專利名稱：轉(zhuǎn)基因棉花種子純度鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種子純度的鑒定方法，尤其是一種轉(zhuǎn)基因棉花種子純度鑒定方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因抗蟲棉由于在遏制棉蟲為害、節(jié)省農(nóng)本、降低勞動(dòng)強(qiáng)度、減少因噴施農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染、促進(jìn)農(nóng)田微觀和宏觀環(huán)境改善等多方面的作用，越來越引起各國(guó)科研工作者的重視[1，2，3]?？瓜x棉是中國(guó)目前準(zhǔn)予商品性生產(chǎn)的農(nóng)作物之一。但在抗蟲棉推廣過程中缺乏快速有效的純度鑒定方法，抗蟲棉中混雜非抗蟲棉種子，將使抗性問題變得不可預(yù)測(cè)和控制。有研究表明[3]用不同齡期的棉鈴蟲在棉田內(nèi)接蟲調(diào)查表明，棉鈴蟲3齡以上幼蟲有在棉株間轉(zhuǎn)株擴(kuò)散的行為。如果在抗蟲棉中混有較多地非抗蟲棉種子，則非抗蟲棉株上的3齡以上幼蟲可轉(zhuǎn)移到附近的抗蟲棉株上，造成取食、存活和抗性淘汰篩選、會(huì)加速棉鈴蟲抗性發(fā)展速度；而通過保證田間抗蟲棉種子的純度，將有助于控制昆蟲抗性發(fā)展，保持品種的持續(xù)抗性。
關(guān)于轉(zhuǎn)基因棉花純度快速檢測(cè)方法，利用CAB Abstracts光盤(1984-2001年)、AGRIS光盤(1975-2000年)、AGRICOLA光盤(1970-2000年)，按關(guān)鍵詞“Purity”and“Transgenic Cotton”所做的計(jì)算機(jī)文獻(xiàn)檢索結(jié)果，尚未發(fā)現(xiàn)國(guó)外有此類相關(guān)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。
在國(guó)內(nèi)，李燕蛾等(1998)[4]報(bào)道一種效果較好的轉(zhuǎn)基因棉花純度快速測(cè)定方法，將轉(zhuǎn)基因棉花種子經(jīng)H2O2表面消毒后，無菌水浸種24小時(shí)，種入含卡那霉素(濃度1g/L)的1/2MS種苗培養(yǎng)基，27±2℃培養(yǎng)4天，根據(jù)棉苗子葉是否出現(xiàn)黃斑或變?yōu)辄S化苗，來確定該棉種的抗蟲性，依此來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的純度。但該方法存在以下缺點(diǎn)①對(duì)試驗(yàn)設(shè)施要求較高，需配制特定的組織培養(yǎng)基，無菌操作條件要求嚴(yán)格，難以實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物品種純度檢測(cè)所需的操作簡(jiǎn)單、快速、高效、具有可普及性等基本目標(biāo)，因此無法在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用；②祝建波等(2000)[5]利用李燕蛾報(bào)道的方法進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該方法會(huì)嚴(yán)重抑制轉(zhuǎn)基因棉苗胚根及根的生長(zhǎng)，對(duì)棉苗的正常生長(zhǎng)發(fā)育有不良影響。
另外，馬麗華等(2000)[6]、祝建波等(2000)[5]、周玉(2000)等[7]報(bào)道了轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉采用卡那霉素涂葉的田間快速檢測(cè)方法，但這些方法僅可用于大田抗蟲棉品種的育種篩選或繁殖過程中的棉種抗蟲性基因的純化，不能直接用于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉銷售過程中種子純度的快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種無需MS固體培養(yǎng)基、操作簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)基因棉花種子純度鑒定方法，以解決目前抗蟲棉種產(chǎn)業(yè)化過程中急需解決的種子純度鑒定問題，為轉(zhuǎn)基因棉花種子的生產(chǎn)銷售和推廣應(yīng)用創(chuàng)造良好條件。
