桑黃菌絲體多糖、制備方法及其在抗腫瘤的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物開發(fā)領(lǐng)域，涉及桑黃菌絲體多糖在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，具 體是桑黃菌絲體多糖的制備及結(jié)構(gòu)和其可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。
【背景技術(shù)】
[0002] 桑黃（Phellinus igniarius)作為珍稀的藥用真菌，多糖為其主要活性成分，且由 于其良好的抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用而得到大量的關(guān)注。
[0003] 由于桑黃子實體特殊的生長環(huán)境和外部環(huán)境條件的限制，使得自然形成的桑黃子 實體很少，同時也給人工栽培加大了難度，造成桑黃資源的開發(fā)研宄緩慢。經(jīng)研宄發(fā)現(xiàn)，桑 黃菌絲體多糖在抗腫瘤方面和桑黃子實體具有相當(dāng)?shù)幕钚?。因此采用液體發(fā)酵，通過搖瓶 發(fā)酵得到桑黃（P. igniarius)菌絲體，并對桑黃菌絲體粗多糖進(jìn)行分離純化，得到純度較 高的桑黃菌絲體多糖。同時對其進(jìn)行活性研宄和結(jié)構(gòu)分析，使其能夠更好地應(yīng)用于保健品、 抗癌藥物治療的開發(fā)。
[0004] 本發(fā)明所涉及的桑黃（Phellinus igniarius)菌絲體均一多糖的結(jié)構(gòu)，迄今未見 相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明提供桑黃菌絲體均一多糖的制備及結(jié)構(gòu)分析，同時提供了桑黃菌絲體均一 多糖的抗腫瘤活性研宄。
[0006] 本發(fā)明所述的桑黃菌絲體均一多糖是從桑黃菌絲體中獲得，其一級結(jié)構(gòu)重復(fù)單元 如通式（1):
[0007]
[0008]
[0009] 其中，Glc代表葡萄糖，Rha代表鼠李糖，1，3, 4, 6代表取代基的位置。
[0010] 本發(fā)明的桑黃菌絲體均一多糖的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行：
[0011] 1)桑黃Phellinus igniarius菌種，菌株編號為5. 95,購于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，桑黃菌絲體搖瓶發(fā)酵顯示：在接種量10%，溫度 28°C，轉(zhuǎn)速135r/min，培養(yǎng)8天，得到桑黃菌絲體干重為4. 53g/L。
[0012] 2)桑黃菌絲體經(jīng)熱水提取，乙醇分級沉淀得到桑黃菌絲粗多糖IPS30、IPS60和 IPS80〇
[0013] 3)桑黃菌絲體粗多糖經(jīng)DESE-52纖維素離子交換柱分離和S印hacryl S-400 凝膠柱純化后得到桑黃菌絲體均一多糖IPSW-I、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4,且經(jīng) HPSEC-RI-MALLS 檢測分子量分別為 34. lkDa、17. 7kDa、15. IkDa 和 21. 7kDa。
[0014] 4)桑黃菌絲體均一多糖IPSW-I、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的紅外光譜分析表明 四種均一多糖均為α型D-葡萄吡喃糖。
[0015] 5)桑黃菌絲體均一多糖IPSW-I、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的氣相色譜顯示 IPSW-l、IPSW-2和IPSW-3都只包含葡萄糖，而IPSW-4含有鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和 半乳糖，摩爾比為 1. 29:1. 21:1. 0:43. 86:1. 86。
