一種魔芋屬植物種質(zhì)資源鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明提出一種鑒定魔芋屬植物種質(zhì)資源的方法，該方法以固相微萃取氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(SPME–GC/MS)技術(shù)為基礎(chǔ)，以魔芋屬植物生殖器官——花序的附屬器分泌的氣味物質(zhì)為研究對象，通過優(yōu)化花期、萃取等條件，選擇性吸附揮發(fā)性成分，獲取其總離子流色譜圖(GC-MSTIC)，再比對標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫確定魔芋屬不同種花序主要揮發(fā)成分，根據(jù)峰值時間及相對含量，獲得不同魔芋種(species)相應(yīng)的特異圖譜。本發(fā)明的方法操作簡單、快捷而且準(zhǔn)確，重復(fù)性好，適用于魔芋種質(zhì)資源鑒定、品種選育。
【專利說明】一種魔芋屬植物種質(zhì)資源鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)研究育種領(lǐng)域，特別涉及一種魔芋屬植物種質(zhì)資源鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]魔芋屬天南星科魔芋屬多年生草本植物，是自然界中唯一能規(guī)?；@取魔芋葡甘聚糖(KGM)的植物，全球超過170種。魔芋是一種古老零星種植的作物，在我國規(guī)模化栽培和產(chǎn)業(yè)化起步較晚，缺乏系統(tǒng)研究，現(xiàn)主要依據(jù)魔芋球莖、葉柄、復(fù)葉、花序(包含佛焰苞、附屬器、雌花序、雄花序或中性花)的表觀形態(tài)分類，其分類受魔芋芋齡、生長環(huán)境的影響較大，故形態(tài)鑒定法不太可靠，近年分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，但在魔芋分類上的應(yīng)用較少，國外僅有少數(shù)人利用葉綠體基因標(biāo)記進(jìn)行魔芋的系統(tǒng)學(xué)分析，國內(nèi)僅張玉進(jìn)、張盛林等以中國的22個魔芋材料，運(yùn)用RAPD技術(shù)對魔芋屬部分野生種和栽培種進(jìn)行基因組的DNA多態(tài)性分析，探討魔芋屬內(nèi)種間及栽培種內(nèi)品種或系統(tǒng)間的親緣關(guān)系。由于魔芋種質(zhì)資源在進(jìn)化學(xué)說中處于較原始狀態(tài)，且其基因不純合，其種質(zhì)資源的研究利用較少，然而當(dāng)前魔芋的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用面臨市場需求倒逼市場供給，魔芋資源原料供不應(yīng)求，同時魔芋的畝產(chǎn)效益極高致使其成為山區(qū)高效特色農(nóng)業(yè)的重要成員之一，為農(nóng)村產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級、農(nóng)民的脫貧致富發(fā)揮日益巨大的作用，而有效的鑒定方法是魔芋分類學(xué)、魔芋雜交育種、魔芋高效定向育種的基礎(chǔ)。故而，建立科學(xué)可靠的種質(zhì)資源鑒定分類方法迫在眉睫且意義巨大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于建立一種魔芋屬植物種質(zhì)資源鑒定的方法，該方法通過固相微萃取及氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析各魔芋屬花揮發(fā)成分，利用其對應(yīng)圖譜來鑒定魔芋屬種質(zhì)資源，通過建立標(biāo)準(zhǔn)的鑒定比對圖譜，結(jié)果直觀可靠，同時用湖北清江花魔芋平行測定5次驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性，用較遠(yuǎn)地域的云南楚雄花魔芋對方法準(zhǔn)確性進(jìn)行印證。
[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0005]一種魔芋屬植物種質(zhì)資源鑒定的方法，具體包括以下步驟:
[0006](I)培養(yǎng)或收集魔芋屬開花種質(zhì)資源；
[0007](2)選擇魔芋屬種質(zhì)資源花序的附屬器作為鑒定取用材料的器官；
[0008](3)于開花時期取用材料；
[0009](4) 一定條件下提取魔芋屬種花揮發(fā)成分；
[0010](5)固相微萃取及吸附色譜柱的選擇；
[0011 ] (6) GC-MS測定條件的優(yōu)化；
[0012](7)將同一屬種多個重復(fù)測定的不同魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到同一屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊圖譜；
