一種測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的方法，該方法主要包括以下步驟：（1）燈盞花素片供試品溶液的制備；（2）燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR檢測；（3）燈盞花素片供試品溶液中野黃芩苷的1H-NMR結(jié)構(gòu)解析及定量峰的選擇；（4）燈盞花素片中野黃芩苷的定量分析，本發(fā)明建立的燈盞花素片中野黃芩苷含量的測定方法不僅具有簡單快速、專屬性強、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，而且無需被測化合物的對照品即可實現(xiàn)準確定量，可以彌補現(xiàn)有標準和其他定量方法的不足，可應用于燈盞花素片的質(zhì)量控制。
【專利說明】一種測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥質(zhì)量分析領域，具體是涉及一種測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]燈蓋花素片是由菊科植物短葶飛蓬(燈蓋細辛)Erigeron breviscapus (Vant.)Hand.-Mazz.提取物制成，主要成分為野黃芩苷(4'-羥基黃芩苷，又稱燈盞花乙素)和少量的燈盞花甲素，具有散寒解表、活血化瘀、通絡止痛的功效，臨床上用于中風后遺癥、冠心病、心絞痛等的治療?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標準?中藥成分制劑》第二十冊中收載了燈盞花素片，標準中規(guī)定采用紫外分光光度法測定本品中野黃芩苷的含量，該方法缺乏專屬性，只能測得總黃酮的含量，不能反映野黃芩苷的真實含量，難以滿足燈盞花素片質(zhì)量控制的要求，而藥品的質(zhì)量是保障其臨床療效和安全性的前提。因此，建立一種專屬的測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的方法十分重要。
[0003]定量核磁共振法(quantitative nuclear magnetic resonance, qNMR)與常規(guī)的定量方法如紫外分光光度法、HPLC、GC相比較，無需對照品、不破壞樣品、樣品預處理步驟簡單，具有快速、準確、專屬性強等優(yōu)點，已在化學、食品、農(nóng)業(yè)領域中得到廣泛應用。近年來，qNMR法在藥學領域中的應用得到了發(fā)展，如藥品質(zhì)量控制、候選藥物純度檢測、藥物體內(nèi)代謝物研究等。目前，美國藥典、歐洲藥典、英國藥典均收載該法，中國藥典2010年版二部附錄IX也首次收載了核磁共振波譜法。在qNMR中，1H-qNMR因靈敏度高、重復性好得到了廣泛應用，其定量分析的基 礎是核磁共振譜中質(zhì)子信號峰的積分面積與產(chǎn)生該信號的氫原子數(shù)成正比，因此根據(jù)被測化合物與內(nèi)標化合物的峰面積及內(nèi)標化合物的濃度，即可計算被測化合物的濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的1H-CiNMR方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]一種測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的方法，包括以下步驟:
[0007](I)燈盞花素片供試品溶液的制備
[0008]取燈盞花素片，粉碎，取粉末20.0mg,精密稱定，置于2mL的量瓶中，加入氘代二甲基亞砜溶解并定容至刻度，精密移取ImL上述溶液置于2mL的量瓶中，加入ImL濃度為
0.lmg/mL的3-三甲基娃基丙酸鈉_d4的重水定容至刻度,混勻，14000rpm離心10分鐘,取上清液，作為燈盞花素片供試品溶液；
[0009](2)燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR檢測
