專(zhuān)利名稱(chēng)：一種桑黃粗多糖的提取方法及桑黃多糖的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物有效成分提取領(lǐng)域，具體涉及一種桑黃粗多糖的提取方 法及桑黃多糖的純化方法。
技術(shù)背景桑黃(Phellinus linteus)，寄生于楊、賴(lài)卩、樺、櫟、松等樹(shù)木之上，分 布廣泛，是東方人(尤其是中國(guó)、韓國(guó)和日本等)的傳統(tǒng)中藥。近年來(lái)，日本、 韓國(guó)相繼對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)，它是目前國(guó)際公認(rèn)的生物抗癌領(lǐng)域中藥效非常好的藥 用真菌，抗癌效果比靈芝、加里斯茸、PL— 2、 PL— 5 ( MeSima)好，已成 為藥用真菌研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。目前已確認(rèn)桑黃的功效主要來(lái)自于桑黃多糖 (polysaccharide from Phellinus linteus)， 其藥理作用如下1、 抗癌早在1968年，日本人科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，桑黃野生子實(shí)體的提取物 對(duì)小鼠肉瘤S180的抑制率為95. 7%，并發(fā)現(xiàn)桑黃中發(fā)揮抗癌作用的物質(zhì)為 多糖。目前，大量的研究結(jié)果表明桑黃多糖能有效抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和防止其轉(zhuǎn) 移是通過(guò)細(xì)胞調(diào)節(jié)和體液免疫而起作用的。桑黃多糖是目前所知抗癌效果最顯 著的多糖，并且對(duì)正常成纖維細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒作用。因此，可以說(shuō)桑黃多糖可 能是化學(xué)方法抗癌的又一個(gè)理想藥物。2、 抗纖維化第二軍醫(yī)大學(xué)對(duì)桑黃抗纖維化作用迸行了試驗(yàn)研究.結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑黃能顯著降低肝纖維化大鼠血清氨基酸轉(zhuǎn)移酶水平和血清膠原成分的含量。并且病理組織觀察顯示桑黃對(duì)肝細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，同時(shí)抑制纖維 組織增生，阻止肝纖維化的形成與發(fā)展。3、 抗氧化韓國(guó)部學(xué)者研究了桑黃乙酸乙酯浸提物的抗氧化作用，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)對(duì)超氧陰離子的清除、抗壞血酸引起油脂氧化的抑制、過(guò)氧化物和一氧 化氮的清除有很好的效果。4、 其他藥理作用研究發(fā)現(xiàn)桑黃提取物還具有抗菌、消炎作用，并且還發(fā)現(xiàn)了該提取物還具有鎮(zhèn)痛作用。目前市場(chǎng)上主要產(chǎn)品包括桑黃多糖、桑黃子實(shí)體超細(xì)粉末、桑黃純菌絲體粉末等。桑黃子實(shí)體質(zhì)地較硬，成份復(fù)雜，致使多糖分離純化較為困難。因此， 桑黃樣品需經(jīng)過(guò)一定的前處理得到粗多糖提取物，之后進(jìn)入逆流色譜進(jìn)行進(jìn) 一步純化。傳統(tǒng)的樣品前處理主要是采用水煮方法，萃取時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6小時(shí)以 上，耗能高，且粗多糖的得率低，僅為生藥的2% 。然后粗桑黃多糖經(jīng)凝膠 過(guò)濾技術(shù)進(jìn)行提純，過(guò)程繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，而且產(chǎn)品純度低， 一般在25%左右， 作為藥物制劑需要更高純度的桑黃多糖產(chǎn)品。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是公開(kāi)一種桑黃粗多糖提取物的提取方法 以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的桑黃粗多糖得率低的技術(shù)缺陷。