專利名稱：：流感全病毒減活疫苗重組體、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重組病毒體毒4朱，尤其涉及一種流感全病毒減活疫苗冷適應(yīng)重組體、其構(gòu)建方法及用途，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：應(yīng)用減毒流感疫苗進行免疫是模仿流感病毒的自然免疫學(xué)原理。它是通過對鼻腔粘膜施用霧化狀態(tài)適冷型減毒疫苗來實現(xiàn)的，此疫苗誘發(fā)血清和粘膜抗體的產(chǎn)生并激活細(xì)胞免疫機能，因而其免疫性與自然感染相似。另外鼻腔噴霧^^藥比注射方式更能增加人們的接受程度。鼻噴式流感全病毒減活疫苗是利用美國密執(zhí)根大學(xué)Maassab博士通過溫度適應(yīng)原理建造的適冷病毒作為疫苗構(gòu)建的基礎(chǔ)，此適冷病毒，在疫苗病毒的構(gòu)建中又稱主供體病毒(MDV)，是將流感病毒在逐漸降低溫度的條件下進行了多次傳代，從而產(chǎn)生一林可以在25。C下有效、穩(wěn)定生長的病毒，經(jīng)過對此原始病毒及其多次和在多種條件下傳代所產(chǎn)生的中間體病毒的基因型的分析研究，結(jié)果表明其對溫度適應(yīng)的特性是由其編碼的遺傳基因所決定的，與原始病毒相比，適冷病毒的六條內(nèi)源基因序列發(fā)生了重要的變更，這些變更保證了適冷性病毒能在低溫下穩(wěn)定生長。通常情況下野生型原代病毒的生長在25。C下嚴(yán)重受限，而主供體病毒是適冷型的，即在25。C下能有效生長；主供體病毒也是溫度壽文感型的，即A型病毒的生長受限溫度為39°C，B型病毒的生長受限溫度為37°C。因雪貂對流感病毒的反應(yīng)與人體非常相近，釆用雪貂為動物材料所作的動物安全性和免疫原性等實驗證實，主供體病毒是在雪貂中為減活的，即此病毒不能在雪貂體內(nèi)產(chǎn)生常見的人流感癥狀。由Maassab博士建造的流感A型和B型主供體病毒抹是減活基因的穩(wěn)定供體，可用于構(gòu)建減活流感侯選疫苗。自1976年以來，美國國家健康研究中心及其它醫(yī)療機構(gòu)對一些適冷型疫苗侯選毒抹進行了臨床研究，在這些臨床研究中，一價和二價A型疫苗，一價B型疫苗，以及三價疫苗被施用于8000多人，年齡從2個月到100多歲。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)原理和手,殳，通過最佳的遺傳組合，完成病毒學(xué)的目標(biāo)，即產(chǎn)生一種減活的、適冷的、溫度牽文感的流感病毒疫苗重組體。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種減活的、適冷的、溫度敏感的流感病毒疫苗重組體(CaA/Newcaledonia/20/99),其微生物保藏號是CGMCC1538;^呆藏地點是中國孩i生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏時間2005年11月17日。本發(fā)明流感病毒減活疫苗重組體含特定的基因組合，由于流感病毒基因組結(jié)構(gòu)的特異性，即8個基因分別由8個RNA片段編碼，在病毒復(fù)制過程中，8個基因片段可以自由組合，因而，此疫苗的組成特點為兩個表面蛋白基因HA和NA來源于野生型病毒，六個內(nèi)源病毒基因PB2，PB1，PA，NP，M和NS來源于適冷型病毒，表面抗原基因決定了病毒的抗原性，內(nèi)源基因決定了病毒的減活與適冷性。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供一種制備上述流感病毒重組體的方法。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的一種制備上述流感病毒重組體的方法，包^^以下步驟將流感主供體病毒和流感野生致病型病毒混合共感染，篩選病毒重組體、克隆、鑒定即得。上述制備方法中，其中，所述的主供體病毒^^朱優(yōu)選為適冷型的A/AnnArbor/6/1960或B/AnnArbor/1/1966(購自MobioHealth公司)；所述的野生致病型病毒抹(購自英國NIBSC)優(yōu)選為A/NewCaledonia/20/1999、A/Wyoming/3/2003和B/Jilin/20/2004。將主供體病毒與野生性病毒按5:1到1:50(優(yōu)選為1:1)的比例混合共感染；共感染的溫度為20-33°C,優(yōu)選為27。