目前，在農(nóng)作物基因工程廣泛使用一種稱Npt-II的報(bào)告基因，它來源于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5上的aphA2，該基因編碼氨基糖苷-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminnoglycoside-3’-phosphotransferase II)，又稱新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycin phosphotrans-frase II)，英文縮寫為Npt-II。該酶使氨基糖苷類抗生素(新霉素、卡那霉素、巴龍霉素等)磷酸化而失活。此類抗生素通過抑制原核生物(或真核生物的葉綠體與線粒體)蛋白質(zhì)生物合成70S起始復(fù)合體的生成，并使fMet-tRNA從70S起始復(fù)合體上解離，從而阻礙原核生物的蛋白質(zhì)生物合成。
此類抗生素對(duì)植物細(xì)胞毒性的機(jī)理是與植物細(xì)胞葉綠體中的核糖體30S亞基結(jié)合，影響70S起始復(fù)合體生成，干擾葉綠體的蛋白質(zhì)生物合成，最終導(dǎo)致植物組織失綠乃至死亡。Npt-II的作用是使ATP分子上的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移到抗生素分子上，影響抗生素與核糖體亞基的結(jié)合，從而使抗生素失活，不再對(duì)植物細(xì)胞具有毒性作用。
凡具有外源Npt-II基因的轉(zhuǎn)化植物，可以使植物細(xì)胞獲得對(duì)上述抗生素的抗性。因此用此類抗生素處理，凡具有Npt-II基因的棉籽出苗以后子葉為正常綠色；而沒有Npt-II基因的普通棉籽出苗以后，其子葉耳基部出現(xiàn)黃斑或擴(kuò)展為子葉局部乃至整片子葉變黃。
依據(jù)上述研究結(jié)果，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因棉花種子純度鑒定方法包括以下步驟(1)配液用氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、新霉素、巴龍霉素等)配制(5-15)×106單位/L濃度的浸種水溶液，浸種液體的用量是種子重量的3-5倍；(2)浸種將被測(cè)種子加浸種液體后充分搖勻，浸潤(rùn)于液體之中。浸種的時(shí)間為24小時(shí)左右，浸種溫度在25℃±2℃；(3)播種用淡水沙做為發(fā)芽床，沙的含水量以手捏成團(tuán)、松開即散為度，在塑料盤中先鋪一層約3厘米厚的沙層，在沙層上播種棉籽，然后蓋一層1厘米的沙層，插上標(biāo)簽，用透明的塑料袋封好；(4)出苗把塑料盤放在光線良好的環(huán)境中，保持出苗所需的濕度，日間溫度控制在25℃以上，夜間溫度不低于15℃；(5)考苗經(jīng)過7天左右，待棉苗子葉完全平展后，對(duì)棉苗進(jìn)行考察，數(shù)每個(gè)送檢樣品的總苗數(shù)與黃斑苗數(shù)，重復(fù)2次以上，求平均值，凡在子葉的耳基部出現(xiàn)黃斑，即判定為黃斑苗；(6)計(jì)算按以下算式計(jì)算抗蟲棉種子純度與黃斑率。1)抗蟲棉種子純度＝(總苗數(shù)-黃斑苗數(shù))/總苗數(shù)×100％2)黃斑率＝黃斑苗數(shù)/總苗數(shù)×100％
