專利名稱：一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星dna方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星 DNA方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星DNA又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence r印eat，SSR)，其具有高水平的雜合性和突變率、雙親遺傳模式等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)被廣泛用于基因定位、種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定以及進(jìn)化分析等研究(見(jiàn)“ChromOSOma”，2000，109 365-371)。白蟻是最古老的社會(huì)性昆蟲(chóng)，嚴(yán)重危害房屋建筑、水庫(kù)提壩和農(nóng)林植物。由于白蟻生活隱蔽，巢體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生殖模式多樣，人們很難直接觀察到白蟻習(xí)性，因此白蟻防治工作帶有很大的盲目性。我國(guó)學(xué)者在上世紀(jì)50年代開(kāi)始采用傳統(tǒng)方法研究白蟻巢群的建立和發(fā)展、補(bǔ)充型生殖蟻的產(chǎn)生及其群體發(fā)展等，取得了一些重要進(jìn)展(見(jiàn)《中華衛(wèi)生殺蟲(chóng)藥械》，2003，9 :8-12)。但是，由于白蟻的筑巢和覓食具有隱蔽性，其在自然環(huán)境中的許多重要生物學(xué)特性仍然沒(méi)有掌握如白蟻巢群中生殖蟻類型、數(shù)量和親緣關(guān)系如何？ 一定區(qū)域內(nèi)原始蟻王蟻后控制的巢群和補(bǔ)充型生殖蟻控制的巢群的比例是多少？

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)狀，旨在提供一種操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，可準(zhǔn)確判斷白蟻巢群生殖模式的鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法。本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)方式為，一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，具體步驟如下1)在野外采集同一巢群，20頭以上的白蟻樣品，將樣品放入裝有95%酒精的樣品管中，置于-20°C冰箱中備用，采樣過(guò)程中，測(cè)定每個(gè)采樣點(diǎn)的經(jīng)度、緯度和海拔高度；2)提取白蟻樣品的基因組DNA，再用ND-2000微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA濃度，并統(tǒng)一稀釋成10-20ng/ μ 1待用；3)在GenBank上查找與白蟻生殖模式相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)；4)利用軟件I^rimer Premier 5. 0在微衛(wèi)星重復(fù)序列的側(cè)翼設(shè)計(jì)引物，選用微衛(wèi)星位點(diǎn)RfM-2、Rf21-l、Rf6-l、RslO和RS68的微衛(wèi)星引物對(duì)白蟻樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200PCR儀上進(jìn)行；用6. 5%聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離， 選用分子標(biāo)準(zhǔn)為50-350bp IRDye800 standard，電泳在LI-C0R4300DNA自動(dòng)分析儀上進(jìn)行，再使用SAGAct軟件測(cè)定電泳圖中每個(gè)條帶對(duì)應(yīng)樣品的基因型；5)基于“孟德?tīng)柖伞睂?duì)白蟻樣品的觀測(cè)基因型頻率與期望基因型頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，再判定該白蟻巢群的生殖模式①簡(jiǎn)單巢群的基因型頻率觀測(cè)值與“孟德?tīng)枴焙?jiǎn)單巢群的基因型頻率預(yù)期值沒(méi)有顯著差異時(shí)為“簡(jiǎn)單巢群”，
②擴(kuò)大巢群的觀測(cè)基因型種類數(shù)與“孟德?tīng)枴焙?jiǎn)單巢群的預(yù)期基因型種類數(shù)不一致，或者經(jīng)X2檢驗(yàn)后エ蟻的基因型頻率觀測(cè)值與“孟德?tīng)?，，?jiǎn)單巢群的基因型頻率預(yù)期值有顯著差異，且每一位點(diǎn)的等位基因數(shù)都小于5時(shí)為“擴(kuò)大巢群”，③混合巢群的白蟻樣品在某些微衛(wèi)星位點(diǎn)上有5個(gè)以上的等位基因時(shí)為“混合巢群”。本發(fā)明利用微衛(wèi)星DNA技術(shù)可以深入研究自然環(huán)境中白蟻巢群的生殖模式，從而了解相關(guān)的白蟻生殖生物學(xué)特征，不僅能有效地解決上述背景技術(shù)中所提到的問(wèn)題，而且可以提高白蟻防治工作的針對(duì)性。采用本發(fā)明對(duì)長(zhǎng)沙10個(gè)黑胸散白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA鑒定表明簡(jiǎn)單巢群7個(gè)、擴(kuò)大巢群2個(gè)和混合巢群1個(gè)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明由由樣品采集、基因組DNA提取、微衛(wèi)星位點(diǎn)查找、引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化、基因型測(cè)定、卡方檢驗(yàn)和生殖模式判定等7個(gè)關(guān)鍵步驟組成。