一種抗凝血黑莓籽多糖及其提取分離方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗凝血黑莓籽多糖及其提取分離方 法、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑莓沿//ws spp. Blackberry為薔薇科懸鉤子屬聚合果類植物，未作藥用，是世界 上新興的4種小果類果樹之一，原產(chǎn)北美，其果實酸甜可口，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價 值，除鮮食外還大部分制成速凍果、果汁、果酒和果醬等食品。文獻檢索發(fā)現(xiàn)對黑莓研究主 要集中在果實揮發(fā)油、黑莓籽油脂肪酸成分和黑莓葉、種子中黃酮、花色苷及維生素E含量 分析方面。
[0003] 黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工產(chǎn)品的副產(chǎn)物，含有約27. 14%的功能性油脂， 其中不飽和脂肪酸總量高達93. 55%，此外還有人體必需的氨基酸，在對抗動脈粥樣硬化、抗 糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、促進生長和智力發(fā)育等方面具有重要的作用。
[0004] 凝血的實質(zhì)是呈水溶性的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)樗胁蝗芙獾墓虘B(tài)纖維蛋白的過程， 是在內(nèi)源性或(和）外源性凝血途徑下產(chǎn)生凝血酶原激活物，在凝血因子的作用下產(chǎn)生凝血 酶，最后在凝血酶的作用下使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。PT主要反映的是外源性凝血途 徑中凝血因子I、II、V、VII、X的活性；APTT主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況，與VIII、X、XI、 XII等內(nèi)源性凝血因子活性有關(guān)；TT值是主要反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白程度的重要 指標(biāo)；FIB主要反映纖維蛋白原的含量。
[0005] 血栓形成是許多疾病如心肌梗死、缺血性卒死、深靜脈血栓等的基本病理過程，它 嚴(yán)重地危害著人類的健康，它的形成與血小板的聚集、粘附、內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)以及 纖維蛋白的形成密切相關(guān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查報告，由于動脈粥樣硬化導(dǎo)致的血栓 疾病引起的死亡已經(jīng)排到了第一位。動脈血栓是由于動脈粥樣硬化，斑塊不穩(wěn)定發(fā)生了斑 塊的破裂，使血液里的血小板發(fā)生聚集，激活了體內(nèi)的凝血系統(tǒng)，最后導(dǎo)致血栓形成。一旦 堵塞以后就會發(fā)生組織的缺血和壞死，產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。在動脈血栓性疾病的急性或特殊 狀態(tài)下，需要輔助使用抗凝血藥物，才能達到更好的抗血栓效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種從黑莓籽中提取的抗凝血黑莓籽多糖，同時提供該多 糖的提取分離方法、應(yīng)用。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 抗凝血黑莓籽多糖的提取分離方法，包括以下步驟：（1)將黑莓籽粉碎，室溫下用石油 醚脫脂3次，揮干溶劑石油醚后，藥渣用70 %乙醇提取3次，過濾，陰干殘渣，然后向殘渣中 按料液質(zhì)量體積比為20 mL/g的比例加入蒸餾水提?。?0 °C下提取3次，一次3 h)，趁熱 抽濾，合并濾液后減壓濃縮，再向濃縮液中加入95%乙醇調(diào)至乙醇的終濃度為70 %，4 °C靜 置24 h后離心（10000 r/min，10 min)，得到的沉淀加蒸餾水溶解透析（48 h，每4 h換一次 蒸餾水）以除去小分子雜質(zhì)，減壓濃縮，冷凍干燥即得黑莓籽粗多糖； (2) 取300 mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸餾水中，過濾，棄去雜質(zhì)后加入到DEAE-52 纖維素柱色譜（2. 5*60 cm)，依次用蒸餾水、0. lmol/L氯化鈉溶液和0. 2 mol/L氯化鈉溶液 進行洗脫，洗脫液采用苯酚-硫酸法進行檢測，測490 nm處的吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐 標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線（圖2)，合并同一洗脫峰的多糖樣品，透析、濃縮后冷凍 干燥；其中，蒸餾水洗脫峰為組分l，〇. 1 mol/L氯化鈉溶液的洗脫峰為組分2,0. 2 mol/L氯 化鈉溶液的洗脫峰為組分3 ; (3) 稱取70 mg的組分1溶于5mL蒸餾水中、過濾棄去雜質(zhì)，加入到SephadexG-100凝 膠柱色譜（1.5*100cm)，用蒸餾水進行洗脫(洗脫流速為0. 5 mL/min，每管2 mL)，采用苯 酚-硫酸法進行檢測，在波長490 nm處測其吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐 標(biāo)，繪制洗脫曲線（圖3)，得到兩組洗脫峰，濃縮第2組洗脫峰，冷凍干燥得到的多糖命名 為BSP-2 ;組分2和3均采用組分1的方法進行洗脫，得單一洗脫峰，分別命名為BSP-3和 BSP-4 ； BSP-2、BSP-3和BSP-4即為抗凝血黑莓籽多糖。
