專(zhuān)利名稱(chēng)：青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)蟹類(lèi)檢驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)，具體講是一種青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法，其屬于中國(guó)沿海青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
青蟹屬(Scylla)蟹類(lèi)屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)，廣泛分布于太平洋、印度洋的溫帶、亞熱帶和熱帶海區(qū)的紅樹(shù)林地區(qū)及河口區(qū)，是亞洲許多發(fā)展中國(guó)家沿海漁業(yè)的重要組成部分。青蟹在我國(guó)長(zhǎng)江以南沿海均產(chǎn)，尤以廣東、廣西、海南、福建為多，是我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi)之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)許多科研工作者致力于青蟹的人工苗種培育及養(yǎng)殖。最初，青蟹屬被認(rèn)為僅有S.serrata一種。自1949年Estampador提出該屬應(yīng)分成兩大類(lèi)群、3種1亞種之后[5]，許多國(guó)外學(xué)者對(duì)鋸緣青蟹屬種間親緣關(guān)系進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)研究[6-16]。但是關(guān)于青蟹的種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還沒(méi)有詳盡的工作開(kāi)展，基于不同的基因標(biāo)記得到的結(jié)果也不盡相同。青蟹的種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系尚未得到詳細(xì)闡明。尤其我國(guó)青蟹的分類(lèi)地位一直沒(méi)有得到澄清，雖然Keena認(rèn)為分布于我國(guó)廈門(mén)的的青蟹與分布于香港水域的青蟹應(yīng)該都屬于S.paramamosai，但是這一觀點(diǎn)并沒(méi)有得到國(guó)內(nèi)學(xué)者的廣泛認(rèn)同。國(guó)內(nèi)有關(guān)青蟹的研究基本還是沿用以前的學(xué)名S.serrata。國(guó)內(nèi)關(guān)于青蟹mtDNA研究的報(bào)道極少。
目前，青蟹養(yǎng)殖業(yè)尚處于初期階段，青蟹資源現(xiàn)狀嚴(yán)峻。因此，研究和保護(hù)青蟹種質(zhì)的檢測(cè)和鑒定技術(shù)，對(duì)保護(hù)我國(guó)青蟹養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)、穩(wěn)定的發(fā)展十分迫切。本領(lǐng)域迫切要開(kāi)發(fā)盡可有效、準(zhǔn)確地鑒別青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定技術(shù)，尤其是有效、準(zhǔn)確鑒定青蟹的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及中國(guó)沿海青蟹的分類(lèi)地位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種有效、準(zhǔn)確地青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法。本發(fā)明對(duì)青蟹屬幾種青蟹以及中國(guó)溫州、廈門(mén)、海南等近海的青蟹樣品進(jìn)行了12S rRNA基因序列測(cè)定，并與Genbank庫(kù)中其他蟹類(lèi)的同源序列進(jìn)行比較分析，為解決青蟹屬物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、澄清中國(guó)青蟹的分類(lèi)地位提供分子依據(jù)。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，研制了一種青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法，其包括如下步驟(1)提取青蟹樣品的DNA；(2)以(1)步的DNA為模板，采用一對(duì)引物對(duì)其線粒體DNA 12S rRNA部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化；(3)利用該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定；(4)對(duì)測(cè)序所得的青蟹樣品的DNA序列結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析首先，選定已發(fā)表在美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank庫(kù))中的相關(guān)青蟹的DNA同源序列作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比序列，其次，將所測(cè)青蟹樣品的DNA序列經(jīng)校對(duì)而得到該樣品的同源序列片段，再將得到的同源序列進(jìn)行如下項(xiàng)目的比較鑒別①單倍型序列長(zhǎng)度，
