專利名稱：：燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及燈盞花甲醇提取物應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地說，是涉及燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人的膚色是由皮膚內(nèi)的黑色素密度和分步來決定的，同時(shí)又受環(huán)境或生理因素的影響，比如太陽光中的紫外線、疲勞、壓力和遺傳因素?，F(xiàn)有化妝品中廣為使用的美白方式，其美白機(jī)理主要有兩種一種是黑色素還原機(jī)理，如以維生素C美白，但美白效果不是很明顯；另一種重要的機(jī)理是通過抑制酪氨酸酶活性而達(dá)到美白效果，如以氫醌、曲酸、桑葚提取物及熊果苷(arbutin，氫醌的天然形式)等美白。但以熊果苷、曲酸等化學(xué)物祛斑美白的臨床效果不是特別明顯。近些年研究發(fā)現(xiàn)，一些傳統(tǒng)的增白祛斑褪色劑，如對(duì)苯二酚、皮質(zhì)類固醇、汞的化合物等，可能會(huì)引起一系列健康問題，如不可逆的皮膚損害、黃褐斑等，因而也被禁止使用?？梢哉f目前只有氫醌可用于皮膚的美白，但研究發(fā)現(xiàn)其可表現(xiàn)出諸如使黑素退化或致突變、細(xì)胞功能破壞等副作用，因此目前在一些國家氫醌被禁止在化妝品中使用。此外，一種氫醌的糖衍生物熊果苷已被開發(fā)成美白商品，但認(rèn)為其增白效果很小，而抗壞血酸、曲酸等雖活性較高，但穩(wěn)定性較差，以致使其應(yīng)用范圍受到限制。黑色素代謝的一般過程是，黑素細(xì)胞中酪氨酸在酪氨酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為多巴、多巴醌和多巴色素等，最終轉(zhuǎn)變?yōu)樯仡w粒，并從黑素細(xì)胞分泌到鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞中去，體現(xiàn)出皮膚的顏色。部分色素沉著性皮膚病，如黃褐斑、雀斑等，就是由于過量水平的黑色素在表皮沉積形成。酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)，分類號(hào)為EC1.14.18.1和EC1.10.3.l是一種含銅的酶，兼有加氧酶和氧化酶雙重功能，為黑色素合成的限速酶，其表達(dá)和活性決定黑素合成的速度和產(chǎn)量。在黑素生成過程中，酪氨酸酶有3個(gè)特征性的催化活性，即酪氨酸羥化酶活性、多巴氧化酶活性和5，6—二羥基吲哚氧化酶活性，分別催化酪氨酸羥化為多巴(Dopa)，多巴(Dopa)氧化為多巴醌(DQ)和5，6—二羥基B引哚(DHI)氧化為5,6—吲哚醌(IQ)。這些反應(yīng)導(dǎo)致所在部位的黑色素沉著，如黑斑、雀斑和痣。因此，可以選擇應(yīng)用酪氨酸酶抑制劑，通過抑制酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的合成反應(yīng)鏈，減少其在皮膚內(nèi)的生成從而達(dá)到祛斑增白的效果。大部分的酪氨酸酶抑制劑是酚類或鄰苯二酚的衍生物，其結(jié)構(gòu)類似于酪氨酸或多巴，作為一種錯(cuò)配底物，從而抑制酶的活性。酪氨酸酶抑制劑在醫(yī)藥和化妝品行業(yè)正越來越受關(guān)注，它可以通過抑制酶的氧化而防治黑色素沉著。已報(bào)道了很多天然產(chǎn)物來源的酪氨酸酶抑制劑，大部分含有酚類結(jié)構(gòu)或能夠螯合酪氨酸酶的銅離子。但這些酪氨酸酶抑制劑都有這樣那樣的缺點(diǎn)，如活性低、毒性高，穿透能力弱等。其他一些活性較強(qiáng)的化學(xué)物，如曲酸和熊果苷，還沒有被證實(shí)具有臨床效果；氫醌，一種廣泛應(yīng)用的祛斑美白藥物，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)黑色素細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，是潛在的有絲分裂物?？朔@些缺點(diǎn)的一個(gè)可能的方向是應(yīng)用從天然物中提取的混合物，利用混合物中的各種成分的不同作用機(jī)制以抑制酪氨酸酶和過氧化物酶等，以聯(lián)合的方式起到抑制黑色素生成的作用。因此，從天然產(chǎn)物中提取化合物已成為化妝品的研究熱點(diǎn)，以滿足人們對(duì)祛斑美白產(chǎn)品的巨大需求。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的美白祛斑活性成分存在的不足，本發(fā)明的目的旨在提供一種更為有效與安全的美白祛斑活性成分一燈盞花甲醇提取物，以制備皮膚美白或祛斑化妝品、抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的藥物組合物和抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的食品。