[0008] 其中DEAE-52纖維素柱色譜為：二乙氨基乙基型纖維素，是一種陰離子交換纖維 素，常用于多糖純化和分離。粗多糖溶液吸附于DEAE-52后，以不同離子強度的鹽進行洗 脫，根據(jù)多糖的離子交換能力差異進行分離。
[0009] 其中SephadexG-100凝膠柱色譜為：是一種半合成的凝膠，基本骨架是以葡萄糖 (右旋糖酐）為殘基的多糖，在鏈狀結(jié)構(gòu)間，以3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑，以醚橋相互 連接成為三維空間的網(wǎng)狀高分子化合物。
[0010] 利用上述提取分離方法得到的抗凝血黑莓籽多糖。
[0011] 抗凝血黑莓籽多糖在制備抗凝血藥物方面的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明采用特殊的提取分離方法從黑莓籽中分離得到多糖BSP-2、BSP-3和 BSP-4,并對這三個多糖的體外凝血效果進行考察，結(jié)果表明，這三個多糖均有良好的抗凝 血效果，且BSP-2和BSP-4的抗凝血效果比陽性對照燈盞花素好（K0. 001)，BSP-3的抗凝 血效果與陽性對照燈盞花素相當(dāng)（乃〇. 05)，可見，它們可以單獨或組合用于制備抗凝血劑。
【附圖說明】
[0013] 圖1為凝血機制圖； 圖2黑莓籽粗多糖DEAE-52洗脫曲線； 圖3組分1的SephadexG-100凝膠柱色譜洗脫曲線； 圖4組分2的SephadexG-100凝膠柱色譜洗脫曲線； 圖5組分3的SephadexG-100凝膠柱色譜洗脫曲線； 圖6標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的GC色譜圖； 圖7 BSP-2水解物GC色譜圖； 圖8 BSP-3水解物GC色譜圖； 圖9 BSP-4水解物GC色譜圖；
【具體實施方式】 以下通過【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再做進一步的詳細(xì)說明。
[0014] 黑莓籽購于河南省封丘縣黑莓種植基地，為薔薇科懸鉤子屬植物黑莓沿//W61 spp. Blackberry 軒。
[0015] 本文中的乙醇濃度均為體積濃度。
[0016] 1、抗凝血黑莓籽多糖的提取分離方法，包括以下步驟：（1)將黑莓籽粉碎，室溫下 用石油醚脫脂3次，揮干溶劑石油醚后，藥渣用70 %乙醇提取3次，過濾，陰干殘渣，然后向 殘渣中按料液質(zhì)量體積比為20 mL/g的比例加入蒸餾水提取，80 °C下提取3次，一次3 h， 趁熱抽濾，合并濾液后減壓濃縮，再向濃縮液中加入95%乙醇調(diào)至乙醇的終濃度為70 %，4 °C靜置24 h后離心（10000 r/min，10 min)，得到的沉淀加蒸餾水溶解透析（48 h，每4 h換 一次蒸餾水）以除去小分子雜質(zhì)，減壓濃縮，冷凍干燥即得黑莓籽粗多糖； (2) 取300 mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸餾水中，過濾，棄去雜質(zhì)后加入到DEAE-52 纖維素柱色譜（2. 5*60 cm)，依次用蒸餾水、0. lmol/L氯化鈉溶液和0. 2 mol/L氯化鈉溶液 進行洗脫，洗脫液采用苯酚-硫酸法進行檢測，測490 nm處的吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐 標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線（圖2)，合并同一洗脫峰的多糖樣品，透析、濃縮后冷凍 干燥；其中，蒸餾水洗脫峰為組分l，〇. 1 mol/L氯化鈉溶液的洗脫峰為組分2,0. 2 mol/L氯 化鈉溶液的洗脫峰為組分3 ; (3) 稱取70 mg的組分1溶于5mL蒸餾水中、過濾棄去雜質(zhì)，加入到SephadexG-100凝 膠柱色譜（1.5*100cm)，用蒸餾水進行洗脫(洗脫流速為0. 5 mL/min，每管2 mL)，采用苯 酚-硫酸法進行檢測，在波長490 nm處測其吸光度，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐 標(biāo)，繪制洗脫曲線（圖3)，得到兩組洗脫峰，濃縮第2組洗脫峰，冷凍干燥得到的構(gòu)成命名為 BSP-2 ;組分2和3均采用組分1的方法進行洗脫，得單一洗脫峰（圖4和5)，分別命名為 BSP-3和BSP-4 ;BSP-2、BSP-3和BSP-4即為抗凝血黑莓籽多糖。
[0017] 2抗凝血黑莓籽多糖（BSP-2、BSP-3、BSP-4)的分子量測定和組分分析： 2. 1、多糖樣品BSP-2、BSP-3和BSP-4送至北京市理化分析測試中心檢測，根據(jù)中華人 民共和國藥典（2010年版）二部附錄￥11(分子排阻色譜法）進行測定。85?-2、85?-3、85?-