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題之二是公開(kāi)一種高效逆流色譜制備桑黃多糖的 方法以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的桑黃多糖純度低的技術(shù)缺陷。發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，用超聲萃取方法制備桑黃粗多糖，不僅縮短 了萃取時(shí)間、而且大大提高了桑黃粗多糖的得率。進(jìn)而，發(fā)明人采用高速逆流 色譜方法實(shí)現(xiàn)了快速純化桑黃多糖，大大提高了桑黃多糖的純度。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供了 一種從桑黃子實(shí)體制備桑黃粗多糖提取物的方法，包括將桑黃 子實(shí)體粉碎、萃取、離心、醇沉淀、洗滌、干燥的步驟，其中所述的萃取為超聲萃取。優(yōu)選地， 一種從桑黃子實(shí)體制備桑黃粗多糖提取物的方法，其中將粉碎的桑 黃子實(shí)體和去離子水混合，超聲萃取的條件為粉碎的桑黃子實(shí)體去離子水=1:4~8、超聲溫度50 7()GC、超聲時(shí)間20 40min、工作2秒、停3秒，超聲功率 800 1200W;離心收集上清，沉淀按照上述超聲萃取條件重復(fù)一次，離心收集 上清，合并兩次的上清液即為桑黃多糖的萃取液。更優(yōu)選地， 一種從桑黃子實(shí)體制備桑黃粗多糖提取物的方法，其中將粉碎的 桑黃子實(shí)體和去離子水混合，超聲萃取的條件為料液比桑黃子實(shí)體去離子水 =1:6、超聲溫度6(A:、超聲時(shí)間30min、工作2秒、停3秒，超聲功率1000W;離 心收集上清，沉淀按照上述超聲萃取條件重復(fù)一次，離心收集上清，合并兩次 的上清液即為桑黃多糖的萃取液。桑黃子實(shí)體的粉碎方法在本領(lǐng)域是常用技術(shù)，如用高速中藥粉碎機(jī)粉碎桑黃 子實(shí)體，粉碎至本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的粒度即可，如粉碎至40 80目。用醇沉淀法沉淀萃取液中的桑黃多糖，醇沉淀前將萃取液濃縮，如用旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀濃縮之， 一般地濃縮到原體積的1/3，加入三倍體積的無(wú)水乙醇、靜置2小時(shí) 4小時(shí)，離心收集沉淀，然后經(jīng)過(guò)將沉淀溶于去離子水，置于切割分子量1000Da 的半透膜中對(duì)去離子水透析24小時(shí)，真空干燥即得桑黃粗多糖提取物。桑黃豐羊品來(lái)、源包括/V2e/Z/"MS/gw/an'ws、戶(hù)/ e〃/wws//w/ews、 _P/2e〃/"iAs 6awm//， 這三種真菌藥用價(jià)值相同或相似。所需設(shè)備包括高速中藥粉碎機(jī)(粉碎細(xì)度10-120目)、超聲波萃取器(復(fù)頻共振式)、高速離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空干燥箱。本發(fā)明提供了一種從桑黃粗多糖提取物純化桑黃多糖的方法，其特征在于， 用高速逆流色譜法從桑黃粗多糖提取物中純化桑黃多糖。優(yōu)選的從桑黃粗多糖提取物純化桑黃多糖的方法，其特征在于，用18XPEG1000， 14%KPi(PH 6.8)的 水性二相系統(tǒng)作高速逆流色譜的介質(zhì)。更優(yōu)選的從桑黃粗多糖提取物純化桑黃多糖的方法，其特征在于包括如下 步驟，(l)水性二相系統(tǒng)配制取聚乙二醇(PEG1000) 180g， K2HP04 70g， KH2P04 70 g，蒸餾水680 g于分液漏斗中，溶解，搖勻后靜置.即得18XPEG1000， 14%KPi(pH 6.8)的水性二相系統(tǒng)1000g，分成上層溶液和下層溶液，以下相為固定相，上相 為流動(dòng)相；(2)HS-CCC法分離桑黃多糖將固定相充實(shí)整個(gè)螺旋柱后，開(kāi)啟色譜 儀，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為600r/min，然后以lml / min的流速導(dǎo)入流動(dòng)相，待兩相達(dá)到平 衡后進(jìn)樣，樣品濃度為10mg桑黃粗多糖/ml水溶液，并以600r/min的轉(zhuǎn)速，用 流動(dòng)相以lml/min的流速進(jìn)行洗脫，每6ml收集一份洗脫液，將第26份至30份洗 脫液合并、冷凍干燥即得桑黃多糖。