為了解決本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題，本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行了深入研究和反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)燈盞花甲醇提取物具有抑制酪氨酸酶活性和黑素生成的作用，從而完成了本發(fā)明。燈盞花，又名燈盞細(xì)辛，為菊科植物短葶飛蓬(ErigeronBreviscapus(Vant.)Hand—Mass)的全草，是主要產(chǎn)于中國西南地區(qū)的一種中草藥，具有祛風(fēng)除濕、活血化瘀、消炎止痛等功效，臨床上用于治療血栓形成等多種心腦血管疾病。但至今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)任何有關(guān)燈盞花甲醇提取物具有皮膚美白功效的報(bào)道。本發(fā)明所述的燈盞花甲醇提取物具有抑制酪氨酸酶活性和黑素生成作用，因此，本發(fā)明的燈盞花甲醇提取物可用于與皮膚美白祛斑有關(guān)癥狀的預(yù)防和治療，具體來說，可用于制備皮膚美白或/和祛斑化妝品、制備抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的醫(yī)藥品，以及制備抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的食品等。就燈盞花而言，其作為原料使用的部位不受特殊限制，可以是莖、葉、花、果實(shí)等，而且可以釆集后立即提取，也可以干燥后再提取，優(yōu)選將莖干燥后提取。作為本發(fā)明中燈盞花的甲醇提取法，不受特殊限制，通過使溶劑與燈盞花接觸來實(shí)施。提取可以在常溫下進(jìn)行，也可以在加溫下進(jìn)行。提取溫度不受特殊限制，操作上優(yōu)選小于或等于溶劑的沸點(diǎn)，提取所需時(shí)間根據(jù)溫度條件、提取方法的不同而不同，通常大于等于l小時(shí)。本發(fā)明的提取物可制成經(jīng)口用(內(nèi)服)和非經(jīng)口用(外用)的兩種制品形式。經(jīng)口用時(shí)，可把本發(fā)明提取物配成醫(yī)藥品或食品等形式。非經(jīng)口用時(shí)，可配成化妝品、醫(yī)藥外用品、皮膚外用劑等形式。本發(fā)明用途之一的化妝品可以是包括軟膏劑、溶液、乳霜、乳液、化妝水、洗劑、凝膠、美容液、粉底霜、填塞物、面膜、口紅、粘粘劑、淋浴液等各種皮膚外用劑在內(nèi)的任何一種形式的化妝品。本發(fā)明的提取物可以制備成目前流通的任何一種化妝品劑型。例如能制成溶液、懸浮劑、乳化劑、膏狀、凝膠、奶液、粉、香皂、含表面活性劑的清潔劑、油、干粉、粉底乳液、濕粉、噴劑等各種劑型。本發(fā)明的用途之二的醫(yī)藥品，可制成任何給藥方式的醫(yī)藥制品，為各種醫(yī)藥制劑形式。醫(yī)藥品制劑包括溶液劑、糖漿劑、注射劑、吸入劑、乳劑等液體制劑和片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、吸入劑等固體劑，以及軟膏皮膚外用劑和栓劑等外用制劑。本發(fā)明的用途之三的食品是指保健食品，包括餅干點(diǎn)心、飲料、蔬菜或果品加工品、畜肉制品和調(diào)味品等。其形式有粉末、固形制品、溶液等。根據(jù)其目的和制品形式，可適當(dāng)調(diào)整食品中燈盞花甲醇提取物的配比量。在不影響本發(fā)明效果的條件下，以本發(fā)明的燈盞花甲醇提取物制備的化妝品、醫(yī)藥品、食品等制品中，還可添加燈盞花甲醇提取物之外的常用于化妝品、醫(yī)藥品和食品的其他成分。對(duì)于化妝品，可添加油性成分、粉末、表面活性劑、保濕劑、增粘劑、低級(jí)醇、皮膜劑、多價(jià)鰲合劑、有機(jī)胺、pH調(diào)節(jié)劑、藥效成分、糖類、防腐劑、維生素類、其他美白劑、防氧化劑、香料和水等。所述油性成分包括液體石蠟、大顆粒蠟、三十碳烷基等碳?xì)浠衔?；硬脂酸等高?jí)脂肪酸類；十六烷醇、硬脂醇等高級(jí)醇；辛酸三甘油酯、十四烷酸異丙醇、蘋果酸二異硬脂酸酯、二一2—庚基十一垸酸甘油酮、三一2—乙基己酸三羥甲基丙烷等。根據(jù)化妝品的性狀和劑型，可適當(dāng)選擇調(diào)整化妝品中的油性成分含有量。所述粉末成分包括滑石粉、云母、高嶺土、二氧化硅、氧化鋅、云母鈦、氧化鈦、氧化鐵、尼龍粉末等。所述表面活性劑包括聚氧乙烯垸基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯等非離子表面活性劑；十六烷酸鈉等陰離子表面活性劑；氧化硬脂酸三甲基銨等陽離子表面活性劑；磺基三甲銨乙內(nèi)酯型兩性表面活性劑。所述保濕劑包括甘油、1，3—丁二醇、聚乙二醇等。