專利名稱：：重組人血管內皮抑制素在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物制品
技術領域：
，具體涉及重組人血管內皮抑制素的制藥用途，該藥物可用于各類實體腫瘤的治療。
背景技術：
：人血管內皮抑制素(endostatin)是膠原XVHI羧基端的一段分子量大小為20kDa的酶切產物，具有抑制血管內皮細胞增殖、遷移，和體內血管生成的活性，是目前已知最強的內源性血管形成抑制因子。重組人血管內皮抑制素是利用DNA重組工程技術，以原核或真核表達載體，將人血管內皮抑制素基因經克隆、表達和純化得到的有血管生成抑制活性形式的蛋白質。中國發(fā)明專利(專利公開號為CN1324818A,公開日為2001年12月5日，發(fā)明名稱為"生產內皮抑制素的方法")提供了一種改良的，以更高的產率和更簡單的純化工藝生產重組人內皮抑制素的方法。該發(fā)明利用DNA重組工程技術，以大腸桿菌表達系統(tǒng)，以簡單的方法和較低的成本大批量生產N末端帶有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加氨基酸序列的人血管內皮抑制素(其中Xaa代表中性氨基酸或不存在)，不4又保留了endostatin的完全的生物學活性，而且沒有產生因加入附加N端序列所致的體內免疫性。上述附加氨基酸序列不僅提高了內皮抑制素結構基因的轉錄和翻譯起始效率，有利于重組蛋白的純化，而且附加氨基酸序列的結構也增加了重組蛋白的穩(wěn)定性。惡性腫瘤是一類嚴重危害人類生命健康的常見病，目前用于胂瘤治療的主要手段有手術、放療、化療和生物治療?；熓且环N常規(guī)的全身性治療手段，選擇性差，在取得治療效果的同時常出現不同程度的毒副作用，長期使用易產生耐藥性而導致治療失敗。
發(fā)明內容腫瘤的生長明顯存在新生血管依賴性，腫瘤血管的發(fā)生依賴于血管內皮細胞的激活、增殖、吸附和成熟的過程。本發(fā)明基于肺瘤發(fā)生和發(fā)展的這個機制上考慮，如果能用某些治療手段特異性地抑制異位病灶新生血管的增殖，使得腫瘤組織得不到生長所必需的大量營養(yǎng)和氧氣，最后停止生長或壞死，因此可以開辟一種治療腫瘤的新的手段。為了克服胂瘤傳統(tǒng)化學療法毒副反應大、選擇性差的缺陷，本發(fā)明提供了重組人血管內皮抑制素的一種制藥用途，具體是使用重組人血管內皮抑制素制備治療胂瘤的藥物的制藥用途，該藥物具有特異性強、無毒、無耐藥性的優(yōu)點。本發(fā)明的技術解決方案涉及重組人血管內皮抑制素在制備治療肺瘤的藥物中的應用。本文中所述重組人血管內皮抑制素保留了endostatin的完全的生物學活性，可運用基因工程手段獲得，通過將人的血管內皮抑制素基因或將改構的人血管內皮抑制素基因構建到大腸桿菌(￡.Coh')或畢赤酵母(Pi'dn'apastoris)表達系統(tǒng)中，經過發(fā)酵、分離、純化等手段得到。本發(fā)明中優(yōu)選的重組人血管內皮抑制素是在人血管內皮抑制素編碼氨基酸序列的起始氨基酸Met后依次添加0-4個任意氨基酸和2-8個組氨,列。其制備方法同中國發(fā)明專利(專利公開號為CN1324818A,公開日為2001年12月5日，發(fā)明名稱為"生產內皮抑制素的方法，，)。上述重組人血管內皮抑制素的起始氨基酸Met可能被切除，原因是在表達宿主中蛋白翻譯后加工過程中可能被刪除。本發(fā)明優(yōu)選的重組人血管內皮抑制素的氨基酸序列如SEQIDN0:1所示，該序列和中國發(fā)明專利(專利公開號為CN1324818A)公開的SEQIDNO:2相同，該序列構成的蛋白質的制備方法和上述公開專利的制備實施例相同。上述治療肺瘤的藥物的制劑可以是注射液或凍干制劑。所述述藥物的活性組分可以是重組人血管內皮抑制素、PEG修飾的重組人血管內皮抑制素或重組人血管內皮抑制素微球。所述PEG的分子量是5000-30000，PEG通過共價鍵(如琥珀酰亞氨基或巰基)與重組人血管內皮抑制素相連。所述重組人血管內皮抑制素微球是通過基質材料與重組人血管內皮抑制素混合制備而成，其基質材料可以是聚乳酸羥基乙酸嵌段共聚物(PLGA),聚乙醇酸(PLA)等。上述治療胂瘤的藥物中還含有保護劑和PH值調節(jié)劑。所述保護劑選自多元醇、糖類、氨基酸、表面活性劑，人血白蛋白、EDTA和NaCl。所述藥物的PH值范圍是4.0-8.5。