專利名稱：：糖偶聯(lián)物疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，涉及含有兩種或多種糖抗原與多表位載體蛋白相偶聯(lián)的新型組合物，所述多表位載體蛋白包含多種病原體蛋白質(zhì)的T細胞表位。本發(fā)明也涉及制備所述組合物的方法和所述組合物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：本領(lǐng)域已知多價疫苗。一個例子是多年來已知的腦膜炎奈瑟球菌(iV./nem'"g/^fo)血清組A、C、Y和W135的莢膜多糖四價疫苗[l，2]，此疫苗已獲批準(zhǔn)用于人類。.然而，雖然此疫苗在青少年和成年人中有效，但在嬰兒中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答差，保護力持續(xù)時間短，因此不能用于嬰兒[如3]。這是因為多糖是T細胞非依賴性抗原，通常誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答不能作加強免疫。故常需關(guān)注該多價疫苗能否廣泛應(yīng)用，因為它們可能造成對象的免疫功能顯著下降，這稱為免疫抑制。給予對象的抗原量超過免疫系統(tǒng)的應(yīng)答能力時，可能導(dǎo)致此種免疫抑制。這種狀況稱為抗原過載。免疫抑制的發(fā)生也可能由于多價疫苗中的一種抗原組分阻止了免疫系統(tǒng)對其另一種抗原組分產(chǎn)生應(yīng)答。后一種免疫抑制形式稱為疫苗干擾。在過去20年中，開發(fā)了包含細菌莢膜多糖與蛋白質(zhì)載體相偶聯(lián)的偶聯(lián)疫苗。例子包括b型流感嗜血桿菌(//^附0/7/7^/wywe"zae)(Hib)偶聯(lián)疫苗[4]以及針對肺炎鏈球菌[5]和腦膜炎奈瑟球菌血清組C(MenC)[6]的偶聯(lián)疫苗。已經(jīng)批準(zhǔn)的疫苗中所用的載體蛋白包括破傷風(fēng)類毒素(TT)、白喉類毒素(DT)、白喉毒素的無毒CRM197突變體和腦膜炎奈瑟球菌血清組B的外膜蛋白復(fù)合物。由于醫(yī)學(xué)實踐中正在引進更多的偶聯(lián)疫苗，因此嬰兒可能接受疫苗本身(如TT或DT)或作為偶聯(lián)疫苗中的載體蛋白形式的多次載體蛋白注射。由于這些蛋白質(zhì)對B-和T-細胞具有高水平的免疫原性，這種載體過載可在初免個體中誘導(dǎo)免疫抑制[7]。這種現(xiàn)象稱為載體誘導(dǎo)的表位抑制，認為這是由于載體特異性抗體和抗原分子內(nèi)的競爭所致[8]。理想的是，載體蛋白應(yīng)能誘導(dǎo)對偶聯(lián)的B-細胞表位(如多糖)產(chǎn)生強大的輔助作用，而不誘導(dǎo)對其本身的抗體應(yīng)答。采用在大多數(shù)II類主要組織相容性復(fù)合物分子結(jié)合時有免疫原性的通用表位是達到此目的的一種方法[9]。已在TT和其它蛋白中鑒定到這種表位。然而，仍需要進一步改進。因此，本發(fā)明的目的是提供改進的糖偶聯(lián)物。
發(fā)明內(nèi)容已發(fā)現(xiàn)多表位載體蛋白作為糖結(jié)合載體特別有用。而且已發(fā)現(xiàn)即使它們包含許多已知的病原體表位，但觀察到對這些載體蛋白也只產(chǎn)生低免疫應(yīng)答，而且預(yù)計此種免疫應(yīng)答與病原體表位數(shù)量成比例提高。因此，在一些實施方式中，本發(fā)明提供了包含兩種或多種單價偶聯(lián)物(如2種、3種、4種、5種、6種或更多種，見圖1A)相組合的組合物。各單價偶聯(lián)物包含(i)載體蛋白，其含有與(ii灘抗原相偶聯(lián)的兩種或多種(如2種、3種、4種、5種、6種或更多種)病原體的T細胞表位。各偶聯(lián)物中優(yōu)選采用相同的載體蛋白。優(yōu)選地，至少一種載體蛋白表位不衍生自與糖抗原相同的病原體。優(yōu)選沒有任何載體蛋白表位衍生自與糖抗原相同的病原體。雖然由于各載體蛋白分子上有多個連接位點(圖1B)，而可將各單價偶聯(lián)物中各載體蛋白分子偶聯(lián)于一種以上糖抗原分子(如l種、5種、10種、20種或更多種)，但偶聯(lián)于任何給定載體蛋白的各糖抗原優(yōu)選來自抗原性不同的同一種病原體。例如，MenA的糖抗原不同于MenC、MenW和MenY的糖抗原，因此稱這些糖抗原來自抗原性不同的病原體，而Hib的糖抗原都來自抗原性不同的同一種病原體。在一種偶聯(lián)物中，各糖抗原雖然來自抗原性不同的同一種病原體，但其鏈長度可以不同。另外，在一些實施方式中，本發(fā)明提供的多價偶聯(lián)物含有偶聯(lián)于相同載體蛋白分子的兩種或多種(如2種、3種、4種、5種、6種或更多種)抗原性不同的糖抗原(圖1C)。在這種情況下，糖抗原來自抗原性不同的病原體。因此，例如，在這種偶聯(lián)組合物中，各載體蛋白分子可偶聯(lián)有MenA、MenC、MenW、MenY和Hib中的兩種或多種糖抗原。本發(fā)明也提供了含兩種或多種(如2種、3種、4種、5種、6種或更多種)這些多價偶聯(lián)物的組合物。另外，本發(fā)明提供的組合物含有上述一種或多種(如1種、2種、3種、4種、5種、6種或更多種)單價偶聯(lián)物和一種或多種(如1種、2種、3種、4種、5種、6種或更多種)多價偶聯(lián)物。載體蛋白所述載體蛋白可包含2種或多種T細胞表位(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100種或更多種)。載體蛋白優(yōu)選包含6種或更多種，或10種或更多種表位。更優(yōu)選地，載體蛋白包含19種或更多種表位。各載體蛋白可僅含有一個拷貝的特定表位，或可含有一個以上拷貝的特定表位。所述表位優(yōu)選CD4+T細胞表位。載體蛋白優(yōu)選包含至少一種細菌表位和至少一種病毒表位。所述表位優(yōu)選衍生自人群通過天然感染或疫苗接種常常接觸的抗原，例如，這些表位可衍生自甲肝病毒、乙肝病毒、麻疹病毒、流感病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、牛型結(jié)核菌(M;;co6flc^7'ww6ov&)和麻風(fēng)分枝桿菌(M/e;rae)和/或鏈球菌(&/^^00^0)菌株等的熱激蛋白。這些表位宜選自破傷風(fēng)毒素(TT)、惡性瘧原蟲(尸A^moo^m/a/c^an/m)CSP(PfCs)、乙肝病毒核衣殼(HBVnc)、流感病毒血凝素(HA)、HBV表面抗原(HBsAg)和流感基質(zhì)(MT)。