所述增粘劑包括羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素、聚乙烯醇等水溶性高分子，膨潤土等粘土礦物。所述多價(jià)螯合劑包括EDTA.4Na、檸檬酸等。低級(jí)醇包括乙醇等。所述有機(jī)胺類包括乙醇胺和三乙醇胺等。所述pH調(diào)節(jié)劑包括；乳酸一乳酸鈉、檸檬酸一檸檬酸鈉等緩沖液。所述藥效成分包括；泛酸醇乙醚和甘草酸鹽等。所述糖類包括蔗糖、葡萄糖、果糖、透明質(zhì)酸等。所述防腐劑包括氨基乙基苯酸、對(duì)氨基丁基苯酸、安息香酸鈉等。所述維生素類包括維生素B類、維生素C及其衍生物、維生素E及其衍生物。所述美白劑包括抗壞血酸及其衍生物、曲酸及其衍生物、甘草提取物、氛醌衍生物、谷胱甘肽等。所述防氧化劑包括生育酚類、二丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯等。對(duì)于醫(yī)藥品，可添加賦形劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、稀釋劑、載體等添加成分。這些添加成分可以是淀粉、乳糖等糖類；硫酸鎂、滑石粉、明膠、羥丙基纖維素等纖維素衍生物；大豆油、芝麻油、動(dòng)物油或合成油等油類；橡膠；生理鹽水等水分；乙醇、1，3—丁二醇、聚二烯醇等醇類。另外，還可在上述配制化妝品的成分中選擇添加成分。對(duì)于食品，可添加甜味劑、酸味劑、保存劑、香料、著色劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、稀釋劑、載體等添加成分。這些添加成分包括蘑菇提取液、人參提取液、生姜提取液、蜂蜜等各種食品提取液、液狀食品。作為糖類可以是環(huán)狀低聚糖、還原麥芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖脂肪酸酯等糖類。另外，還可在上述配制化妝品和醫(yī)藥品的成分中選擇添加成分。燈盞花甲醇提取物臨床上被批準(zhǔn)用于治療腦血栓形成的多種心腦血管疾病已有多年，已證明安全無毒。本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)并通過實(shí)驗(yàn)證明燈盞花甲醇提取物能有效地抑制酪氨酸酶活性和黑素生成，即有效地抑制皮膚的色素沉積，藥理作用強(qiáng)，對(duì)皮膚沒有副作用，可美白紫外線照射后曬黑的皮膚，預(yù)防、改善和治療因日曬引發(fā)的老人斑、雀斑、紅斑等皮膚色素沉積癥狀，為燈盞花甲醇提取物發(fā)掘了一個(gè)全新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新應(yīng)用領(lǐng)域，預(yù)示著燈盞花甲醇提取物有更好的藥用前景。作為燈盞花甲醇提取物生產(chǎn)原料的燈盞花，其莖、葉、花、果實(shí)等都可作為原料，而且可以采集后立即用于提取，也可以干燥后再進(jìn)行提取，來源豐富，價(jià)格低廉。燈盞花甲醇提取物的提取制備工藝成熟，操作易于掌握。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，闡述燈盞花甲醇提取物在美白祛斑防治中的有益效果。實(shí)施例1——燈盞花甲醇提取物提取制備燈盞花甲醇提取物可通過以下方法制備干燥的燈盞花全枝莖500g,用甲醇在室溫下浸泡12小時(shí)左右，浸泡提取結(jié)束后，經(jīng)過濾、減壓濃縮、干燥成粉末即為燈盞花甲醇提取物。實(shí)施例2——燈盞花甲醇提取物對(duì)純化蘑菇酪氨酸酶的抑制作用試驗(yàn)方法將蘑菇酪氨酸酶(Sigma，E.C丄14.18.1)用于研究試驗(yàn)例1制備的粉末燈盞花提取物的抑制活性。將酪氨酸酶溶解于1A5M的磷酸緩沖液(PH6.8)，使酶溶液的濃度為368U/ml。作為底物，在1/15M的磷酸緩沖液(PH6.8)中溶解L一3，4—二羥基苯丙氨酸(L一DOPA)，使L一DOPA濃度為5mM/ml。燈盞花甲醇提取物用蒸餾水配制成0，125,250，500，1000,2000嗎/ml5個(gè)濃度。以上溶液均為現(xiàn)用現(xiàn)配。在25。C,依次向試管中加入5mM的左旋多巴(L-DOPA)0.8ml、1/15M的PBS(PH6.8)1.2ml以及0.1ml的受試物，陰性對(duì)照組加入等量蒸餾水，37'C孵育5min，再加入368U/ml的蘑燕酪氨酸酶0.3ml，調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的波長為A475，測(cè)定反應(yīng)0.5min和2min后的光吸收值，用L-DOPA的自身氧化作參比。