專利名稱：體外保存血小板、紅血球、無(wú)核細(xì)胞與含血小板組合物的反應(yīng)劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以粉末狀態(tài)長(zhǎng)期保存血小板、紅血球和其它無(wú)核細(xì)胞的新穎方法與反應(yīng)劑。本發(fā)明還提供了一種含有血小板的組合物，是藉由血小板與所述反應(yīng)劑接觸所制得。
背景技術(shù)：
血小板為人體血液循環(huán)中最小的細(xì)胞，除了在血管滲漏時(shí)扮演封阻傷口的角色外，還具有釋放許多生長(zhǎng)因子(growth factors)以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)與促進(jìn)組織修復(fù)和再生的能力。從1960年代開(kāi)始，科學(xué)家便致力于研發(fā)體外保存血小板的方法，目前，血小板的體外保存皆是在22℃下置放于含檸檬酸鹽的穩(wěn)定酸堿值(pH 6.8-7.2)血槳內(nèi)，保存5天。進(jìn)一步的試管外研究發(fā)現(xiàn)可在室溫下將血小板濃厚液(platelet concentrates；PCs)保存于聚烯烴(polyolefin)材質(zhì)容器內(nèi)達(dá)5-7天。但這段時(shí)間在室溫下保存可能導(dǎo)致細(xì)菌繁殖造成污染，美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)規(guī)定用于輸血用途的血小板保存時(shí)間限于五天。然而，基于捐血的諸多規(guī)范，嚴(yán)格限制了捐獻(xiàn)者的條件，使得捐血者減少，血液的來(lái)源也日漸短缺，故紅血球(RBC)以及血小板的替代物的研發(fā)被視為刻不容緩的事情。
許多失血過(guò)量的患者特別需要血小板輸血，然而由于目前的保存技術(shù)易導(dǎo)致血小板功能性的降解，而長(zhǎng)期保存具有活性的血小板的有效方式又尚未研發(fā)成功，所以血小板短缺的問(wèn)題一直無(wú)法解決。一般而言，于體外保存過(guò)程中，首先需確保的是維持血小板功能與構(gòu)造的完整，即，需要在保存的過(guò)程中維持血小板正常形狀、避免活化分子釋放以及在制備與穩(wěn)定濃厚血小板血漿時(shí)避免血小板聚集。同時(shí)，理想的體外保存要件是必須保留血小板細(xì)胞膜上特定糖蛋白Ib/IX與IIb/IIIa的完整，以便能分別做為von Willebrand分子及纖維蛋白原(fibrinogen)的受器。更進(jìn)一步來(lái)看，維持完整代謝路徑，例如配體與受器結(jié)合后，釋放α顆粒等訊息物質(zhì)及生理反應(yīng)的過(guò)程，也是必需的。其次，為了達(dá)成其還原后(reconstitution)仍保有正常凝血功能的目標(biāo)，也必須維持正常完整的細(xì)胞膜、具功能性酶的活性以及聚集、釋放和吞噬作用等反應(yīng)。
凍干血小板技術(shù)是一種可以滿足上述要求的替代性保存方式。被凍干的血小板可以儲(chǔ)存于室溫達(dá)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，且當(dāng)需要使用時(shí)可以復(fù)水還原回原來(lái)的形式。故凍干技術(shù)不但可以延長(zhǎng)血小板的儲(chǔ)存時(shí)間，同時(shí)可以改善物流運(yùn)送方式。此外，對(duì)于低溫狀態(tài)下血小板細(xì)胞膜行為的了解，也可以應(yīng)用于延展血小板于冰箱溫度的保存期限。利用相同的原理，如能于體外保存紅血球，就能研究紅血球細(xì)胞膜的修飾作用，例如ABH糖蛋白酶切割等，這樣就可以進(jìn)一步了解紅血球的特性。