蛋白的表位載體蛋白中所用表位宜選自P23TT(SEQIDNO:1)、P32TT(SEQIDNO:2)、P21TT(SEQIDNO:3)、PfCs(SEQIDNO:4)、P30TT(SEQIDNO:5)、P2TT(SEQIDNO:6)、HBVnc(SEQIDNO:7)、HA(SEQIDNO:8)、HBsAg(SEQIDNO:9)或MT(SEQIDNO:10)。所述表位宜通過間隔臂連接。間隔臂優(yōu)選不是表位的短(如1、2、3、4或5個)氨基酸序列。優(yōu)選的間隔臂包含一個或多個甘氨酸殘基，如-KG-。載體蛋白優(yōu)選含有六-His尾和/或蛋白酶切割序列的N-或C-末端區(qū)，六-His尾是用于篩選載體蛋白的免疫親和標(biāo)記(例如可采用序歹iJ"MDYKDDDD"[SEQIDNO:12])。蛋白酶解序列優(yōu)選為因子Xa的識別位點。所述載體優(yōu)選不包含抑制性T細胞表位。所述載體蛋白優(yōu)選為N19(SEQIDNO:11)。已證明，大腸桿菌(&c/zm'c/^co//)表達的稱為N19的遺傳工程改造蛋白含有幾個人CD4+T-細胞通用表位[10]，當(dāng)將其與Hib多糖偶聯(lián)后具有強載體作用[ll]。N19的N末端區(qū)域由以下部分組成(i)可用于純化的六His尾，(ii)克隆過程中用于篩選陽性克隆的兔多克隆抗體可識別的標(biāo)記肽Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp序列(SEQIDNO:12)，(iii)易于清除該標(biāo)記的因子Xa識別位點Ile-Glu-Gly-Arg(SEQIDNO:13)。N19是表1所列前9個表位加流感基質(zhì)蛋白CD4+表位MT的兩個拷貝。這些表位可用Lys-Gly間隔臂隔開，以提供該分子的可屈曲性，允許該多糖隨后偶聯(lián)于Lys殘基的伯位e-氨基。除CD4+表位外，載體蛋白可包含其它肽或蛋白片段，例如免疫調(diào)節(jié)性細胞因子如白介素-2(IL-2)或粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的表位。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>糖抗原優(yōu)選偶聯(lián)本發(fā)明組合物載體蛋白的糖抗原是細菌糖抗原，具體是細菌莢膜糖抗原。本發(fā)明組合物中可包含的細菌莢膜糖的例子包括腦膜炎奈瑟球菌(血清組A、B、C、W135和/或Y)、肺炎鏈球菌(&w/7tococc^;"ewwom'ae)(血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，尤其是4、6B、9V、14、18C、19F和/或23F)、無乳鏈球菌C^eptococc^aga/ac"ae)(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和/或VIII型，如參考文獻20-23中所述的糖抗原)、流感嗜血桿菌(/^emo;/H7^/n/7wenzae)(可分型菌株a、b、c、d、e和/或f)、綠膿假單胞菌(尸sez^owowasaen^mwa)(例如分離自PA01、05血清型的LPS)、金黃色葡萄球菌(5top/2;;/ococatfaweiw)(如血清型5禾口8)、糞腸球菌(五"feracocctw/fleca/Z力或屎腸球菌(￡/aec/wm)(三糖重復(fù))、小腸結(jié)腸炎耳P爾森菌(7e^/m'aewferaco〃"ca)、霍舌L弧菌(P6"'oc/w/erae)、傷寒沙門菌OSa/mo"e〃a0^/n')、克雷伯菌(K/e6wW/fl^p.)等的莢膜糖。本發(fā)明組合物可包含的其它糖包括葡聚糖(如真菌葡聚糖，如白色念珠菌(Camfe/aa/6/ca似)的葡聚糖)和真菌莢膜糖，如新型隱球菌(Oj/^ococcmweo/or謹—莢膜的莢膜糖o腦膜炎奈瑟球菌血清組A(MenA)莢膜是(a1—6)-連接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-l-磷酸的均聚物，在C3和C4位部分0-乙?；?。腦膜炎奈瑟球菌血清組B(MenB)莢膜是(a2—8)-連接的唾液酸的均聚物。腦膜炎奈瑟球菌血清組C(MenC)莢膜糖是(a2—9)-連接的唾液酸的均聚物，在位置7和/或8含有可變的0-乙?；ＤX膜炎奈瑟球菌血清組W135糖是含有唾液酸-半乳糖二糖單元[—4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2—6>D-Gal-a-(l—]的聚合物。它在唾液酸的7位和9位上含有可變的O-乙?；痆24]。腦膜炎奈瑟球菌血清組Y糖類似于血清組W135糖，除了二糖重復(fù)單元用葡萄糖代替了半乳糖[—4)-D-Neu/5Ac(7/90Ac)-a-(2—6)-D-Glc-a-(1—]。它也在唾液酸的7位和9位含有可變的O-乙酰化。本發(fā)明組合物包含糖抗原混合物。該組合物優(yōu)選包含2種、3種、4種或更多種不同的糖抗原。所述抗原可來自抗原性相同或不同的病原體。本發(fā)明組合物優(yōu)選包含一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清組的糖抗原，例如該組合物可包含血清組A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖偶聯(lián)物。優(yōu)選這些組合物包含血清組C和Y的糖。其它優(yōu)選的組合物包含血清組C、W135和Y的糖。尤其優(yōu)選的組合物包含血清組A、C、W135和Y的糖。當(dāng)混合物包含血清組A腦膜炎球菌的糖和至少一種其它血清組的糖時，MenA糖與其它血清組糖的比例(w/w)可以大于1(如2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)。優(yōu)選1:2-5:1的比例，以及1:1.25-1:2.5之間的比例。血清組A:C:W135:Y的糖的優(yōu)選比例(w/w)為1:1:1:1;1:1:1:2;2:1:1:1;4:2:1:1;8:4:2:1;4:2:1:2;8:4:1:2;4:2:2:1;2:2:1:1;4:4:2:1;2:2:1:2;4:4:1:2;和2:2:2:1。本發(fā)明的其它優(yōu)選組合物包含Hib糖偶聯(lián)物和至少一種腦膜炎奈瑟球菌血清組，優(yōu)選一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清組的糖偶聯(lián)物。