②單倍型的分布情況，③堿基A，T，G，C的組成(％)，④單倍型個(gè)體數(shù)，⑤種間凈遺傳距離和種內(nèi)個(gè)體間遺傳多樣性，⑥采用簡(jiǎn)約法或鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，從這六個(gè)項(xiàng)目的比較鑒別，來(lái)確定所測(cè)的分類(lèi)地位未知的青蟹樣品的分類(lèi)地位。
所述的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比序列，其是所述的基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank庫(kù))中檢索號(hào)分別為AY647179、AY647182、AY647183的青蟹S.serrata、S.olivacea、S.paramamosain的12S rRNA的同源序列。
所述的②單倍型的分布情況項(xiàng)目的比較鑒別，是指是否具有共享單倍型，是否具有變異位點(diǎn)。
所述的⑤，⑥項(xiàng)目的比較鑒別，其中的種間凈遺傳距離，種內(nèi)個(gè)體間遺傳多樣性和構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果，是使用Mega軟件運(yùn)算而得到的。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于對(duì)測(cè)序所得的青蟹樣品的DNA序列結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析首先，選定已發(fā)表在美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank庫(kù))中的相關(guān)青蟹的DNA同源序列作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比序列，其次，將所測(cè)青蟹樣品的DNA序列經(jīng)校對(duì)而得到該樣品的同源序列片段，再將得到的同源序列進(jìn)行如下項(xiàng)目的比較鑒別①單倍型序列長(zhǎng)度，②單倍型的分布情況，③堿基A，T，G，C的組成(％)，④單倍型個(gè)體數(shù)，⑤種間凈遺傳距離和種內(nèi)個(gè)體間遺傳多樣性，⑥采用簡(jiǎn)約法或鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，從這六個(gè)項(xiàng)目的比較鑒別，來(lái)確定所測(cè)的分類(lèi)地位未知的青蟹樣品的分類(lèi)地位。從而確定了中國(guó)沿海青蟹的分類(lèi)地位；即本發(fā)明通過(guò)對(duì)青蟹樣品進(jìn)行生化遺傳分析，采用單倍型序列長(zhǎng)度、變異位點(diǎn)、堿基組成、單倍型個(gè)體數(shù)、凈遺傳距離和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的方法確定了中國(guó)沿海青蟹的分類(lèi)地位，中國(guó)沿海青蟹實(shí)際上是S.paramamosain。本發(fā)明青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法是一種有效的分子標(biāo)記技術(shù)。該種質(zhì)檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠。


圖1本發(fā)明構(gòu)建的青蟹鄰接關(guān)系樹(shù)圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)材料本發(fā)明的樣本中3種蟹類(lèi)及中國(guó)沿海的青蟹樣本的采集情況如下S.serrata采自日本的和歌山縣紀(jì)之川、日本的高知、日本的靜岡浜名湖、日本的沖繩及馬達(dá)加斯加；S.olivacea采自日本的和歌山縣紀(jì)之川、日本的靜岡浜名湖、日本的沖繩及泰國(guó)Surat Thani；S.paramamosain采自日本的和歌山縣紀(jì)之川、日本的高知及越南；中國(guó)沿海的青蟹樣品(暫時(shí)命名為Scylla spp.)采自中國(guó)的福建、溫州及海南。酒精固定或DNA樣品運(yùn)到中國(guó)海洋大學(xué)漁業(yè)資源實(shí)驗(yàn)室后，-20℃以下保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明分析中采用Keena分類(lèi)系統(tǒng)對(duì)樣品命名。
本發(fā)明的青蟹種質(zhì)檢測(cè)和鑒定的方法，其包括步驟(1)提取青蟹樣品的DNA；取約100mg的青蟹步足肌肉，使用試劑盒(上海生工)提取基因組DNA。提取青蟹樣品的基因組DNA具體實(shí)施例剪取約100mg的青蟹步足肌肉，加入600ul STE(10mmol/L Tris-Cl，PH8.0；0.1mol/LEDTA，PH8.0；0.5％m/v SDS)稍加碾磨，加蛋白酶K15ul(10mg/ml)，55℃作用5～8h。加入600ul(PH8.0)平衡酚，離心(12000g，4℃，10min)，吸取上清液。加入混合液(苯酚∶氯仿∶異戊醇)(25∶24∶1)500ul，顛倒混勻10min，離心(12000g，4℃，10min)吸取上清液，重復(fù)兩次。加入氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液450ul，混勻10min，離心(12000g，4℃，10min)，吸取上清液，加入2.5倍體積的純酒精，并于-20℃存放20分鐘左右(4℃存放1小時(shí)左右)。離心(12000g，4℃，10min)產(chǎn)生白色沉淀，輕柔倒去酒精，再加入200ul 75％的酒精，緩慢顛倒并洗滌管壁，再離心(12000g，4℃，10min)，去酒精。