專利名稱：一種新型的脂質(zhì)超聲造影凍干制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的脂質(zhì)超聲造影凍干制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
超聲造影劑研制現(xiàn)狀目前，以脂質(zhì)、高分子多聚體作為成膜材料的第3代超聲造影劑是目前研究的熱點，而脂膜因其優(yōu)良的變形性和彈性，具有很好的造影增強效果。脂質(zhì)超聲造影劑還具有天然的靶向性和很好的生物相容性，已顯示出良好的應(yīng)用前景。國內(nèi)進口的Sonovue也是采用磷脂作為成膜材料，是難一被我國衛(wèi)生部批準應(yīng)用于臨床的超聲造影劑，但因其價格昂貴，導(dǎo)致其不易被推廣使用。目前國內(nèi)脂質(zhì)超聲造影劑研究僅限于實驗室，難以實現(xiàn)工業(yè)化批量生產(chǎn)應(yīng)用到臨床，主要有以下原因1.穩(wěn)定性差，保存時間短。液態(tài)造影劑保存、運輸極不方便，而且其保存時間很有限。而目前的凍干粉脂質(zhì)造影劑，復(fù)溶后形成的微泡混懸液體外穩(wěn)定性往往也很差，給使用帶來不便。進入體內(nèi)后，其增強顯像效果不佳，持續(xù)時間過短，難以應(yīng)用到臨床。
2.使用前需聲振或機械振蕩才能形成微泡混懸液，需要配備專門的聲振儀或機械振蕩儀，難以實現(xiàn)商品化應(yīng)用到臨床，其保存，運輸、使用極為不便。
3.制備過程復(fù)雜，不易控制，成本高。目前制備脂質(zhì)超聲造影劑往往需要反復(fù)進行冷凍干燥或聲振，此過程中各項參數(shù)、條件難以控制，所以其成本高，重復(fù)性往往很低，難以實現(xiàn)其商品化。有些制備方法中還需使用氯仿等有機溶劑助溶磷脂，其去除過程會導(dǎo)致成本增高，在產(chǎn)品中的殘留問題難以解決。
4.制備條件苛刻，不利于載藥或載基因研究。目前超聲造影劑的制備過程中往往采用聲振法，聲振的條件不夠穩(wěn)定，其無菌過程也難以實現(xiàn)。并且在聲振過程中，會產(chǎn)生大量的熱量，會影響脂質(zhì)及所載藥物或基因的活性，不利于超聲造影劑載藥或載基因治療方面的研究。
5.造影劑成膜材料成份復(fù)雜，難以達到靜脈注射要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是改進造影劑成膜材料，提供一種性能穩(wěn)定的脂質(zhì)超聲造影凍干制劑；本發(fā)明的另一目的是優(yōu)化造影劑的制備工藝，提供一種制備制備脂質(zhì)超聲造影凍干制劑的方法實現(xiàn)超聲微泡造影劑的工業(yè)化批量制備與常溫保存。
為實現(xiàn)上述目的，所采用的技術(shù)方案如下1、對造影劑的成膜材料進行簡化、改進，全部選用符合靜脈注射標準的安全可靠材料，包括磷脂混合物、甘油和甘露醇。磷脂混合物占有重量比為1.5～3％，甘油占有重量比為8～10％，甘露醇占有重量比為4～15％，其余為去離子蒸餾水。各種磷脂往往具有不同的相變溫度，由單純一種磷脂構(gòu)成的脂膜相變溫度一致，穩(wěn)定性較差。選用多種不同相變溫度的磷脂按適當比例組成脂膜結(jié)構(gòu)，可使其穩(wěn)定性大大增加。本造影劑成膜材料中，所述磷脂混合物選自選自1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿、1，2二硬脂酰磷脂酰膽堿、1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、1，2-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺中、1，2-二硬脂酰磷脂酸、1，2-二棕櫚酰磷脂酸中的至少兩種按任意比例組成。
所述磷脂混合物還可以選自1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)中的一種、1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和1，2-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)中的一種，另外為達到最佳穩(wěn)定性效果，還可加入1，2-二棕櫚酰磷脂酸(DSPA)和1，2-二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)中的一種，其重量比例分別為50％～70％、15％～30％和15％～20％。優(yōu)選以上幾種磷脂按最佳比例組合，可使微泡具有極佳的穩(wěn)定性。