[0013](8)通過GC-MS聯(lián)用法分別對各屬種魔芋花提取的揮發(fā)成分進(jìn)行分析測定，獲取各GC-MS總離子流色譜圖；各屬種魔芋花提取的揮發(fā)成分各具有特異性離子流色譜圖；
[0014](9)分析GC-MS總離子流色譜圖色譜峰對應(yīng)的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)，并用面積歸一法測定其相對含量；各屬種魔芋花提取的揮發(fā)成分及相對含量不同；
[0015](10)將不同屬種魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到不同屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊對比圖譜，不同屬種魔芋揮發(fā)成分含量及圖譜不同，從而依據(jù)圖譜確定魔芋品種。
[0016]進(jìn)一步的，步驟(I)中，選取清江花魔芋、楚雄花魔芋、遠(yuǎn)雜I號、白魔芋、西盟魔芋、滇魔芋6種魔芋屬開花種質(zhì)資源。
[0017]進(jìn)一步的，步驟(3)中，取用時期為雌花期，雄花序未成熟，花序附屬器散發(fā)氣味最濃烈時；
[0018]進(jìn)一步的，步驟(4)中，具體條件為:取各新鮮采摘的魔芋花序附屬器2.0g于萃取瓶中，在40°C恒溫中頂空萃取30min。
[0019]進(jìn)一步的，步驟(5)中，根據(jù)不同極性吸附色譜柱對花魔芋揮發(fā)性成分測定效果，優(yōu)化選擇65 μ m PDMS/DVB固相微萃取頭。
[0020]進(jìn)一步的，步驟(6)中，氣質(zhì)聯(lián)用:美國安捷倫公司生產(chǎn):(Agilent)GC6890N氣相色譜儀_(Agilent)5975質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜條件:采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱，30mX0.25mmX0.25 μ m)、；離子源EI，電子能量70eV，離子源溫度230 °C，四極桿溫度150°C，進(jìn)樣口溫度為280°C ;轉(zhuǎn)接口溫度280°C，使用全掃描，載氣為高純氦氣，純度>99.999 %,不分流進(jìn)樣，流速lmL/min ;柱溫起始為40 °C,保持5min,以3 °C /min升至210°C，保持3min，再以15°C /min升至230°C，由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST05.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，確定其化學(xué)成分，同時采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)進(jìn)一步確定部分組分。
[0021]進(jìn)一步的，步驟(7)中，同一屬種進(jìn)行5株不同魔芋揮發(fā)成分及圖譜測定。
[0022]本發(fā)明代表人從中國湖北、云南、四川、陜西、重慶等西南山區(qū)采集了 7種魔芋，10幾個栽培地方品種，其中，測定中的清江花魔芋來源于湖北恩施州，楚雄花魔芋來源于云南省楚雄州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究推廣所，遠(yuǎn)雜I號為湖北省恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院魔芋所通過有性雜交創(chuàng)制，白魔芋、西盟魔芋和滇魔芋均采集于云南省野外。檢測鑒定由專業(yè)檢測技術(shù)人員和魔芋育種人員共同完成。
[0023]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:
[0024]1.本發(fā)明首先提供了一種準(zhǔn)確可靠快速的魔芋屬植物種質(zhì)資源鑒定的新方法，該方法不僅區(qū)別于形態(tài)鑒定的不準(zhǔn)確性，而且區(qū)別于遺傳分子鑒定的高花費(fèi)、耗時長。
[0025]2.本發(fā)明選擇的鑒定材料特殊，是植物器官進(jìn)化中穩(wěn)定性最好的有性器官——附屬器。這是本方法穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ)保障。
[0026]3.本發(fā)明中固相微萃頭為經(jīng)優(yōu)化的65μπι PDMS/DVB萃取頭，同時GC-MS測定中的色譜條件也經(jīng)過優(yōu)化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是5株清江花魔芋GC-MS重復(fù)測定圖(1、3_甲基-丁醇；2、二甲基寡硫醚；3、辛烷；4、二甲基三硫醚；5、i^一烷；6、十二烷；7、十三烷)
[0028]圖2是清江花魔芋GC-MS測定圖(1、3_甲基-丁醇；2、二甲基寡硫醚；3、辛烷；4、二甲基三硫醚；5、i^一烷；6、十二烷；7、十三烷；8、未知)