將乙醇沉淀后的DNA干燥后加入100ul的TE溶解并在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> (2)PCR擴(kuò)增、純化；以(1)步驟的DNA為模板，用一對(duì)引物12S-F 5’-ACA CCT ACT ATgTTA CgA CTT-3’和12S-R 5’-ATA AAC TAg gAT TAg ATA CCC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的確定即PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃45s，52℃45s，72℃1min，最后72℃延伸10min。反應(yīng)體積為25μL，其中10×緩沖液2.5μL，MgCl21.5mmol/L，各種dNTP200μmol/L，Ex Taq酶1.25units，每個(gè)引物各0.2mmol/L，模板DNA1μL，加滅菌蒸餾水至25μL。以上反應(yīng)均用陰性對(duì)照來(lái)檢查是否有DNA污染。
(3)DNA序列測(cè)定；擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的基因片段經(jīng)UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海華舜)純化回收后，取適量回收產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)和雙向測(cè)序，以確保DNA序列的可靠性。
(4)數(shù)據(jù)分析；用DNASTAR和MEGA 2.1軟件進(jìn)行所測(cè)序列和美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank庫(kù))中其他蟹類(lèi)的同源片段序列的編輯、排序、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳學(xué)分析[24]。采用Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，引用同科的日本蟳、底棲短槳蟹和已發(fā)表青蟹同源序列(Genbank庫(kù)中的檢索號(hào)分別為AY647177-AY647184)進(jìn)行比較，采用簡(jiǎn)約法(MP)或鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)所得的系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行自展檢驗(yàn)(1000次重復(fù))。
本發(fā)明通過(guò)對(duì)青蟹樣品進(jìn)行生化遺傳分析分析過(guò)程如下；本發(fā)明采集了青蟹屬三種青蟹及中國(guó)沿海的青蟹樣本，測(cè)定分析了其線粒體DNA 12S rRNA部分片段，研究了青蟹屬三種青蟹的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，闡明分布于中國(guó)沿海的青蟹的分類(lèi)地位。由于中國(guó)沿海青蟹的分類(lèi)地位未定，所以實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，將中國(guó)沿海青蟹暫時(shí)以Scylla spp來(lái)命名，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)過(guò)人工校對(duì)后，得到了同源序列片段，對(duì)這些片段的分析如下首先，分析比較單倍型序列長(zhǎng)度中國(guó)沿海青蟹和三種青蟹的同源片段長(zhǎng)度存在差異，通過(guò)分析可知，中國(guó)沿海的青蟹Scylla spp的單倍型序列長(zhǎng)度分別為406和407；S.paramamosain的單倍型序列長(zhǎng)度分別為406和407；S.serrata的單倍型序列長(zhǎng)度為408；S.olivacea的單倍型序列長(zhǎng)度分別為403和404。
以上可以看出，中國(guó)沿海的青蟹Scylla spp與paramamosain的單倍型序列的長(zhǎng)度范圍一樣；S.serrata與S.olivacea的單倍型序列長(zhǎng)度范圍與中國(guó)沿海的青蟹Scylla spp的相差較大。
其次，比較單倍型的分布情況中國(guó)沿海的青蟹Scylla spp與S.paramamosain的具有共享單倍型，(見(jiàn)表1)，分別為，SP1、SP2和SP1、SP3；其中SP1長(zhǎng)度為406bp，SP2；SP3長(zhǎng)度為407。
再次，分析比較堿基A，T，G，C的組成(％)
從表2中可看出，中國(guó)沿海的青蟹Scylla spp與S.paramamosain的單倍型序列堿基組成基本一樣(見(jiàn)表2)，SP1的堿基組成(％)A，T，G，C分別為36.7、38.2、10.1和15.0；SP2的堿基組成(％)A，T，G，C分別為36.6、38.3、10.1和15.0；SP3的堿基組成(％)A，T，G，C分別為36.6、38.1、10.1和15.2；其中，SP2和SP3僅僅相差一個(gè)堿基。
然而，S.serrata的單倍型為SS1、SS2、SS3，其長(zhǎng)度均為408bp，堿基組成分別為36.0、38.0、10.8、15.2；35.8、38.0、11.0、15.2和36.0、38.0、10.8、15.2。
S.Olivacea的單倍型為SO1、SO2、SO3、SO4、SO5，其長(zhǎng)度分別為404、404、404、403、403。
SO1的堿基組成分別為35.9、36.1、10.9和17.1；SO2的為35.9、36.1、11.1和16.8；.