例如，本發(fā)明組合物可包含Hib糖和腦膜炎奈瑟球菌血清組A、C、W135和Y中一種或多種(即1、2、3或4種)的糖。本發(fā)明也提供上述病原體的糖偶聯(lián)物的其它組合。在一些實施方式中，本發(fā)明也提供了各偶聯(lián)物的載體蛋白不相同的偶聯(lián)物組合。本發(fā)明的其它優(yōu)選組合物包含第一偶聯(lián)物和第二偶聯(lián)物。第一偶聯(lián)物是上述多表位偶聯(lián)物，第二偶聯(lián)物包含的糖抗原所偶聯(lián)的載體蛋白不同于第一偶聯(lián)物所用載體蛋白。例如，第二偶聯(lián)物可以是偶聯(lián)于載體CRM197的糖抗原。第二偶聯(lián)物中的糖抗原與第一偶聯(lián)物中的糖抗原可以相同或不同。莢膜糖抗原的制備制備莢膜糖抗原的方法是熟知的。例如，參考文獻25描述了腦膜炎奈瑟球菌糖抗原的制備。參考文獻26第14章描述了流感嗜血桿菌糖抗原的制備。現(xiàn)有技術(shù)描述了肺炎鏈球菌糖抗原和偶聯(lián)物的制備。例如，PrevenarTM是一種7-價肺炎球菌偶聯(lián)疫苗。參考文獻27和28中詳細描述了無乳鏈球菌糖抗原的制備方法。可用已知技術(shù)純化莢膜糖，如本文引用的幾篇參考文獻所述。糖抗原可以經(jīng)化學(xué)修飾。例如，可修飾它們，用封閉基團取代一個或多個羥基。這種方法對腦膜炎球菌血清組A特別有用，其中用封閉基團取代乙?；煞乐顾鈁29]。這種修飾的糖仍然是本發(fā)明意義上的血清組A糖。糖的化學(xué)修飾是與天然情況下發(fā)現(xiàn)的莢膜糖相比。例如，糖可被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙?；?部分或全部)、N-丙酰化(部分或全部)等?？稍谂悸?lián)之前、期間或之后進行去乙酰化，但優(yōu)選在偶聯(lián)前進行。根據(jù)具體糖，去乙?；赡芑蚩赡懿挥绊懫涿庖咴裕鏝eisVac-CT^疫苗采用去-0-乙?；奶?，而MenjugateTM是乙酰化的，但這兩種疫苗都有效?？捎贸Ｒ?guī)實驗評價去乙?；鹊挠绊?。所用的莢膜糖可以是寡糖形式。通過純化莢膜多糖的片段化(如通過水解)方便地形成寡糖，片段化后通常要純化所需大小的片段。優(yōu)選進行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最終小于30?？赏ㄟ^離子交換色譜或比色測定方便地測定DP[30]。如果進行水解，通常對水解產(chǎn)物進行篩分，以去除短鏈寡糖[31]?？捎酶鞣N方法，如超濾后離子交換色譜實現(xiàn)此目的。對于腦膜炎球菌血清型A，優(yōu)選去除聚合程度小于或等于約6的寡糖；對于血清組W135和Y，優(yōu)選去除聚合程度小于4左右的寡糖。本發(fā)明偶聯(lián)物可包含少量游離(即未偶聯(lián))載體。當(dāng)本發(fā)明組合物中給定載體蛋白存在游離和偶聯(lián)形式時，未偶聯(lián)形式優(yōu)選不多于組合物中載體蛋白總量的5%，更優(yōu)選少于2%(以重量計)。偶聯(lián)后，可分離游離和偶聯(lián)糖。有許多合適的分離方法，包括疏水色譜、切向超濾、透析等。[也參見參考文獻32和33等]?？刹捎萌魏魏线m的偶聯(lián)反應(yīng)，必要時采用任何合適的接頭。優(yōu)選通過-NH2基團，例如載體蛋白中賴氨酸殘基側(cè)鏈或精氨酸殘基側(cè)鏈中的-NH2基團連接糖抗原與載體。當(dāng)糖具有游離醛基時，醛基可與載體中的氨基反應(yīng)，通過還原胺化形成偶聯(lián)物。也可通過-SH基團，如半胱氨酸側(cè)鏈中的-SH基團連接?；蛘撸强乖赏ㄟ^接頭分子連接于載體。一般在偶聯(lián)前活化或官能化糖?；罨砂ɡ缬们杌噭┤鏑DAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[34，35等])。其它合適技術(shù)采用碳二亞胺、酰肼、活性酯、降冰片垸、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU(也參見參考文獻36的引言)接頭可用任何已知方法，如參考文獻37和38所述的方法通過接頭基團進行連接。一種連接類型包括糖的還原性胺化，將得到的氨基與己二酸接頭基團的一端偶聯(lián)，然后將載體蛋白偶聯(lián)于該己二酸接頭基團的另一端[39,40]。其它接頭包括B-丙酰胺基[41]、硝基苯基-乙基胺[42]、鹵代?；u化物[43]、配糖鍵[44]、6-氨基己酸[45]、ADH[46]、C4-C12部分[47]等。作為采用接頭的替代方法，可以釆用直接連接。直接連接蛋白質(zhì)可包括氧化多糖，然后與蛋白質(zhì)進行還原性胺化，如參考文獻48和49所述。優(yōu)選包括以下步驟的方法將氨基引入糖(如用-NH2取代末端-0基團)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺基二酯)衍生后，與載體蛋白反應(yīng)?？刹捎秒p功能接頭提供偶聯(lián)糖的氨基的第一基團和偶聯(lián)載體(一般偶聯(lián)于載體的氨基)的第二基團。因此，雙功能接頭中的第一基團能夠與糖的氨基(-NH2)反應(yīng)。此反應(yīng)一般包括氨基氫原子的親電子取代。雙功能接頭中的第二基團能夠與載體的氨基反應(yīng)。此反應(yīng)一般也包括氨基的親電子取代過程。糖與載體的反應(yīng)涉及氨基時，優(yōu)選采用雙功能接頭X-l-X，其中兩個X基團相同，可與氨基反應(yīng)；L是接頭中的連接部分。優(yōu)選X基團是N-氧琥珀酰亞胺。L優(yōu)選具有式L'-L、L'，其中L'是羰基。優(yōu)選的I^基團是含l-10個碳原子(如d、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C,o)的直鏈垸基，W-(CH2)4-。其它X基團是與HO-L-OH混合時形成酯的基團，如降冰片烷、對硝基苯甲酸和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺。用于本發(fā)明的其它雙功能接頭包括丙烯酰鹵(如丙烯酰氯)和鹵代?；栈铩Ｍǔ＜尤肽栠^量的接頭以修飾糖。偶聯(lián)后，可分離游離和偶聯(lián)的糖。有許多合適的分離方法，包括疏水色譜、切向超濾、透析等。[也參見參考文獻50和51等]。當(dāng)本發(fā)明組合物包含解聚的糖時，優(yōu)選在偶聯(lián)之前進行解聚。