本發(fā)明中所述治療腫瘤的藥物可與肺瘤化療類藥物聯合應用，如與長春瑞濱(NVB,VinorelbineNavelbine)順粕(PDD,Cisplatin或Diamminedichloroplati畫)、紫杉醇(Paclitaxe,PTX)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、吉西他濱(Gemcitabine)等化療藥物聯用，也可以配合腫瘤術后的治療。本發(fā)明中所述腫瘤是實體瘤，這些實體瘤的組織及其外周存在新生血管的增殖。本發(fā)明還公開了一種治療肺瘤的重組人血管內皮抑制素注射液，其特征在于它是由重組人血管內皮抑制素和藥用輔料配制而成按每毫升注射液計含有重組人血管內皮抑制素lmg~20mg。所述藥用輔料優(yōu)選甘露醇，按每毫升注射液計含有10mg80mg;此外還可以添加PH調節(jié)劑，調節(jié)pH值為4.0~8.5。本發(fā)明的實施例中還公開了重組人血管內皮抑制素凍干制劑的制備工藝，該工藝制得的凍干制劑產品穩(wěn)定性好，能夠長期保存。凍干制劑使用時需要溶于注射用水中，使用量根據病變程度酌情使用。本發(fā)明適用于各種原因引起的實體腫瘤的治療，實體腫瘤包括但不限于肺癌、結腸癌、神經內分泌瘤、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、淋巴癌、食道癌、腎癌、膽管癌、惡性黑色素瘤、宮頸癌、鼻咽癌、肉瘤等等，治療劑量可根據病情或瘤體大小酌情加減，一般采用病變局部注射的方法應用。為了更好的說明本發(fā)明，下面結合藥物實驗、動物實驗以及臨床實驗說明其在制備治療腫瘤的藥物中的用途。在下文的實驗例以及制備實施例中所使用的重組人血管內皮抑制素具有SEQIDN0:1所示的氨基酸序列。如無特殊說明，下文中所涉及的實驗用材料均可通過商業(yè)途徑獲-{曰付。1、重組人血管內皮抑制素抑制黑色素瘤血管生成的實-瞼研究將低溫保存的B16惡性黑色素瘤組織于43。C左右的熱水中迅速升溫20-30s,然后按1000rpm離心10min,無菌棉絮吸取上清后，將瘤組織剪碎，加入生理鹽水制成瘤細胞懸液(細胞濃度lx107/ml),于鼠蹊部注射瘤細胞懸液O.2ml/只。觀察接種部位液體吸收、腫瘤生長過程及小鼠狀況，待腫瘤生長10d,采用抽簽法隨機分為三組，每組20只，于接種黑色素瘤細胞林后第10天給予藥物。用藥的三組如下(l)重組人血管內皮抑制素低劑量組重組人血管內皮抑制素針劑于小鼠瘤周皮下注射0.75mg(kg.d)—1;(2)重組人血管內皮抑制素高劑量組重組人血管內皮抑制素針劑于小鼠瘤周皮下注射l.5mg(kg.d廣；(3)Endostatin組Endostatin針劑于小鼠瘤周皮下注射l.5mg(kg.d廣。文中所述Endostatin為人血管內皮抑制素蛋白，是由人血管內皮抑制素結構基因編碼的氨基酸序列，不含任何修飾序列?？瞻讓φ战M，接種后小鼠正常飲水給食。給藥10d后用尾推脫臼法將兩組小鼠全部處死，剝離出瘤組織，福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4)am厚連續(xù)切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察并比較肺瘤組織擬態(tài)樣血管和內皮依賴性血管數目。處死小鼠同時留取部分新鮮標本戊二醛固定，制作電鏡切片，電子顯孩吏鏡觀察腫瘤微血管結構。結果光鏡下觀察，可見到腫瘤組織中內皮依賴性血管，還可見到瘤組織中有瘤細胞圍成的腔隙樣結構，內有結構完整的紅細胞存在，提示為VM(vasculogenicmimicry,血管生成擬態(tài))。分另'K十凄史內皮依賴性血管和VM數目，見表1。用藥的三組小鼠肺瘤組織中的內皮依賴性血管和VM數目與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表l兩種血管在內皮抑制素組和對照組中的數目<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>內皮依賴性血管中的內皮細胞呈現出幼稚型的現象。結論重組人血管內皮抑制素治療可明顯抑制黑色素瘤皮下移植瘤新生血管生成，接收治療的小鼠腫瘤血管密度明顯減低，腫瘤組織出現大片壞死，而對照組則腫瘤血管密度較高，細胞增殖活躍，壞死少見。因此重組人血管內皮抑制素具有可靠的抑制腫瘤內皮依賴性血管和VM新生的作用，從而阻斷肺瘤細胞獲取營養(yǎng)，達到抑制其生長和轉移的目的。