[0029]圖3是楚雄花魔芋GC-MS測定圖(1、3_甲基-丁醇；2、二甲基寡硫醚；3、辛烷；4、二甲基三硫醚；5、i^一烷；6、十二烷；7、十三烷；8、未知)
[0030]圖4是白魔芋GC-MS測定圖(1、硫代乙酸甲酯；2、二甲基寡硫醚；3、二甲基三硫醚；4、二甲基四硫醚)
[0031]圖5是遠(yuǎn)雜I號魔芋GC-MS測定圖(1、二甲基寡硫醚；2、二甲基三硫醚；3、二甲基四硫醚)
[0032]圖6是滇魔芋GC-MS測定圖(1、3_甲基-丁醇；2、辛烷；3、甲酸_3_甲基丁酯；4、甲酸-3-甲基丁酯；5、1_甲基苯甲醇；6、乙酸苯甲酯；7、乙酸-1-甲基苯甲酯)
[0033]圖7是西盟魔芋GC-MS測定圖(1、己烷；2、2_乙烯氧基乙醇；3、3_羥基_2_ 丁酮；4、3_甲基-丁醇；5、二甲基寡硫醚；6、辛烷；7、4_甲基戊醇；8、2_甲基丁酸乙酯；9、3_甲基丁酸乙酯；10、4_甲基戊酸甲酯；11、庚醛；12、4-甲基戊酸；13、4_甲基戊酸乙酯；14、二甲基三硫醚；15、庚醇；16、壬醛；17、壬醇；18、十五烷；19、丁羥甲苯)
[0034]圖8是不同種魔芋GC-MS測定圖。

【具體實(shí)施方式】
[0035]本專利鑒定過程簡單，方法直觀可靠，可通過標(biāo)準(zhǔn)圖譜直觀比較得出不同種魔芋花序附屬器揮發(fā)性成分特征，從而得出具體的魔芋種屬，同時，可重復(fù)性和穩(wěn)定性好，同種魔芋重復(fù)測定以及同種魔芋不同地方居群測定，均可得到相同的特征物質(zhì)，這表明方法的穩(wěn)定可靠。下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對發(fā)明方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述:
[0036]實(shí)施例1:如圖1所示，5株清江花魔芋GC-MS重復(fù)測定
[0037](I)收集和繁殖清江花魔芋開花種質(zhì)資源；
[0038](2)魔芋花序器官如花葶、佛焰苞、附屬器、雄花序、雌花序、中性花等部位中，選擇花株雌花期，雄花序未成熟，附屬器散發(fā)氣味最濃烈時附屬器為研究材料；
[0039](3)取新鮮采摘的魔芋花序附屬器2.0g于萃取瓶中，在40°C恒溫中頂空萃取30min,固相微萃取經(jīng)優(yōu)化選用65 μ m PDMS/DVB萃取頭；
[0040](4)氣質(zhì)聯(lián)用:美國安捷倫公司生產(chǎn):(Agilent)GC6890N氣相色譜儀- (Agilent) 5975質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件:采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m);離子源EI，電子能量70eV，離子源溫度230 °C，四極桿溫度150°C，進(jìn)樣口溫度為280°C ;轉(zhuǎn)接口溫度280°C，使用全掃描，載氣為高純氦氣，純度>99.999 %,不分流進(jìn)樣，流速lmL/min ;柱溫起始為40 °C,保持5min,以3 °C /min升至2100C，保持3min，再以15°C /min升至230°C。由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST05.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，確定其化學(xué)成分，同時采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量(組分峰面積占總峰面積的百分比)，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)進(jìn)一步確定部分組分；
[0041](5)將同一屬種不同魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到同一屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊圖譜；
[0042](6)五種清江花魔芋種均具有1、3_甲基-丁醇；2、二甲基寡硫醚；3、辛烷；4、二甲基二硫釀；5、十一燒；6、十_.燒;7、十二燒等七種特征物質(zhì)。
[0043]實(shí)施例2:如圖2所示，清江花魔芋(湖北恩施地方花魔芋品種)GC-MS測定
[0044](I)收集和繁殖清江花魔芋開花種質(zhì)資源；
[0045](2)魔芋花序器官如花葶、佛焰苞、附屬器、雄花序、雌花序、中性花等部位中，選擇花株雌花期，雄花序未成熟，附屬器散發(fā)氣味最濃烈時附屬器為研究材料；
[0046](3)取新鮮采摘的魔芋花序附屬器2.0g于萃取瓶中，在40°C恒溫中頂空萃取30min,固相微萃取經(jīng)優(yōu)化選用65 μ m PDMS/DVB萃取頭；