有鑒于目前保存技術(shù)的缺點(diǎn)，確實(shí)需要一種有效且新穎的方法與反應(yīng)劑，可以延展血小板、紅血球與其它無(wú)核細(xì)胞保存的品質(zhì)與時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于解決上述已知血小板保存方法的缺點(diǎn)，提供一種能夠延展血小板、紅血球與其它無(wú)核細(xì)胞保存的品質(zhì)與時(shí)間的方法與反應(yīng)劑。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供了一種含有血小板的組合物，其是將血小板與一反應(yīng)劑混合接觸后而形成。其中所述反應(yīng)劑包含(a)5％-30％抗凝血?jiǎng)?b)0.0001％-3％冷凝沉淀物(cryoprecipitate)；以及(c)0.0001％-5％凝血酶。
本發(fā)明還提供了一種保存血小板的方法，包含(a)將抗凝血?jiǎng)?、冷凝沉淀物以及凝血酶加入一溶?例如生理食鹽水或其他適當(dāng)溶劑)中搖晃之后靜置形成溶液；(b)將含有血小板的介質(zhì)加入步驟(a)的溶液并且靜置形成含有血小板的溶液；以及(c)凍干所述步驟(b)所形成的含有血小板的溶液。
本發(fā)明還提供了一種反應(yīng)劑以保存無(wú)核細(xì)胞，所述反應(yīng)劑包含(a)5％-30％抗凝血?jiǎng)?b)0.0001％-3％冷凝沉淀物；以及(c)0.0001％-5％凝血酶。
本發(fā)明的反應(yīng)劑中所包含的抗凝血?jiǎng)⒗淠恋砦镆约澳溉咧g的含量關(guān)系也可以理解為體積比，即，抗凝血?jiǎng)├淠恋砦锬福?-30∶0.0001-3∶0.0001-5。當(dāng)包含溶劑時(shí)，各組分以該體積比加入溶劑(例如生理食鹽水或是其它適當(dāng)?shù)娜軇┑?中可用于保存無(wú)核細(xì)胞，以100體積份的溶劑為基準(zhǔn)，此時(shí)各組分在溶劑中還應(yīng)滿足上述濃度要求，例如，100ml溶劑中添加5-30ml的抗凝血?jiǎng)?.0001-3ml的冷凝沉淀物以及0.0001-5ml的凝血酶，即本發(fā)明中所述的“5％-30％抗凝血?jiǎng)?、?.0001％-3％冷凝沉淀物”以及“0.0001％-5％凝血酶”。
本發(fā)明另外還提供了一種醫(yī)藥組合物，包括含有血小板的組合物以及醫(yī)藥可接受的賦型劑。
本發(fā)明利用纖維蛋白原以及凝血酶仿真凝血機(jī)制最后一個(gè)步驟，產(chǎn)生兩階段溶液，首先產(chǎn)生一種具有保存效果的反應(yīng)劑，接著創(chuàng)造一種含有血小板組合物溶液，經(jīng)穩(wěn)定冷凍干燥后，形成血小板粉末，可以長(zhǎng)期保存。
本發(fā)明中，用以保存的“卡式”反應(yīng)劑(cassette medium)是將血小板包覆于一保護(hù)性的膠體薄膜之中，該膠體薄膜是由低濃度的纖維蛋白原與低濃度的凝血酶加入含有抗凝血?jiǎng)┑纳硎雏}水后所形成的。本發(fā)明所揭露的方法以及反應(yīng)劑可以將血小板保存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，甚至達(dá)兩年，仍保有血小板應(yīng)有的功能與活性。因此本發(fā)明所提出的無(wú)核細(xì)胞凍干技術(shù)，將是一種臨床應(yīng)用上的有效替代方式，可舒緩血液供給的需求。


圖1是顯示本發(fā)明的保存血小板方法的步驟流程圖。
圖2是顯示還原以后血小板的掃瞄式電子顯微鏡照片。
圖3是顯示還原以后血小板的掃瞄式電子顯微鏡照片，為圖2中單一血小板的高倍放大圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供了一種含有血小板的組合物，是由血小板接觸反應(yīng)劑后所產(chǎn)生，該反應(yīng)劑包含(a)5％-30％抗凝血?jiǎng)?b)0.0001％-3％冷凝沉淀物；以及(c)0.0001％-5％凝血酶。
所述抗凝血?jiǎng)┌?，但不限于，抗凝血檸檬酸葡萄?anticoagulantcitrate dextrose；ACD-A)。進(jìn)一步，ACD-A的優(yōu)選濃度為5％至30％，最優(yōu)選濃度為10％至12％。
所述抗凝血?jiǎng)┌ǎ幌抻冢瑱幟仕崃姿嵊倚咸烟?citratephosphate dextrose；CPD)。進(jìn)一步，CPD的優(yōu)選濃度范圍為5％至30％，最優(yōu)選為10％至12％。
所述冷凝沉淀物的濃度優(yōu)選為0.001％至3％。