SO3的為35.9、35.9、11.4和16.8；SO4堿基組成為36.0、36.2、10.9和16.9；SO5堿基組成為35.7、36.2、11.2和16.9。
在分析的5個(gè)S.olivacea個(gè)體中共檢測(cè)到5個(gè)單倍型。各個(gè)種內(nèi)單倍型關(guān)系很近，單倍型間最多只有三個(gè)核苷酸位點(diǎn)差異(見(jiàn)表2)。
在S.paramamosain和S.olivacea兩個(gè)種內(nèi)存在插入/缺失。
從這些單倍型的堿基組成來(lái)看，種內(nèi)個(gè)體間差異很小，種間差別顯著，但中國(guó)沿海的青蟹Scylla spp與S.paramamosain之間差異非常小，變異位點(diǎn)結(jié)果顯示中國(guó)沿海的青蟹Scyllaspp與S.paramamosain僅相差一個(gè)堿基。
本發(fā)明使用Mega軟件運(yùn)算，采用簡(jiǎn)約法(MP)或鄰接法(NJ)兩種方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，對(duì)所得的系統(tǒng)樹(shù)進(jìn)行自展檢驗(yàn)(1000次重復(fù))。結(jié)果兩種方法得到的系統(tǒng)樹(shù)一致，所以本發(fā)明只給出了鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖1)。系統(tǒng)樹(shù)結(jié)果顯示青蟹的12S rRNA基因片段長(zhǎng)度存在差異，每一種的個(gè)體都單獨(dú)聚為一支，顯示具有很高的自展置信值，鄰接關(guān)系樹(shù)還顯示中國(guó)沿海的青蟹Scylla spp(Fujian1-Fujian3，Wenzhou1-Wenzhou3和Hainan1-Hainan3)與S.paramamosain的序列完全聚在一起，并且與S.paramamosain具有共享單倍型(見(jiàn)圖1)。S.serrata和S.paramamosain二個(gè)種親緣關(guān)系較近，這二個(gè)種形成一個(gè)單系群并且具有很高的自展置信值。S.olivacea與其他二個(gè)種互為單系，與以上二個(gè)種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
本發(fā)明運(yùn)用Mega軟件計(jì)算了種間的凈遺傳距離(位于對(duì)角線以下)和種內(nèi)個(gè)體間的遺傳多樣性(對(duì)角線上的數(shù)值)(見(jiàn)表3)，結(jié)果顯示中國(guó)沿海的青蟹(Scylla spp)與S.paramamosain之間的遺傳距離為“0”，結(jié)合上面的單倍型序列長(zhǎng)度差異分析，變異位點(diǎn)分析，堿基組成及單倍型個(gè)體數(shù)和構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)的分析結(jié)果可以確定Scylla spp實(shí)際上就是S.paramamosain，它們同是一個(gè)種。
總之，本發(fā)明采用了單倍型序列長(zhǎng)度差異分析、變異位點(diǎn)分析、堿基組成、凈遺傳距離和種內(nèi)個(gè)體間的遺傳多樣性的分析手段確定了，中國(guó)沿海青蟹Scylla spp就是S.paramamosain，確定了中國(guó)沿海青蟹Scylla spp在S.paramamosain的分類(lèi)地位。
本發(fā)明選定的三種青蟹(S.serrata，S.olivacea，S.paramamosain)種內(nèi)的遺傳多樣性(0.0003~0.0030)遠(yuǎn)低于種間的凈遺傳距離(見(jiàn)表3)，在這三個(gè)品種中，S.paramamosain的種內(nèi)遺傳多樣性最低，S.olivacea最高，S.serrata(見(jiàn)表3)。S.olivacea與另外二個(gè)種之間的凈遺傳距離(0.0633~0.0696)明顯大于其他二個(gè)種之間的遺傳距離(0.0342~0.0398)大(見(jiàn)表3)。
表1青蟹采樣信息及單倍型分布表

表2三個(gè)種青蟹和中國(guó)沿海青蟹單倍型序列長(zhǎng)度，變異位點(diǎn)，堿基組成，單倍型個(gè)體數(shù)比較表

表2注釋?zhuān)槐碇袌A點(diǎn)“.”表示該處與參考序列相同，段劃線“-”表示缺失，數(shù)字代表發(fā)生變異的位點(diǎn)。
表3青蟹四種間遺傳距離(對(duì)角線下面的內(nèi)容)和各個(gè)種內(nèi)遺傳多樣性(對(duì)角線)

本發(fā)明把中國(guó)沿海的青蟹12S rRNA序列與三種青蟹的12S rRNA序列放在一起比對(duì)，然后采用簡(jiǎn)約法(MP)或鄰接法(NJ)兩種方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示中國(guó)沿海的青蟹與S.paramamosain的序列聚在一起，并且與S.paramamosain具有共享單倍型(見(jiàn)圖1)。種間凈遺傳距離和種內(nèi)遺傳多樣性進(jìn)一步表明中國(guó)沿海的青蟹為S.paramamosain。以下的分析中采自中國(guó)沿海的青蟹用S.paramamosain表示。
