專利名稱：一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備預(yù)防和治療奶牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種獸用藥品，更具體地說，本發(fā)明涉及的是一種短棒狀桿菌制 劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備預(yù)防和治療奶牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
短棒狀桿菌菌苗(CPV，1995版《中國生物制品規(guī)程》)或稱短棒狀桿菌制劑(CPP， 2000版《中國生物制品規(guī)程》)是一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑。它是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)滅 活后制成的死菌苗，其制備過程公開在1995版及2000版《中國生物制品規(guī)程》。目前應(yīng)用 的CPP制劑還有法國Merleux研究所生產(chǎn)的滅活菌苗；英國Wellcome藥廠生產(chǎn)的滅活菌苗寸。CPP具有激活單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的能力。CPP對免疫系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)在激活 單核巨噬細(xì)胞、使NK細(xì)胞活性增強(qiáng)、促進(jìn)機(jī)體對多種抗原產(chǎn)生IgG和IgM、誘生干擾素、白細(xì) 胞介素-2等，因此具有抗腫瘤和抗感染作用。CPP的抗腫瘤作用已為許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究所證實(shí)。對實(shí)驗(yàn)動物接種腫瘤前后應(yīng) 用CPP，能顯著抑制某些實(shí)體瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型腫瘤及白血病的生長。腫 瘤消退的動物對于再次攻擊的腫瘤細(xì)胞有特異性的抵抗力。CPP對腫瘤轉(zhuǎn)移亦有抑制作用。CPP抗腫瘤及抗感染的核心是通過激活巨噬細(xì)胞，使其數(shù)量和質(zhì)量大大提高，激活 的巨噬細(xì)胞可將腫瘤細(xì)胞及感染的微生物殺死。CPP作為免疫調(diào)節(jié)劑用于腫瘤及其它疾病的治療已有數(shù)十年的歷史，其通過激活 單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)抗腫瘤、抗感染的效果已被公認(rèn)。CPP作為一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，其 有效性是至今為止發(fā)現(xiàn)的最好的制品之一。但由于存在一定的副作用，如發(fā)燒、胸痛、注射 局部易產(chǎn)生腫痛、硬結(jié)等副作用，限制了其應(yīng)用。中國專利 02123571. 6,02123570. 8、02123572. 4 和 03157454. 8 中已經(jīng)公開了一種
一種無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑、其制備方法、在制備治療結(jié)核病藥物上的用途以及在制備治 療HIV感染或艾滋病藥劑中的應(yīng)用。奶牛乳腺炎是奶牛常見疾病之一，隨著奶牛業(yè)的迅速發(fā)展，該病發(fā)生率明顯升高， 其中臨床乳腺炎發(fā)病率達(dá)20-40 %，隱形乳腺炎發(fā)病率高達(dá)50-80 %。病牛若得不到及時治 療，將會導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量大大下降，甚至造成無奶，嚴(yán)重影響奶牛的生產(chǎn)性能，這無疑會給 奶牛養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過科學(xué)研究、實(shí)驗(yàn)證明病原微生物是引起乳腺炎的主要病原，環(huán)境因素及管理 方法、牛體狀況也與本病的發(fā)生有關(guān)。引起乳腺炎的主要病原菌是無乳鏈球菌、停乳鏈球 菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，其次有綠膿桿菌、化膿性棒狀桿菌、乳房鏈球菌、諾卡氏菌 等，另外，真菌如念珠菌屬、毛孢子菌、胞漿菌屬等、支原體如牛型支原體等、病毒如牛細(xì)小 病毒等引起的感染也較為常見。牛乳腺炎有以下兩種臨床表現(xiàn)