下面通過(guò)具體實(shí)施例詳述本發(fā)明。樣品采集在長(zhǎng)沙采集10個(gè)黑胸散白蟻巢群的白蟻樣品，每個(gè)巢群采集エ蟻25 頭，兩個(gè)采樣點(diǎn)間的距離應(yīng)在20m以上。采樣后，將エ蟻放入樣品管中，用95%酒精浸泡，貼上標(biāo)簽，在-20°C冰箱中保存?zhèn)溆?。在采樣過(guò)程中，用手持GPS定位儀測(cè)定每個(gè)采樣點(diǎn)的經(jīng)度、緯度和海拔高度。基因組DNA提取按照已有的動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒的方法提取所有樣品的基因組DNA。采用ND-2000微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，并將提取的樣品 DNA稀釋為10-20ng/ μ 1待用。微衛(wèi)星位點(diǎn)查找在已有的GenBank上查找與白蟻生殖模式相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化利用軟件I^rimer Premier5. 0在微衛(wèi)星重復(fù)序列的側(cè)翼設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)引物的原則為引物長(zhǎng)度為19-2^p，GC含量40% -60%，退火溫度為45_65°C，預(yù)期PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100-300bp。根據(jù)不同引物的不同Tm值在PCR儀上進(jìn)行溫度梯度優(yōu)化，選擇20個(gè)樣品等量混合，得到樣品DNA。本實(shí)施例的樣品DNA是10個(gè)黑胸散白蟻巢群中20個(gè)樣品的DNA等量混合得到。基因型測(cè)定選定微衛(wèi)星位點(diǎn)RfM-2、Rf21-l、Rf6-l、RslO和RS68的引物對(duì)白蟻樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200PCR儀(Bio-Rad)上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10レ1，包括模板0嫩(10叫/^1)2.(^1，(1(1!120 4. 8 μ 1，1 XReaction Buffer 1. 0μ 1, MgC12^nmol/L)0· 4μ 1，dNTPs (0. 2mmol/L) 0· 8 μ 1，5，端加有 M13 正向測(cè)序引物的正向引物(2pmol/y 1)0. 2μ 1，反向引物(2pmol/y 1)0. 2μ 1。帶有熒光標(biāo)記的Μ13 引物(M13F-29/ IRD 800) (0. 32pmol/ μ 1)0. 32 μ 1, Taq polymerase (0. 4U/ μ 1)0. 08 μ 1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序94°C預(yù)變性30s ；94°C變性30s，60°C退火30s，每循環(huán)一次降 1°C，72°C延伸30s，6個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸:3min，4°C終止反應(yīng)。用6. 5 %聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，分子量標(biāo)準(zhǔn)為50-350bpIRDye800 standard (LI-COR，Inc.) 電泳在 LI-COR 4300DNA 自動(dòng)分析儀上進(jìn)行，再使用SAGAct軟件(LI-COR，he.)測(cè)定電泳圖中每個(gè)條帶對(duì)應(yīng)樣品的基因型?？ǚ綑z驗(yàn)整理和統(tǒng)計(jì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的樣品基因型，基干“孟德?tīng)柖伞庇?エ蟻基因型逆推出生殖蟻的預(yù)期基因型，再根據(jù)生殖蟻基因型推算出后代基因型的頻率預(yù)期值，再將エ蟻基因型頻率觀測(cè)值與エ蟻基因型頻率預(yù)期值進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。生殖模式判定基于卡方檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)判定黑胸散白蟻巢群的生殖模式，判定標(biāo)準(zhǔn)①當(dāng)基因型頻率觀測(cè)值與“孟德?tīng)枴焙?jiǎn)單巢群的基因型頻率預(yù)期值沒(méi)有顯著差異時(shí)為“簡(jiǎn)單巢群”，②當(dāng)觀測(cè)基因型種類數(shù)與“孟德?tīng)枴焙?jiǎn)單巢群的預(yù)期基因型種類數(shù)不一致，或者經(jīng) XX2檢驗(yàn)后エ蟻基因型頻率觀測(cè)值與“孟德?tīng)枴焙?jiǎn)單巢群的エ蟻基因型頻率預(yù)期值有顯著差異，且每一位點(diǎn)的等位基因數(shù)都小于5時(shí)為“擴(kuò)大巢群”，③當(dāng)白蟻樣品在某些微衛(wèi)星位點(diǎn)上有5個(gè)以上的等位基因時(shí)為“混合巢群”。由此判斷出，在長(zhǎng)沙10個(gè)黑胸散白蟻巢群中，有7個(gè)簡(jiǎn)單巢群、2個(gè)擴(kuò)大巢群和1 個(gè)混合巢群。
權(quán)利要求