其它抗原本發(fā)明組合物可包含一種或多種(如2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種)其它抗原，如丄一術(shù)貧嚴適用于本發(fā)明的細菌抗原包括可從細菌中分離、純化或衍生的蛋白質(zhì)、多糖、脂多糖和外膜囊泡。此外，細菌抗原可包括細菌裂解物和滅活的細菌制劑。細菌抗原可通過重組表達產(chǎn)生。細菌抗原優(yōu)選包括在細菌生活周期的至少一個階段中暴露于細菌表面上的表位。細菌抗原優(yōu)選在多種血清型之間的保守抗原。細菌抗原包括衍生自一種或多種下述細菌的抗原以及下面鑒定的特定抗原例子。腦膜炎奈瑟球菌腦膜炎球菌抗原可包括純化或衍生自腦膜炎奈瑟球菌血清組如A、C、W135、Y和/或B的蛋白質(zhì)(如參考文獻52-58中鑒定的蛋白質(zhì))，糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡[59-62]。腦膜炎球菌蛋白質(zhì)抗原可選自粘附素、自身轉(zhuǎn)運蛋白、毒素、獲鐵蛋白(ironacquisitionprotein)和膜結(jié)合蛋白(優(yōu)選完整的外膜蛋白)。也參見參考文獻63-71。肺炎鏈球菌肺炎鏈球菌抗原可包括肺炎鏈球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白質(zhì)。蛋白抗原可選自(例如)參考文獻72-77中任一篇所鑒定的蛋白質(zhì)。肺炎鏈球菌蛋白可選自聚組氨酸三聚體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25或Sp133。也參見參考文獻78-84。釀膿鏈球菌OS^e^ococc^woge"e》(A型鏈球菌)鏈球菌血清組A抗原可包含參考文獻85或86中鑒定的蛋白質(zhì)(包括GAS40)、GASM蛋白片段的融合物(包括參考文獻87-89所述融合物)、纖連蛋白結(jié)合蛋白(Sfbl)、鏈球菌血紅素相關(guān)蛋白(Shp)和鏈球菌素S(SagA)。也參見參考文獻85、90和91。粘膜炎莫拉菌(Mora;ce//acato廳/a/的莫拉菌抗原包括參考文獻92和93中鑒定的抗原、外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。也參見參考文獻94。百日咳博德特菌(50^"6/&j^Wwm/力百日咳抗原包括百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，還任選與百日咳桿菌外膜蛋白(pertactin)和/或凝集原2和3聯(lián)用。也參見參考文獻95和96。金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌抗原包括任選地偶聯(lián)于無毒重組綠膿假單胞菌外毒素A的5型和8型金黃色葡萄球菌莢膜多糖，如StaphVAXTM，或衍生自表面蛋白、侵襲素(殺白細胞素、激酶、透明質(zhì)酸酶)、抑制吞噬細胞吞噬、類胡蘿卜素、過氧化氫酶產(chǎn)生的表面因子(莢膜、蛋白質(zhì)A)、蛋白質(zhì)A、凝固酶、凝血因子和/或裂解真核細胞膜的膜損傷性毒素(任選地脫毒)(溶血素、白細胞毒素、殺白細胞素)。也參見參考文獻97。表皮葡萄球菌(&a;/^/ococcMe;Werm/力表皮葡萄球菌抗原包括黏液相關(guān)性抗原(SAA)。破傷風(fēng)梭菌(C7oWnW/Mmfetom')(破傷風(fēng))破傷風(fēng)抗原包括破傷風(fēng)類毒素(TT)，優(yōu)選用作與本發(fā)明組合物結(jié)合/偶聯(lián)的載體蛋白。白喉棒狀桿菌(Coow6a"m'wwfl^M2er/ae)(白喉)白喉抗原包括白喉毒素或其脫毒突變體，如CRM197。此外，考慮將能夠調(diào)節(jié)、抑制ADP核糖基化或與其相關(guān)的抗原與本發(fā)明組合物組合/共同給予/偶聯(lián)。這些白喉抗原可用作載體蛋白。流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌抗原包括B型的糖抗原，或蛋白D[98]。綠膿假單胞菌假單胞菌抗原包括內(nèi)毒素A、Wzz蛋白和/或外膜蛋白，包括外膜蛋白F(OprF)[99]。嗜肺軍團菌(丄"/0"6/&p"ewmop/7a)。細菌抗原可衍生自嗜肺軍團菌。無乳鏈球菌(B型鏈球菌)B型鏈球菌抗原包括參考文獻85和100-103中鑒定的蛋白質(zhì)抗原。例如，該抗原包括蛋白質(zhì)GBS80、GBS104、GBS276和GBS322。淋病奈瑟球菌(We/^eWago"ofr/zoeae):淋病球菌抗原包括Por蛋白(或通道蛋白)如PorB[104]，轉(zhuǎn)運結(jié)合蛋白如TbpA和TbpB[105]，不透明蛋白(如Opa)，可還原修飾的蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制劑[106]。也參見參考文獻52-54和107。沙眼衣原體(CWam;;fifefrac/zomfl^):沙眼衣原體抗原包括衍生自血清型A、B、Ba和C(沙眼病原體，引起失明)，血清型L1、L2和L3(與性病淋巴肉芽腫有關(guān))和血清型D-K的抗原。沙眼衣原體抗原也可包括在參考文獻103和108-110中鑒定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH樣(CT242)、L7/L12(CT316)、OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)和MurG(CT761)。也參見參考文獻111。蒼白密螺旋體(7)r;70"emapa〃/^m)(梅毒)梅毒抗原包括TmpA抗原。杜氏嗜血菌(Z/aemo;7M^^cr，')(引起軟下疳)杜氏嗜血菌抗原包括外膜蛋白(DsrA)。糞腸球菌或屎腸球菌抗原包括參考文獻112提供的三糖重復(fù)(抗原)或其它腸球菌衍生抗原。幽門螺桿菌(7/e"co6a"er;^/on'):幽門螺桿菌抗原包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原。[113-123]。腐生葡萄球菌(5to//z;;/ococcM;ya;7ra;/z;;"cw力抗原包括腐生葡萄球菌抗原的160kDa血凝素。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(7ew/m'aewferacoto'cfl)抗原包括LPS[124]。