C;共感染的時間為20-60小時，優(yōu)選為24小時；共感染的劑量是每個病毒感染1-0.01細(xì)胞，優(yōu)選為每個病毒感染1個細(xì)胞。適當(dāng)比例的主供體病毒與野生性病毒，以及感染劑量對成功地構(gòu)建種子疫苗起到?jīng)Q定性的作用。首先，各病毒的感染劑量是本著每個病毒感染一個細(xì)胞的原則，.即MOI(Multiplicityoflnfectivity)為1,這個原則的確立是為了確4果每個細(xì)胞最多只被一個病毒感染，只有一套病毒基因組進入細(xì)胞，與此同時，由于病毒儲備液中絕大部分病毒顆粒是無感染力的，盡可能使重組時干擾病毒顆粒數(shù)量維持最低，MOI太高會影響感染效率；再者，病毒的個體差異性也決定了在混合實驗中使用其它感染滴度比例(MOI)。在確定了感染劑量后，兩種病毒的比例也是一個重要因素，如果根據(jù)每種病毒有一個病毒顆粒感染一個細(xì)胞的原則，主供體病毒與野生型病毒的比例為1:1,這一比例在實-瞼中也經(jīng)常被采納。由于主供體病毒在低溫25。C下生長，而野生型病毒則不能，本發(fā)明選擇25-33°C作為混合感染溫度，優(yōu)選27。C作為混合感染溫度，從而給兩種病毒的生長都提供了機會，但相對而言對主供體病毒生長更有利，較大程度地限制了野生型病毒的生長，提供了一個有利于獲取主供體病毒的六個內(nèi)源基因的條件。病毒完成一個循環(huán)復(fù)制所需時間不等，流感病毒多為4小時左右，但由于病毒感染不同步，加上病毒的個體生物差異性，為了確保基因重組的發(fā)生，本發(fā)明選擇共感染的時間為20-60小時，優(yōu)選為24小時。完成混合感染后，得到的是一個含多種基因組合的重組病毒的混合物，從中得到所需的6:2病毒體，即兩個表面蛋白基因來源于野生型病毒，六個內(nèi)源基因來源于適冷型病毒，可參考以下的方法進行篩選首先，本發(fā)明對這個病毒混合體用抗主供體病毒的抗血清去中和含主供體表面抗原的病毒顆粒，保護那些含野生型表面抗原的重組病毒；然后從雞胚中分離出的病毒經(jīng)終點稀釋法稀釋后接種雞胚腎原細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每天測定各樣品的凝血酶效價(HA),含HA+的孔數(shù)小于50%的培養(yǎng)亞被選用進入下一步篩選。小于50%的板被定義為達到終點稀釋度，即每孔中最多只接受一個具有感染性病毒顆粒的理想狀態(tài)。最后將HA+的細(xì)胞懸液接種雞胚培養(yǎng)，收集蛋清液。以上收集的蛋清液被用來抽提RNA，通過常規(guī)RNA反轉(zhuǎn)錄過程形成cDNA，以此cDNA為模板采用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來取得流感病毒的八個基因片段，將各基因片段用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶處理，再用瓊脂凝膠電泳法分析，將未知樣品與兩個母本病毒的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)相比較，從而鑒定未知病毒中各基因片段的來源，HA和NA來源于野生型，其它六個內(nèi)源基因來源于適冷型，即6:2重組體。本發(fā)明以經(jīng)多次逐漸降溫而培養(yǎng)出來的一種遺傳性穩(wěn)定、適冷性的流感病毒遺傳變異體作為模板，用當(dāng)年流行的野生型病毒的表面抗原取代該適冷病毒的表面抗原而制備得到流感減毒活疫苗。本發(fā)明重組體病毒是適冷的(在25。C條件下有效生長)、溫度敏感性的(A型病毒的生長受限溫度為39°C，B型病毒的生長受限溫度為37°C)、減活的(在雪貂中為減活的，即此病毒不能在雪貂體內(nèi)產(chǎn)生常見的人流感癥狀，可用于產(chǎn)生活流感候選疫苗)。本發(fā)明病毒重組體的適冷性與在動物或人體內(nèi)弱化的特點使它成為極好的候選疫苗，補充了目前流感疫苗的短缺狀態(tài)。本發(fā)明最終產(chǎn)品為三價減活流感全病毒疫苗混合物，其制備方法如下三林單價減活、適冷疫苗病毒分別含有當(dāng)年世界衛(wèi)生組織推薦的三種野生型病毒的表面抗原，三種野生型病毒包括兩個A型病毒，即H1N1和H3N2，和一個B型病毒。單價病毒構(gòu)建完成后，先用常規(guī)的終點稀釋法測定出各單價疫苗病毒的效價，以組織培養(yǎng)半感染劑量(TCID5。/mL)表示。將各單價病毒用無菌的蛋清液稀釋至要求的最終效價，即1065-10"。使用時，將所制備的疫苗混合物以500pL分裝入微型噴霧器。