所述凝血酶的濃度優(yōu)選為0.001％-5％。
所述組合物可以進(jìn)一步包含溶劑，例如但不限于常規(guī)的生理食鹽水。
本發(fā)明的組合物可以利用凍干技術(shù)制造成為粉末，或利用熟知本領(lǐng)域的人員所知道的其它方法制造。
本發(fā)明另提供了一種保存血小板的方法。請(qǐng)參見(jiàn)圖1所示，該方法包含下列步驟(a)將抗凝血?jiǎng)⒗淠恋砦镆约澳讣尤肷硎雏}水中搖晃之后靜置形成溶液；(b)將含有血小板的介質(zhì)加入步驟(a)的溶液并且靜置形成含有血小板的溶液；以及(c)凍干步驟(b)所形成的含有血小板溶液。
所述步驟(a)中的抗凝血?jiǎng)┌ǎ幌抻?，抗凝血檸檬酸葡萄?anticoagulant citrate dextrose；ACD-A)。進(jìn)一步，抗凝血檸檬酸葡萄糖的濃度優(yōu)選為5-30％，最優(yōu)選為10％-12％。
所述步驟(a)中的抗凝血?jiǎng)┌?，但不限于，檸檬酸磷酸右旋葡萄?citrate phosphate dextrose；CPD)。進(jìn)一步，所述檸檬酸磷酸右旋葡萄糖的濃度優(yōu)選為5-30％，最優(yōu)選為10％-12％。更進(jìn)一步，所述步驟(a)中的冷凝沉淀物的濃度優(yōu)選為0.0001％-3％，更優(yōu)選為0.001％-3％。所述步驟(a)中的凝血酶的濃度優(yōu)選為0.0001％-5％，更優(yōu)選為0.001％-5％。本發(fā)明中所述步驟(b)中的含有血小板的介質(zhì)可為血小板濃厚液(PlateletConcentrate)、血小板濃厚血漿(Platelet-Rich Plasma；PRP)或是任何含有血小板的介質(zhì)。
本發(fā)明還提供了一種反應(yīng)劑以保存無(wú)核細(xì)胞，所述反應(yīng)劑包含(a)5％-30％抗凝血?jiǎng)?b)0.0001％-3％冷凝沉淀物；以及(c)0.0001％-5％凝血酶。
所述的抗凝血?jiǎng)┌?，但不限于，抗凝血檸檬酸葡萄?anticoagulantcitrate dextrose；ACD-A)。進(jìn)一步，抗凝血檸檬酸葡萄糖的濃度優(yōu)選為5％-30％，更優(yōu)選為10％-12％。
所述抗凝血?jiǎng)┌ǎ幌抻?，檸檬酸磷酸右旋葡萄?citratephosphate dextrose；CPD)。進(jìn)一步，所述檸檬酸磷酸右旋葡萄糖的濃度優(yōu)選為5％-30％，更優(yōu)選濃度為10％-12％。
所述冷凝沉淀物的濃度優(yōu)選為0.001％-3％。
所述凝血酶的濃度優(yōu)選為0.001％-5％。
所述可以保存無(wú)核細(xì)胞的反應(yīng)劑可以進(jìn)一步包含一溶劑，例如但不限于生理食鹽水。此外，所述無(wú)核細(xì)胞包括血小板和/或紅血球。
當(dāng)使用本發(fā)明的反應(yīng)劑保存無(wú)核細(xì)胞時(shí)，可以是將所述反應(yīng)劑與含有無(wú)核細(xì)胞的介質(zhì)以適當(dāng)?shù)谋壤旌?，例如，可以將反?yīng)劑與血小板濃厚血漿以1-10∶1-7的體積比混合以保存血小板，更進(jìn)一步還可以將混合物凍干成粉末后保存。
本發(fā)明還提供了一種醫(yī)藥組合物，包括含有血小板的組合物以及醫(yī)藥可接受的賦型劑。所述醫(yī)藥組合物可進(jìn)一步以凍干技術(shù)制備。
本發(fā)明一方面利用粉末狀血小板具有復(fù)水還原、激發(fā)后釋出多種生長(zhǎng)因子的特性，可以應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，另一方面也幫助研究者能夠在體外研究血小板的特性。因此本發(fā)明可以實(shí)質(zhì)改善傳統(tǒng)血小板保存方法。
以下提供利用本發(fā)明保存血小板以及復(fù)水還原后的生物活性測(cè)試的具體實(shí)施例，以進(jìn)一步了解本發(fā)明的上述和其它實(shí)施方式、目的與優(yōu)點(diǎn)，然而這些實(shí)施例并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本領(lǐng)域的人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種的更動(dòng)與潤(rùn)飾。
