣本，26個(gè)L最大，而另4個(gè)中2個(gè)Ydy最大，另兩個(gè)L最大，毫無疑問可以判別該批三疣梭子蟹樣本為來自大連群體。權(quán)利要求1、一種三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定方法，其特征在于，其步驟如下，(1)取至少30個(gè)待測樣品梭子蟹進(jìn)行7個(gè)形態(tài)學(xué)參數(shù)的測定，分別測定其背甲長CL、背甲寬CW、內(nèi)背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節(jié)長ML、第5步足趾節(jié)寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個(gè)參數(shù)；然后以背甲長CL參數(shù)值作分母、其余6個(gè)參數(shù)值作分子，獲得6個(gè)比例參數(shù)值X1CW/CL；X2ICW/CL；X9AW/CL；X14ML/CL；X175PW/CL；X19OCS/CL；(2)將X1、X2、X9、X14、X17和X196個(gè)比例參數(shù)值分別代入下列方程中進(jìn)行結(jié)果判定Yzs＝0.07010X1-0.52105X2-1.14342X9+1.30263X14-0.22921X17-1.13982X19-2.62019Ydl＝1.70164X1-1.49333X2-1.89597X9+0.65353X14-0.32891X17-1.31352X19-3.66955Ylyg＝1.03275X1-2.37031X2+0.71223X9+0.72934X14-0.59053X17+4.01213X19-5.20638Ydy＝0.94429X1-1.55943X2+0.11175X9-0.74477X14+1.87868X17+0.49741X19-2.92971Yzj＝-2.85322X1+4.81737X2+1.39575X9-1.43024X14-0.82160X17-2.15829X19-6.13701(3)根據(jù)所得Y值的最大值出現(xiàn)頻率最多的群體即為待測樣品梭子蟹所處的來源。全文摘要本發(fā)明是一種三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定方法，其特征在于，其步驟如下，取至少30個(gè)待測樣品梭子蟹進(jìn)行7個(gè)形態(tài)學(xué)參數(shù)的測定，分別測定其背甲長CL、背甲寬CW、內(nèi)背甲寬ICW、腹部寬AW、螯肢長節(jié)長ML、第5步足趾節(jié)寬5PW和螯肢腕骨上外面的棘長OCS這7個(gè)參數(shù)；然后以背甲長CL參數(shù)值作分母、其余6個(gè)參數(shù)值作分子，獲得X₁、X₂、X₉、X₁₄、X₁₇、X₁₉6個(gè)比例參數(shù)值并將這6個(gè)比例參數(shù)值分別代入判別方程中進(jìn)行結(jié)果判定，根據(jù)所得Y值的最大值出現(xiàn)頻率最多的群體即為待測樣品梭子蟹所處的來源。本發(fā)明方法可以快速、經(jīng)濟(jì)、相對準(zhǔn)確和操作簡便地鑒定三疣梭子蟹的種質(zhì)。文檔編號A61B19/00GK101301225SQ20081012311公開日2008年11月12日申請日期2008年6月5日優(yōu)先權(quán)日2008年6月5日發(fā)明者李曉英,董志國,閻斌倫,煥高申請人:淮海工學(xué)院