本發(fā)明還提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物含有治療上有效量的本發(fā)明流感病毒疫苗重組體，任選的一種或多種免疫佐劑和藥學(xué)可接受的賦型劑。以本發(fā)明三價減活流感全病毒疫苗接種CD—1小鼠(ICR品系，劑量為50uL/只，接種方式為鼻腔噴射)，接種后觀察小鼠的生命體征和測試其免疫反應(yīng)，并對每組小鼠用與測試疫苗相等劑量的野生型三價病毒進行攻擊試驗，測定本發(fā)明疫苗對病毒感染的保護性及能力。試驗結(jié)果表明抗體在接種本發(fā)明疫苗后的第四天開始產(chǎn)生，在第六到第八天達到最高。之后的十多天的觀察期間抗體效價一直維持較高水平。小鼠21天后接受三價野生型病毒攻擊，未接受免疫的對照組動物全部(IOO%)出現(xiàn)流感癥狀，死亡率為100%;接受免疫的動物中有16.7%的小鼠體溫稍有升高，兩到三天后消失，未出現(xiàn)明顯的流感癥狀，其中兩只小鼠出現(xiàn)無力體征，體溫分別為39.(TC和39.5'C,其它小鼠表現(xiàn)正常，本發(fā)明三價流感疫苗的免疫保護效率達到93.3%?？傮w結(jié)果表明，本發(fā)明減活流感疫苗具有較好的抗原性和免疫原性，而且在動物體受較高濃度同類野生型病毒感染的情況下也能產(chǎn)生當(dāng)高的保護力。用本發(fā)明三價減活流感全病毒疫苗接種CD—1小鼠(ICR品系)，劑量為50uL/只，以鼻腔噴霧接種來評價本發(fā)明疫苗對動物體的安全性。與此同時，用同劑量的三價野生病毒混合體、以同樣的接種方式接種陽性對照組，和用磷酸緩沖液接種陰性對照組。通過連續(xù)15天對各組小鼠的觀察，確定小鼠有無流感癥狀，測定體征及記錄死亡率。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明疫苗組小鼠與陰性對照組小鼠綜合指標(biāo)無明顯差異，兩組小鼠的平均體重在接種前和接種后變化幅度基本一致，未出現(xiàn)小鼠死亡。陽性對照組呈典型流感癥狀，死亡率為95%。實驗結(jié)杲表明，本發(fā)明三價減活流感疫苗對小鼠使用是安全的。圖1主供體對照限制性酶切電泳圖譜；圖2野生型對照限制性酶切電泳圖譜；圖3本發(fā)明病毒重組體限制性酶切電泳圖譜；圖4小鼠對本發(fā)明疫苗、無菌磷酸鹽緩沖液和野生性病毒的不良反應(yīng)率;圖5免疫后小鼠體內(nèi)三種病毒特異性抗體效價；圖6受試動物免疫后，小鼠體重在野生型病毒攻擊前后的變化；圖7受試動物免疫后，小鼠體溫在野生型病毒攻擊前后的變化。具體實施例方式以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明病毒重組體的制備。用無特異性病原(SPF)雞胚制取雞胚腎原細(xì)胞，用70%的酒精噴灑消毒容器，放入超凈工作臺中風(fēng)干。將細(xì)胞容器來回倒置不少于八次以充分混合，直至細(xì)胞為均一狀態(tài)。將細(xì)胞液通過六層無菌紗布以去處細(xì)胞殘渣，將過濾物收集于50mL試管中。用臺盼藍(lán)計數(shù)活細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。活細(xì)胞總數(shù)>50/小格，作進一步稀釋，直至小于50/小格。用完全MEM細(xì)胞培養(yǎng)液(90%的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液+10%的胎牛血清+1倍青鏈霉素)調(diào)整細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)量到2.5xl06/mL,在6-孔板的每孔中加入2ml的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞板至于37°C,含5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。在相差顯微鏡下檢驗細(xì)胞生長情況，以匯合程度表示，選擇匯合度〉70%的板做下一步試驗。選用兩個孔做細(xì)胞計數(shù)。在各孔中加入0.5ml的胰酶-EDTA溶液。37。C下培養(yǎng)2到4分鐘或室溫下5分鐘。當(dāng)培養(yǎng)完成后，加入0.5mL的完全M199培養(yǎng)液(90%的完全M199培養(yǎng)液+10%的胎牛血清+1倍青鏈霉素)以抑制胰酶的活性。混合直到細(xì)胞懸液達到均一狀態(tài)。做細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸液和臺盼藍(lán)按1:1混合。