實(shí)施例血小板為一種無(wú)核的細(xì)胞，釋出蛋白質(zhì)后并無(wú)復(fù)原機(jī)制。當(dāng)血小板被活化或失去功能時(shí)，將會(huì)維持無(wú)功能的狀態(tài)。雖然血小板無(wú)法合成蛋白質(zhì)以利細(xì)胞重生，但其細(xì)胞表面具有許多受器并在調(diào)控血小板功能上扮演某些角色；而且當(dāng)血小板被活化時(shí)，有些細(xì)胞內(nèi)蛋白會(huì)于細(xì)胞表面產(chǎn)生表現(xiàn)型，可充作活性測(cè)定的偵測(cè)指針。此外，在凝血過(guò)程當(dāng)中，血小板會(huì)附著、聚集并且形成一種預(yù)凝血的基團(tuán)反應(yīng)，以促使凝血酶以及纖維蛋白的產(chǎn)生。血小板是生長(zhǎng)因子的儲(chǔ)藏庫(kù)，包括血小板生長(zhǎng)因子(platelet-derivedgrowth factors；PDGF)、轉(zhuǎn)型生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorsβ；TGF-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factor；EGF)以及細(xì)胞激素(cytokines)等。以下實(shí)施例將利用上述的血小板活化特征以偵測(cè)血小板粉末經(jīng)復(fù)水還原后的活性。
實(shí)施例一含有血小板組合物的制備血小板組合物是根據(jù)圖1所示的流程制備成粉末狀血小板(此處簡(jiǎn)稱為PLT)。
(1)先將20ml的ACD-A加入100ml的生理食鹽水中，形成含有20％抗凝血?jiǎng)┑娜芤?，搖晃后靜置五分鐘；(2)于所述抗凝血?jiǎng)┤芤褐屑尤?.001ml冷凝沉淀物，搖晃后靜置五分鐘；(3)加入5ml凝血酶，搖晃后靜置五分鐘；(4)將血小板濃厚液(platelet concentrate)或血小板濃厚血漿(platelet-rich plasma；PRP)加入步驟(3)的溶液，靜置五分鐘；(5)最后將步驟(4)的溶液凍干成粉末后保存。
實(shí)施例二含有血小板組合物的制備實(shí)施例二中所制備的血小板組合物方法與實(shí)施例一相同，除了步驟(1)中的ACD-A為5ml，形成含有5％抗凝血?jiǎng)┑娜芤?；步驟(2)加入的冷凝沉淀物為3ml；步驟(3)加入的凝血酶為3ml。
實(shí)施例三含有血小板組合物的制備實(shí)施例三中所制備的血小板組合物方法與實(shí)施例一相同，除了步驟(1)中的ACD-A為10ml，形成含有10％抗凝血?jiǎng)┑娜芤?；步驟(2)加入的冷凝沉淀物為0.02ml；步驟(3)加入的凝血酶為0.01ml。
實(shí)施例四P-選擇子(P-selectin)測(cè)定某些特殊的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)可以作為估量血小板被活化的指針。當(dāng)血小板被激活劑(agonist)活化以后，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)α顆粒(α-granules)膜上的P-選擇子(P-selectin)會(huì)表現(xiàn)于血小板細(xì)胞膜表面，P-選擇子是一種糖蛋白，測(cè)量血小板被凝血酶活化前以及活化后的P-選擇子的數(shù)值的變化，即可測(cè)出血小板被活化的程度。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)步驟如下取0.001g由實(shí)施例三所制備保存達(dá)半年的PLT粉末加入生理食鹽水(P)還原后，再加入凝血酶，其中P與凝血酶的比例為1∶1(v/v)。最后，利用ELISA試劑盒偵測(cè)P-選擇子(Cat # BBE6，購(gòu)自R&D system，Inc.