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1、隱形乳腺炎為臨床乳腺炎的潛伏期，該階段沒有明顯的臨床癥狀，只是產(chǎn)奶量 有所下降，乳汁無明顯外觀變化，只有應(yīng)用生物制劑和儀器檢測乳汁在物理、化學(xué)和生物等 方面的變化，才能決定乳中有無病原菌存在。2、臨床乳腺炎絕大多數(shù)臨床乳腺炎是由隱性乳腺炎發(fā)展而來的。病牛呈現(xiàn)明顯的 臨床癥狀，通常表現(xiàn)喂乳房腫脹、乳孔閉塞，乳房觸摸有硬塊；乳汁稀稠異常，變色，帶血或 內(nèi)含乳凝塊、絮狀物等。當(dāng)細(xì)菌毒素及其分解產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)，則呈現(xiàn)全身毒性作用，病 牛會出現(xiàn)食欲減退，精神不振和體溫升高等全身癥狀。對于牛乳腺炎的治療方面，一般臨床乳腺炎可采用乳房內(nèi)灌注抗生素，如頭孢 畜健，每一發(fā)病乳區(qū)0. 1-0. 2g，每天一次；嚴(yán)重者除乳房灌注抗生素外，可配合肌注抗生 素，如青霉素350萬單位，鏈霉素4g，每日兩次；同時可以用0. 25% -0. 5%普魯卡因溶液 400-500mL，一次靜脈注射。通過這種辦法治療后的奶牛的牛奶在用藥后48小時之內(nèi)抗生 素、激素等的殘留量都非常的高，大大的超過了我國自定的綠色無污染標(biāo)準(zhǔn)和國際出口標(biāo) 準(zhǔn)，這樣的牛奶不得不被丟棄，而且“有抗奶”對嬰幼兒及兒童的影響較大，如果嬰幼兒食用 “有抗奶”，其對抗生素的耐藥性大大增加，這個問題在臨床抗感染治療上已經(jīng)成為棘手問 題。由于上述治療方法存在這些弊端，因此研究人員著手對既能有效治療奶牛乳腺炎又能 避免對牛奶的污染的新的治療方法進(jìn)行研究。近年來，亦有采用中藥對奶牛乳腺炎進(jìn)行治療和預(yù)防的方法。專利申請CN200810136934.2中公開了一種治療奶牛乳腺炎中藥透皮軟膏及其制 備方法，其主要由蒲公英、黃芩、連翹的提取物(25-40%)、透皮促滲劑(1-6%)及藥物基質(zhì) (74-54% )組成，采用涂抹外皮透皮吸收的給藥方式治療奶牛乳腺炎。專利申請CN200410073289.6中公開了一種用于治療奶牛乳腺炎的中藥散劑，該 中藥散劑具有清熱解毒、活血化瘀散結(jié)、消腫下乳等功效。專利申請200810132601. 2中公開了一種治療奶牛乳腺炎的中藥組合物，該組合 物由下列中藥原料制備而成馬齒莧、野菊花、蒲公英、冰片、地丁、天花粉、赤芍藥、蟾酥、大 蒜、貫眾、青黛、黃芩；也涉及該組合物的制備方法和用于治療奶牛乳腺炎藥物的用途。采用中藥的方法對奶牛乳腺炎進(jìn)行治療，雖然對牛奶的污染低于采用抗生素治療 對牛奶的污染，但該方法同樣存在著中草藥殘留的問題，這對嬰幼兒的影響是有害的，其潛 在危害目前尚無良好的研究與評估，其前景很可能是不易被接受的。研究人員在此基礎(chǔ)上， 針對上述缺陷，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑 (NCP)在制備預(yù)防和治療奶牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用。所述短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌 (CP)經(jīng)滅活后制成的制劑，所述NCP為短棒狀桿菌經(jīng)破碎后提取的有效組分，顆粒大小較 均一、吸收度明顯提高，熱源低，可減少CPP的發(fā)燒、注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用；短棒狀 桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)作為一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，通過激活 巨噬細(xì)胞，使其數(shù)量和質(zhì)量大大提高，激活的巨噬細(xì)胞可將引起乳腺炎的主要病原體(如 無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，其次有綠膿桿菌、化膿性棒狀桿菌、 乳房鏈球菌、諾卡氏菌等，真菌如念珠菌屬、毛孢子菌、胞漿菌屬等、支原體如牛型支原體等、病毒如牛細(xì)小病毒等)吞噬殺滅，從而為預(yù)防和治療奶牛乳腺炎提供了一種新的有效的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備預(yù)防和治療奶牛乳腺炎藥 劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所述短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌經(jīng)滅活后制成的制劑。本發(fā)明所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌經(jīng)破碎制備的無細(xì)胞制劑， 粒度為IO-IOOOnm ；優(yōu)選所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑的粒度為10-500nm。本發(fā)明所述的短棒狀桿菌為粉刺丙酸桿菌，菌號為76-27、H_84或77_1，優(yōu)選所述 的短棒狀桿菌為菌號77-1。