大腸桿菌C^c/^n'c/n》co//):大腸桿菌抗原可衍生自產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌(ETEC)、腸凝聚性大腸桿菌(EAggEC)、擴散粘附性大腸桿菌(DAEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)和/或腸出血性大腸桿菌(EHEC)菌株的抗原。炭疽桿菌(5a"7/wm2Arac的(炭疽)；炭疽桿菌抗原任選其脫毒抗原，選自A組分(致死因子(LF)和水腫因子(EF))，二者共享的共同B組分，稱為保護性抗原(PA)。參見參考文獻125-127。鼠疫耶爾森菌(投"/m'fl/^他)(鼠疫)鼠疫抗原包括F1莢膜抗原[128]、LPS[129]、V抗原[130〗。結(jié)核分枝桿菌結(jié)核病抗原包括脂蛋白、LPS、BCG抗原、抗原85B(Ag85B)的融合蛋白和/或任選地配制到陽離子脂質(zhì)囊泡中的ESAT-6[131]，結(jié)核分枝桿菌(Mtb)異檸檬酸脫氫酶相關(guān)抗原[132]和/或MPT51抗原[133]。立克次體抗原包括外膜蛋白，包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)[134]，LPS和表面蛋白抗原(SPA)[135]。單核細胞增生利斯特菌(i:/Wen'flmomc^oge"^):細菌抗原可衍生自單核細胞增生利斯特菌。肺炎衣原體(C//。w;;c&7/wewnom'ae):抗原包括參考文獻108和136-141中鑒定的抗原?；魜y弧菌(1^^0c/zo/eme):抗原包括蛋白酶抗原，具體是霍亂弧菌II脂多糖、OllnabaO-特異性多糖、霍亂弧菌O139、IEM108疫苗抗原[142]和/或封閉小帶(Zo"w/aocc/z^/ew)毒素(Zot)。鼠傷寒沙門菌(^/附0"6^妙的(傷寒)抗原包括莢膜多糖，優(yōu)選偶聯(lián)物(Vi，如vax-TyVi)。布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)(萊姆病)抗原包括脂蛋白(如OspA、OspB、OspC和OspD)，其它表面蛋白如OspE-相關(guān)蛋白(Erps)，核心蛋白聚糖結(jié)合蛋白(如DbpA)和抗原性可變的VI蛋白，如與P39和P13(完整的膜蛋白，[M3])結(jié)合的抗原以及VlsE抗原性可變蛋白[144〗。牙齦葉啉單胞菌(尸o^/^ramonasg/"g/vafc):抗原包括外膜蛋白(OMP)。也參見參考文獻145?？死撞?Klebsiella):抗原包括OMP(包括OMPA)或任選地偶聯(lián)于破傷風(fēng)類毒素的多糖。其它細菌抗原可以是上述任何一種細菌的莢膜抗原、糖抗原或蛋白質(zhì)抗原。其它細菌抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制劑。此外，抗原包括活、減毒和/或純化的任何上述細菌。本發(fā)明所用抗原可衍生自革蘭陰性菌和/或革蘭陽性菌。本發(fā)明所用抗原可衍生好氧和/或厭氧性細菌。5.瘋就嚴適用于本發(fā)明的病毒抗原包括滅活(或殺死的)病毒，減毒病毒，分離的病毒制劑，純化的亞基制劑，分離、純化或衍生自病毒的病毒蛋白，以及病毒樣顆粒(VLP)。病毒抗原可衍生自在細胞培養(yǎng)物或其它基質(zhì)上增殖的病毒?；蛘撸芍亟M表達病毒抗原。病毒抗原優(yōu)選包含在病毒生活周期的至少一個階段中暴露于病毒表面上的表位。病毒抗原優(yōu)選在多種血清型或分離物之間的保守抗原。病毒抗原包括衍生自一種或多種下述病毒的抗原以及下面鑒定的特定抗原例子。正粘病毒病毒抗原可衍生自正粘病毒，如流感病毒A、B和C。正粘病毒抗原可選自一種或多種病毒蛋白，包括血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白(M1)、膜蛋白(M2)、一種或多種轉(zhuǎn)錄酶組件(PB1、PB2禾QPA)。優(yōu)選抗原包括HA和NA。流感抗原可衍生自暴發(fā)流行期(一年一次)的流感毒株?；蛘撸鞲锌乖裳苌钥赡芤鸨l(fā)流行的毒株(即與目前流行毒株的血凝素相比具有新型血凝素的流感毒株，或?qū)η蓊愑兄虏⌒圆⒖赡芩絺鞑ソo人群的流感毒株，或?qū)θ擞兄虏⌒缘牧鞲卸局?。副粘病毒病毒抗原可衍生自副粘病毒，如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。[146-148]。肺炎病毒病毒抗原可衍生自肺炎病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒，小鼠肺炎病毒和火雞鼻氣管炎病毒。肺炎病毒優(yōu)選為RSV。肺炎病毒抗原可選自一種或多種下述蛋白，包括表面蛋白融合物(F)，糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)，基質(zhì)蛋白M和M2，核衣殼蛋白N、P和L以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2。優(yōu)選的肺炎病毒抗原包括F、G和M。參見例如參考文獻149。肺炎病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/P1V病毒可包含RSV和PIV二者的組分。副粘病毒病毒抗原可衍生自副粘病毒，如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎、仙臺病毒、猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒優(yōu)選PIV或腮腺炎病毒。副粘病毒抗原可選自一種或多種下述蛋白質(zhì)血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基質(zhì)蛋白(M)。副粘病毒蛋白優(yōu)選包括HN、Fl和F2。副粘病毒抗原也可配制成嵌合病毒形式或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合RSV/PIV病毒可包含RSV和PFV二者的組分。市售腮腺炎疫苗包括單價形式或與麻疹和風(fēng)疹疫苗(MMR)混合的減毒活腮腺炎病毒。麻疹病毒病毒抗原可衍生自麻疹病毒，如麻疹。麻疹病毒抗原可選自一種或多種下述蛋白血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基質(zhì)(M)。