[0016] 6)桑黃菌絲體均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4高碘酸氧化、Smith降 解、甲基化和核磁共振分析顯示：IPSW-1主鏈為Glc (1 - 6)和Glc (1 - 3, 4)，非還原性末 端為61。；1卩51-2主鏈為61。（1 - 6)、61。（1 - 3,4)和61。（1 - 3,6)，端基為61(：;1?5評-3 主鏈為Glc (1 - 6)、Glc (1 - 3, 4)和Glc (1 - 3,6)，非還原性末端為Glc ;IPSW-4主鏈為 Glc(l - 6)和Glc(l - 3, 4)，支鏈為Rha(l - 2)，非還原性末端為Glc。
[0017] 7)MTT試驗結(jié)果顯示：桑黃菌絲體均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4對 體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞H印G2和腸癌細(xì)胞SW480的增殖具有顯著的抑制作用。
[0018] 包含本發(fā)明化合物的藥物可以作為單獨(dú)的抗腫瘤藥物使用，也可以與其它藥物聯(lián) 合使用。
[0019] 包含本發(fā)明化合物的藥物可以制成各種藥物劑型使用。
【附圖說明】
[0020] 圖1為均一多糖IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IPSW-4的紅外光譜圖。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1 :桑黃菌絲體的發(fā)酵
[0022] 種子液培養(yǎng) 250mL搖瓶中裝新鮮PDB培養(yǎng)基100mL，Phellinus igniarius NO. 5. 95 (CGMCC)菌種接活化后的平板母種5塊，每塊0. 25cm2。置于28°C、135r/min恒溫 搖床培養(yǎng)振蕩8天。
[0023] 上述的IL種子液培養(yǎng)基：200g/L馬鈴薯，葡萄糖20g/L，KH2P0 4lg/L、 MgSO4 · 7Η200· 5g/L。
[0024] 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 500mL搖瓶中裝新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基200mL，接種量10%，培養(yǎng)5天。 培養(yǎng)條件同種子液培養(yǎng)，得桑黃菌絲體。
[0025] 上述的IL發(fā)酵培養(yǎng)基：小麥粉51. 6g/L、麩皮13. 8g/L、桑枝粉10g/L、 KH2PO4O. 98g/L、MgSO4 · 7H20 0· 54g/L。
[0026] 實施例2 ;桑黃菌絲體多糖的提取、分離和純化
[0027] 桑黃菌絲體粗多糖的提取桑黃菌絲體用蒸餾水沖洗，凍干，粉碎，10倍體積乙醇 脫脂兩次。除去乙醇后得到的烘干的固體物加10倍體積的蒸餾水沸水浴提取3次，合并上 清液，減壓濃縮至1/4,加95%乙醇使乙醇最終濃度為30%，離心得到的沉淀凍干并命名為 IPS30，繼續(xù)加95 %乙醇使?jié)舛葹?0 %，得沉淀，命名為IPS60，重復(fù)，使乙醇濃度為80 %，沉 淀命名為IPS80。
[0028] 桑黃菌絲體多糖的分離純化分別取桑黃粗多糖IPS30、IPS60和IPS8010g，完全 溶解于20mL蒸餾水，上于已經(jīng)平衡好的DEAE-52纖維素離子交換柱，依次用蒸餾水，0. 1、 0. 2、0. 3、0. 4mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，自動收集器收集，苯酚硫酸法和示差折光 檢測器同步檢測，合并相同餾分，減壓濃縮，透析，冷凍干燥，獲得桑黃菌絲體多糖IPS30W、 IPS60W 和 IPS80W。IPS30W、IPS60W 和 IPS80W 復(fù)溶于蒸餾水，用 S印hacryl S-400 凝膠柱 層析（1.5X100cm)對離子交換柱分離出的餾分進(jìn)一步純化。蒸餾水洗脫，自動收集器收 集，RI和苯酚硫酸法同步檢測，合并相同餾分，減壓濃縮，冷凍干燥，得桑黃菌絲體純化多糖 IPSW-I、IPSW-2、IPSW-3 和 IPSW-4。
[0029] 桑黃菌絲體純化多糖的純度鑒定和分子量測定高效液相色譜儀（HPLC)聯(lián)合折 光示差檢測器（RI)和多角度光散射儀DAWN HELEOS- II進(jìn)行多糖的純度鑒定和分子量測 定，色譜柱：TSK-GEL 3000PW(7. 5X300mm)，流動相：0· lmol/L 的 NaCl 溶液，流速：0· 5mL/ min，柱溫：30°C。檢測結(jié)果表明，IPSW-1、IPSW-2、IPSW-3和IP