本發(fā)明所述的短棒狀桿菌制劑(CPP，見2000版中國生物制品規(guī)程)是一種非特異 性免疫調(diào)節(jié)劑。它是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)滅活后制成的死菌苗，其制備過程公開在1995 版及2000版中國生物制品規(guī)程。目前應(yīng)用的CPP制劑還有法國Merleux研究所生產(chǎn)的滅 活菌苗；英國Wellcome藥廠生產(chǎn)的滅活菌苗等。本發(fā)明所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌(NCP)是通過下述步驟制備的1)CP工作種子批菌種連續(xù)2-4次傳代后接種于大瓶或營養(yǎng)罐，在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5-7 天;2)收集無雜菌污染的菌體，加熱煮沸15-60分鐘得到菌液3)無菌試驗(yàn)合格的茵液經(jīng)洗滌后，用破碎裝置破碎菌體；4)菌體破碎后的懸液經(jīng)離心后收集沉淀，洗滌沉淀制成懸液；5)將懸液加熱滅菌，得到NCP。其中步驟1)中所述的CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌(propionibacterium acnes)，菌號 為 65101 (76-27) ,65102 (H-84)或 65103 (77-1)，其中 76-27 亦稱為 7627，77-1 亦稱為 771。 培養(yǎng)基為選自硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、蛋白胨、肝或酵母透析液中的一種，且為低熱原培養(yǎng)基。步驟1)中培養(yǎng)條件為36-37 °C培養(yǎng)。其中所述培養(yǎng)基中的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基為不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。步驟3)中所述的菌體是滅活菌，菌體濃度為50-500億/mL。所述破碎裝置是利用超高壓射流對撞機(jī)將菌體破碎到Ι-lOOOnm，優(yōu)選粒度為 10-500nm。所述菌體破碎是在無菌條件下進(jìn)行。步驟3)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌至少2次。步驟4)中所述的洗滌是將沉淀物用無菌生理鹽水離心洗滌0-5次。步驟4)菌體破碎后懸液的離心條件是在4°C -室溫，6000-12000rpm下離心 30-150 分鐘。步驟5)中所述的加熱為在60_65°C加熱0. 5-2小時。本發(fā)明的制備方法中，進(jìn)一步包括將步驟5)得到的NCP分裝后，安瓿在60 士 2。C加 熱30分鐘。本發(fā)明中所述培養(yǎng)基優(yōu)選為經(jīng)過0. 22 μ m或0. 45 μ m膜過濾的培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的制備方法中，還包括將步驟5)得到的NCP冷凍干燥，得到凍干制劑。
本發(fā)明中所述的無菌試驗(yàn)合格是指按照《中國生物制品規(guī)程》規(guī)定的方法檢驗(yàn)不 得有任何細(xì)菌生長。本發(fā)明中由于采用低熱原培養(yǎng)基，特別是硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，并經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)控， 以及整個制備過程中無菌低熱原操作，保證了最終產(chǎn)物低熱原和無雜菌污染。本發(fā)明通過超高壓射流對撞機(jī)將CP破碎，通過選擇不同的離心力(轉(zhuǎn)速)，確定了 離心提取條件，獲得的沉淀部分為NCP，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明，該制劑與全菌體制劑具有相同的 脾激活及抑瘤等生物學(xué)活性，上清部分則無脾激活及抑瘤作用，因此，本發(fā)明的NCP具有良 好的生物學(xué)活性。超高壓射流對撞機(jī)的工作原理是將混有被加工物的液體用高壓泵(工作壓力為 500-3000kgf/cm2加壓后分成兩股，以高速射流進(jìn)入兩片直徑為8MM人造金剛石晶片組成的 通道中，相向?qū)ψ埠罅鞒?。由于液體的速度很高，流體相向?qū)ψ矔r產(chǎn)生很強(qiáng)的沖擊波，使金 剛石晶片產(chǎn)生高頻、高強(qiáng)超聲波。大功率高頻超聲波使被加工物顆粒瞬間粉碎、超微化。本發(fā)明的制備過程中，為更好地破碎菌體，采用超高壓射流對撞機(jī)，在菌體濃度為 50 500億/ml，工作壓力為500-2000kgf/cm2的條件下破碎，破碎后的菌體懸液在4°C 室溫下，6000-200(K)rpm離心30 150分鐘，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水溶液洗滌0 5 次后制成懸液，在60 65°C加溫0. 