一種桑黃多糖的純化方法，包括如下步驟(a)從桑黃子實(shí)體制備桑黃粗 多糖提取物；和(b)用高速逆流色譜法從桑黃粗多糖提取物純化桑黃多糖。優(yōu)選的， 一種桑黃多糖的純化方法，包括如下步驟(a)從桑黃子實(shí)體制 備桑黃粗多糖提取物；和(b)用高速逆流色譜法從桑黃粗多糖提取物純化桑黃多 糖，其特征在于，步驟(a)包括將桑黃子實(shí)體粉碎、萃取、離心、醇沉淀、洗 滌、干燥的步驟，其中所述的萃取為超聲萃取，超聲萃取的條件是為粉碎的桑 黃子實(shí)體去離子水=1:4~8、超聲溫度50 7(^C、超聲時(shí)間20 40min、工作2秒、 停3秒，超聲功率800 1200W;離心收集上清，沉淀按照上述超聲萃取條件重復(fù) 一次，離心收集上清，合并兩次的上清液即為桑黃多糖的萃取液。更優(yōu)選的， 一種桑黃多糖的純化方法，包括如下步驟(a)從桑黃子實(shí)體 制備桑黃粗多糖提取物；和(b)用高速逆流色譜法從桑黃粗多糖提取物純化桑黃 多糖，其特征在于，步驟(a)包括將桑黃子實(shí)體粉碎、萃取、離心、醇沉淀、洗滌、干燥的步驟，其中所述的萃取為超聲萃取，超聲萃取的條件是為粉碎的桑黃子實(shí)體去離子水=1:4~8、超聲溫度50 7(^C、超聲時(shí)間20 40min、工作2秒、停3秒，超聲功率800 1200W;離心收集上清，沉淀按照上述超聲萃取條件重復(fù)一次，離心收集上清，合并兩次的上清液即為桑黃多糖的萃取液；步驟(b)包括(l)水性二相系統(tǒng)配制取180g聚乙二醇PEG1000， K2HP04 70g， KH2P04 70 g，蒸餾水680 g于分液漏斗中，溶解，搖勻后靜置.即得18XPEG1000， 14%KPi(pH6.8)的水性二相系統(tǒng)1000g，分成上層溶液和下層溶液，以下相為固定相，上相為流動(dòng)相；(2)HS-CCC法分離桑黃多糖將固定相充實(shí)整個(gè)螺旋柱后，開(kāi)啟色譜儀，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為600r/min，然后以lml / rain的流速導(dǎo)入流動(dòng)相，待兩相達(dá)到平衡后進(jìn)樣，樣品濃度為10mg桑黃粗多糖/ml水溶液，并以600r/min的轉(zhuǎn)速，用流動(dòng)相以lml/min的流速進(jìn)行洗脫，每6ml收集一份洗脫液，將第26份至30份洗脫液合并、冷凍干燥即得桑黃多糖。所需設(shè)備包括TBE-300A高速逆流色譜系統(tǒng)，配8823B^UV紫外檢測(cè)儀，按照設(shè)備廠家提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。桑黃多糖的測(cè)定方法在本領(lǐng)域是公知的，如硫酸-苯酚法(張惟杰，糖復(fù)合物 生化研究技術(shù)[M].杭州浙江大學(xué)出版社，1994: 202—212， 271. 339.)。本發(fā)明從桑黃子實(shí)體制備桑黃粗多糖提取物的方法具有顯著的技術(shù)效果:傳 統(tǒng)水煮方法制備桑黃粗多糖提取物的方法，萃取時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6小時(shí)以上，耗能高， 且粗多糖最高得率僅為生藥的2% ;而本法采用超聲波萃取法制備桑黃粗多糖 提取物，萃取時(shí)間縮短至l小時(shí)，耗能低，且產(chǎn)品得率高達(dá)生藥的6%以上。逆流色譜(High—speed Countercurrent Chromatography ， HSCCC)結(jié)合了液 液萃取和分配色譜的優(yōu)點(diǎn)，是一種不用任何固態(tài)載體或支撐的液液分配色譜技 術(shù)?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效的分離。與高效液相色譜(HPLC)不同的是，它不 需要固體支撐體，克服了固相載體帶來(lái)的樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點(diǎn)。因?yàn)橹苽淞看?，是一種理想的制備分離技術(shù)。