一種抗凝血黑莓籽多糖及其提取分離方法、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物提取技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種抗凝血黑莓籽多糖及其提取分離方 法、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑莓沿//ws spp. Blackberry為薔薇科懸鉤子屬聚合果類植物,未作藥用,是世界 上新興的4種小果類果樹之一,原產(chǎn)北美,其果實酸甜可口,具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價 值,除鮮食外還大部分制成速凍果、果汁、果酒和果醬等食品。文獻檢索發(fā)現(xiàn)對黑莓研究主 要集中在果實揮發(fā)油、黑莓籽油脂肪酸成分和黑莓葉、種子中黃酮、花色苷及維生素E含量 分析方面。
[0003] 黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工產(chǎn)品的副產(chǎn)物,含有約27. 14%的功能性油脂, 其中不飽和脂肪酸總量高達93. 55%,此外還有人體必需的氨基酸,在對抗動脈粥樣硬化、抗 糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、促進生長和智力發(fā)育等方面具有重要的作用。
[0004] 凝血的實質(zhì)是呈水溶性的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)樗胁蝗芙獾墓虘B(tài)纖維蛋白的過程, 是在內(nèi)源性或(和)外源性凝血途徑下產(chǎn)生凝血酶原激活物,在凝血因子的作用下產(chǎn)生凝血 酶,最后在凝血酶的作用下使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白。PT主要反映的是外源性凝血途 徑中凝血因子I、II、V、VII、X的活性;APTT主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況,與VIII、X、XI、 XII等內(nèi)源性凝血因子活性有關(guān);TT值是主要反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白程度的重要 指標(biāo);FIB主要反映纖維蛋白原的含量。
[0005] 血栓形成是許多疾病如心肌梗死、缺血性卒死、深靜脈血栓等的基本病理過程,它 嚴(yán)重地危害著人類的健康,它的形成與血小板的聚集、粘附、內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)以及 纖維蛋白的形成密切相關(guān)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查報告,由于動脈粥樣硬化導(dǎo)致的血栓 疾病引起的死亡已經(jīng)排到了第一位。動脈血栓是由于動脈粥樣硬化,斑塊不穩(wěn)定發(fā)生了斑 塊的破裂,使血液里的血小板發(fā)生聚集,激活了體內(nèi)的凝血系統(tǒng),最后導(dǎo)致血栓形成。一旦 堵塞以后就會發(fā)生組織的缺血和壞死,產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。在動脈血栓性疾病的急性或特殊 狀態(tài)下,需要輔助使用抗凝血藥物,才能達到更好的抗血栓效果。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種從黑莓籽中提取的抗凝血黑莓籽多糖,同時提供該多 糖的提取分離方法、應(yīng)用。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案: 抗凝血黑莓籽多糖的提取分離方法,包括以下步驟:(1)將黑莓籽粉碎,室溫下用石油 醚脫脂3次,揮干溶劑石油醚后,藥渣用70 %乙醇提取3次,過濾,陰干殘渣,然后向殘渣中 按料液質(zhì)量體積比為20 mL/g的比例加入蒸餾水提?。?0 °C下提取3次,一次3 h),趁熱 抽濾,合并濾液后減壓濃縮,再向濃縮液中加入95%乙醇調(diào)至乙醇的終濃度為70 %,4 °C靜 置24 h后離心(10000 r/min,10 min),得到的沉淀加蒸餾水溶解透析(48 h,每4 h換一次 蒸餾水)以除去小分子雜質(zhì),減壓濃縮,冷凍干燥即得黑莓籽粗多糖; (2) 取300 mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸餾水中,過濾,棄去雜質(zhì)后加入到DEAE-52 纖維素柱色譜(2. 5*60 cm),依次用蒸餾水、0. lmol/L氯化鈉溶液和0. 2 mol/L氯化鈉溶液 進行洗脫,洗脫液采用苯酚-硫酸法進行檢測,測490 nm處的吸光度,以洗脫管數(shù)為橫坐 標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線(圖2),合并同一洗脫峰的多糖樣品,透析、濃縮后冷凍 干燥;其中,蒸餾水洗脫峰為組分l,〇. 1 mol/L氯化鈉溶液的洗脫峰為組分2,0. 2 mol/L氯 化鈉溶液的洗脫峰為組分3 ; (3) 稱取70 mg的組分1溶于5mL蒸餾水中、過濾棄去雜質(zhì),加入到SephadexG-100凝 膠柱色譜(1.5*100cm),用蒸餾水進行洗脫(洗脫流速為0. 5 mL/min,每管2 mL),采用苯 酚-硫酸法進行檢測,在波長490 nm處測其吸光度,以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐 標(biāo),繪制洗脫曲線(圖3),得到兩組洗脫峰,濃縮第2組洗脫峰,冷凍干燥得到的多糖命名 為BSP-2 ;組分2和3均采用組分1的方法進行洗脫,得單一洗脫峰,分別命名為BSP-3和 BSP-4 ; BSP-2、BSP-3和BSP-4即為抗凝血黑莓籽多糖。