，Minneapolis，MN，USA)的數(shù)值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表一所示，由十二位符合中國(guó)臺(tái)灣血庫(kù)所要求的健康捐贈(zèng)者標(biāo)準(zhǔn)的正常捐血者，經(jīng)由血小板分離術(shù)(plateletpheresis)所取得的血小板濃厚液，其P-選擇子的數(shù)值為0.328±0.01ng/ml。由凍干再還原的PLT(reconsitituted PLT)所測(cè)定的P-選擇子數(shù)值為0.34±0.0ng/ml，而還原后的PLT與凝血酶混合之后，所偵測(cè)到的P-選擇子的數(shù)值為0.35±0.017ng/ml。以上數(shù)值顯示保存達(dá)半年的再還原PLT與由分離術(shù)采集而得的新鮮血小板一樣仍具有生物活性。因此，由本實(shí)驗(yàn)可知本發(fā)明的組合物可以長(zhǎng)期保存血小板并且保有其完整功能。
表一 *0.1g PLT粉末是由30ml PRP濃縮而來(lái)，本實(shí)施例中所使用的PLT粉末為0.01g，相當(dāng)于3ml PRP。
實(shí)施例五PDGF、TGF-β、EGF的測(cè)定實(shí)驗(yàn)材料測(cè)定生長(zhǎng)因子釋出量是使用ELISA & Activity Assay套組PDGF套組與EGF套組購(gòu)自R&D Minneapolis，MN，USA；TGF-β1套組購(gòu)自Biosource International，Nivelles，Belgium人類PDGF-ABCat # DHD00B(R&D system，Inc.，Minneapolis，MN，USA)
人類TGF-β1KAC 1688(Biosource International，Nivelles，Belgium)人類EGFCat # DEG00(R&D system，Inc.，Minneapolis，MN，USA)實(shí)驗(yàn)步驟為觀察復(fù)水還原的血小板生物活性，將保存半年的實(shí)施例三的PLT粉末與生理食鹽水混合，其比例為0.05g PLT粉末與生理食鹽水(P)混合的比例為1∶300(w/v)，之后加入凝血酶，其中P與凝血酶的比例為1∶1(v/v)。
將粉末血小板還原后，形成PLT-生理食鹽水溶液進(jìn)行ELISA(酶聯(lián)免疫分析法；Enzyme-linked immunoassay)PDGF試驗(yàn)，ELISA TGF-β試驗(yàn)以及ELISA EGF試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)表二所示，對(duì)照組凝血酶的PDGF測(cè)量值為2657.1±887.3pg/ml，TGF-β1測(cè)量值為801±20.3pg/ml而EGF則因?yàn)閿?shù)值過(guò)低而無(wú)法被測(cè)量到；然而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的PDGF、TGF-β和EGF測(cè)量值遠(yuǎn)大于對(duì)照組的測(cè)量值，顯示血小板的儲(chǔ)存庫(kù)中的生長(zhǎng)因子包括PDGF、TGF-β和EGF確實(shí)在PLT粉末還原并混合凝血酶后由PLT釋放出來(lái)的。由表二所產(chǎn)生的結(jié)果顯示藉由本發(fā)明保存的血小板，當(dāng)還原之后，仍然保有原本的功能。
綜合上述ELISA數(shù)據(jù)，顯示本發(fā)明中的血小板組合物結(jié)合凍干技術(shù)一方面可以長(zhǎng)期保存血小板，另一方面仍可維持其生物活性。
表二

*pH值為7.03
實(shí)施例六再還原的血小板以掃瞄式電子顯微鏡(SEM)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟為了觀察血小板的形態(tài)，取根據(jù)實(shí)施例三制備并儲(chǔ)存達(dá)半年的PLT粉末經(jīng)復(fù)水還原后進(jìn)行SEM(掃瞄式電子顯微鏡；Scanning ElectronMicroscope)檢測(cè)。