本發(fā)明的桑黃多糖純化方法具有顯著的技術(shù)效果現(xiàn)有技術(shù)采用液液萃 取和凝膠過(guò)濾技術(shù)進(jìn)行提純，過(guò)程繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，而且產(chǎn)品純度低， 一般 在25%左右，本發(fā)明用逆流色譜技術(shù)純化桑黃多糖能夠顯著提高分離效率，較 之傳統(tǒng)的液液萃取和凝膠過(guò)濾技術(shù)具有純化時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并且 能夠大幅度提高產(chǎn)品純度。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中桑黃多糖純度達(dá)到75%以上。以下結(jié)合具體實(shí)施利進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是應(yīng)該理解，這些實(shí)施例都是 說(shuō)明性的。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例l將1000g桑黃子實(shí)體切成適當(dāng)小塊，放入高速中藥粉碎機(jī)中粉碎，粉碎細(xì)度 達(dá)到60目。將粉碎后的桑黃粉粒與6L去離子水混合，放在超聲波萃取器中進(jìn)行 超聲萃取。超聲溫度6()GC，超聲時(shí)間30min(工作2秒，停3秒)，超聲功率1000W。 5000rpm離心10min，將所得沉淀按照上述超聲萃取條件重新操作一遍。5000rpm， 離心10min，將兩次萃取并離心后所得上清液合并。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將萃取液濃 縮到原體積的1/3，向濃縮液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇。5000rpm，離心10min， 將所得沉淀放入膜切割分子量1000的透析袋中透析，采用流動(dòng)去離子水透析 24h， 50GC真空干燥。得到粗提物351g，多糖純度18.6%，粗多糖得率為生藥的 6.52% 。實(shí)施例2配制18XPEG1000， 14%KPi(pH 6.8)的水性二相系統(tǒng)，分成上層溶液和下層溶液，以下相為固定相，上相為流動(dòng)相。稱(chēng)取粗多糖提取物200mg，用流動(dòng)相 配成20ml的樣品溶液。將固定相充實(shí)HS-CCC整個(gè)螺旋柱后，開(kāi)啟色譜儀，調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)速為600r/min，然后以lml / min的流速導(dǎo)入流動(dòng)相，待兩相達(dá)到平衡后進(jìn)樣; 并以600r/min的轉(zhuǎn)速，用流動(dòng)相以lml / min的流速進(jìn)行洗脫，以每6ml收集一 份洗脫液，將第26份至30份洗脫液合并，凍干。測(cè)得所得產(chǎn)品多糖含量76.7%， 蛋白質(zhì)含量18.8% 。
權(quán)利要求
1.一種從桑黃子實(shí)體制備桑黃粗多糖提取物的方法，包括將桑黃子實(shí)體粉碎、萃取、離心、醇沉淀、洗滌、干燥的步驟，其特征在于所述的萃取為超聲萃取。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的從桑黃子實(shí)體制備桑黃粗多糖提取物的方法，其特征在于將粉碎的桑黃子實(shí)體和去離子水混合，超聲萃取的條件為粉碎的桑黃子實(shí)體去離子水=1:4 8、超聲溫度50 7(fC、超聲時(shí)間20 40min、工作2秒、停 3秒，超聲功率800 1200W;離心收集上清，沉淀按照上述超聲萃取條件重 復(fù)一次，離心收集上清，合并兩次的上清液即為桑黃多糖的萃取液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的從桑黃子實(shí)體制備桑黃粗多糖提取物的方法，其特征在于 將粉碎的桑黃子實(shí)體和去離子水混合，超聲萃取的條件為料液比桑黃子實(shí) 體去離子水=1:6、超聲溫度6(^C、超聲時(shí)間30min、工作2秒、停3秒，超 聲功率1000W;離心收集上清，沉淀按照上述超聲萃取條件重復(fù)一次，離心 收集上清，合并兩次的上清液即為桑黃多糖的萃取液。