2、重組人血管內皮抑制素治療人骨肉瘤棵鼠模型的實驗Balb/c-nu/nu棵鼠40只，3-4周齡，雌雄各半，平均體重16-20g,取對數期生長的人骨肉瘤細胞林9901細胞，制備細胞懸液濃度5x107/ml。在棵鼠腋下接種肺瘤細胞O.2ml。待肺瘤生長34天，至體積40mm3時隨機分組為對照組、Endostatin組[劑量為l，5mg(kg.d)—i〗、重組人血管內皮抑制素低劑量治療組[劑量為O.75mg(kgd)—"和重組人血管內皮抑制素高劑量治療組[劑量為l.5mg(kgd)—對照組給予等量PBS,連續(xù)給藥14天。其間每日測量鼠重、腫瘤長徑和短徑，腫瘤體積-長徑x短徑2/2。實驗第15天處死動物，肺瘤稱重，計算抑瘤率(tumorinhibitionrate，TIR),TIR=(對照組腫瘤體積-實—瞼組肺瘤體積)/對照組腫瘤體積xiooy。。繪制移植瘤生長曲線。在無菌條件下快速切分肺瘤，冰凍切片，行組織缺氧和血管標記。常規(guī)10%中性福爾馬林液固定，蘇木精-伊紅(HE)染色和S-P法免疫組化染色。細胞增殖抗原標記物Ki67免疫組化染色顯示肺瘤細胞的增殖程度、血管內皮細胞表面抗原分子CD31免疫組化染色顯示腫瘤的微血管密度。TUNEL法檢測細胞凋亡。在動物處死前3個小時尾靜脈注射EF5(2-[2-nitro-lH-imidazole-1-yl]-N-(2,2,3，3，3—pentafluoropropyl)acetamide);月中瘤纟且纟只50jum》K凍、士刀片，分另'J用Cy3-標記的EF5抗體，以及CD31單克隆抗體和FITC標記的IgG二抗進行免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察。結果如表2所示，重組人血管內皮抑制素低劑量組和高劑量組與對照組有明顯差異(P<0.01),且高劑量組對內皮細胞遷;f走抑制明顯高于低劑量組，顯示重組人血管內皮抑制素能顯著抑制內皮細胞的遷徙，且有明顯的量效關系。表2重組人血管內皮抑制素對骨肉瘤細胞誘導血管內皮遷徙的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與空白對照組比，*P<0.01。低劑量組和高劑量組對腫瘤生長抑制率分別為22.92%和35.83%,見表3。表3內皮抑制素對人骨肉瘤細胞棵鼠移植瘤的抑瘤作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>重組人血管內皮抑制素低劑100.7518.521.61.85±0.0822.92<0.01量組重組人血管內皮抑制素高劑101.518.221.51.54±0.0835.83<0.01量組上述藥物試驗及動物實驗研究表明重組人血管內皮抑制素能顯著抑制人骨肉瘤棵鼠模型的腫瘤生長，接受重組人血管內皮抑制素治療的小鼠肺瘤血管密度明顯減低，血管閉塞、壞死，肺瘤組織出現大片壞死；重組人血管內皮抑制素能顯著抑制B16黑色素瘤小鼠模型皮下抑制瘤新生血管生成，接受治療的小鼠腫瘤血管密度明顯減低，腫瘤組織出現大片壞死。以下通過臨床療效觀察來進一步闡述本發(fā)明藥物的有益效果。病例一男性，70歲。經過PET/CT和病理學檢查于2006年2月確診為左肺腺癌IV期(雙肺內播散，縱隔淋巴結、腹腔淋巴結、雙側。腎上H顱內以及多發(fā)骨轉移)。曾先后應用以吉西他濱為主的方案、替莫唑胺膠嚢、卡培他濱片以及司莫司汀膠嚢等多種化療方案無效，病情持續(xù)進展。2006年5月改用吉非替尼，治療l月后胸悶、疼痛和乏力均減輕、食^:和體質明顯改善，復查胸部CT提示兩肺多發(fā)粟粒樣病灶較前顯著減少、縱隔內多枚肺大淋巴結較前縮??；頭盧貞MRI提示顱內轉移病灶略有縮小。近期療效評價為穩(wěn)定(SD),生活質量明顯改善。至2007年1月，癥狀反復，PET/CT檢查發(fā)現病情進展。2007年2月起應用重組人血管內皮抑制素注射液聯合NP治療，2周期后(2007年3月)復查PET/CT顯示肺部病灶明顯縮小，腦部病灶消失，全身多處骨轉移灶的標準化攝取值(SUV)下降，雙腎上腙_病灶縮小，療效評價為部分緩解(PR)，至2007年5月共應用了5周期，維持PR時間達到18周。2007年9月，再次PET/CT檢查病情進展，改為現代中藥制劑和支持治療。2007年11月，患者死于肺部感染?？偟纳鏁r間達到20個月。病例二男性，45歲。