首先，將0.1M磷酸緩沖液1ml以及5％蔗糖溶液(含有2.5％戊二醛；pH 7.2)滴于蓋玻片上。之后將PLT粉末與生理實(shí)驗(yàn)水混合，并且取0.5ml滴于所述蓋玻片。于搖動(dòng)器上緩慢攪動(dòng)30分鐘后，蓋玻片以50％-100％乙醇脫水后再用乙酸異戊酯(isoamylacetate)處理之后，于臨界點(diǎn)干燥儀(critical point dryer)干燥。最后將蓋玻片鍍金處理后置于掃瞄式電子顯微鏡下觀察。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖2為SEM照片顯示粉末血小板經(jīng)復(fù)水還原后，呈薄圓盤狀并具有光滑表面。圖3則為圖2中局部較高倍數(shù)放大圖。這一再還原的血小板形態(tài)顯示該血小板維持在未被活化的特征，且具有被活化的潛力。
任何保存方式必須確保血小板保有一定程度的功能活性，例如，血小板的外型完整，不能夠釋出活化物以及不能聚集。根據(jù)本發(fā)明的保存方法，血小板呈現(xiàn)分開(kāi)獨(dú)立的細(xì)胞且多數(shù)具有圓盤外型。綜上所述，本發(fā)明的反應(yīng)劑、組合物以及方法是長(zhǎng)期保存血小板具有潛力的優(yōu)選的方式，且不會(huì)使血小板喪失功能。
其它實(shí)施方案在本說(shuō)明書中所揭露的所有特征都可能與其它方法結(jié)合，本說(shuō)明書中所揭露的每一個(gè)特征都可能選擇性的以相同、相等或相似目的特征所取代，因此，除了特別顯著的特征之外，所有在本說(shuō)明書中所揭露的特征僅是相等或相似特征中的一個(gè)例子。
權(quán)利要求
1.一種含有血小板的組合物，其是將血小板與一用以保存血小板的反應(yīng)劑接觸而制備得到，所述反應(yīng)劑包含(a)5％-30％抗凝血?jiǎng)?b)0.0001％-3％冷凝沉淀物；以及(c)0.0001％-5％凝血酶。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述抗凝血?jiǎng)榭鼓獧幟仕崞咸烟恰?br> 3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述抗凝血檸檬酸葡萄糖的濃度為10％-12％。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述抗凝血?jiǎng)闄幟仕崃姿嵊倚咸烟恰?br> 5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述檸檬酸磷酸右旋葡萄糖的濃度為10％-12％。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述冷凝沉淀物的濃度為0.001％-3％。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述凝血酶的濃度為0.001％-5％。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，該組合物進(jìn)一步包含溶劑。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述溶劑為生理食鹽水。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，該組合物進(jìn)一步以凍干技術(shù)制備。
11.一種保存血小板的方法，包含(a)將抗凝血?jiǎng)?、冷凝沉淀物以及凝血酶加入生理食鹽水中搖晃之后靜置形成溶液；(b)將含有血小板的介質(zhì)加入步驟(a)的溶液并且靜置形成含有血小板的溶液；以及(c)凍干所述步驟(b)所形成的含有血小板的溶液。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述步驟(a)中的抗凝血?jiǎng)榭鼓獧幟仕崞咸烟恰?br> 13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述抗凝血檸檬酸葡萄糖的濃度為5-30％。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述抗凝血檸檬酸葡萄糖的濃度為10％-12％。