[0010]取0.6mL步驟(1)所得的燈盞花素片供試品溶液，轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中密封，將核磁管置于核磁共振儀中，按以下條件進行1H-NMR檢測:抑水峰序列zgcppr，觀測頻率600.23MHz，測定溫度297.7K，譜寬12335.5Hz，90°脈沖寬度13 μ S，數(shù)據(jù)采樣點65536，掃描次數(shù)16次，延遲時間15s，接受增益203，得到燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR譜圖；
[0011](3)燈盞花素片供試品溶液中野黃芩苷的1H-NMR結(jié)構(gòu)解析及定量峰的選擇
[0012]根據(jù)燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR譜圖，對其化學位移和耦合常數(shù)進行歸屬，解析化合物為野黃芩苷，具體為 6 7.93:2H, d, J=9Hz, H-2' ’6, ； 8 6.98:3H, m, H-8，3’，5’ ；8 6.82:1H, s, H-3 ； S 5.22: 1H, d, J=7.2Hz, H_1 " ； 8 4.03:1H, d, J=9.6Hz, H-5 ";選取其中無干擾的質(zhì)子信號峰IH或2H或3H作為野黃芩苷的定量峰；或選取其中無干擾的質(zhì)子信號峰IH和2H，或IH和3H，或2H和3H作為野黃芩苷的定量峰；或同時選取其中無干擾的質(zhì)子信號峰1H、2H和3H作為野黃芩苷的定量峰，其中質(zhì)子信號峰1H、2H、3H的化學位移5分別為 6.82、7.93、6.98ppm ；
[0013](4)燈盞花素片中野黃芩苷的定量分析
[0014]按步驟(I)制備燈盞花素片供試品溶液，按步驟(2)進行1H-NMR檢測，按步驟(3)所選定的定量峰采用內(nèi)標法計算燈盞花素片中野黃芩苷的含量。
[0015]本發(fā)明建立的測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的方法，不僅具有簡單快速、專屬性強、重現(xiàn)性好等特點，而且無需被測化合物的對照品即可實現(xiàn)準確定量，可以彌補現(xiàn)有標準和其他定量方法的不足，可應用于燈盞花素片的質(zhì)量控制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR譜圖。
[0017]圖2為不同產(chǎn)家和/或不同批次燈盞花素片1H-NMR譜圖比較。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0019]儀器與試藥
[0020]BRUKER AVANCE III 600型超導核磁共振波譜儀(德國BRUKER公司)，質(zhì)子激發(fā)頻率600.23MHz,配置BBFO正相觀察寬帶探頭和BVT3200數(shù)字控溫儀；WG-5000核磁管(美國Wilmad公司)；氣代二甲基亞砜(DMS0-d6)(氣代度>99.8%,美國Cambridge IsotopeLaboratories有限公司);重水(D2O)(氘代度>99.8%，美國SAFC公司);3_三甲基硅基丙酸鈉-d4 (TSP)(氘代度>98%，美國Sigma-Aldrich公司)；實驗用樣品為市售的不同產(chǎn)家和/或不同批次的燈盞花素片，分別為云南生物谷藥業(yè)股份有限公司(批號:20130502、20120102)、昆明興中制藥有限責任公司(批號:20100201)、云南白藥集團興中制藥有限公司(批號:20110202)、滇虹藥業(yè)集團玉溪生物制藥有限公司(批號:20120501、20130301)。
[0021]實施例1
[0022]一種測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的方法，包括以下步驟:
[0023](I)燈盞花素片供試品溶液的制備
[0024]取燈盞花素片，粉碎，取粉末20.0mg,精密稱定，置于2mL的量瓶中，加入氘代二甲基亞砜溶解并定容至刻度，精密移取ImL上述溶液置于2mL的量瓶中，加入ImL濃度為
0.lmg/mL的3-三甲基娃基丙酸鈉_d4的重水定容至刻度,混勻，14000rpm離心10分鐘,取上清液，作為燈盞花素片供試品溶液。