2004年12月在外院因左腎盂癌行腹腔鏡下左腎切除術、左輸尿管全切和部分膀胱切除術，術后病理4艮告"左腎盂移行細胞癌II級，8cmx3cmx4cm;膀胱移行細月包癌II級，2cmxlcmxlcm;左輸尿管及腎周脂肪嚢未見特殊"。術后應用表阿霉素行膀胱灌注化療及IFN-a+IL-2免疫治療1.5年。2006年6月因膀胱組織復發(fā)再次手術，切除部分膀胱。2006年9月，出現胸腰部疼痛，不能彎腰和起床活動，經CTAMRI檢查發(fā)現Tu胸推前緣骨質破壞和肝臟內多發(fā)性轉移灶。2006年9月起應用重組人血管內皮抑制素注射液聯合GP方案化療，治療l個周期后骨痛減輕，體力狀況改善，可以下床活動；2周期后(2006年11月)CT評價肝臟轉移病灶為PR,Tu胸推骨質破壞控制；6周期后(2007年3月)CT復查仍處于PR中，正在用該方案行第7個周期治療，現生活可以自理。病例三男性，27歲。2006年9月行縱隔肺瘤姑息切除術，術中見肺瘤位于前縱隔，約15cmx10cmx8cm,嚢實性，內見多數干酪樣壞死，邊界欠清。術后病理結合免疫組化考慮卵黃嚢瘤伴壞死，癌組織累及胸腺。術后CT(2006年10月)示前縱隔不規(guī)則軟組織病灶，心包局部受累，左下肺部分不張、實變，左側胸腔積液。行PVB(順鉑+長春新堿+博萊霉素)方案化療l周期，復查CT示前縱隔病灶增大，左下肺實變較前明顯，右下肺結節(jié)影。2006年11月、12月行￡8(順鉑+足葉乙甙+博萊霉素)方案化療2周期，2007年1月復查CT提示病情迅速進展。2007年1月開始應用重組人血管內皮抑制素注射液聯合DP方案化療，2周期結束后胸悶、氣急、疼痛以及進食不暢明顯減輕，2007年3月復查胸部CT示縱隔內、心包緣及左上肺胸膜緣嚢實性病灶較前明顯縮小，右上肺結節(jié)病灶消失。臨床評價獲得PR,目前患者已經行該方案化療3周期，維持PR,生活質量明顯改善。病例四女性，55歲。2003年06月患者因體重減輕查CT示肝左葉占位，于2003年06月29日行左肝外葉切除術、膽嚢切除術，術程順利，術后病理示肝膽管細胞癌，慢性膽嚢炎。術后于2003年07月30日及2003年08月30曰在外院行2次mmc(絲裂霉素c)10mg，5-fu(5-氟尿嘧啶)1.Og，epi(表阿霉素)40mg聯合介入化療及善寧、曱基斑蟊胺等治療。2004年06月復查B超示肝多發(fā)占位，CT示肝內多發(fā)低密度影，考慮轉移性腫瘤。2004年07月開始應用重組人血管內皮抑制素注射液聯合TP方案化療，4周期結束后復查腹部CT示肝臟病灶較前明顯縮小。臨床療效評價獲得PR,生活質量明顯改善。臨床觀察經病理組織學和/或細胞學檢查，皆為依照《實體瘤診斷標準》確診的IV期復治惡性實體瘤患者，包括非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食管癌、大腸癌、腎癌、卵巢癌、膽管癌、惡性黑色素瘤、宮頸癌、鼻咽癌、胃癌共452例，既往均接受過一種或多種的方案聯合化療，但出現病情進展。具有CT或MRI可測量的客觀病灶，血常規(guī)、肝腎功能及心臟功能基本正常。全部病例均采用重組人血管內皮抑制素注射液聯合化療藥物治療，給予的化療藥物為該病例既往未使用的或與既往治療無交叉耐藥的化療藥物，其中聯合NP的方案131例，聯合DP110例，聯合TP123例，聯合GP88例。出現G3/4(Grade3-4)級的毒性僅有57例次，安全性較高。有182例(占復3%)生活質量(QOL)改善，有205例(占45.4%)QOL穩(wěn)定，生活質量改善明顯?？稍u價療效共390例，治療四個周期后獲完全緩解(CR)25例，PR111例，SD162例，有效率為34.8%，疾病控制率為76.4%。本發(fā)明的有益效果是1)挖掘了重組人血管內皮抑制素的新的適應癥的治療用途，開拓了一個新的應用領i或。2)本發(fā)明的重組人血管內皮抑制素特異抑制實體腫瘤組織新生血管的增殖，安全無毒，無耐藥性，預示著有很好的應用前景。3)本發(fā)明的重組人血管內皮抑制素聯合化療藥物治療腫瘤，通過與化療藥物協(xié)同作用提高治療有效率和患者生存率，抑制腫瘤轉移，不增加毒副作用，能提高患者生活質量。具體實施方式下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1配制含有重組人血管內皮抑制素的注射液，使其每毫升含有血管內皮抑制素5mg、甘露醇40mg,加入濃度為40mM醋酸鈉調節(jié)PH值為5.5。