即將20/d的細(xì)胞懸液和20jul的臺盼藍(lán)在一個1.5mL的微型離心管中在混合，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計數(shù)，用完全MEM培養(yǎng)液將供體病毒稀釋為MOI等于4.0和0.4(即感染性病毒數(shù)目與細(xì)胞數(shù)目的比值)，野生型感染度根據(jù)主供體/野生型的比為5:l和25:1計算。水上保存。取出細(xì)胞6-孔板。在超凈工作臺中無菌抽出每個孔中的培養(yǎng)液，用2mL預(yù)熱的PBS洗滌細(xì)胞一次。將lmL的主供體病毒稀釋液和lmL的野生病毒稀釋液混合。將感染的細(xì)胞板在27士1。C和5±1%C02中培養(yǎng)60士15分鐘。在培養(yǎng)結(jié)束時，用新吸頭將病毒感染液吸去。各孔中加入2mL的、室溫的、完全MEM培養(yǎng)液。在27土1。C和5±1%(302培養(yǎng)12±1和48±1小時，收集細(xì)胞上清液，完成混合感染將收集的上清液保存在-60。C以下。取上述共感染上清液樣品，在37士2。C的水浴鍋中融化樣品，將樣品在使用前在冰上保存。在超凈工作臺中，用完全MEM培養(yǎng)液進行稀釋。將樣品保存在冰上待用。37士2。C水浴鍋中預(yù)熱PBS和完全MEM細(xì)胞培養(yǎng)液不少于10分鐘。獲取含雞胚腎原細(xì)胞的96-孔板，在超凈工作臺中將96—孔的雞胚腎原細(xì)胞;f反內(nèi)的用過的完全M199培養(yǎng)液遺棄，用200mL預(yù)熱的PBS洗滌細(xì)胞，將獲取的共感染上清液^f故IO倍系列稀釋，取20mL的以上所制備的病毒稀釋液，加入96孔的雞胚腎原細(xì)胞板的各孔中。將細(xì)胞板放入27土rC和5±1%C02,細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此過程允許病毒吸附于宿主細(xì)胞表面，完成感染過程的第一步。在培養(yǎng)細(xì)胞時，制備篩選用抗血清稀釋液。用預(yù)熱的完全MEM細(xì)胞培養(yǎng)液將適當(dāng)?shù)目怪鞴w病毒抗血清稀釋為0.05%。在細(xì)胞感染60±15分鐘后，將板內(nèi)病毒液棄去。各孔加入200/xL的含抗主供體病毒抗體的完全MEM細(xì)胞培養(yǎng)液實現(xiàn)抗血清篩選的目標(biāo)。將細(xì)胞板在27±1°C,5%C02下培養(yǎng)3到7天。在這3到7天的培養(yǎng)期間，每天要對細(xì)胞板的各孔液^故HA測試，以確定HA陽性孔的百分率。如果HA陽性孔數(shù)^0%,放棄該板。如果細(xì)胞板中不呈現(xiàn)HA陽性，將板放回，繼續(xù)培養(yǎng)，第2天再測。對于達標(biāo)板，分別收集HA+孔的上清液為疫苗種子侯選病毒，冷凍保存。將HA+侯選病毒分別接種11天的SPF雞胚，在27.0土rC,濕度為70±5%條件下培養(yǎng)8±1或12±1小時。用照蛋燈檢查雞胚，將活雞胚放入4。C水箱中，冷凍4-12小時。采集雞胚尿清液，將收獲物分別裝入冷凍儲藏管中，-60°C以下保存。分別取樣，進行RNA抽提，具體操作參照廠家TRIZOL(上海閃晶)或RNA抽提試劑盒(Qiagen)的說明書。下邊以一個樣品為例進行基因型鑒定的詳細(xì)說明。第一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將提取的RNA7uL、引物Unil20.5/iL和純化水2.5uL配成的混合物置于PCR儀，7(TC反應(yīng)5分鐘，4。C保存。將4ul的10mMdNTPs、4pL的5X反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、lptL的RNA酶抑制劑(RNasin)和1/iL反轉(zhuǎn)錄酶組成的混合液加入上述反應(yīng)液中，室溫下保存10-30分鐘，放入PCR儀，42。C反應(yīng)1.5hrs,75。C反應(yīng)10min,4。C下保存。反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物即cDNA。第二步PCR擴增。取40uL上步制得的cDNA樣品，力口8uL的dNTPs(10mM)、10uL的10XDNA聚合酶緩沖液、的TaqDNA聚合酶，加入純化水配得總體積為80uL的混合液，將該混合液平分為8份，各取10ul分裝入8個PCIU敬型管中，將管1至管8分別標(biāo)記為PB2，PB1，PA,HA，NP,NA，M,NS，按標(biāo)記分別加入1.5pL的相應(yīng)的引物對(見表1)。