本發(fā)明在所分析的15個(gè)S.paramamosain個(gè)體中，共檢測(cè)到3個(gè)單倍型，其中一個(gè)為13個(gè)個(gè)體共享的主體單倍型(SP1)，另外兩個(gè)單倍型分別只在一個(gè)個(gè)體中發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表2)。所分析的3個(gè)S.tranquebarica個(gè)體中，共檢測(cè)到兩個(gè)單倍型。在7個(gè)S.serrata個(gè)體中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)單倍型，其中SS1及SS2各為3個(gè)個(gè)體共享，SS3只在一個(gè)個(gè)體中發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表2)。在分析的5個(gè)S.olivacea個(gè)體中共檢測(cè)到5個(gè)單倍型。各個(gè)種內(nèi)單倍型關(guān)系很近，單倍型間最多只有三個(gè)核苷酸位點(diǎn)差異(見(jiàn)表2)。在S.paramamosain和S.olivacea兩個(gè)種內(nèi)存在插入/缺失。結(jié)果表明四種青蟹的12S rRNA基因片段長(zhǎng)度存在差異，每一種的個(gè)體都單獨(dú)聚為一支，并且具有很高的自展置信值，中國(guó)沿海的青蟹樣品全部與Scylla paramamosain聚為一枝，結(jié)果提示分布于中國(guó)沿海的青蟹主要是S.paramamosain。S.serrata和S.paramamosain二個(gè)種親緣關(guān)系較近，這二個(gè)種形成一個(gè)單系群并且具有很高的自展置信值。S.olivacea與其他二個(gè)種互為單系，與以上二個(gè)種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒(méi)有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法，其包括如下步驟(1)提取青蟹樣品的DNA；(2)以(1)步的DNA為模板，采用一對(duì)引物對(duì)其線粒體DNA 12S rRNA部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化；(3)利用該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定；其特征在于對(duì)測(cè)序所得的青蟹樣品的DNA序列結(jié)果進(jìn)行(4)數(shù)據(jù)分析首先，選定已發(fā)表在美國(guó)基因數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank中的相關(guān)青蟹的DNA同源序列作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比序列，其次，將所測(cè)青蟹樣品的DNA序列經(jīng)校對(duì)而得到該樣品的同源序列片段，再將得到的同源序列進(jìn)行如下項(xiàng)目的比較鑒別①單倍型序列長(zhǎng)度，②單倍型的分布情況，③堿基A，T，G，C的組成(％)，④單倍型個(gè)體數(shù)，⑤種間凈遺傳距離和種內(nèi)個(gè)體間遺傳多樣性，⑥采用簡(jiǎn)約法或鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，從這六個(gè)項(xiàng)目的比較鑒別，來(lái)確定所測(cè)的分類(lèi)地位未知的青蟹樣品的分類(lèi)地位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比序列，其是所述的基因數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank中檢索號(hào)分別為AY647179、AY647182、AY647183的青蟹S.serrata、S.olivacea、S.paramamosain的12S rRNA的同源序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法，其特征在于所述的②單倍型的分布情況項(xiàng)目的比較鑒別，是指是否具有共享單倍型，是否具有變異位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法，其特征在于所述的⑤，⑥項(xiàng)目的比較鑒別，其中的種間凈遺傳距離，種內(nèi)個(gè)體間遺傳多樣性和構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果，是使用Mega軟件運(yùn)算而得到的。
全文摘要
本發(fā)明是青蟹的種質(zhì)檢測(cè)和鑒定方法，其包括(1)提取青蟹樣品的DNA；(2)以(1)步的DNA為模板PCR擴(kuò)增，純化；(3)利用該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定；(4)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)分析首先，選定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比序列，其次，進(jìn)行比較鑒別①單倍型序列長(zhǎng)度，②單倍型的分布情況，③堿基A，T，G，C的組成(％)，④單倍型個(gè)體數(shù)，⑤種間凈遺傳距離和種內(nèi)個(gè)體間遺傳多樣性，⑥采用簡(jiǎn)約法或鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，來(lái)確定所測(cè)的分類(lèi)地位未知的中國(guó)沿海青蟹實(shí)際上是S.paramamosain。本發(fā)明的檢測(cè)和鑒定方法是一種有效的分子標(biāo)記技術(shù)，為解決青蟹屬物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、澄清中國(guó)青蟹的分類(lèi)地位提供分子依據(jù)，其方法簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1900313SQ20061004454
公開(kāi)日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者高天翔, 王玉江, 陳艷翠, 程光平 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)