在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)，甘油與水混溶形成溶劑，對磷脂有較好的助溶作用。當達到一定溫度時，即可形成脂質(zhì)混懸液。再加上機械振蕩作用，磷脂可實現(xiàn)完全分散并形成脂膜包裹氣體，不需采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或冷凍干燥等方法形成脂質(zhì)混懸液，此過程大大節(jié)約了成本。另外，在冷凍干燥過程中，甘油也可成為凍干保護劑，增強微囊的穩(wěn)定性，保護微囊結(jié)構(gòu)在凍干過程中不被破壞。
甘露醇作為優(yōu)良的凍干保護劑，在凍干過程中起骨架作用，防止脂膜結(jié)構(gòu)被破壞，使凍干制劑為多孔疏松結(jié)構(gòu)且顏色基本不變，復(fù)水性好。甘露醇溶液可提高微泡的產(chǎn)率并可通過滲透壓調(diào)節(jié)微泡的粒徑大小，加入其高滲液可制備納米脂質(zhì)超聲造影劑。
2、將上述原料在管形容器中混合后，置于42℃水浴30～60分鐘形成混懸液；再以全氟丙烷氣體置換其內(nèi)空氣，然后將容器固定在機械振蕩儀內(nèi)振蕩30～60秒，機械振蕩儀的工作頻率為3300～4500次/分鐘，得到含全氟丙烷的微囊液，轉(zhuǎn)移至西林瓶中，置-30℃預(yù)凍半小時。將預(yù)凍好的樣品置于冷凍干燥機中，控制凍干條件，真空干燥24～48h，再充入全氟丙烷氣體，即得脂質(zhì)超聲造影劑，密封壓蓋后可長期保存。
3、穩(wěn)定性及顯像效果觀察該造影劑為白色凍干制劑(參見附圖7)，常溫密封保存于西林瓶中，內(nèi)充全氟丙烷氣體。使用前加入3ml注射用水，用手搖勻后形成乳白色微泡混懸液(參見附圖8)。納米級微泡粒徑范圍0.3～0.9um(參見附圖1，附圖2)，平均粒徑0.65um，微泡濃度5.3～6.5×109/ml；微米微泡粒徑范圍0.7～1.5um(參見附圖3，附圖4)，平均粒徑1.2um，微泡濃度3.1～4.5×109/ml。分別于即刻、30min、60min、2h、6h、12h、24h取微泡混懸液于顯微鏡下觀察、計數(shù)。微泡形態(tài)飽滿、均一性好。24h后觀察，微泡形態(tài)無明顯變化，濃度無明顯下降。將造影劑以60Co γ射線輻射滅菌(輻射劑量150萬～180萬rad)，按照藥典規(guī)定抽樣進行無菌檢查，證實已達滅菌效果。復(fù)溶后，造影劑粒徑、形態(tài)，濃度等各參數(shù)均無明顯變化，以上均證明其穩(wěn)定性好。
將微泡混懸液以0.05～0.2ml/kg的劑量經(jīng)靜脈注入狗或新西蘭大白兔體內(nèi)，在超聲下觀察其增強肝、腎、心臟等組織器官顯影的效果。
4、冷凍干燥法適用于工業(yè)生產(chǎn)，而且容易達到無菌要求，為造影劑在臨床上的應(yīng)用創(chuàng)造了條件。工業(yè)化生產(chǎn)可按以下方法制備(1)按上述比例配取各種原料，制備脂質(zhì)混懸液，并對脂質(zhì)混懸液進行滅菌處理，然后分裝入管型容器。(2)以全氟丙烷氣體置換管型容器內(nèi)空氣，然后在機械振蕩儀中振蕩，頻率3300～4500次/分鐘，幅度10～20mm，振蕩時間30～60s，制得微囊液。(3)將微囊液轉(zhuǎn)移分裝至5ml西林瓶中，送入冷凍干燥機中，控制凍干條件，真空干燥，全部過程均可實現(xiàn)無菌操作。(4)干燥完畢后，再往冷凍干燥機內(nèi)通入經(jīng)過濾除菌的氟碳氣體，然后壓蓋密封。此工業(yè)化過程，制備工藝簡便，易于控制，保證了產(chǎn)品商品化的實現(xiàn)。
發(fā)明效果1.通過本方法制備出了一種性能穩(wěn)定的脂質(zhì)超聲微泡造影凍干制劑。所有原材料安全可靠、符合靜脈注射標準。
2.制備的造影劑為凍干制劑，每單位(瓶)凍干制劑中，固體重量約80mg，氣體40～70mg。常溫保存，運輸、使用方便。溶解性能好，使用前只需加入3ml注射用水，以手輕輕搖勻即可。復(fù)溶后形成的微泡混懸液具有極佳的穩(wěn)定性能，常溫放置超過24h無明顯改變(目前文獻報道的凍干粉造影劑復(fù)溶后放置時間不超過6小時)，4℃條件下可保存7天左右。
3.制備工藝簡便、易操作，成本低，可實施工業(yè)化批量生產(chǎn)。
4.制備條件溫和、易于控制，并且可制備納米級脂質(zhì)微泡造影劑，有利于載藥或載基因聯(lián)合超聲進行治療研究(不影響所載藥物或基因的活性)。