引物對的準(zhǔn)備是先將各引物對配制成1/xg/jttL的儲存液，稀釋成25ng//iL的工作液，按以下PCR反應(yīng)程序合成基因片斷，94°C3min1個循環(huán)、94。C下1分鐘，55。C下2分鐘，72。C下3分鐘做35個循環(huán)、4。C保存。表l引物序列型基因正向引物反向引物PB2GAAGTACACATCAGGGAGACGCCTAAGGATGTCTACCATCCPB1ATGAGAAGAAAGCAAAGTTGGCAAATGTTGGTTGCTGGACCAAGATCATTGTTTATCATPACTCAAATGTCCAAAGAAGCCATGCTCACAAAGTTTACCHlCTACTGGTCCTGTTATGTGCTAGAACACATCCAGAAGCTGH2CTCATTCTCCTGTTCACAGCGCAGATCCTGCACTGCAGAGH3GACTATCATTGCTTTGAGCTGTTGCACCTAATGTTGCCNPGAGAATGGTGCTCTCTGCCGATCGGGTTCGTTGCCNlCAACACTAATGTTGTTGCTGGAAAGCCGAAAACCCCACTGCAGATGN2GGCTCTGTCTCTCTCACCCAGGCCATGGAGCCTGTTCCMCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTTACTCCAGCTCTATGCTGACNSGACAAAGACATAATGGATCCGCTGAAACGAGAAAGTTCTTATCTCPB2CTGTTAAGGGACAATGAAGCTTTATTTCTCCTCTCACTCCTTG別PB1CATAGATGTACCCATACAGAAATCCCGGAACCAAATTGGPAAGGCCAAAAACACAATGGCAGAGTGGCCCACTTGGCATAATTHAGTACTACTCATGGTAGTAACATCCGCAAGAAACATTGTCTCTGGAGACCNPGAGTTGGACTTGACCCTTCATGGTCATCATAATCCTCTGCTGT<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>第三步DNA片段的限制性內(nèi)切酶處理。取6uL的DNA擴增產(chǎn)物，根據(jù)基因來源，加入限制性內(nèi)切酶(表2),按照以下的方式準(zhǔn)備，PCR產(chǎn)物6pL、10X內(nèi)切酶緩沖液lpL、限制性內(nèi)切酶0.25|iL,加適量雙蒸水配成總體積10uL的酶切混合液，將酶切反應(yīng)混合物放入各種酶所要求的反應(yīng)溫度下反應(yīng)至少1小時。第四步瓊脂糖凝膠電泳。在酶切處理過的DNA樣品中加入適量的DNA上樣緩沖液，點入1-1.2%的瓊脂糖凝膠，100V穩(wěn)壓條件下電泳50-60分鐘，紫外分析儀上觀察DNA譜帶，根據(jù)限制性內(nèi)切酶對野生型和適冷型病毒基因的選擇性切割的特征圖語，確定某基因是來源于主供體病毒還是野生型病毒。最后篩選出病毒PB2，PB1,PA，NP，M和NS六條基因來源于主供體，同時，HA和NA來源于野生型，這樣的病毒為我們的所要篩選的種子病毒(圖1、圖2、圖3)。表2限制性內(nèi)切酶的具體種類<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>試驗例1本發(fā)明減活流感全病毒疫苗的動物安全性評價試驗一、受試制劑與使用試劑1、受試制劑本發(fā)明三價減活流感全病毒疫苗。規(guī)格0.5ml/支，保存條件-15°<:避光保存。2、陽性對照試劑三價野生型病毒(各野生型單價病毒購自英國NIBSC，經(jīng)擴增與效價測定后，用無菌蛋清液稀釋并將三種病毒液混合，使三種病毒的最終效價為106TCID5()/mL)。規(guī)格0.5ml/支。保存條件-15。C避光保存3、陰性對照試劑無菌磷酸鹽緩沖液；規(guī)格0.5ml/支。二、受試動物清潔級小鼠，3-4周齡，體重12.0-18.0g,雌雄兼用，由北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證書號0040014。所有動物均按常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，動物詞養(yǎng)環(huán)境溫度為18-22。C,相對濕度40-60%，良好通風(fēng)。有資格參加試驗的動物應(yīng)該為紅血球凝集試驗(HA)陰性。三、試-瞼方法1)動物選擇與分配參加試驗的動物先抽血，做紅血球凝集試驗測定，合格動物應(yīng)為血凝試驗(HA)陰性。隨機選取符合條件的動物60只，分三組，分別為陰性對照組、試驗組、和陽性對照組，每組20只。