使用曲酸作為陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)以下公式計(jì)算酶抑制率-[(A-B)-(C-D)]/(A-B)其中A:陰性對(duì)照組2分鐘時(shí)475nm處吸光度；B:陰性對(duì)照組0.5分鐘時(shí)475nm處吸光度；C:受試物組2分鐘時(shí)475nm處吸光度；D:受試物組0.5分鐘時(shí)475nm處吸光度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)后顯示125~1000pg/ml的燈盞花甲醇提取物對(duì)酪氨酸酶活性具有抑制作用，抑制率為9.49%~73.33%，且隨濃度增加，抑制作用也逐漸增加，并呈劑量依賴性(P<0.05)。表1燈盞花提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>)受試物濃度(ug/ml)酶抑制率(％)陰性對(duì)照00燈盞花甲醇提取物1259.43±1.4725029.10±2.6250047.47±4.69100073.14±2.16200096.05±1.64曲酸(陽性對(duì)照)6.2520.558±3.6212.532.68±2.952550.39±2.565076.74±1.37100103.5±8.51實(shí)施例3—J燈盞花甲醇提取物對(duì)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制作用試驗(yàn)方法B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞(四川大學(xué)衛(wèi)生部移植工程與移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)，將培養(yǎng)的細(xì)胞消化配置成單個(gè)細(xì)胞懸液后，以lxl()S/rnl細(xì)胞密度接種于6孔板，將6孔板放入C02孵箱，在37'C、5%<:02及飽和濕度條件下，培養(yǎng)24小時(shí)后添加含受試物的培養(yǎng)液2ml，72h后消化并收集細(xì)胞。用離心機(jī)以1000r/min頻率離心5min，用PBS洗2次，加入PBS制成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)細(xì)胞密度后，調(diào)整細(xì)胞密度為lxlO"ml。取lml細(xì)胞懸液離心后棄去上清液，加入l%TritonX-100(用PH7.4的磷酸緩沖液S配制)lml,迅速放入-8(TC冰箱冷凍，30min后取出在37'C溶解，加入5mM的L-DOPA2ml。調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的波長為A475，測(cè)定即時(shí)反應(yīng)的光吸收值；再置于37'C條件下30min后測(cè)定光吸收值。均用L-DOPA的自身氧化作為參比。以曲酸作為陽性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)以下公式計(jì)算酶抑制率=[(A-B)-(C-D)]/(A-B)其中A:陰性對(duì)照組37'C孵育30分鐘后475nm處吸光度；B:陰性對(duì)照組37'C孵育前475nm處吸光度；C:受試物組37'C孵育30分鐘后475nm處吸光度；D:受試物組37'C孵育前475nm處吸光度；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)后顯示31.25~25(Hig/ml燈盞花甲醇提取物對(duì)活體B16細(xì)胞的酪氨酸酶的活性和細(xì)胞內(nèi)黑素含量有抑制作用，酶抑制率為9.95%~80.36%,且隨著濃度的增加其對(duì)活體細(xì)胞酪氨酸酶活性的抑制作用越強(qiáng)，并呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。表2燈盞花甲醇提取物對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響(4s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例4一燈盞花甲醇提取物對(duì)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑素生成的抑制作用試驗(yàn)方法U)黑素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用含10%DMSO的Imol/lNaOH溶液配制6個(gè)黑素(Sigma)溶液濃度，分別為0、40、80、120、160、20(Hig/ml，各濃度終體積均為3ml。將配置好的黑素系列液置于80'C水浴中30分鐘后，調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的波長為475nm,測(cè)定黑素系列液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制黑素標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及細(xì)胞懸液蛋白濃度的測(cè)定按照蛋白分析試劑盒(Bio—Rad)進(jìn)行。