5.動物實驗證實，該造影劑增強顯像效果好。造影后，兔肝血管分支可清晰顯示(參見附圖5)，腎實質(zhì)顯影均勻增強(參見附圖6)，單次注射持續(xù)時間達20min，完全滿足臨床診斷需要。實驗過程中，動物未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，實驗結(jié)束后，動物狀態(tài)良好。解剖動物肝、腎、心臟等臟器病理檢查未發(fā)現(xiàn)損傷，證明其安全可靠。


附圖1為光學(xué)顯微鏡下觀察本發(fā)明納米級微泡造影劑(×400)；附圖2為本發(fā)明納米級微泡粒徑分布圖附圖3為光學(xué)顯微鏡下觀察本發(fā)明微米級微泡造影劑(×400)；附圖4為本發(fā)明微米級微泡粒徑分布圖；附圖5為本發(fā)明微泡增強兔肝血管顯影；其中A為造影前；B為造影后。造影前肝血管未顯示，造影后肝血管分支清晰可見附圖6為本發(fā)明微泡增強兔腎實質(zhì)顯影；其中A為造影前腎實質(zhì)；B為造影后腎實質(zhì)，造影后腎實質(zhì)均勻增強附圖7為本發(fā)明脂質(zhì)造影凍干制劑樣品；附圖8為本發(fā)明脂質(zhì)造影凍干制劑復(fù)溶后形成的微泡混懸液。
具體實施例方式
實例1成膜材料磷脂混合物為1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和1，2-二棕櫚酰磷脂酸(DSPA)三種，甘露醇、甘油、全氟丙烷(C3F8)；設(shè)備電子天平、恒溫水浴箱、機械振蕩儀、冷凍干燥機等；方法先分別稱取DPPC5mg、DSPE2mg、DSPA1mg、甘露醇22.5mg混合，加入甘油50ul、去離子蒸餾水450ul，裝入一1.5ml管形密閉容器中，以全氟丙烷置換其內(nèi)空氣。置于42℃水浴30min，以機械振蕩儀振蕩60s，得含全氟丙烷的微囊液，轉(zhuǎn)入西林瓶中，置-30℃預(yù)凍半小時。將預(yù)凍好的樣品置于冷凍干燥機中，控制凍干條件，真空干燥24h，再充入全氟丙烷氣體，即得脂質(zhì)超聲造影劑，密封加蓋后常溫保存。
實例2成膜材料磷脂混合物為1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)兩種，甘露醇、甘油、全氟丙烷(C3F8)；設(shè)備電子天平、恒溫水浴箱、機械振蕩儀、冷凍干燥機等方法先分別稱取DPPC7mg、DSPE2mg、甘露醇22.5mg混合，加入甘油50ul、去離子蒸餾水450ul，裝入一1.5ml管形密閉容器中，以全氟丙烷置換其內(nèi)空氣。置于42℃水浴30min，以機械振蕩儀振蕩30s，得含全氟丙烷的微囊液，轉(zhuǎn)入西林瓶中，置-30℃預(yù)凍半小時。將預(yù)凍好的樣品置于冷凍干燥機中，控制凍干條件，真空干燥36h，再充入全氟丙烷氣體，即得脂質(zhì)超聲造影劑，密封加蓋后常溫保存。
實例3成膜材料磷脂混合物為1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1，2-二棕櫚酰磷脂酸(DSPA)三種，甘露醇、甘油、全氟丙烷(C3F8)；設(shè)備電子天平、恒溫水浴箱、機械振蕩儀、冷凍干燥機等；方法先分別稱取DPPC5mg、DSPE2mg、DSPA1mg、甘露醇22.5mg混合，加入甘油50ul、去離子蒸餾水450ul，裝入一1.5ml管形密閉容器中，以全氟丙烷置換其內(nèi)空氣。置于42℃水浴30min，以機械振蕩儀振蕩60s，得含全氟丙烷的微囊液，轉(zhuǎn)入西林瓶中，置-30℃預(yù)凍半小時。將預(yù)凍好的樣品置于冷凍干燥機中，控制凍干條件，真空干燥24h，再充入全氟丙烷氣體，即得脂質(zhì)超聲造影劑，密封加蓋后常溫保存。
實例4成膜材料磷脂混合物為1二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、1，2-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)和1，2-二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)三種，甘露醇、甘油、全氟丙烷(C3F8)；設(shè)備電子天平、恒溫水浴箱、機械振蕩儀、冷凍干燥機等；方法先分別稱取DSPC5mg、DPPE2mg、DPPA1mg、甘露醇22.5mg混合，加入甘油50ul、去離子蒸餾水450ul，裝入一1.5ml管形密閉容器中，以全氟丙烷置換其內(nèi)空氣。置于42℃水浴30min，以機械振蕩儀振蕩60s，得含全氟丙烷的微囊液，轉(zhuǎn)入西林瓶中，置-30℃預(yù)凍半小時。將預(yù)凍好的樣品置于冷凍干燥機中，控制凍干條件，真空干燥24h，再充入全氟丙烷氣體，即得脂質(zhì)超聲造影劑，密封加蓋后常溫保存。