上述方法突破了以MS固體培養(yǎng)基進(jìn)行無菌育苗鑒定抗蟲棉純度的常規(guī)，利用一定濃度的氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、新霉素、巴龍霉素等)浸種，采用淡水沙做為發(fā)芽床，在發(fā)芽過程中不會(huì)出現(xiàn)種子因病菌感染造成霉變或因培養(yǎng)基組分造成爛根現(xiàn)象，試驗(yàn)無需對(duì)棉種進(jìn)行消毒，無需進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作，可直接用自來水配制浸種液體。另外，在日間溫度25℃以上，夜間溫度不低于15℃，鑒定試驗(yàn)也可直接在光線良好的室內(nèi)進(jìn)行，無需溫光種子發(fā)芽箱設(shè)備。
不難看出，本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)條件要求簡(jiǎn)單，試驗(yàn)所用試劑及物品價(jià)格低廉，特別適宜在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
1、本方法實(shí)施的具體步驟為(1)配液用獸用卡那霉素配制107單位/L濃度的浸種水溶液。浸種液體可直接用自來水(或蒸餾水)配制。浸種液體的用量是種子重量的4倍，(2)浸種被測(cè)樣品為硫酸脫絨的棉花種子。種子加浸種液體后充分搖勻，浸潤(rùn)于液體之中。浸種的時(shí)間為24小時(shí)左右，浸種溫度在25℃±2℃。在浸種過程中罩塑料袋以防止水分蒸發(fā)。(3)播種用淡水沙做為發(fā)芽床，沙的含水量要適宜，以手捏成團(tuán)、松開即散為度(含水量為8.3％±0.6％)。在每塑料盤中先鋪一層約3厘米厚的沙層，在沙層上播種100粒棉籽，然后蓋一層1厘米的沙層，插上標(biāo)簽，用透明的塑料袋封好。(4)出苗保持發(fā)芽所需的濕度。把塑料盤放入種子溫光發(fā)芽箱中，發(fā)芽箱的溫度控制在27℃±2℃。照光可在種子頂土后進(jìn)行。每個(gè)被測(cè)樣品重復(fù)4次，求平均值。(當(dāng)日間溫度25℃以上、夜間溫度不低于15℃時(shí)，發(fā)芽試驗(yàn)也可直接在光線良好的室內(nèi)進(jìn)行，無需溫光發(fā)芽箱設(shè)備。)(5)考苗經(jīng)過7天左右，棉苗子葉完全平展，對(duì)棉苗進(jìn)行考察，數(shù)每個(gè)送檢樣品的總苗數(shù)與黃斑苗數(shù)，求各重復(fù)的平均值。凡在子葉的耳基部出現(xiàn)黃斑，即判定為黃斑苗。(6)計(jì)算按以下算式計(jì)算抗蟲棉種子純度與黃斑率。1)抗蟲棉種子純度＝(總苗數(shù)-黃斑苗數(shù))/總苗數(shù)×100％2)黃斑率＝黃斑苗數(shù)/總苗數(shù)×100％2、最宜卡那霉素浸種濃度的確定
非轉(zhuǎn)基因普通棉省1-省6，用分別5×106單位/L、107單位/L濃度的卡那霉素浸種24小時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1 不同濃度卡那霉素浸種后棉苗情況
平均總苗數(shù) 平均黃斑苗數(shù) 平均黃斑率(％)
品種
5g/L 10g/L 5g/L 10g/L 5g/L10g/L
省1 676460 6389.55 98.44
省2 644762 4796.88 100
省3 544753 4698.15 97.87
省4 616061 60100 100
省5 736071 6097.26 100
省6 475147 51100 100
由表1可知，用5×106單位/L卡那霉素浸種，普通棉省1抗蟲性的黃斑率最低，為89％；省4、省6最高，達(dá)100％。說明普通棉不同品種對(duì)卡那霉素的敏感程度存在一定程度的差異，某些普通棉品種對(duì)卡那霉素具有一定耐性。
當(dāng)浸種濃度達(dá)107單位/L時(shí)，省2、省4、省5及省6黃斑率均達(dá)100％，省1及省3也高達(dá)98％，6個(gè)普通棉品種的平均黃斑率達(dá)99.38％，表明在該濃度下可以消除可能由于某些品種本身對(duì)卡那霉素有一定耐性而造成對(duì)抗性鑒定結(jié)果的干擾，從而提供了關(guān)于不同品種是否具有抗卡那霉素基因的真實(shí)的抗性鑒定結(jié)果，尤其是該濃度對(duì)棉種出苗率沒有產(chǎn)生明顯的不良影響(表2中列出了9個(gè)不同棉種經(jīng)卡那霉素浸種后的平均出苗率與清水浸種后的平均出苗率)。因此，確定把107單位/L卡那霉素濃度作為鑒定棉花品種是否具有抗卡那霉素基因比較合適的濃度。根據(jù)該濃度浸種后出現(xiàn)的黃斑率高低，可判斷一個(gè)品種是否是轉(zhuǎn)基因抗蟲棉或非轉(zhuǎn)基因普通棉。