(3)B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞將培養(yǎng)的細(xì)胞消化配置成單個(gè)細(xì)胞懸液后，以lxl05/ml細(xì)胞密度接種于6孔板，將6孔板放入C02孵箱，在37'C、5%C02及飽和濕度條件下，培養(yǎng)24小時(shí)后添加含受試物的培養(yǎng)液2ml，72h后消化并收集細(xì)胞。用離心機(jī)以1000r/min頻率離心5min，用PBS洗2次，加入PBS制成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)細(xì)胞密度后，調(diào)整細(xì)胞密度為lxl06/ml。取上述細(xì)胞懸液lml離心去上清液，加入3ml含10%DMSO的1mol/lNaOH溶液，80。C水浴30min,測(cè)定A475。根據(jù)黑素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黑素含量，用蛋白含量進(jìn)行校正。按公式(i)黑素含量=黑素濃度/蛋白含量、公式(ii)黑素生成抑制率=(對(duì)照黑素含量-藥物黑素含量)/對(duì)照黑素含量，求出黑素生成抑制率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)后顯示31.25~25(Hig/ml燈盞花甲醇提取物對(duì)活體B16細(xì)胞的酪氨酸酶的活性和細(xì)胞內(nèi)黑素含量有抑制作用，黑素生成抑制率為4.33%69.22%，且隨著濃度的增加其對(duì)活體細(xì)胞黑素生成的抑制作用越強(qiáng)，并呈劑量依賴性(P<0.05)。見表3。表3燈盞花甲醇提取物對(duì)B16細(xì)胞黑素含量的影響(4s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例5—燈盞花甲醇提取物毒理學(xué)評(píng)價(jià)(第一階段和致突變?cè)u(píng)價(jià))(1)第一階段評(píng)價(jià)試驗(yàn)所用動(dòng)物均由由四川省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào):SCXK(川)2004-16號(hào)。實(shí)驗(yàn)前檢疫一周，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物房(許可證號(hào)四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)第Oll號(hào))，動(dòng)物自由攝食和飲水，動(dòng)物房溫度20'C24'C，相對(duì)濕度60%~75%。a)大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)采用最大限量法。設(shè)5000mg/kg—個(gè)劑量組，20只SD大鼠，雌雄各半。以lml/100g.bw于動(dòng)物空腹下一次性灌胃染毒。灌胃后觀察其中毒癥狀、體征，連續(xù)觀察二周，判定毒性分類。燈盞花甲醇提取物5g/kg.bw劑量經(jīng)口染毒后，兩周內(nèi)未見動(dòng)物死亡，亦無明顯的中毒癥狀或不良反應(yīng)，結(jié)果見表4。兩周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剖殺全部動(dòng)物，內(nèi)臟器官未見明顯異常改變。即燈盞花甲醇提取物對(duì)雌、雄性SD大鼠的急性經(jīng)口MTD大于5g/kg.bw，屬實(shí)際無毒類。表4燈盞花甲醇提取物對(duì)SD大鼠的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b)大鼠急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)采用最大限量法。設(shè)5000mg/kg—個(gè)劑量組，20只SD大鼠，雌雄各半。備皮:剪去大鼠脊柱兩側(cè)的被毛，去毛面積為4X5cm2。24h后確認(rèn)無皮膚損傷，以1m1/100g.bw將該劑量組溶液滴于6層紗布上，貼敷于己去毛的皮膚上，覆蓋稱量紙，膠布固定。4h后，取下紗布，洗去殘留物，觀察其中毒癥狀、體征，連續(xù)觀察二周，判定其毒性分類。燈盞花甲醇提取物5g/kg.bw劑量經(jīng)皮染毒后，兩周內(nèi)未見動(dòng)物死亡，亦無明顯的中毒癥狀或不良反應(yīng)，結(jié)果見表5。兩周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剖殺全部動(dòng)物，內(nèi)臟器官未見明顯異常改變。即燈盞花甲醇提取物對(duì)雌、雄性SD大鼠的急性經(jīng)皮MTD大于5g/kg.bw，屬實(shí)際無毒類。