陰性對照組接種50ul無菌磷酸鹽緩沖液(25uL/鼻孔)，試驗組接種50uL受試制劑(本發(fā)明三價疫苗)，陽性對照組接種50ul三價野生型病毒混合物，三價野生性病毒混合物中每個病毒效價為106TCID5。/mL。2)本發(fā)明疫苗病毒、野生型病毒及磷酸鹽緩沖液的準(zhǔn)備與使用使用之前，本發(fā)明減活流感全病毒疫苗和三價野生型病毒必需解凍，解凍方法之一為將噴霧器握在手掌中，解凍后立即使用。另一種解凍方式是在水箱中解凍，解凍后可在2-8。C下保存，保存時間不得超過60小時。磷酸鹽緩沖液在使用之前應(yīng)滅菌，在4。C條件下保存不超過180天。3)搡作規(guī)程在病毒液與磷酸鹽援沖液的使用過程中，將它們作為同等生物試劑對待，試驗人員需要帶口罩，穿無菌服，戴試驗于套，以保證試驗人員的安全。試驗中的各組動物應(yīng)有相對大的隔離空間，以防交叉感染，保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。接受動物身體固定，頭部稍^f敬向上傾斜，將微型噴霧注射器的尖端塞進鼻孔內(nèi)側(cè)邊緣，按壓微型噴霧注射器注射桿。通常每只小鼠用量為50uL(25uL/鼻孔)。接種后每天測定小鼠體溫、體重指標(biāo)，對照三組動物的各指標(biāo)變化情況，并在試驗過程中觀察咳嗽、打噴嚏、流鼻涕、無力、死亡等指標(biāo)。具體按表3、表4標(biāo)準(zhǔn)判斷動物反應(yīng)發(fā)生程度，計算反應(yīng)發(fā)生率。在每個試驗結(jié)束后，將動物用C02處死并銷毀。表3小鼠藥物反應(yīng)癥狀<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4小鼠藥物反應(yīng)評價指標(biāo)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.試驗結(jié)果小鼠對疫苗、無菌磷酸鹽緩沖液和野生型病毒的不良反應(yīng)以藥物不良反應(yīng)率來反映(圖4)。陰性對照組的小鼠在試驗觀察期內(nèi)無一死亡，生長狀況良好，體重均有所增加，體溫正常。接種本發(fā)明流感減毒活疫苗(試驗組)的20只小鼠與陰性對照組比無明顯差別，100%存活，全部呈正常生長，其中1只小鼠在接種疫苗后的第1天出現(xiàn)無力、抓鼻現(xiàn)象，到2天兩只小鼠有體溫升高現(xiàn)象，偶有躁動、抓鼻、打噴噢現(xiàn)象，呈陽性反應(yīng)，但無嚴(yán)重的流感癥狀出現(xiàn)，這兩只小鼠在第4至第5天后均恢復(fù)正常。接種野生性病毒的20只小鼠中，其中兩只在接種后的第1天體溫開始升高，第2天和第3天后所有小鼠出現(xiàn)咳嗽、流鼻弟、打噴噢、流淚、喘息等癥狀，流感癥狀表現(xiàn)較典型，體重明顯減輕，并有一只小鼠死亡，在隨后的幾天中，小鼠相繼死亡，死亡率達95%,到試驗結(jié)束時，僅有一只陽性對照小鼠從感染中恢復(fù)，存活，呈極強陽性反應(yīng)。上述試驗結(jié)果表明，在本試驗條件下，陰性對照組小鼠全部健康，與之相對應(yīng)的陽性對照組，全部小鼠都出現(xiàn)不同程度的流感癥狀，動物死亡率達95%,與兩對照組相比，本發(fā)明三價減活流感全病毒疫苗以50uL/只接種小鼠后，試驗動物末出現(xiàn)流感癥狀，生長狀況良好，表明本發(fā)明疫苗對動物安全。試驗例2本發(fā)明減活流感全病毒疫苗的抗原性、免疫原性和動物保護性試驗一、受試制劑與使用試劑1受試制劑本發(fā)明三價減活流感全病毒疫苗。規(guī)格0.5ml/支，保存條件-15。C避光保存。2、攻擊試驗試劑三價野生型病毒(各野生型單價病毒購自英國NIBSC,經(jīng)擴增與效價測定后，用無菌蛋清液稀釋并將三種病毒液混合，使三種病毒的最終效價為106TCID5()/mL)。規(guī)格0.5ml/支，保存條件-15。C避光保存。3、陰性對照試劑無菌磷酸鹽緩沖液，規(guī)格0.5ml/支，保存方式避光，干燥處保存。二.受試動物清潔級小鼠，3-4周齡，體重12.0-18.0g，雌雄兼用，由北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證書號0040014。所有動物均按常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18-22。C，相對濕度40-60%,良好通風(fēng)。有資格參加試驗的動物應(yīng)該為紅血球凝集試驗(HA)陰性。三.試〗全方法l)動物選擇與分配參加試驗的動物先抽血，做紅血球凝集試驗測定，合格動物應(yīng)為血凝試驗(HA)13陰性。