由表2的鑒定結(jié)果可見，其中K068、凡8、R086為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉；石遠(yuǎn)321、寧早1號(hào)、泗168為非抗蟲的普通棉；寧雜210、寧雜209、寧雜205為轉(zhuǎn)基因抗蟲雜種棉。
表2、107單位/L卡那霉素對(duì)不同品種屬性鑒定結(jié)果3、幾個(gè)抗蟲棉品系(或雜交種)純度鑒定結(jié)果
用107單位/L濃度的卡那霉素浸種，各品種的黃斑率結(jié)果見表3。4個(gè)2000年參加抗蟲棉區(qū)試的品系，其中GK22的品種純度為100％，GK14為91.78％，蘇抗103為83.12％；但鹽抗1211的品種純度僅16.95％，說明該品種的抗蟲性已極度退化，或抗蟲基因發(fā)生了丟失。
抗蟲棉品系A(chǔ)065的品種純度很低，僅68.99％。雜交抗蟲棉寧雜210的品種純度為99.46％，寧雜209的品種純度為96.07％，寧雜202的品種純度為91.01％；雙價(jià)抗蟲棉SGK321的品種純度為98.52％；美國(guó)2個(gè)抗蟲棉32B、33B的品種純度均為100％。
表3 卡那霉素浸種法對(duì)棉花抗蟲性純度鑒定結(jié)果
為了保障品種的抗蟲性，防止棉種抗蟲性的退化，作為生產(chǎn)上推廣的抗蟲棉良種，其抗蟲性純度應(yīng)在95％以上，黃斑率應(yīng)控制在5％以內(nèi)。育種家掌握的原種純度則不低于99％。4、品系黃斑率與抗蟲性的相關(guān)分析
隨機(jī)選擇2000年抗蟲棉區(qū)試中的5個(gè)品系，分析結(jié)果表明，黃斑率與抗蟲性指數(shù)具有顯著的負(fù)相關(guān)(R＝-0.9562*)，即品系的黃斑率愈高，其抗蟲性愈差；反之亦然。當(dāng)品系的黃斑率在80％以上時(shí)，可以判斷該棉種基本上不再具有抗蟲性(見表4)，是一種不再具有商品價(jià)值退化的或摻雜的假抗蟲棉。
表4、黃斑率與抗蟲性相關(guān)分析注2000年江蘇省抗蟲棉區(qū)試的抗蟲性鑒定，依據(jù)室內(nèi)接蟲和田間罩籠接蛾二種方法。為了方便數(shù)學(xué)分析，我們把抗性指標(biāo)做如下數(shù)量化高抗-3；中抗-2；低抗-1；不抗-0。依據(jù)室內(nèi)接蟲和田間罩籠接蛾二種方法，對(duì)苗期室內(nèi)鑒定、蕾鈴期田間罩籠鑒定結(jié)果，按各品系的抗蟲性強(qiáng)弱進(jìn)行數(shù)量定級(jí)，求得抗蟲性平均值，即抗蟲性指數(shù)。
除卡那霉素之外，采用其它氨基糖苷類抗生素，比如新霉素、巴龍霉素等，只要方法相同、浸種液的濃度適宜，也可以達(dá)到同樣的鑒定效果。有關(guān)實(shí)施情況不另一一舉例。參考文獻(xiàn)[1]Cousin YL，Lyon BR.Transformation of an Australian cottoncultivarprospects for cotton improvement through geneticsengineering.Aust.J Pl.Physiol.，1991，18(8)481-494[2]Benedict JH，et al.Behavior growth survival and plant injury byHeliothis viresences on transgenic Bt cotton..J Econ.Entomol.，1992，85589-593[3]賈士榮，郭三堆，安道昌.轉(zhuǎn)基因棉花.科學(xué)出版社.2001年版[4]李燕蛾等.轉(zhuǎn)基因棉花純度快速測(cè)定法.中國(guó)棉花，1998，25(8)14[5]祝建波等.轉(zhuǎn)基因棉花的田間篩選技術(shù)研究.棉花學(xué)報(bào)，2000，12(5)230-233[6]馬麗華等.轉(zhuǎn)Bt基因棉卡那霉素田間快速檢測(cè)法.中國(guó)棉花，2000，27(12)11-12[7]周玉等.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉田間快速鑒定方法研究.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，(1)48-49