5 2小時，無菌試驗(yàn)合格后合并，經(jīng)配制，分裝后安瓿 在60+2°C加熱15-60分鐘，得到高質(zhì)量、粒度和均一性良好的目的產(chǎn)品。本發(fā)明的NCP是將CP的細(xì)胞破碎，去除無效的上清部分制備的，產(chǎn)品具有低熱原、 無雜菌污染，顆粒粒度較均一，吸收度和擴(kuò)散度明顯提高，有利于奶牛吸收并提高藥效；同 時可減少發(fā)燒，注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用，是一種良好的免疫抗菌制劑。本發(fā)明的一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在用于治療奶牛乳腺炎 藥劑時，采取肌肉或靜脈注射的方式，用量為3-10毫克/次，每天一次或隔日一次或每周一 次，3-10次為一療程。本發(fā)明的CPP、NCP為一種免疫調(diào)節(jié)劑，用于作為制備治療奶牛乳腺炎的藥劑，具 備如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明提供了 CPP、NCP新的獸藥用途，為預(yù)防和治療奶牛乳腺炎提供了新的途徑。2、本發(fā)明的NCP制劑具有低熱原、無雜菌污染、粒度較均一，吸收度和擴(kuò)散度明顯 提高，有利于奶牛身體的吸收并提高藥效；同時可減少發(fā)燒，注射局部紅腫、硬結(jié)等副作用， 是一種新型的良好的免疫抗菌制劑。3、根據(jù)需要，本發(fā)明的NCP可以制成無菌生理鹽水的懸浮制劑，固體含量為 l.O-lOmg/mL，也可以制成凍干粉針或適合獸藥用的其它劑型。4、短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)作為一種非特異性免疫 調(diào)節(jié)劑，通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫，即通過激活巨噬細(xì)胞，使其數(shù)量和質(zhì)量大大提高， 激活的巨噬細(xì)胞可將引起乳腺炎的主要病原體(如無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄 球菌和大腸桿菌，其次有綠膿桿菌、化膿性棒狀桿菌、乳房鏈球菌、諾卡氏菌等，真菌如念珠 菌屬、毛孢子菌、胞漿菌屬等、支原體如牛型支原體等、病毒如牛細(xì)小病毒等)吞噬殺滅，從 而為奶牛乳腺炎提供了一種新型的無有害殘留的預(yù)防和治療方法。
具體實(shí)施例方式下面是本發(fā)明的具體實(shí)施例用于詳細(xì)描述本發(fā)明，所述的實(shí)施例用于描述本發(fā)明 而不是限制本發(fā)明。其中CP學(xué)名為粉刺丙酸桿菌(propionibacterium acnes)，菌號為 65101 (76-27) ,65102 (H-84)公開于1993版《中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種目錄》，北京理工大學(xué)出版 社(ISBN7-81013-859-6/R. 7), 65103 (77-1或771)公開于2000版《中國生物制品規(guī)程》，化 學(xué)工業(yè)出版社。實(shí)施例1參照2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法進(jìn)行細(xì)菌種子批的建立、檢定以 及其它檢定。本實(shí)施例中采用的培養(yǎng)基為市售的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)，成分為胰 酪胨15g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖5g/l，氯化鈉2. 5g/l，L 一胱氨酸0. 5g/l，硫乙醇酸鈉 0. 5g/l。使用前將培養(yǎng)基用0. 22um膜過濾。啟開CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacterium acnes) 771 (見《中國生物制 品規(guī)程》)菌種管，每管含菌60億，用毛細(xì)管吸取約0. 2 0. 3ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不 含瓊脂)，加在菌種管底部使之完全溶解后吸出，加入中管(容量38ml)中，用上述培養(yǎng)基 8-lOlml混合，置37°C培養(yǎng)2天。取菌液用上述培養(yǎng)基(菌液培養(yǎng)基體積比1 9)混 合，置37°C培養(yǎng)2天。取上述培養(yǎng)的菌液用上述培養(yǎng)基(按1 9)混合，置37°C培養(yǎng)3天， 收獲菌液。逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之。