隨機選取符合條件的動物39只，分兩組，陰性對照組9只(等分為3個小組)，每只接種50uL無菌磷酸鹽緩沖液；試驗組30只(等分為3個小組)，每只接種50uL本發(fā)明三價減活流感全病毒疫苗。21天后，每只小鼠接受50uL三價野生型病毒混合物接種進行攻擊試驗，病毒混合體內(nèi)每種病毒效價為106TCID5o/mL。2)本發(fā)明三價流感減活疫苗病毒、野生型病毒及磷酸鹽緩沖液的準(zhǔn)備與使用之前，本發(fā)明流感減活疫苗和三價野生型病毒必需解凍，解凍方法之一為將噴霧器握在手掌中，解凍后立即使用。另一種解凍方式是在冰箱中解凍，化凍后可在2-8"下保存，保存時間不得超過60小時。磷酸鹽緩沖液在使用之前應(yīng)滅菌，在4。C條件下保存不超過180天。3)操作規(guī)程在病毒液與磷酸鹽緩沖液的使用過程，將它們作為生物制劑對待，試驗人員需要帶口罩，穿無菌服，戴試驗手套。適當(dāng)程度的保護以保證試驗人員的安全。試驗中的各小組動物應(yīng)有相對大的隔離空間，以防交叉感染，保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。接受動物身體固定，頭部稍微向上傾斜，將微型噴霧注射器的尖端塞進鼻孔內(nèi)側(cè)邊緣，按壓微型噴霧注射器注射桿。通常每只小鼠用量為50uL(25uL/鼻孔)。接種后第2天到第12天，根據(jù)抗原性與免疫原性操作規(guī)程進行斷尾取血，分離血清，對血清樣品進行血凝抑制試驗(HI)，測定血清對疫苗混合物中各病毒特異性抗體的效價；具體操作是從免疫接種后的第2天起一直到第12天，按照取樣時間表取血樣，每次取血對照組用3只動物(一個小組)，試驗組用10只動物(一個小組)，輪流對每小組動物抽血以免引起取血過多造成的非藥物影響。每只動物取血樣約為100-200uL，分離血清，將血清與受體破壞酶以3:1混和，37。C處理過夜，65°C滅活30分鐘，對處理過的血清作血凝抑制測定(HI)，決定血清對各單一病毒的抗體的效價，以評價疫苗的抗原性及免疫原性。免疫接種后第21天用三價野生型病毒混合物接種小鼠進行攻擊試驗，劑量為50uL/只106TCID5。/mL，攻擊試驗開始前，野生型病毒攻擊后第3、5、8和第14天(即第一次免疫后第24、26、29和35天)，測定小鼠體溫、體重等指標(biāo)，并在試驗過程中觀察咳嗽、打噴噢、流鼻弟、無力、死亡等指標(biāo)。具體按表3、表4標(biāo)準(zhǔn)判斷攻擊反應(yīng)發(fā)生程度，計算攻擊反應(yīng)發(fā)生率。在每個試驗結(jié)束后，將動物用C0214處死并銷毀。5.試驗結(jié)果l)抗原性與免疫原性試驗前，所有小鼠對疫苗的三個病毒成份都沒有特異性抗體。陰性對照組的9只小鼠抗體效價結(jié)果均為陰性，陰性表型持續(xù)整個試驗過程(見圖5與表5、6和7)。接種三價流感疫苗的試驗組30只小鼠全部有抗體產(chǎn)生，抗體在接種疫苗后的第三天開始陸續(xù)產(chǎn)生，但效價都《，在第六到第八天達到最高64~256。之后的幾天觀察期間抗體效價一直維持較高水平。其中H1N1型免疫效果最好，在免疫觀察的后期具有較高的抗體效價，平均約134個HI單位。H3N2和B型與H1N1相比抗體效價略低，但也有很好的免疫效果，平均抗體效價為89和46個HI。綜合30只小鼠的抗體效價水十分析，存在一定個體差異其中有25只小鼠抗體效價相接近處在較高的位置，而有5只小鼠抗體效價偏低。抗體效價的檢測結(jié)果匯總見表5、表6和表7。表5小鼠免疫接種后血清抗體效價檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表6小鼠免疫接種后血清抗體效價檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表7小鼠免疫接種后血清抗體效價檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>對照7000000000三組800000000090000000002100000000022000000000試23000000000驗248226464321286464二25842128646412812864組26161641286432128128642744212812864128128642822016168161682916486464641281286430321641281286425612864平均11739266401189247試驗結(jié)果表明，本發(fā)明三價減活流感全病毒疫苗可以有效的激發(fā)動物體產(chǎn)生病毒特異性抗體，并有較高的抗體效價，具有有效的抗原性與免疫原性。