市售麻疹疫苗包括減毒的活麻疹病毒，一般與腮腺炎和風(fēng)疹(MMR)聯(lián)用。小核糖核酸病毒病毒抗原可衍生自小核糖核酸病毒，如腸道病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒、心臟病毒和口蹄疫病毒。優(yōu)選抗原衍生自腸道病毒，如脊髓灰質(zhì)炎病毒的抗原。參見參考文獻150和151。腸道病毒病毒抗原可衍生自腸道病毒，如l、2或3型脊髓灰質(zhì)炎病毒，1-22型和24型柯薩奇病毒A，l-6型柯薩奇病毒B，1-9、11-27和29-34型艾柯(ECHO)病毒和腸道病毒68-71。腸道病毒優(yōu)選脊髓灰質(zhì)炎病毒。腸道病毒抗原優(yōu)選選自一種或多種下述衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。市售脊髓灰質(zhì)炎疫苗包括滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(OPV)。嗜肝RNA病毒病毒抗原可衍生自嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒(HAV)。市售HAV疫苗包括滅活的HAV疫苗。[152,153]。披膜病毒病毒抗原可衍生自披膜病毒，如風(fēng)疹病毒、a病毒或動脈炎病毒。優(yōu)選抗原衍生自風(fēng)疹病毒(rubivirus)，如風(fēng)疹病毒抗原。披膜病毒抗原可選自El、E2、E3、C、NSP-1、NSPO-2、NSP-3或NSP-4。披膜病毒抗原優(yōu)選選自El、E2或E3。市售風(fēng)疹疫苗含有冷適應(yīng)活病毒，一般與腮腺炎和麻疹疫苗(MMR)聯(lián)用。黃病毒病毒抗原可衍生自黃病毒，如蜱媒腦炎(TBE)、登革熱(l、2、3或4型)、黃熱病、日本腦炎、西尼羅河腦炎、圣路易斯腦炎、俄國春夏腦炎、波瓦生腦炎。黃病毒抗原可選自PrM、M、C、E、NS-I、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b或NS5。黃病毒抗原優(yōu)選選自PrM、M或E。市售TBE疫苗包含滅活的病毒疫苗。瘟病毒病毒抗原可衍生自瘟病毒，如牛病毒性腹瀉(BVDV)、豬瘟(CSFV)或邊界病(BDV)病毒。嗜肝DNA病毒病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原可選自表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。市售HBV疫苗包含含有表面抗原S蛋白的亞單位疫苗[153,154]。丙肝病毒病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可選自E1、E2、E1/E2、NS345聚蛋白、NS345-核心聚蛋白、核心和/或非結(jié)構(gòu)區(qū)肽中的一種或多種[155,156]。桿狀病毒病毒抗原可衍生自桿狀病毒，如恐水病病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)。桿狀病毒抗原可選自糖蛋白(G)、核蛋白(N)、大蛋白(L)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)。市售狂犬病病毒疫苗包含用人雙倍體細胞或胎猴肺細胞培養(yǎng)的滅活病毒[157,158]。杯狀病毒科病毒抗原可衍生自杯狀病毒科，如諾沃克病毒和諾沃克樣病毒，如夏威夷病毒和雪山病毒。冠狀病毒病毒抗原可衍生自冠狀病毒、SARS、人呼吸道冠狀病毒、禽傳染性支氣管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)。冠狀病毒抗原可選自刺突(S)、包膜(E)、基質(zhì)(M)、核衣殼(N)和/或血凝素-酯酶糖蛋白(HE)。冠狀病毒抗原優(yōu)選衍生自SARS病毒。參考文獻159中描述了SARS病毒抗原。逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒抗原可衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒，如腫瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。腫瘤病毒抗原可衍生自HTLV-1、HTLV-2或HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自HIV-1或HIV-2。逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原可選自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu和vpr。HIV抗原可選自gag(p24gag和p55gag)、env(gpl60、gpl20和gp41)、pol、tat、nef、revvpu、小蛋白(優(yōu)選p55gag和gpl40v缺失)。HIV抗原可衍生自以下一種或多種毒株HlVmb、HIVsf2、HIVLAV、HIVlai、HIVmn、HIV-1CM235、HIV-1脂。呼腸病毒病毒抗原可衍生自呼腸病毒，如正呼腸病毒、輪狀病毒、環(huán)狀病毒或科羅拉多蜱傳熱病毒。呼腸病毒抗原可選自結(jié)構(gòu)蛋白X1、人2、X3、^d、p2、al、cj2或(j3，或者非結(jié)構(gòu)蛋白oNS、pNS或(Tls。優(yōu)選的呼腸病毒抗原可衍生自輪狀病毒。輪狀病毒抗原可選自VP1、VP2、VP3、VP4(或切割產(chǎn)物VP5和VP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4和/或NSP5。優(yōu)選的輪狀病毒抗原包括VP4(或切割產(chǎn)物VP5禾口VP8)和VP7。細小病毒病毒抗原可衍生自細小病毒，如細小病毒B19。細小病毒抗原可選自VP-1、VP-2、VP-3、NS-l和/或NS-2。細小病毒抗原優(yōu)選衣殼蛋白VP-2。5-肝炎病毒(HDV):病毒抗原可以是衍生的HDV,特別是HDV的5-抗原(參見例如，參考文獻160)。戊肝病毒(HEV):病毒抗原可衍生自HEV。庚肝病毒(HGV):病毒抗原可衍生自HGV。人皰疹病毒病毒抗原可衍生自人皰疹病毒，如單純皰疹病毒(HSV)，水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)，巨細胞病毒(CMV)，人皰疹病毒6(HHV6)，人皰疹病毒7(HHV7)和人皰疹病毒8(HHV8)。