合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸15分鐘， 用超高壓射流對撞擊(日本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號NMG-75-200)在3000kgf/cm2壓力 下破碎菌體3次破碎后的懸液在室溫、6000rpm離心90分鐘，收集沉淀，用無菌生理鹽水 洗滌沉淀3次，無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民 共和國藥典》)合格后制成固體含量為lmg/ml的懸液，60°C加熱1小時，得到NCP。其中CP，學(xué)名為粉刺丙酸桿菌65103 (77-1)或771。經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量lmg/ml)，本發(fā)明 的NCP熱原小于60ElJ/ml ；考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社) 測定蛋白質(zhì)含量25% (g/g)紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量 10% (g/g)；葸酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為10% (g/g)?？紤]到 蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖未測出。電鏡測定粒度為10-300nm。分裝后，安瓿在60+2 V加熱20分鐘。實(shí)施例2參照實(shí)施例1的方法，將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacteriumacnes)65101 (76-27)連續(xù)4次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)(使用前將培養(yǎng) 基用0. 45 μ m膜過濾)中，36-37°C培養(yǎng)6天逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之合并收集無雜 菌污染的菌體加熱煮沸60分鐘，用超高壓射流對撞機(jī)在1500kgf/cm2壓力下破碎菌體5次 破碎后的懸液SOOOrpm離心1小時，用無菌生理鹽水洗滌沉淀5次，無菌檢驗(yàn)(2000版《中 國生物制品規(guī)程》)及熱原檢測(2000版《中國人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為 5. 0mg/ml的懸液，65°C加熱60分鐘，得到NCP。經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量lmg/ml)，NCP熱原 小于120ElJ/ml 考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白
7質(zhì)含量4090(g/g):紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260nm測定核酸含量5% (g/g)； 葸酮法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為20% (g/g)。考慮到蛋白質(zhì)和核酸的測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖可能未測出。電鏡檢 測粒度為200 500nm，粒度均勻。分裝后，安瓿在60+2 °C加熱30分鐘。實(shí)施例3 參照實(shí)施例1的方法，將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacteriumacnes)65102 (H-84)連續(xù)4次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在蛋白胨培養(yǎng)基中36-37°C培養(yǎng)7天；逐瓶鏡檢，有 雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸30分鐘，用超高壓射流對撞機(jī)(日 本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號AQUA300) 500kgf/cm2壓力下破碎菌體10次破碎后的懸液 12000rpm離心，用無菌生理鹽水洗滌沉淀4次，無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》) 及熱原檢測(2000版《中華人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為10.0mg/ml的懸液， 65°C加熱100分鐘，得到NCP。