[0025](2)燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR檢測[0026]取0.6mL步驟(1)所得的燈盞花素片供試品溶液，轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中密封，將核磁管置于核磁共振儀中，按以下條件進行1H-NMR檢測:抑水峰序列zgcppr，觀測頻率600.23MHz，測定溫度297.7K，譜寬12335.5Hz，90°脈沖寬度13 y S，數(shù)據(jù)采樣點65536，掃描次數(shù)16次，延遲時間15s，接受增益203，得到燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR譜圖(見圖1)。
[0027](3)燈盞花素片供試品溶液中野黃芩苷的1H-NMR結(jié)構(gòu)解析
[0028]根據(jù)燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR譜圖，對其化學位移和耦合常數(shù)進行歸屬，解析化合物為野黃芩苷，具體為 6 7.93:2H, d, J=9Hz, H-2' ’6, ； 8 6.98:3H, m, H-8，3’，5’ ；8 6.82:1H, s, H-3 ； 8 5.22:1H, d, J=7.2Hz, H-1 " ； 8 4.03:1H, d, J=9.6Hz, H-5 "。
[0029](4)燈盞花素片供試品溶液中野黃芩苷定量峰的選擇
[0030]根據(jù)(3)的解析結(jié)果，選取其中無干擾的質(zhì)子信號峰IH作為野黃芩苷的定量峰，采用內(nèi)標法進行計算，其中質(zhì)子信號峰IH的化學位移8為6.82ppm。
[0031](5)選擇一種質(zhì)子信號峰作為定量峰的含量計算公式
【權(quán)利要求】
1.一種測定燈盞花素片中野黃芩苷含量的方法，其特征是包括以下步驟: (1)燈盞花素片供試品溶液的制備 取燈盞花素片，粉碎，取粉末20.0mg，精密稱定，置于2mL的量瓶中，加入氘代二甲基亞砜溶解并定容至刻度，精密移取ImL上述溶液置于2mL的量瓶中，加入ImL濃度為0.lmg/mL的3-三甲基硅基丙酸鈉-d4的重水定容至刻度，混勻，HOOOrpm離心10分鐘，取上清液，作為燈盞花素片供試品溶液； (2)燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR檢測 取0.6mL步驟(I)所得的燈盞花素片供試品溶液，轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中密封，將核磁管置于核磁共振儀中，按以下條件進行1H-NMR檢測:抑水峰序列zgcppr，觀測頻率.600.23MHz，測定溫度297.7K，譜寬12335.5Hz，90°脈沖寬度13 μ S，數(shù)據(jù)采樣點65536，掃描次數(shù)16次，延遲時間15s，接受增益203，得到燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR譜圖； (3)燈盞花素片供試品溶液中野黃芩苷的1H-NMR結(jié)構(gòu)解析及定量峰的選擇 根據(jù)燈盞花素片供試品溶液的1H-NMR譜圖，對其化學位移和耦合常數(shù)進行歸屬，解析化合物為野黃芩苷，具體為 5 7.93:2H, d, J=9Hz,H-2/，6' ; δ 6.98:3H，m，H-8，3’，5’ ；. 6.82:1Η, s, Η-3 ； δ 5.22:1Η, d, J=7.2Hz, H-1 " ； δ 4.03:1Η, d, J=9.6Ηζ, Η_5 ";選取其中無干擾的質(zhì)子信號峰IH或2Η或3Η作為野黃芩苷的定量峰；或選取其中無干擾的質(zhì)子信號峰IH和2Η，或IH和3Η，或2Η和3Η作為野黃芩苷的定量峰；或同時選取其中無干擾的質(zhì)子信號峰1Η、2Η和3Η作為野黃芩苷的定量峰，其中質(zhì)子信號峰1Η、2Η、3Η的化學位移δ分別為 6.82、7.93、6.98ppm ； (4)燈盞花素片中野黃芩苷的定量分析 按步驟(I)制備燈盞花素片供試品溶液，按步驟(2)進行1H-NMR檢測，按步驟(3)所選定的定量峰采用內(nèi)標法計算燈盞花素片中野黃芩苷的含量。
【文檔編號】G01N24/08GK103776861SQ201410028292
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】李文寶, 江振作, 李安平, 王福海, 王躍飛, 焦玉嬌, 姜苗苗, 柴欣 申請人:瀚盟生物技術(shù)（天津）有限公司, 天津中醫(yī)藥大學