權(quán)利要求
1、一種轉(zhuǎn)基因棉花種子純度鑒定方法。其特征在于包括以下步驟(1)配液用氨基糖苷類抗生素(卡那霉素、新霉素、巴龍霉素等)配制(5-15)×106單位/L濃度的浸種水溶液，浸種液體的用量是種子重量的3-5倍；(2)浸種將被測(cè)種子加浸種液體后充分搖勻，浸潤(rùn)于液體之中。浸種的時(shí)間為24小時(shí)左右，浸種溫度在25℃±2℃；(3)播種用淡水沙做為發(fā)芽床，沙的含水量以手捏成團(tuán)、松開即散為度，在塑料盤中先鋪一層約3厘米厚的沙層，在沙層上播種棉籽，然后蓋一層1厘米的沙層，插上標(biāo)簽，用透明的塑料袋封好；(4)出苗把塑料盤放在光線良好的環(huán)境中，保持出苗所需的濕度，日間溫度控制在25℃以上，夜間溫度不低于15℃；(5)考苗經(jīng)過7天左右，待棉苗子葉完全平展后，對(duì)棉苗進(jìn)行考察，數(shù)每個(gè)送檢樣品的總苗數(shù)與黃斑苗數(shù)，重復(fù)2次以上，求平均值，凡在子葉的耳基部出現(xiàn)黃斑，即判定為黃斑苗；(6)計(jì)算按以下算式計(jì)算抗蟲棉種子純度與黃斑率1)抗蟲棉種子純度＝(總苗數(shù)-黃斑苗數(shù))/總苗數(shù)×100％2)黃斑率＝黃斑苗數(shù)/總苗數(shù)×100％。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因棉花種子純度鑒定方法，其特征在于所述氨基糖苷類抗生素為卡那霉素，濃度為107單位/L。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因棉花種子純度鑒定方法，其特征在于所述氨基糖苷類抗生素也可以是新霉素、巴龍霉素。
4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因棉花種子純度鑒定方法，其特征在于所述步驟(3)中淡水沙含水量為8.3％±0.6％。
5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因棉花種子純度鑒定方法，其特征在于所述步驟(4)把塑料盤放入種子溫光發(fā)芽箱中，發(fā)芽箱的溫度控制在27℃±2℃。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因棉花(包括雜交棉)種子純度鑒定方法，該方法通過用氨基糖苷類結(jié)構(gòu)抗生素(卡那霉素等)配制合適濃度的浸種水溶液，將被測(cè)種子浸泡后，以不含鹽份的淡水沙為發(fā)芽床，播種后保持發(fā)芽所需的溫濕度；經(jīng)過7天左右，棉苗子葉完全平展，對(duì)棉苗進(jìn)行考察計(jì)數(shù)，按黃斑率鑒定出種子純度。本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)條件要求簡(jiǎn)單，在發(fā)芽過程中不會(huì)出現(xiàn)種子因病菌感染造成霉變或因培養(yǎng)基組分造成爛根現(xiàn)象，試驗(yàn)無需對(duì)棉種進(jìn)行消毒，無需進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作，可直接用自來水配制浸種液體，特別適宜在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/00GK1394472SQ0111376
公開日2003年2月5日 申請(qǐng)日期2001年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月10日
發(fā)明者陳旭升, 狄佳春, 劉劍光, 許乃銀, 肖松華 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所