實例5成膜材料磷脂混合物為1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1，2-二棕櫚酰磷脂酸(DSPA)、1，2-二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)五種，甘露醇、甘油、全氟丙烷(C3F8)；
設(shè)備電子天平、恒溫水浴箱、機械振蕩儀、冷凍干燥機等；方法先分別稱取DPPC3mg、DSPC4mg、DSPE2mg、DSPA和DPPA各1mg、甘露醇22.5mg混合，加入甘油50ul、去離子蒸餾水450ul，裝入一1.5ml管形密閉容器中，以全氟丙烷置換其內(nèi)空氣。置于42℃水浴30min，以機械振蕩儀振蕩60s，得含全氟丙烷的微囊液，轉(zhuǎn)入西林瓶中，置-30℃預(yù)凍半小時。將預(yù)凍好的樣品置于冷凍干燥機中，控制凍干條件，真空干燥24h，再充入全氟丙烷氣體，即得脂質(zhì)超聲造影劑，密封加蓋后常溫保存。
上述實施例中，每單位(瓶)凍干制劑中，固體重量為70～90mg，全氟丙烷氣體40-70mg。
權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)超聲造影凍干制劑，由成膜材料包裹氟碳氣體組成，其特征在于成膜材料包括磷脂混合物、甘油、甘露醇，其中，磷脂占有重量比為1.5-3％，甘油占有重量比為8-10％，甘露醇占有重量比為4-15％，其余為蒸餾水；所述磷脂混合物選自1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、1，2-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺中、1，2-二棕櫚酰磷脂酸、1，2-二棕櫚酰磷脂酸中的至少兩種按任意比例組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)超聲造影凍干制劑，其特征是磷脂混合物選自1，2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿中的一種，1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和1，2-二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺中的一種，1，2-二棕櫚酰磷脂酸和1，2-二棕櫚酰磷脂酸中的一種，其重量比例分別為50％～70％、15％～30％和15％～20％。
3.一種制備脂質(zhì)超聲造影凍干制劑的方法，按以下步驟進行(1)將磷脂混合物、甘油、甘露醇與水溶液按比例在容器中混合，42℃恒溫水浴30～60分鐘，形成脂質(zhì)混懸液；(2)以全氟丙烷氣體置換容器頭部空氣，然后將其固定在機械振蕩儀中進行3300～4500次/分鐘的振蕩，振蕩30-60秒，得到含全氟丙烷氣體的微囊液，將其轉(zhuǎn)移至西林瓶中，置-30℃預(yù)凍半小時；(3)將預(yù)凍好的樣品置冷凍干燥機中，真空干燥24-48小時，最后再充入全氟丙烷氣體，密封壓蓋，常溫保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)超聲造影凍干制劑，其特征是每單位凍干制劑中，固體重量70～90mg，全氟丙烷氣體40-70mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂質(zhì)超聲造影凍干制劑，其特征是每單位凍干制劑中，固體重量70～90mg，全氟丙烷氣體40-70mg。
全文摘要
一種脂質(zhì)超聲造影凍干制劑，由成膜材料包裹氟碳氣體組成，其特征在于成膜材料包括磷脂混合物、甘油、甘露醇，其中，磷脂占有重量比為1.5－3％，甘油占有重量比為8－10％，甘露醇占有重量比為4－15％，其余為蒸餾水。本發(fā)明涉及的方法是先將磷脂混合物、甘油、甘露醇與去離子蒸餾水混合，以全氟丙烷氣體置換其P內(nèi)空氣，然后機械振蕩，制得含全氟丙烷的微囊液，再冷凍干燥，最后重新充入全氟丙烷氣體，即得干制劑。此脂質(zhì)超聲造影凍干制劑性能穩(wěn)定，運輸、保存方便；復(fù)溶后，穩(wěn)定性好。制備工藝簡便、成本低，可實施工業(yè)化批量生產(chǎn)。動物實驗證實，該造影劑顯像效果好，可完全滿足臨床診斷需要。所有原材料均安全可靠、符合靜脈注射標準。
文檔編號A61K49/22GK101015702SQ20071007816
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者李攀, 王志剛, 鄭元義, 冉海濤, 許川山, 張群霞, 楊春江, 李興升 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院