表5燈盞花甲醇提取物對(duì)SD大鼠的急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>c)皮膚刺激性試驗(yàn)家兔急性皮膚刺激試驗(yàn)白色家兔4只，剪去脊柱兩側(cè)的被毛，去毛面積兩側(cè)各為2x3cm2，24h后確認(rèn)無皮膚損傷，將0.5mg燈盞花甲醇提取物原粉涂布在已去毛的兔背右側(cè)皮膚上，左側(cè)用蒸餾水作對(duì)照，覆蓋2層紗布和稱量紙，膠布固定。持續(xù)4h后，取下紗布，洗去殘留物，觀察去除受試物后的l、24、48及72h的皮膚刺激反應(yīng)和恢復(fù)情況，計(jì)算刺激反應(yīng)的平均分值，作出評(píng)價(jià)。多次皮膚刺激性試驗(yàn)白色家兔4只，剪去脊柱兩側(cè)的被毛，去毛面積兩側(cè)各為2x3cm2，24h后確認(rèn)無皮膚損傷，將0.5mg燈盞花甲醇提取物原粉涂布在已去毛的兔背右側(cè)皮膚上，左側(cè)用蒸餾水作對(duì)照，每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14d。從第二天開始，每次涂抹前應(yīng)剪毛，用水清除殘留受試物。一小時(shí)后觀察結(jié)果，計(jì)算刺激反應(yīng)的平均分值，作出評(píng)價(jià)。燈盞花甲醇提取物對(duì)四只家兔急性皮膚刺激反應(yīng)和多次皮膚刺激反應(yīng)的紅斑、水腫形成評(píng)分之和的均值最高為0，見表6,7。根據(jù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，表明燈盞花甲醇提取物對(duì)家兔皮膚無刺激性。表6燈盞花甲醇提取物對(duì)家兔皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表7燈盞花甲醇提取物對(duì)家兔多次皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>d)家兔眼刺激試驗(yàn)白色家兔4只，確認(rèn)無眼疾病后，在一側(cè)眼結(jié)膜囊中滴入O.lmg的燈盞花甲醇提取物原粉，另一側(cè)眼作空白對(duì)照。觀察滴眼后l、24、48、72h及4、7d的眼結(jié)膜、虹膜、角膜的刺激反應(yīng)和恢復(fù)情況，計(jì)算眼刺激積分指數(shù)，作出評(píng)價(jià)。燈盞花甲醇提取物對(duì)四只家兔眼睛急性刺激反應(yīng)的最高刺激指數(shù)均值為0.25，見表8，24h后為0，根據(jù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，表明燈盞花甲醇提取物對(duì)家兔眼睛無刺激性。_表8燈盞花甲醇提取物對(duì)家兔眼睛刺激性試驗(yàn)結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>e)豚鼠皮膚致敏試驗(yàn)60只成年豚鼠，隨機(jī)分為3個(gè)組，即受試物組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組。每組20只，雌雄各半。經(jīng)預(yù)試，燈盞花甲醇提取物對(duì)皮膚無明顯刺激，正式試驗(yàn)采用原粉。陽性藥物用2%的2,4-二硝基氯苯。試驗(yàn)方法如下致敏接觸。試驗(yàn)前24h剪去豚鼠背部左側(cè)的被毛，面積為3x3cm2。24h后確認(rèn)無皮膚損傷，分別將涂有0.2mg的燈盞花甲醇提取物或0.2ml的2%的2，4-二硝基氯苯的濾紙貼敷于豚鼠已去毛區(qū)，封閉固定，持續(xù)6h后，去除斑貼，洗去殘留物。第7天和第14天以同樣方法各重復(fù)誘導(dǎo)一次。陰性對(duì)照組不經(jīng)致敏誘導(dǎo)。激發(fā)接觸于末次致敏后15d，用上述方法在另一側(cè)己去毛皮膚進(jìn)行激發(fā)接觸試驗(yàn)；陰性對(duì)照組僅用受試物進(jìn)行激發(fā)接觸。激發(fā)接觸后24h和48h觀察皮膚反應(yīng)，進(jìn)行評(píng)分,判定受試物的致敏強(qiáng)度。陰性對(duì)照組動(dòng)物均未出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)，陽性對(duì)照組豚鼠經(jīng)三次誘導(dǎo)和一次激發(fā)后，所有動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度紅斑、水腫，致敏率達(dá)100%，提示本試驗(yàn)系統(tǒng)是可靠的。而經(jīng)燈盞花甲醇提取物三次誘導(dǎo)、二次激發(fā)試驗(yàn)組動(dòng)物均未出現(xiàn)紅斑和水腫，致敏率為0%，見表9。試驗(yàn)結(jié)果表明燈盞花甲醇提取物對(duì)豚鼠皮膚屬弱致敏物。