2)動物保護性接種本發(fā)明三價疫苗后的實驗組小鼠和陰性對照組的小鼠在第21天接受野生三價流感病毒的攻擊，在攻擊后的14天內(nèi)對小鼠的體溫和體重進行了測定記錄(表8),試驗結(jié)果見圖6與圖7。在攻擊后的第三天陰性對照的9只小鼠全部出現(xiàn)打噴噢，流鼻弟的流感癥狀，體溫均有所增加；在第四到第五天流感癥狀加劇有的小鼠出現(xiàn)呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)、痙攣等等，體重明顯減輕，體溫持續(xù)高熱，并行小鼠死亡，十大內(nèi)小鼠全部死亡，呈極強陽性反應(yīng)。接種本發(fā)明三價疫苗的實驗組小鼠接受攻擊后，其中有5只在第三天體溫略有升高(表8),但總體觀察無明顯體重減輕現(xiàn)象。其中的2只出現(xiàn)流感癥狀，體溫17分別達39.0。C和39.5。C,呈陽性反應(yīng)，其后幾天感冒癥狀逐漸消失，痊愈。表8小鼠經(jīng)攻擊試驗后體溫和體重變化情況<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3037.923.838.623.638.123.637.924.437.924.9試驗結(jié)果表明，沒有接受本發(fā)明疫苗的對照組小鼠在受到野生型病毒攻擊的情況下，無抵抗力，該組所有動物在攻擊試驗初期都在不同程度上表現(xiàn)出流感病狀，十天內(nèi)陰性對照組中所有動物死亡率為100%。然而，接受疫苗的試驗組動物，除了兩只小鼠呈現(xiàn)流鼻洋、打噴嚷等輕微流感癥狀外，其它動物在全部試驗過程中部健康、正常，無一動物死亡，保護率達93.3%,兩只患病小鼠最終也康復(fù)。攻擊試驗綜合評價見表9。表9攻擊試驗綜合評價攻擊后天凄t死亡率平均體溫("C)陰'性，寸照釭L30/940.02/939.886/940.4149/9一試馬全組30/3038.20/3038.280/3038.0140/3038.0試驗結(jié)論上述試驗結(jié)果表明，在本試驗條件下，本發(fā)明流感減活全疫苗對小鼠為良好的抗原體，并在小鼠體內(nèi)可激發(fā)良好的免疫原反應(yīng)，通過免疫后的小鼠對野生型病毒具有明顯的保護性。19權(quán)利要求1、一種減活的、適冷的、溫度敏感的流感病毒疫苗重組體(CaA/Newcaledonia/20/99)，其微生物保藏號是CGMCC1538。2、一種制備權(quán)利要求1的流感病毒減活疫苗重組體的方法，包^^以下步驟將流感主供體病毒毒林和流感野生致病型病毒毒才朱混合共感染宿主細(xì)l包；篩選、克隆、鑒定，得到重組體。3、根據(jù)權(quán)利要求2，其特征在于，所述的主供體病毒毒抹選用適冷的A/AnnArbor/6/60或B/AnnArbor/1/66。4、根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，將主供體病毒與野生型病毒按5:1到1:50的比例混合共感染；共感染的溫度為25-33°C;共感染的時間為20到60小時；共感染的劑量是每個病毒感染1-0.01細(xì)胞；感染宿主細(xì)胞為雞胚腎原細(xì)胞。5、根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，將主供體病毒與野生型病毒按1:1的比例混合共感染；共感染的溫度為27°C;共感染的時間為24小時；共感染的劑量是每個病毒感染1細(xì)胞。6、一種疫苗組合物，含有治療上有效量的權(quán)利要求1的流感病毒疫苗重組體，任選的一種或多種免疫佐劑，和藥學(xué)可接受的賦型劑。7、權(quán)利要求1的流感病毒疫苗重組體在制備防治流感藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種新的減活的、適冷的、溫度敏感的流感病毒疫苗重組體，其微生物保藏號是CGMCC1538。本發(fā)明以經(jīng)多次逐漸降溫而培養(yǎng)出來的一種遺傳穩(wěn)定、適冷的流感病毒遺傳變異體作為模板，用遺傳重組的方法以野生病毒的表面抗原取代該適冷病毒的表面抗原而制備得到本發(fā)明減活流感全病毒疫苗。本發(fā)明流感病毒疫苗重組體具有減活、適冷、溫度敏感等特點，由其制備成的減活流感全病毒疫苗具有良好的抗原性、免疫原性和保護效力，可有效防治流感病毒。文檔編號A61K39/145GK101497877SQ20081000475公開日2009年8月5日申請日期2008年1月28日優(yōu)先權(quán)日2008年1月28日發(fā)明者劉貴生,李金鈴,武文軍,董存元申請人:河北新張藥股份有限公司