人皰疹病毒抗原可選自立即早期蛋白(a)、早期蛋白(卩)和晚期蛋白Cy)。HSV抗原可衍生自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原可選自糖蛋白gB、gC、gD和gH、融合蛋白(gB)，或免疫逃避蛋白(gC、gE或gl)。VZV抗原可選自核心、核衣殼、外被膜或包膜蛋白。可購得減毒的活VZV疫苗。EBV抗原可選自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣殼抗原(VCA)或膜抗原(MA)的糖蛋白。CMV抗原可選自衣殼蛋白、包膜糖蛋白(如gB和gH)或外被膜蛋白。乳頭狀多瘤空泡病毒抗原可衍生自乳頭狀多瘤空泡病毒，如乳頭瘤病毒和多瘤病毒。乳頭瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原優(yōu)選衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原可選自衣殼蛋白(L1)和(L2)或E1-E7，或其融合物。優(yōu)選將HPV抗原制成病毒樣顆粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原可選自VP1、VP2或VP3。C.真慮貧辰真菌抗原可衍生自下述真菌組的一種或多種真菌。真菌抗原可衍生自皮膚真菌，包括絮狀表皮霉菌(f/!'cfennop/^ow/Jocamwz)，奧t土安氏zj、抱子菌(Af/cros/orw附awiiow'"0，(Af/crcw;orw附corc^)，犬^、抱子菌(M/.crosporwwcf/5toWwm)，馬<J、抱子菌(Af/cr(w/orw附e《w/"ww)，石膏樣刁、抱子菌(M/cra，r,，矮小小孢子菌(Mz'cra印or,wa鼎m)，同心性毛癬菌(7Hc/zo/一o"co"ce"Wcwm)，馬毛癬菌(7Hc/zo;/^o"e，,"wm)，雞毛癬菌(7Hc/zop/z,"g?！?"ae)，石膏樣毛癬菌(7Wc/o//2,"gy/we,)，(7h'c/zo/一o"meg"/"0，須癬毛癬菌(7Wc/zop/^to"Ane"fagrapAyfe力，(7h.c/zop/zWo"gw/"cA:ea"MW)，紅色毛癬菌(7Wc/zoj!/^to"raZr謂)，許蘭毛癬斷7Hc/zo/一owsc/zoew/e—，斷發(fā)毛癬斷7Wc/zop/zy加/orawra/w)，統(tǒng)狀毛痛菌(7WcAo//]ytowve^TwawMm)，統(tǒng)狀毛病菌(rve/rwcosMm)a/6wm變禾中、cfoco/ifes變禾中、oc/zracewm變禾中，紫色毛癬菌(7Wc/zo//^towv/o/acewm)和/或蜜塊狀毛真菌病原體包括煙曲霉045pe/^/〃M51/wm/ga^s)、黃曲霉04^erg/〃wsy/av"力、黑曲霉(js;erg/〃iwm'ger)、構(gòu)巢曲霉(/45pergZ〃wsmV/w/aw)、土曲霉C^/erg/〃wsfe〃ew力、聚多曲霉(y4werg/〃w515>>c/ow/)、黃曲霉(J5perg/〃wsy7avafM51)、灰綠曲霉0457ergf〃"sg/awcz^)、頭狀芽裂殖菌(5/astoyc/z/zomyce51ca/"a^y)、白假絲酵母(Ca"6/ctoa/6Zca"力、(Caw/Wae"o/aw)、熱帶假絲酵母(C朋a&to^;z'cafo)、光滑假絲酵母(Ca"aWag/Wrato)、克魯斯假絲酵母(Ca"&V/a^r"se/)、近平滑假絲酵母(Camfe^;ara戸//0^)、類星形假絲酵母(Ca"^foWe//fltoWea)、克魯斯假絲酵母(OwAWaA^e/)、(Caw^a戸m^me0、葡萄牙假絲酵母(Ca"^/a/肌Yam'ae)、偽熱帶假絲酵母(C朋c^a/wez^fofrop/ca/&)、季也蒙假絲酵母(C"aw(af/dagw.〃/e77now<^.)、卡氏豐支抱霄(C7aafoi/on'wmcam'om7)、粗球抱子菌(CoccWo/(iw/m脂'"51)、皮炎芽生菌(5/a加mycescfermaf礎(chǔ)力、新型l^急球菌(C/^/tococcz^weo/o/7naw51)、棒i也毒(Geofn'c/^mc/m^^wm)、英膜鄉(xiāng)且會只胞衆(zhòng)菌(/^sfop/aswaca/ww/af"m)、月市炎克雷伯菌(A7e6s/e〃a/wewmom'ae)、(尸aracocc/Wo/tfes6ms77/ew57J)、卡氏月市孢子蟲(尸wewwoc"他can'm7)、(尸;^/z/wmwzVw/(i/ojwm)、皮屑芽胞菌(尸//)^015^0^附ova/e)、酉良酒酵母(Sflc/zaromycescerev&ae)、布拉酵母0S"acc/w7-omyces6ow/aWz')、粟酒酵母(iSacc/wrom少ces_pow6e)、(iScedas/oWwma/^/en/w)、申克孢子絲菌CS^oraf/wixsc/zewcW)、白吉禾!j絲孢酵母(7Hc/05^oraw6e〖ge/,/)、弓形蟲(7bxop/asmago"d/()、馬爾尼菲青毒菌CPe"/c,〃Zw/n附ar"e^0、馬拉色菌(Afa/awez/as;/.)、著色真菌(尸oraecaeaW/.)、王氏霉菌(恥"g,e〃。WP.)、孢子絲菌(S/7ora^l)c印p.)、蛙糞霉(5咖'必oZ)o/t^//.)、耳霉(ComW/o6o/w55pp,)、根霉(7/z/zo/7"j毛霉(Mwcor犁頭霉(/iZwWas//.)、被孢霉(MoW/ere〃。s/^')、小克銀漢霉(Cw""/wg/j謡e〃。s/^')、瓶霉(iS"afoe"wasp;.)、鏈格孢菌04/feman'a5p/7.)、彎孢菌(Cwrra/an'a^/.)、長蠕孢菌Cf/e/m/w^2057on'w附^sp/.)、嫌胞菌(尸z^an'w/ws//.)、曲霄j^erg/〃"51spp.)、青霄(尸e"/".〃,wms;;.)、(Mowo/Zw〖as//.)、絲f亥菌(7/2feocfom.fls_f!P.)、擬青霉(尸aecz7om;;ce51■s,)、皮司霉(尸欣omycesj/7/.)禾口枝孢霉(Ctoto5por/w附印/.)。本領(lǐng)域熟知產(chǎn)生真菌抗原的方法[161]。在優(yōu)選方法中，提取溶解組分，使之與己基本除去或至少部分除去細胞壁的真菌細胞的不溶性組分分離，其特征在于所述方法包括以下步驟獲得活真菌細胞；獲得己基本除去或至少部分除去細胞壁的真菌細胞；破碎已基本除去或至少部分除去細胞壁的真菌細胞；獲得不溶性組分；以及從不溶性組分中提取和分離溶解組分。