經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量mg/ml)NCP熱原 60ElJ/ml，考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量 12% (g/g)，紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260rlm測定核酸含量25% (g/g)，葸酮 法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為16% (g/g)，考慮到蛋白質(zhì)和核酸的測 定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖未測出。電鏡檢測平均粒度為700-1000nm，粒度均勻。分裝后，安瓿在60+2 °C加熱30分鐘。實(shí)施例4參照實(shí)施例1的方法，將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌，propionibacteriumacnes)65102 (H-84)連續(xù)4次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在蛋白胨培養(yǎng)基中36-37°C培養(yǎng)7天；逐瓶鏡檢，有 雜菌污染者棄之；合并收集無雜菌污染的菌體加熱煮沸30分鐘，用超高壓射流對撞機(jī)(日 本Nanonizer Inc.產(chǎn)品，型號AQUA300) 700kgf/cm2。壓力下破碎菌體10次破碎后的懸液 12000rpm離心，用無菌生理鹽水洗滌沉淀4次，無菌檢驗(yàn)(2000版《中國生物制品規(guī)程》) 及熱原檢測(2000版《中華人民共和國藥典》)合格后制成固體含量為10.0mg/ml的懸液， 65°C加熱100分鐘，得到NCP。經(jīng)鱟試劑法(2000版《中華人民共和國藥典》)檢測(固體含量mg/ml)NCP熱原 60ElJ/ml，考馬斯亮蘭法(《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法》，北京大學(xué)出版社)測定蛋白質(zhì)含量 12% (g/g)，紫外法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)260rlm測定核酸含量25% (g/g)，葸酮 法(2000版《中國生物制品規(guī)程》)測定多糖含量為16% (g/g)，考慮到蛋白質(zhì)和核酸的測 定結(jié)果比較準(zhǔn)確，估計(jì)其余的多糖未測出。電鏡檢測平均粒度為500 800nm，粒度均勻。分裝后，安瓿在60+2 °C加熱30分鐘。實(shí)施例5其他同實(shí)施例1，不同之處在于破碎后的懸液在8000rpm離心1小時后，用凍干機(jī) 凍干，得到粉針劑。實(shí)施例6采用2000版《中國生物制品規(guī)程》中描述的方法將CP(學(xué)名粉刺丙酸桿菌， propionibacterium acnes) 771連續(xù)3次傳代后接種于營養(yǎng)罐，在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(不含瓊脂)中36-37 C培養(yǎng)5天逐瓶鏡檢，有雜菌污染者棄之合并收集無雜菌污染的菌 體分別加熱煮沸30、60分鐘進(jìn)行無菌試驗(yàn)，無菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)離心后，用新鮮無菌生 理鹽水溶液洗滌沉淀3次并制成懸液，60-65°C加熱1小時，無菌檢測合格后分裝，安瓿在 60+2°C加熱30分鐘，經(jīng)檢測兩種樣品每瓶含菌為6. OX 109/mL。實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例涉及對奶牛乳腺炎病的治療試驗(yàn)1、試驗(yàn)動物選擇泌乳期的4-8歲青、壯年高產(chǎn)、黑白花奶牛，其患臨床型乳腺炎患病，癥狀為 乳腺患病區(qū)紅、腫，表面溫度升高，觸之敏感，體積增大，泌乳量顯著減少或停止，乳汁質(zhì)量 異常，呈淺黃或淺紅色，乳汁稀薄或粘稠，或出現(xiàn)絮狀物。出現(xiàn)此類癥狀的牛可作為本試驗(yàn) 治療對象，但伴有嚴(yán)重全身感染癥狀的病牛除外。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的共有300例病牛，其中 200例為臨床乳腺炎病牛，100例為隱性乳腺炎病牛，恩諾沙星對照組為18頭臨床乳腺炎病 牛。2、試驗(yàn)方案NCP治療組采取肌肉或靜脈注射的方式，用量為3-10毫克/次，每天一次或隔日一 次或每周一次，3-10次為一療程。恩諾沙星對照組在擠奶后，用0.5%恩諾沙星50mL灌注乳區(qū)，上午下午各一次，5 天為一個療程。病情嚴(yán)重的病例可以連續(xù)用藥2個療程觀察治療效果。3、觀察指標(biāo)(1)痊愈臨床乳腺炎的癥狀全部消失，乳房組織柔軟，牛奶里沒有凝塊，乳汁肉 眼觀察正常，產(chǎn)奶量恢復(fù)正常水平，精神和食欲都正常。(2)有效乳區(qū)紅、熱、痛明顯減輕，乳汁絮狀物基本消失或明顯減少，產(chǎn)奶量有所 回升，但乳房腫脹沒有完全消失。(3)無效兩個療程后，乳腺紅、腫、熱、痛仍無明顯減輕，乳汁仍清稀或發(fā)黃，絮片 仍較明顯，或在治療過程中病程未減輕而改用其他方法治療者。