過濾除菌，無菌灌裝，每支3ml。用法與用量每天一支，注入300~500ml生理鹽水或葡萄糖注射液中，靜脈滴注3~4個小時。實施例2使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制151.5ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml及20。/。蔗糖溶液7.5ml，補加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液2.98ml,加入注射水至300ml。經0.22jam微孔濾膜除菌過濾，分裝于預灌封注射器中，于4。C保存。實施例3:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制90.9ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml,補力。1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液4.20ml,加入注射水至300ml。經0.22iam微孔濾膜除菌過濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內，制品溫度下降至-4(TC,保持3-4小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-20。C,保持8小時，繼續(xù)加熱升高溫度至25。C,保持6小時，至真空度變化不大時，真空壓塞后取出，軋蓋。實施例4:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制151.5ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml及20%蔗糖溶液15ml,補加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液2.98ml,加入注射水至300ml。經0.22Him微孔濾膜除菌過濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內，制品溫度下降至_40°C,保持4-5小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-25。C,保持10小時，繼續(xù)加熱升高溫度至30°C,保持4小時，至真空度變化不大時，真空壓塞后取出，軋蓋。實施例5:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制97.8ml濃度為30.61mg/ml的重組人血管內皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml及20。/。蔗糖溶液60ml,補力口1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液4.04ml，加入注射水至300ml。經0.22)am微孔濾膜除菌過濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內，制品溫度下降至-45°C,保持6小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-3(TC,保持6小時，再加熱升高溫度至-25。C,保持6小時，繼續(xù)加熱升高溫度至25。C，保持8小時，至真空度變化不大時真空壓塞后取出，軋蓋。實施例6:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制147ml濃度為30.61mg/ml的重組人血管內皮抑制素溶液，加入20%甘露醇60ml、20%蔗糖溶液60ml及20%海藻糖溶液30ml，補加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉l爰沖液3.06ml,加入注射水至3Q0ml。經0.22jam樣么孔濾膜除菌過濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內，制品溫度下降至-45°C，保持2-4小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-30°C,保持12小時，繼續(xù)加熱升高溫度至3(TC,保持6小時，至真空度變化不大時，真空壓塞后取出，軋蓋。