表9燈盞花甲醇提取物對(duì)豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果注在皮膚反應(yīng)強(qiáng)度欄為當(dāng)皮膚反應(yīng)積分為O、1、2、3...時(shí)，發(fā)生反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)占受試動(dòng)物數(shù)的比例(2)致突變?cè)囼?yàn)a)Ames試驗(yàn)釆用經(jīng)鑒定符合要求的TA97、TA98、TA100和TA102菌株,進(jìn)行加與不加大鼠肝S9的標(biāo)準(zhǔn)平皿摻入法試驗(yàn)(S9mix用量為0.5ml/皿)。設(shè)四個(gè)燈盞花甲醇提取物劑量組40、200、1000和5000pg/皿(準(zhǔn)確稱取受試物1.0g，加蒸餾水至20ml得最高工作濃度50mg/ml，取該液100pl加入平皿為最高終濃度5000^g/皿。其它濃度以最高工作濃度為基礎(chǔ)，依次用蒸餾水5倍往下稀釋)，同時(shí)設(shè)自發(fā)對(duì)照、溶劑對(duì)照(蒸餾水100W皿)和陽性對(duì)照。不加S9試驗(yàn)的陽性對(duì)照為2，4，7-TNFone(0.2pg/皿，適用菌株TA97、TA98);4-NQNO(0.5ng/皿，適用菌株TA100)、MMC(0.5pg/皿，適用菌株TA102);力[]S9試驗(yàn)的陽性對(duì)照為2-AF(10.0ng/皿，適用菌株TA97、TA98、TAIOO)、1，8-二羥基蒽醌(Dan)(50.0pg/皿，適用菌株TA102)。每個(gè)試驗(yàn)劑量作三個(gè)平行皿，重復(fù)試驗(yàn)一次。本試驗(yàn)結(jié)果表明，無論加與不加S9的試驗(yàn)，自發(fā)對(duì)照組的每皿平均回變菌落數(shù)均在正常值范圍內(nèi)，而陽性對(duì)照組誘發(fā)的每皿平均回變菌落數(shù)均為自發(fā)對(duì)照組二倍以上，呈明顯陽性反應(yīng)。燈盞花甲醇提取物各劑量組的平均回變菌落數(shù)均未超過溶劑對(duì)照組的一倍，呈陰性反應(yīng)，即燈盞花甲醇提取物無誘導(dǎo)試驗(yàn)菌株回復(fù)突變的作用。b)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)以CHL細(xì)胞(中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞系，由上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供)進(jìn)行加與不加S9的染色體畸變?cè)囼?yàn)。用MTT法檢測(cè)燈盞花甲醇提取物對(duì)CHL細(xì)胞的半數(shù)生長抑制濃度(ICso)，得燈盞花甲醇提取物(24h)ICso為5.92mg/ml。正式試驗(yàn)設(shè)5.92，2.96，1.48mg/ml三個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(不含血清MEM培養(yǎng)基)和陽性對(duì)照，加S9試驗(yàn)增設(shè)S9對(duì)照。不加S9試驗(yàn)的陽性對(duì)照為MMC(0.5yg/ml，作用24小時(shí))，加S9試驗(yàn)的陽性對(duì)照為CP(20ug/ml，作用6小時(shí))，陽性對(duì)照均釆用1%體積皮膚反應(yīng)強(qiáng)度^—:i的動(dòng)-物數(shù)(％)123401232000.2mg200.2mg0.2mg200.2ml0.2ml2410000048100000241000004810000024001545480010300100000010000001000000100000400203050600102565察間w觀時(shí)&發(fā)量激劑導(dǎo)量誘齊動(dòng)物數(shù)且經(jīng)性照試組性照陰対受物陽對(duì)比加至5ml的MEM培養(yǎng)基中。每個(gè)試驗(yàn)劑量作兩個(gè)平行樣，重復(fù)試驗(yàn)一次。按510X10"個(gè)/ml的密度接種細(xì)胞，24小時(shí)貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。不加S9時(shí)，每個(gè)25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5mlMEM受試物浸提液，處理6小時(shí)或24小時(shí)。