4. 一種從桑黃粗多糖提取物純化桑黃多糖的方法，用高速逆流色譜法從桑黃粗 多糖提取物中純化桑黃多糖，其特征在于,用18XPEG1000， 14%KPi(pH 6.8) 的水性二相系統(tǒng)作高速逆流色譜的介質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的從桑黃粗多糖提取物純化桑黃多糖的方法，其特征在于，包 括如下步驟，(l)水性二相系統(tǒng)配制取聚乙二醇(PEG1000)180g， K2HP04 70g， KH2P04 70 g，蒸餾水680 g于分液漏斗中，溶解，搖勻后靜置.即得18XPEG1000， 14%KPi(pH 6.8)的水性二相系統(tǒng)1000g，分成上層溶液和下層溶液，以下相 為固定相，上相為流動(dòng)相；(2)HS-CCC法分離桑黃多糖將固定相充實(shí)整個(gè) 螺旋柱后，開(kāi)啟色譜儀，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為600r/min，然后以lml / min的流速導(dǎo) 入流動(dòng)相，待兩相達(dá)到平衡后進(jìn)樣，樣品濃度為10mg桑黃粗多糖/ml水溶液，并以600r/min的轉(zhuǎn)速，用流動(dòng)相以lml / min的流速進(jìn)行洗脫，每6ml收集一 份洗脫液，將第26份至30份洗脫液合并、冷凍干燥即得桑黃多糖。
6. —種桑黃多糖的純化方法，包括如下步驟(a)從桑黃子實(shí)體制備桑黃粗多 糖提取物；和(b)用高速逆流色譜法從桑黃粗多糖提取物純化桑黃多糖，其 特征在于，步驟(a)包括將桑黃子實(shí)體粉碎、萃取、離心、醇沉淀、洗滌、 干燥的步驟，其中所述的萃取為超聲萃取，超聲萃取的條件是為粉碎的桑黃 子實(shí)體去離子水=1:4~8、超聲溫度50 7()OC、超聲時(shí)間20 40min、工作2秒、 停3秒，超聲功率800 1200W;離心收集上清，沉淀按照上述超聲萃取條件 重復(fù)一次，離心收集上清，合并兩次的上清液即為桑黃多糖的萃取液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的桑黃多糖的純化方法，其特征在于，步驟(a)包括將桑黃 子實(shí)體粉碎、萃取、離心、醇沉淀、洗滌、干燥的步驟，其中所述的萃取為 超聲萃取，超聲萃取的條件是為粉碎的桑黃子實(shí)體去離子水=1:4~8、超聲 溫度50 7(^C、超聲時(shí)間20 40min、工作2秒、停3秒，超聲功率800 1200W; 離心收集上清，沉淀按照上述超聲萃取條件重復(fù)一次，離心收集上清，合并 兩次的上清液即為桑黃多糖的萃取液；和，步驟(b)包括(l)水性二相系統(tǒng) 配制取180g聚乙二醇PEG1000， K2HP04 70g， KH2P04 70 g，蒸餾水680 g于 分液漏斗中，溶解，搖勻后靜置.即得18MPEG1000， 14Q^KPi(pH 6.8)的水 性二相系統(tǒng)1000g，分成上層溶液和下層溶液，以下相為固定相，上相為流 動(dòng)相；(2)HS-CCC法分離桑黃多糖將固定相充實(shí)整個(gè)螺旋柱后，開(kāi)啟色譜 儀，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為600r/min，然后以lml / min的流速導(dǎo)入流動(dòng)相，待兩相達(dá) 到平衡后進(jìn)樣，樣品濃度為10mg桑黃粗多糖/ml水溶液，并以600r/min的轉(zhuǎn) 速，用流動(dòng)相以lml/min的流速進(jìn)行洗脫，每6ml收集一份洗脫液，將第26 份至30份洗脫液合并、冷凍干燥即得桑黃多糖。
全文摘要
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物有效成分提取領(lǐng)域，具體涉及一種桑黃粗多糖的提取方法及桑黃多糖的純化方法。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)一種桑黃粗多糖提取物的提取方法和一種高效逆流色譜制備桑黃多糖的方法。本發(fā)明用超聲萃取法從桑黃子實(shí)體中提取桑黃粗多糖，用高速逆流色譜法進(jìn)一步純化桑黃多糖。本發(fā)明的方法桑黃粗多糖的得率高，可達(dá)生藥的6％；而且進(jìn)一步純化桑黃多糖其純度大幅提高，達(dá)75％左右。
文檔編號(hào)A61P39/00GK101323648SQ200810041120
公開(kāi)日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者波 唐, 孫向軍, 許彥梅 申請(qǐng)人:上海璞誠(chéng)生物科技有限公司