[0047](4)氣質(zhì)聯(lián)用:美國安捷倫公司生產(chǎn):(Agilent)GC6890N氣相色譜儀- (Agilent) 5975質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件:采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m);離子源EI，電子能量70eV，離子源溫度230 °C，四極桿溫度150°C，進(jìn)樣口溫度為280°C ;轉(zhuǎn)接口溫度280°C，使用全掃描，載氣為高純氦氣，純度>99.999 %,不分流進(jìn)樣，流速lmL/min ;柱溫起始為40 °C,保持5min,以3 °C /min升至2100C，保持3min，再以15°C /min升至230°C。由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST05.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，確定其化學(xué)成分，同時采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量(組分峰面積占總峰面積的百分比)，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)進(jìn)一步確定部分組分；
[0048](5)將同一屬種不同魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到同一屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊圖譜；
[0049](6)清江花魔芋標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中具有1、3_甲基-丁醇；2、二甲基寡硫醚；3、辛烷；4、_■甲基二硫釀；5、十一燒；6、十_.燒;7、十二燒；8、未知等八種特征物質(zhì)。
[0050]實(shí)施例3:如圖3所示，楚雄花魔芋(云南楚雄花魔芋地方品種)GC-MS測定
[0051](I)收集和繁殖楚雄花魔芋開花種質(zhì)資源；
[0052](2)魔芋花序器官如花葶、佛焰苞、附屬器、雄花序、雌花序、中性花等部位中，選擇花株雌花期，雄花序未成熟，附屬器散發(fā)氣味最濃烈時附屬器為研究材料；
[0053](3)取新鮮采摘的魔芋花序附屬器2.0g于萃取瓶中，在40°C恒溫中頂空萃取30min,固相微萃取經(jīng)優(yōu)化選用65 μ m PDMS/DVB萃取頭；
[0054](4)氣質(zhì)聯(lián)用:美國安捷倫公司生產(chǎn):(Agilent)GC6890N氣相色譜儀- (Agilent) 5975質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件:采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m);離子源EI，電子能量70eV，離子源溫度230 °C，四極桿溫度150°C，進(jìn)樣口溫度為280°C ;轉(zhuǎn)接口溫度280°C，使用全掃描，載氣為高純氦氣，純度>99.999 %,不分流進(jìn)樣，流速lmL/min ;柱溫起始為40 °C,保持5min,以3 °C /min升至2100C，保持3min，再以15°C /min升至230°C。由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST05.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，確定其化學(xué)成分，同時采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量(組分峰面積占總峰面積的百分比)，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)進(jìn)一步確定部分組分；
[0055](5)將同一屬種不同魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到同一屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊圖譜；
[0056](6)楚雄花魔芋標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中具有1、3_甲基-丁醇；2、二甲基寡硫醚；3、辛烷；4、_■甲基二硫釀；5、十一燒；6、十_.燒;7、十二燒；8、未知等八種特征物質(zhì)。
[0057]實(shí)施例4:如圖4所示，白魔芋GC-MS測定
[0058](I)收集和繁殖白魔芋開花種質(zhì)資源；
[0059](2)魔芋花序器官如花葶、佛焰苞、附屬器、雄花序、雌花序、中性花等部位中，選擇花株雌花期，雄花序未成熟，附屬器散發(fā)氣味最濃烈時附屬器為研究材料；
[0060](3)取新鮮采摘的魔芋花序附屬器2.0g于萃取瓶中，在40°C恒溫中頂空萃取30min,固相微萃取經(jīng)優(yōu)化選用65 μ m PDMS/DVB萃取頭；