結(jié)束后，吸去含受試物的培養(yǎng)液，用Hanks液洗細(xì)胞3次，加入含10%新生小牛血清的培養(yǎng)液5ml，放回培養(yǎng)箱，于24h內(nèi)收獲細(xì)胞；加S9時(shí)，每個(gè)25ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入4.5mlMEM受試物浸提液，0.5mlS9混合液，處理6小時(shí)或24小時(shí)后，棄培養(yǎng)液，用Hanks液洗細(xì)胞3次，加入含10%新生小牛血清的培養(yǎng)液5ml，放回培養(yǎng)箱，于24h內(nèi)收獲細(xì)胞。于收獲前4h,加入終濃度為0.2ug/ml秋水仙堿，培養(yǎng)4小時(shí)后收獲細(xì)胞，低滲、固定后常規(guī)制片染色，每個(gè)劑量組油鏡下觀察分裂中期相細(xì)胞100個(gè)，記錄畸變類型，計(jì)算細(xì)胞染色體畸變率(％)。試驗(yàn)結(jié)果表明，無論是培養(yǎng)6小時(shí)或24小時(shí)兩個(gè)時(shí)間段，加S9與不加S9，陽性對(duì)照組的染色體畸形率顯著高于空白對(duì)照組(尸O.Ol)，畸變類型以斷裂、缺失和交換為主；燈盞花甲醇提取物各劑量組和S9對(duì)照組的染色體畸形率均<5%，且與空白對(duì)照組比較均無顯著性差異(尸〉0.05),即燈盞花甲醇提取物在CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)中為陰性結(jié)果。權(quán)利要求1、燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用。2、如權(quán)利要求l所述燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用，其特征是燈盞花甲醇提取物在制備皮膚美白或/和祛斑化妝品中的應(yīng)用。3、如權(quán)利要求l所述燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用，其特征是燈盞花甲醇提取物在制備抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成藥物中的應(yīng)用。4、如權(quán)利要求l所述燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用，其特征是燈盞花甲醇提取物在制備抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成食品中的應(yīng)用。5、如權(quán)利要求2所述的燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用，其特征是所述化妝品為軟膏劑、溶液、乳霜、乳液、化妝水、洗劑、凝膠、美容液、粉底霜、填塞物、面膜、口紅、粘粘劑和淋浴液中的一種形式。6、如權(quán)利要求2或5所述的燈盞花甲醇提取物在在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用，其特征在于所述化妝品中添加有油性成分、粉末、表面活性劑、保濕劑、增粘劑、低級(jí)醇、皮膜劑、多價(jià)鰲合劑、有機(jī)胺、pH調(diào)節(jié)劑、藥效成分、糖類、防腐劑、維生素類、其他美白劑、防氧化劑、香料和水中的至少一種。7、如權(quán)利要求3所述的燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中添加有賦形劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、稀釋劑和載體中的至少一種。8、如權(quán)利要求4所述的燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用，其特征在于所述食品中添加有可添加甜味劑、酸味劑、保存劑、香料、著色劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、稀釋劑和載體中的至少一種。全文摘要本發(fā)明公開了燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應(yīng)用，即以燈盞花提取物為活性成分制備皮膚美白或/和祛斑化妝品、抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的醫(yī)藥品和食品。實(shí)驗(yàn)證明，燈盞花甲醇提取物能有效地抑制酪氨酸酶活性和黑素生成，且對(duì)皮膚沒有副作用，可美白紫外線照射后曬黑的皮膚，預(yù)防、改善和治療因日曬引發(fā)的老人斑、雀斑、紅斑等皮膚色素沉積癥狀。本發(fā)明發(fā)掘了燈盞花甲醇提取物的一個(gè)全新用途，有極好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61K133/00GK101125155SQ20071004976公開日2008年2月20日申請(qǐng)日期2007年8月15日優(yōu)先權(quán)日2007年8月15日發(fā)明者徐培渝,熊靜芳,黃毅娜申請(qǐng)人:四川大學(xué)