實施例7:使用10mMpH6.0±0.5左右的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制30ml濃度為9.9mg/tnl的重組人血管內皮抑制素溶液，加入2。/。甘氨酸15ml、吐溫-800.15ml,補加1.0MpH6.5左右的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2.70ml，加入注射水至300ml。經0.22jam微孔濾膜除菌過濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內，制品溫度下降至-40°C,保持2-4小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-30。C，保持8小時，繼續(xù)加熱升高溫度至3(TC，保持8小時，至真空度變化不大時，真空壓塞后取出，軋蓋。實施例8:使用10mMpH7.。土0.5左右的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制73.5ml濃度為30.61mg/ml的重組Aj6i管內皮抑制素溶液，加入2%EDTA30ml、20%甘露醇溶液30ml及20%嚴糖溶液7.5ml，補加1.5MpH7.0±0.5左右的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液2.26ml，加入注射水至300ml。經0.22jam微孔濾膜除菌過濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內，制品溫度下降至-45。C，保持8小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-30°C，保持12小時，繼續(xù)加熱升高溫度至25°C，保持IO小時，至真空度變化不大時，真空壓塞后取出，軋蓋。.實施例9:^f吏用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制15ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內皮抑制素溶液，加入10°/。谷氨酸15ml及10。/。蘇氨酸15ml，補加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液5.7ml,加入注射水至300ml。經O.22nm微孔濾膜除菌過濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內，制品溫度下降至-40°C,保持4-5小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-25°C,保持10小時，繼續(xù)加熱升高溫度至3(TC,保持4小時，至真空度變化不大時，真空壓塞后取出，軋蓋。實施例10:使用30mMpH5.5±0.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖體系對純化后的重組人血管內皮抑制素蛋白溶液超濾透析配制151.5ml濃度為9.9mg/ml的重組人血管內皮抑制素溶液，加入20%人血白蛋白溶液30ml，補加1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液2.98ml,加入注射水至300ml。經0.22lim微孔濾膜除菌過濾，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍千箱內，制品溫度下降至-40°C，保持4-5小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至一15°C,保持10小時，繼續(xù)加熱升高溫度至20。C,保持10小時，至真空度變化不大時，真空壓塞后取出，軋蓋。實施例11:稱取重組人血管內皮抑制素微球(PLGA包合)30g,內包合重組人血管內皮抑制素3g，加入20%甘露醇60ml,20%蔗糖溶液15ml加入1.5MpH5.5左右的醋酸一醋酸鈉緩沖液6.0ml,加入注射水至300ml，分裝于西林瓶中，加丁基膠塞，藥液置于凍干箱內，制品溫度下降至-4(TC，保持4-5小時，抽真空，隔板加熱，使制品溫度升高至-"。