[0061](4)氣質(zhì)聯(lián)用:美國安捷倫公司生產(chǎn):(Agilent)GC6890N氣相色譜儀- (Agilent) 5975質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件:采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m);離子源EI，電子能量70eV，離子源溫度230 °C，四極桿溫度150°C，進(jìn)樣口溫度為280°C ;轉(zhuǎn)接口溫度280°C，使用全掃描，載氣為高純氦氣，純度>99.999 %,不分流進(jìn)樣，流速lmL/min ;柱溫起始為40 °C,保持5min,以3 °C /min升至2100C，保持3min，再以15°C /min升至230°C。由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST05.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，確定其化學(xué)成分，同時采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量(組分峰面積占總峰面積的百分比)，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)進(jìn)一步確定部分組分；
[0062](5)將同一屬種不同魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到同一屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊圖譜；
[0063](6)白魔芋標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中具有1、硫代乙酸甲酯；2、二甲基寡硫醚；3、二甲基三硫醚；4、二甲基四硫醚等四種特征物質(zhì)。
[0064]實(shí)施例5:如圖5所示，遠(yuǎn)雜I號魔芋(花魔芋X白魔芋)GC-MS測定
[0065](I)收集和繁殖遠(yuǎn)雜I號魔芋開花種質(zhì)資源；
[0066](2)魔芋花序器官如花葶、佛焰苞、附屬器、雄花序、雌花序、中性花等部位中，選擇花株雌花期，雄花序未成熟，附屬器散發(fā)氣味最濃烈時附屬器為研究材料；
[0067](3)取新鮮采摘的魔芋花序附屬器2.0g于萃取瓶中，在40°C恒溫中頂空萃取30min,固相微萃取經(jīng)優(yōu)化選用65 μ m PDMS/DVB萃取頭；
[0068](4)氣質(zhì)聯(lián)用:美國安捷倫公司生產(chǎn):(Agilent)GC6890N氣相色譜儀- (Agilent) 5975質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件:采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m);離子源EI，電子能量70eV，離子源溫度230 °C，四極桿溫度150°C，進(jìn)樣口溫度為280°C ;轉(zhuǎn)接口溫度280°C，使用全掃描，載氣為高純氦氣，純度>99.999 %,不分流進(jìn)樣，流速lmL/min ;柱溫起始為40 °C,保持5min,以3 °C /min升至2100C，保持3min，再以15°C /min升至230°C。由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST05.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，確定其化學(xué)成分，同時采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量(組分峰面積占總峰面積的百分比)，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)進(jìn)一步確定部分組分；
[0069](5)將同一屬種不同魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到同一屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊圖譜；
[0070](6)遠(yuǎn)雜I號魔芋標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中具有1、二甲基寡硫醚；2、二甲基三硫醚；3、二甲基四硫醚等三種特征物質(zhì)。
[0071 ] 實(shí)施例6:如圖6所示，滇魔芋GC-MS測定
[0072](I)收集和繁殖滇魔芋開花種質(zhì)資源；
[0073](2)魔芋花序器官如花葶、佛焰苞、附屬器、雄花序、雌花序、中性花等部位中，選擇花株雌花期，雄花序未成熟，附屬器散發(fā)氣味最濃烈時附屬器為研究材料；
[0074](3)取新鮮采摘的魔芋花序附屬器2.0g于萃取瓶中，在40°C恒溫中頂空萃取30min,固相微萃取經(jīng)優(yōu)化選用65 μ m PDMS/DVB萃取頭；