1.一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于具體步驟如下1)在野外采集同一巢群，20頭以上的白蟻樣品，將樣品放入裝有95%酒精的樣品管中，置于-20°C冰箱中備用，采樣過(guò)程中，測(cè)定每個(gè)采樣點(diǎn)的經(jīng)度、緯度和海拔高度；2)提取白蟻樣品的基因組DNA，再用ND-2000微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA 濃度，并統(tǒng)一稀釋成10-20ng/y 1待用；3)在GenBank上查找與白蟻生殖模式相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)；4)利用軟件I^rimerPremier 5. 0在微衛(wèi)星重復(fù)序列的側(cè)翼設(shè)計(jì)引物，選用微衛(wèi)星位點(diǎn)Rf24-2、Rf21-1、Rf6_l、RslO和RS68的微衛(wèi)星引物對(duì)白蟻樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200PCR儀上進(jìn)行；用6. 5%聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，選用分子標(biāo)準(zhǔn)為50-350bp IRDye800 standard，電泳在LI-C0R4300DNA自動(dòng)分析儀上進(jìn)行， 再使用SAGAct軟件測(cè)定電泳圖中每個(gè)條帶對(duì)應(yīng)樣品的基因型；5)基于“孟德?tīng)柖伞睂?duì)白蟻樣品的觀測(cè)基因型頻率與期望基因型頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)， 再判定該白蟻巢群的生殖模式①簡(jiǎn)單巢群的基因型頻率觀測(cè)值與“孟德?tīng)枴焙?jiǎn)單巢群的基因型頻率預(yù)期值沒(méi)有顯著差異時(shí)為“簡(jiǎn)單巢群”，②擴(kuò)大巢群的觀測(cè)基因型種類數(shù)與“孟德?tīng)枴焙?jiǎn)單巢群的預(yù)期基因型種類數(shù)不一致，或者經(jīng)X2檢驗(yàn)后工蟻的基因型頻率觀測(cè)值與“孟德?tīng)枴焙?jiǎn)單巢群的基因型頻率預(yù)期值有顯著差異，且每一位點(diǎn)的等位基因數(shù)都小于5時(shí)為“擴(kuò)大巢群”，③混合巢群的白蟻樣品在某些微衛(wèi)星位點(diǎn)上有5個(gè)以上的等位基因時(shí)為“混合巢群”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于設(shè)計(jì)引物的原則為引物長(zhǎng)度為19-2^p，GC含量40% -60%，退火溫度為45_65°C，預(yù)期 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100-300bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于根據(jù)不同引物的不同Tm值在PCR儀上進(jìn)行溫度梯度優(yōu)化，選擇20個(gè)樣品等量混合，得到樣品DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系 10 μ 1，包括模板 DNA(10ng/y 1)2.0 μ 1，ddH20 4. 8 μ 1，IX Reaction Buffer 1. 0μ 1, MgC12 (2mmol/L) 0. 4 μ 1, dNTPs (0. 2mmol/L)0. 8μ 1,5'端力口有 M13 正向測(cè)序引物的正向引物(2ρπι01/μ 1)0·2μ 1，反向引物(2pmol/y 1)0.2μ 1 ；帶有熒光標(biāo)記的 Μ13 引物(M13F-29/IRD 800) (0. 32pmol/y 1)0. 32 μ 1, Taq polymerase (0. 4U/ μ 1)0. 08μ 1 ；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序94°C預(yù)變性30s ；94°C變性30s，60°C退火30s，每循環(huán)一次降1°C， 72°C延伸30s，6個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸 ;3min，4°C終止反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，其特征在于基于“孟德?tīng)柖伞庇晒は伝蛐湍嫱瞥錾诚伒念A(yù)期基因型，再根據(jù)生殖蟻基因型推算出后代基因型的頻率預(yù)期值，再將工蟻基因型頻率觀測(cè)值與工蟻基因型頻率預(yù)期值進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA方法，在野外采集同一巢群的20頭以上白蟻樣品，提取樣品基因組DNA，稀釋。在GenBank上查找與白蟻生殖模式相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，利用軟件Primer Premier 5.0在微衛(wèi)星重復(fù)序列的側(cè)翼設(shè)計(jì)引物，選用微衛(wèi)星引物對(duì)白蟻樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后在自動(dòng)分析儀上進(jìn)行電泳，用SAGAGT軟件測(cè)定電泳圖中每個(gè)條帶對(duì)應(yīng)樣品的基因型?；凇懊系?tīng)柖伞睂?duì)白蟻樣品的觀測(cè)基因型頻率與期望基因型頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，判定白蟻巢群的生殖模式。采用本發(fā)明對(duì)長(zhǎng)沙10個(gè)黑胸散白蟻巢群生殖模式的微衛(wèi)星DNA鑒定表明簡(jiǎn)單巢群7個(gè)、擴(kuò)大巢群2個(gè)和混合巢群1個(gè)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，可準(zhǔn)確判斷白蟻巢群的生殖模式，對(duì)制定防治白蟻策略有重要參考價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559896SQ20121000607
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者李剛?cè)A, 雷朝亮, 黃求應(yīng) 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)