C,保持IO小時，繼續(xù)加熱升高溫度至3(TC，保持4小時，至真空度變化不大時，真空壓塞后取出，軋蓋。序列表<110〉山東先聲麥得津生物制藥有P艮公司<120>重組人血管內皮抑制素在制藥中的應用<130>MP071324<160>1<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>192<212>PRT<213>Artificial<220><223>重組人血管內皮抑制素<400>1MetGlyGlySerHisHisHisHisHisHisSerHisArgAspPheGin151015ProVallxuHisLeuValAlaLeuAsnSerProLeuSerGlyGlyMet202530ArgGlylieArgGlyAlaAspPheGinCysPheGinGinAlaArgAla354045ValGlyLeuAlaGlyThrPheArgAlaPheIxuSerSerArgLeuGin505560AspLeuTyrSerlieValArgArgAlaAspArgAlaAlaValProlie65707580ValAsnLeuLysAspGluLeuLeuPheProSerTrpGluAlaLeuPhe859095SerGlySerGluGlyProLeuLysProGlyAlaArgliePheSerPhe100105110AspGlyLysAspValIxuArgHisProThrTrpProGinLysSerVal115120125TrpHisGlySerAspProAsnGlyArgArgLeuThrGluSerTyrCys130135140GluThrTrpArgThrGluAlaProSerAlaThrGlyGinAlaSerSer145150155165170180185190160LeuLeuGlyGlyArgLeuLeuGlyGinSerAlaAlaSerCysHisHis175AlaTyrlieValLeuCyslieGluAsnSerPheMetThrAlaSerLys權利要求1、重組人血管內皮抑制素在制備治療腫瘤的藥物中的應用。2、權利要求l所述的應用，其特征在于所述重組人血管內皮抑制素是在人血管內皮抑制素編碼氨基酸序列的起始氨基酸Met后依次添加0-4個任意氨基酸和2-8個組氨酸序列。3、權利要求2所述的應用，其特征在于所述重組人血管內皮抑制素的起始氨基酸Met可以一皮切除。4、權利要求2所述的應用，其特征在于所述重組人血管內皮抑制素的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。5、權利要求1-4任一項所述的應用，其特征在于所述治療腫瘤的藥物的制劑是注射液或凍干制劑。6、權利要求5所述的應用，其特征在于所述藥物的活性組分是重組人血管內皮抑制素、PEG修飾的重組人血管內皮抑制素或重組人血管內皮抑制素微球。7、權利要求6所述的應用，其特征在于所述PEG的分子量是5000-30000,PEG通過共^介一建與重組人血管內皮抑制素相連。8、權利要求6所述的應用，其特征在于所述重組人血管內皮抑制素微球是通過基質材料與重組人血管內皮抑制素混合制備而成。9、權利要求5所述的應用，其特征在于所述藥物中還含有保護劑和PH值調節(jié)劑。10、權利要求9所述的應用，其特征在于所述保護劑選自多元醇、糖類、氨基酸、表面活性劑，人血白蛋白、EDTA和NaCl。11、權利要求9所述的應用，其特征在于所述藥物的PH值范圍是4.0-8.5。12、權利要求1所述的應用，其特征是所述治療腫瘤的藥物可與肺瘤化療藥物聯合應用。13、權利要求l所述的應用，其特征是所述腫瘤是實體瘤。全文摘要本發(fā)明涉及重組人血管內皮抑制素在制藥中的應用，具體公開了重組人血管內皮抑制素在制備治療腫瘤的藥物中的應用。重組人血管內皮抑制素能夠特異抑制腫瘤組織新生血管的增殖，從而抑制腫瘤的轉移，該方法安全無毒，無耐藥性，聯合化療藥物治療的效果顯著，提高腫瘤治療的有效率和生存率。文檔編號A61K38/17GK101224297SQ200810006058公開日2008年7月23日申請日期2008年2月1日優(yōu)先權日2008年2月1日發(fā)明者武劉,靜姜,鵬朱,羅興洪申請人:山東先聲麥得津生物制藥有限公司