[0075](4)氣質(zhì)聯(lián)用:美國安捷倫公司生產(chǎn):(Agilent)GC6890N氣相色譜儀- (Agilent) 5975質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件:采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m);離子源EI，電子能量70eV，離子源溫度230 °C，四極桿溫度150°C，進(jìn)樣口溫度為280°C ;轉(zhuǎn)接口溫度280°C，使用全掃描，載氣為高純氦氣，純度>99.999 %,不分流進(jìn)樣，流速lmL/min ;柱溫起始為40 °C,保持5min,以3 °C /min升至2100C，保持3min，再以15°C /min升至230°C。由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST05.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，確定其化學(xué)成分，同時采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量(組分峰面積占總峰面積的百分比)，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)進(jìn)一步確定部分組分；
[0076](5)將同一屬種不同魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到同一屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊圖譜；
[0077](6)滇魔芋標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中具有1、3_甲基-丁醇；2、辛烷；3、甲酸-3-甲基丁酯；4、甲酸-3-甲基丁酯；5、1_甲基苯甲醇；6、乙酸苯甲酯；7、乙酸-1-甲基苯甲酯等七種特征物質(zhì)。
[0078]實(shí)施例7:如圖7所示，西盟魔芋GC-MS測定
[0079](I)收集和繁殖西盟魔芋開花種質(zhì)資源；
[0080](2)魔芋花序器官如花葶、佛焰苞、附屬器、雄花序、雌花序、中性花等部位中，選擇花株雌花期，雄花序未成熟，附屬器散發(fā)氣味最濃烈時附屬器為研究材料；
[0081](3)取新鮮采摘的魔芋花序附屬器2.0g于萃取瓶中，在40°C恒溫中頂空萃取30min,固相微萃取經(jīng)優(yōu)化選用65 μ m PDMS/DVB萃取頭；
[0082](4)氣質(zhì)聯(lián)用:美國安捷倫公司生產(chǎn):(Agilent)GC6890N氣相色譜儀- (Agilent) 5975質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件:采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m);離子源EI，電子能量70eV，離子源溫度230 °C，四極桿溫度150°C，進(jìn)樣口溫度為280°C ;轉(zhuǎn)接口溫度280°C，使用全掃描，載氣為高純氦氣，純度>99.999 %,不分流進(jìn)樣，流速lmL/min ;柱溫起始為40 °C,保持5min,以3 °C /min升至2100C，保持3min，再以15°C /min升至230°C。由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST05.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，確定其化學(xué)成分，同時采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量(組分峰面積占總峰面積的百分比)，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)進(jìn)一步確定部分組分；
[0083](5)將同一屬種不同魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到同一屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊圖譜；
[0084](6)西盟魔芋標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中具有1、己烷；2、2_乙烯氧基乙醇；3、3_羥基-2-丁酮；4、3_甲基-丁醇；5、二甲基寡硫醚；6、辛烷；7、4_甲基戊醇；8、2_甲基丁酸乙酯；9、3-甲基丁酸乙酯；10、4-甲基戊酸甲酯；11、庚醛；12、4_甲基戊酸；13、4_甲基戊酸乙酯；14、二甲基三硫醚；15、庚醇；16、壬醛；17、壬醇；18、十五烷；19、丁羥甲苯等十九種特征物質(zhì)。
[0085]實(shí)施例8:如圖8所示，不同種魔芋GC-MS測定
[0086](I)通過GC-MS聯(lián)用法分別對各屬種魔芋花提取的揮發(fā)成分進(jìn)行分析測定，獲取各GC-MS總離子流色譜圖；