4、治療試驗(yàn)結(jié)果將患有臨床乳腺炎的奶牛隨機(jī)分為5組，每天一次肌肉注射，注射療程為3天，其 試驗(yàn)結(jié)果如表1所示表1 :NCP與恩諾沙星對臨床乳腺炎的療效試驗(yàn)結(jié)果 將患有臨床乳腺炎的奶牛隨機(jī)分為5組，隔天一次肌肉注射，注射療程為5天，其 試驗(yàn)結(jié)果如表2所示表2 =NCP與對臨床乳腺炎的療效試驗(yàn)結(jié)果 將患有隱性乳腺炎的奶牛隨機(jī)分為5組，每周一次靜脈注射，注射療程為7次，其 試驗(yàn)結(jié)果如表3所示表3 :NCP (每周一次靜脈注射)與隱性乳腺炎療效試驗(yàn)結(jié)果 綜上所述，NCP用于治療奶牛乳腺炎藥劑時，對治療奶牛隱性乳腺炎和臨床乳腺炎
都有很好的效果。試驗(yàn)例2其余與試驗(yàn)例1相同，其中所用的藥物為CPP而不是NCP，其劑量和使用方式都一樣，只是用CPP后注射局部有些許紅腫。試驗(yàn)例3
本實(shí)驗(yàn)例涉及對奶牛乳腺炎病的預(yù)防試驗(yàn)1、試驗(yàn)動物選擇泌乳期的4-8歲青、壯年高產(chǎn)、黑白花健康奶牛，其乳房組織柔軟，牛奶里沒 有凝塊，乳汁肉眼觀察正常，產(chǎn)奶量為正常水平，精神和食欲都正常。選取符合上述標(biāo)準(zhǔn)的 共有100例奶牛，將其隨機(jī)分為2組，一組為NCP預(yù)防組，一組為對照組，每組50頭奶牛。2、試驗(yàn)方案NCP預(yù)防組采取肌肉或靜脈注射的方式，用量為3-5毫克/次，每周一次，3次為一 療程。對照組不采取任何方式進(jìn)行預(yù)防。打完后三個月后觀察其效果。3、試驗(yàn)結(jié)果表4 =NCP預(yù)防奶牛乳腺炎療效試驗(yàn)結(jié)果 綜上所述，NCP用于預(yù)防奶牛乳腺炎藥劑時，對預(yù)防奶牛乳腺都有很好的效果。試驗(yàn)例4其余與試驗(yàn)例3相同，其余與試驗(yàn)例1相同，其中所用的藥物為CPP而不是NCP，其 劑量和使用方式都一樣，只是用CPP后注射部位局部有些許紅腫。
權(quán)利要求
一種短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備預(yù)防和治療奶牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備預(yù)防和治 療奶牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌經(jīng)滅 活后制成的制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備 預(yù)防和治療奶牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑是 由短棒狀桿菌經(jīng)破碎制備的無細(xì)胞制劑，粒度為lO-lOOOnm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中任一所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備預(yù) 防和治療奶牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑的粒 度為 10-500nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備預(yù)防和治 療奶牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用，其特征在于，其中所述的短棒狀桿菌為粉刺丙酸桿菌，菌號為 76-27、H-84 或 77-1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的短棒狀桿菌制劑或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑在制備預(yù)防和治 療奶牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用，其特征在于所述的短棒狀桿菌為菌號77-1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種短棒狀桿菌制劑(CPP)或無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑(NCP)在制備預(yù)防和治療牛乳腺炎藥劑中的應(yīng)用，所述短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)滅活后制成的制劑，所述無細(xì)胞短棒狀桿菌制劑是由短棒狀桿菌(CP)經(jīng)破碎后提取有效組分制成的制劑，該制劑顆粒大小較均一、吸收度明顯提高，熱原低；本發(fā)明的CPP與NCP可用于奶牛乳腺炎病的預(yù)防和治療。
文檔編號A61P15/14GK101869703SQ20091013604
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者熊鈞 申請人:熊鈞