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述步驟(a)中的抗凝血?jiǎng)闄幟仕崃姿嵊倚咸烟恰?br> 16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述檸檬酸磷酸右旋葡萄糖的濃度為5-30％。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述檸檬酸磷酸右旋葡萄糖的濃度為10％-12％。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述步驟(a)中的冷凝沉淀物的濃度為0.0001％-3％。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述冷凝沉淀物的濃度為0.001％-3％。
20.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述步驟(a)中的凝血酶的濃度為0.0001％-5％。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述凝血酶的濃度為0.001％-5％。
22.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述步驟(b)中的含有血小板的介質(zhì)為血小板濃厚液。
23.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述步驟(b)中的含有血小板的介質(zhì)為血小板濃厚血漿。
24.一種醫(yī)藥組合物，包含如權(quán)利要求1所述的含有血小板的組合物以及醫(yī)藥可接受的賦型劑。
25.如權(quán)利要求24所述的醫(yī)藥組合物，其中所述醫(yī)藥組合物進(jìn)一步以凍干技術(shù)制備。
26.一種保存無(wú)核細(xì)胞的反應(yīng)劑，包含(a)5％-30％抗凝血?jiǎng)?b)0.0001％-3％冷凝沉淀物；以及(c)0.0001％-5％凝血酶。
27.如權(quán)利要求26所述的反應(yīng)劑，其中所述的抗凝血?jiǎng)榭鼓獧幟仕崞咸烟恰?br> 28.如權(quán)利要求27所述的反應(yīng)劑，其中所述抗凝血檸檬酸葡萄糖的濃度為10％-12％。
29.如權(quán)利要求26所述的反應(yīng)劑，其中所述抗凝血?jiǎng)闄幟仕崃姿嵊倚咸烟恰?br> 30.如權(quán)利要求29所述的反應(yīng)劑，其中所述檸檬酸磷酸右旋葡萄糖的濃度為10％-12％。
31.如權(quán)利要求26所述的反應(yīng)劑，其中所述冷凝沉淀物的濃度為0.001％-3％。
32.如權(quán)利要求26所述的反應(yīng)劑，其中所述凝血酶的濃度為0.001％-5％。
33.如權(quán)利要求26所述的反應(yīng)劑，該反應(yīng)劑進(jìn)一步包含溶劑。
34.如權(quán)利要求33所述的反應(yīng)劑，其中所述溶劑為生理食鹽水。
35.如權(quán)利要求26所述的反應(yīng)劑，其中所述無(wú)核細(xì)胞包括血小板或紅血球。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種含有血小板的組合物，該組合物是藉由制備一反應(yīng)劑與血小板接觸以保存血小板。該反應(yīng)劑包含抗凝血?jiǎng)?、冷凝沉淀物以及凝血酶。本發(fā)明還提供一種長(zhǎng)期保存血小板的方法，其步驟包括(a)將抗凝血?jiǎng)?、冷凝沉淀物以及凝血酶加入生理食鹽水中形成溶液；(b)將含有血小板的介質(zhì)加入步驟(a)的溶液并且靜置形成含有血小板的溶液；以及(c)凍干步驟(b)所形成的含有血小板的溶液。更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種反應(yīng)劑以保存無(wú)核細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1883504SQ20061007596
公開(kāi)日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月22日
發(fā)明者蘇正堯, 林澄治 申請(qǐng)人:蘇正堯, 林澄治