[0008] 其中DEAE-52纖維素柱色譜為:二乙氨基乙基型纖維素,是一種陰離子交換纖維 素,常用于多糖純化和分離。粗多糖溶液吸附于DEAE-52后,以不同離子強度的鹽進行洗 脫,根據(jù)多糖的離子交換能力差異進行分離。
[0009] 其中SephadexG-100凝膠柱色譜為:是一種半合成的凝膠,基本骨架是以葡萄糖 (右旋糖酐)為殘基的多糖,在鏈狀結(jié)構(gòu)間,以3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑,以醚橋相互 連接成為三維空間的網(wǎng)狀高分子化合物。
[0010] 利用上述提取分離方法得到的抗凝血黑莓籽多糖。
[0011] 抗凝血黑莓籽多糖在制備抗凝血藥物方面的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明采用特殊的提取分離方法從黑莓籽中分離得到多糖BSP-2、BSP-3和 BSP-4,并對這三個多糖的體外凝血效果進行考察,結(jié)果表明,這三個多糖均有良好的抗凝 血效果,且BSP-2和BSP-4的抗凝血效果比陽性對照燈盞花素好(K0. 001),BSP-3的抗凝 血效果與陽性對照燈盞花素相當(dāng)(乃〇. 05),可見,它們可以單獨或組合用于制備抗凝血劑。
【附圖說明】
[0013] 圖1為凝血機制圖; 圖2黑莓籽粗多糖DEAE-52洗脫曲線; 圖3組分1的SephadexG-100凝膠柱色譜洗脫曲線; 圖4組分2的SephadexG-100凝膠柱色譜洗脫曲線; 圖5組分3的SephadexG-100凝膠柱色譜洗脫曲線; 圖6標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物的GC色譜圖; 圖7 BSP-2水解物GC色譜圖; 圖8 BSP-3水解物GC色譜圖; 圖9 BSP-4水解物GC色譜圖;
【具體實施方式】 以下通過【具體實施方式】,對本發(fā)明的上述內(nèi)容再做進一步的詳細(xì)說明。
[0014] 黑莓籽購于河南省封丘縣黑莓種植基地,為薔薇科懸鉤子屬植物黑莓沿//W61 spp. Blackberry 軒。
[0015] 本文中的乙醇濃度均為體積濃度。
[0016] 1、抗凝血黑莓籽多糖的提取分離方法,包括以下步驟:(1)將黑莓籽粉碎,室溫下 用石油醚脫脂3次,揮干溶劑石油醚后,藥渣用70 %乙醇提取3次,過濾,陰干殘渣,然后向 殘渣中按料液質(zhì)量體積比為20 mL/g的比例加入蒸餾水提取,80 °C下提取3次,一次3 h, 趁熱抽濾,合并濾液后減壓濃縮,再向濃縮液中加入95%乙醇調(diào)至乙醇的終濃度為70 %,4 °C靜置24 h后離心(10000 r/min,10 min),得到的沉淀加蒸餾水溶解透析(48 h,每4 h換 一次蒸餾水)以除去小分子雜質(zhì),減壓濃縮,冷凍干燥即得黑莓籽粗多糖; (2) 取300 mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸餾水中,過濾,棄去雜質(zhì)后加入到DEAE-52 纖維素柱色譜(2. 5*60 cm),依次用蒸餾水、0. lmol/L氯化鈉溶液和0. 2 mol/L氯化鈉溶液 進行洗脫,洗脫液采用苯酚-硫酸法進行檢測,測490 nm處的吸光度,以洗脫管數(shù)為橫坐 標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制洗脫曲線(圖2),合并同一洗脫峰的多糖樣品,透析、濃縮后冷凍 干燥;其中,蒸餾水洗脫峰為組分l,〇. 1 mol/L氯化鈉溶液的洗脫峰為組分2,0. 2 mol/L氯 化鈉溶液的洗脫峰為組分3 ; (3) 稱取70 mg的組分1溶于5mL蒸餾水中、過濾棄去雜質(zhì),加入到SephadexG-100凝 膠柱色譜(1.5*100cm),用蒸餾水進行洗脫(洗脫流速為0. 5 mL/min,每管2 mL),采用苯 酚-硫酸法進行檢測,在波長490 nm處測其吸光度,以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐 標(biāo),繪制洗脫曲線(圖3),得到兩組洗脫峰,濃縮第2組洗脫峰,冷凍干燥得到的構(gòu)成命名為 BSP-2 ;組分2和3均采用組分1的方法進行洗脫,得單一洗脫峰(圖4和5),分別命名為 BSP-3和BSP-4 ;BSP-2、BSP-3和BSP-4即為抗凝血黑莓籽多糖。
[0017] 2抗凝血黑莓籽多糖(BSP-2、BSP-3、BSP-4)的分子量測定和組分分析: 2. 1、多糖樣品BSP-2、BSP-3和BSP-4送至北京市理化分析測試中心檢測,根據(jù)中華人 民共和國藥典(2010年版)二部附錄¥11(分子排阻色譜法)進行測定。85?-2、85?-3、85?-