[0087](2)分析GC-MS總離子流色譜圖色譜峰對應(yīng)的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)，并用面積歸一法測定其相對含量；
[0088](3)將不同屬種魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到不同屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊對比圖譜。
[0089]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種魔芋屬植物種質(zhì)資源鑒定的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)培養(yǎng)或收集魔芋屬開花種質(zhì)資源； (2)選擇魔芋屬種質(zhì)資源花序的附屬器作為鑒定取用材料的器官； (3)于開花時期取用材料； (4)一定條件下提取魔芋屬種花揮發(fā)成分； (5)固相微萃取及吸附色譜柱的選擇； (6)GC-MS測定條件的優(yōu)化； (7)將同一屬種多個重復(fù)測定的不同魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到同一屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊圖譜； (8)通過GC-MS聯(lián)用法分別對各屬種魔芋花提取的揮發(fā)成分進(jìn)行分析測定，獲取各GC-MS總離子流色譜圖；各屬種魔芋花提取的揮發(fā)成分各具有特異性離子流色譜圖； (9)分析GC-MS總離子流色譜圖色譜峰對應(yīng)的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)，并用面積歸一法測定其相對含量；各屬種魔芋花提取的揮發(fā)成分及相對含量不同； (10)將不同屬種魔芋植株花揮發(fā)成分離子流色譜圖建立在一張色譜圖上，得到不同屬種魔芋揮發(fā)成分及重疊對比圖譜，不同屬種魔芋揮發(fā)成分含量及圖譜不同，從而依據(jù)圖譜確定魔宇品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，選取清江花魔芋、楚雄花魔芋、遠(yuǎn)雜I號、白魔芋、西盟魔芋、滇魔芋6種魔芋屬開花種質(zhì)資源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，取用時期為雌花期，雄花序未成熟，花序附屬器散發(fā)氣味最濃烈時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，具體條件為:取各新鮮采摘的魔芋花序附屬器2.0g于萃取瓶中，在40°C恒溫中頂空萃取30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，根據(jù)不同極性吸附色譜柱對花魔芋揮發(fā)性成分測定效果，優(yōu)化選擇65 μ m PDMS/DVB固相微萃取頭。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)中，氣質(zhì)聯(lián)用:美國安捷倫公司生產(chǎn):(Agilent) GC6890N氣相色譜儀-(Agilent) 5975質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜條件:采用HP-5MS彈性石央毛細(xì)管柱，30mX 0.25rnrnX 0.25 u rn) > ;尚子源EI，電子日8里70eV，尚子源溫度230°C，四極桿溫度150°C，進(jìn)樣口溫度為280°C ;轉(zhuǎn)接口溫度280°C，使用全掃描，載氣為高純氦氣，純度>99.999%，不分流進(jìn)樣，流速lmL/min ;柱溫起始為40°C，保持5min，以3°C /min升至210°C，保持3min，再以15°C /min升至230°C，由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST05.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索，確定其化學(xué)成分，同時采用峰面積歸一化法定量，得到各組分的相對含量，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)進(jìn)一步確定部分組分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(7)中，同一屬種進(jìn)行5株不同魔芋揮發(fā)成分及圖譜測定。
【文檔編號】G01N30/02GK104198604SQ201410443194
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】劉二喜, 馬作江, 楊朝柱, 鄭小江, 陳勇, 鄧明才, 盛德賢, 潘婭妮, 降巧龍, 牟方貴, 趙青華, 覃宇, 謝玲玲, 劉小芳, 胡永忠 申請人:恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院