ZX，綠本發(fā)明組合物可包含性傳播疾病(STD)產(chǎn)生的一種或多種抗原。這種抗原可預(yù)防或治療STD，如衣原體、生殖器皰疹、肝炎(如HCV)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或軟下疳[162]?？乖裳苌砸环N或多種病毒或細菌性STD。用于本發(fā)明的病毒STD抗原可衍生自(例如)HIV、單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳頭瘤病毒(HPV)和肝炎(HCV)。用于本發(fā)明的細菌STD抗原可衍生自(例如)淋病奈瑟球菌、沙眼衣原體、蒼白密螺旋體、杜氏嗜血菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌。上面已描述了衍生自這些病原體的特定抗原的例子。五.,譜拔嚴本發(fā)明組合物可包含衍生自引起呼吸道疾病的病原體的一種或多種抗原。例如，呼吸道抗原可衍生自呼吸道病毒如正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PrV)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(風(fēng)疹)、VZV和冠狀病毒(SARS)。呼吸道抗原可衍生自引起呼吸道疾病的細菌，如肺炎鏈球菌、綠膿假單胞菌、百日咳博德特菌、結(jié)核桿菌(Afyco6ac/e廠/w附/w6e/rw/os/s)、月市炎支原體(Afycop/oy附apwewmom'ae)、月巿炎衣原體、炭疽桿菌和粘膜炎莫拉菌。上面描述了衍生自這些病原體的特定抗原的例子。尸.乂蓳疫苗貧辰本發(fā)明組合物可包含適用于兒童對象的一種或多種抗原。兒童對象一般年齡小于約3歲，或小于約2歲，或小于約1歲。兒童用抗原可在6個月、l年、2年或3年的時間中給予多次。兒童用抗原可衍生自可靶向兒童群體的病毒和/或兒童群體易受感染的病毒。兒童用病毒抗原包括衍生自正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(風(fēng)疹)、腸道病毒(脊髓灰質(zhì)炎)、HBV、冠狀病毒(SARS)和水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)的一種或多種抗原。兒童用細菌抗原包括衍生自肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟球菌(We/wen'amem'"g/"^y)、釀膿鏈球菌(A型鏈球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌(破傷風(fēng))、白喉棒狀桿菌(白喉)、B型流感嗜血桿菌(Hib)、綠膿假單胞菌、無乳鏈球菌(B型鏈球菌)和大腸桿菌的一種或多種抗原。上面描述了衍生自這些病原體的特定抗原的例子。G.適舒辨乂或棘力減諒付艦嚴本發(fā)明組合物可包含適用于老年人或免疫力減弱個體的一種或多種抗原。這些個體可能需要接種多次較高計量或用佐劑配制的疫苗，以提高他們對耙抗原的免疫應(yīng)答。目標(biāo)用于老年人或免疫力減弱個體的抗原包括衍生自一種或多種以下病原體的抗原腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌(A型鏈球菌)、粘膜炎莫拉菌、百曰咳博德特菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌(破傷風(fēng))、白喉棒狀桿菌(白喉)、B型流感嗜血桿菌(Hib)、綠膿假單胞菌、嗜肺軍團菌、無乳鏈球菌(B型鏈球菌)、糞腸球菌、幽門螺桿菌、肺炎衣原體、正粘病毒(流感)、肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(風(fēng)疹)、腸道病毒(脊髓灰質(zhì)炎)、HBV、冠狀病毒(SARS)、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)。上面描述了衍生自這些病原體的特定抗原的例子。兄適舒鈔頓赫皿本發(fā)明組合物可包含適用于青少年對象的一種或多種抗原。青少年可能需要用先前已給予的兒童用抗原作加強接種。上面描述的兒童用抗原可能適用于青少年。此外，青少年是接受衍生自STD病原體抗原免疫接種的目標(biāo)人群，以保證在開始性活動之前產(chǎn)生保護性或治療性免疫力。上面描述了可能適用于青少年的STD抗原。/.辦拔辰本發(fā)明的一個實施方式包括腫瘤抗原或癌抗原。腫瘤抗原可以是(例如)含肽的腫瘤抗原，如多肽腫瘤抗原或糖蛋白腫瘤抗原。腫瘤抗原也可以是(例如)含糖的腫瘤抗原，如糖脂腫瘤抗原或神經(jīng)節(jié)苷脂腫瘤抗原。腫瘤抗原還可以是(例如)表達含多肽的腫瘤抗原的含多核苷酸的腫瘤抗原，如RNA載體構(gòu)建物或DNA載體構(gòu)建物，如質(zhì)粒DNA。適用于實施本發(fā)明的腫瘤抗原包括各種分子，如(a)含多肽的腫瘤抗原，包括多肽(長度范圍可以是(例如)8-20個氨基酸，雖然超出此長度以外的也常見)、脂多肽和糖蛋白，(b)含糖腫瘤抗原，包括多糖、粘蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂、糖脂和糖蛋白；(c)表達抗原性多肽的多核苷酸。腫瘤抗原可以是(例如)(a)與癌細胞相關(guān)的全長分子，(b)它們的同源或修飾形式，包括含有缺失、添加和/或取代部分的分子，以及(c)它們的片段。腫瘤抗原可以是重組形式。腫瘤抗原包括例如CD8+淋巴細胞識別的I型-限制性抗原或CD4+淋巴細胞識別的II型-限制性抗原。本領(lǐng)域已知許多腫瘤抗原，包括(a)睪丸癌-抗原如NY-ES0-1、SSX2、SCP1以及RAGE、BAGE、GAGE和MAGE家族多肽，如GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12(可用于(例如)檢測黑色素瘤、肺腫瘤、頭頸腫瘤、NSCLC、乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤和膀胱腫瘤)，(b)突變抗原，例如p53(與各種實體瘤如結(jié)直腸癌、肺癌、頭頸癌有關(guān))、p21/Ras(與(如)黑色素瘤、胰腺癌和結(jié)直腸癌有關(guān))、CDK4(與(如)黑色素瘤有關(guān))、MUM1(與(如)黑色素瘤有關(guān))、胱冬酶-8(與(如)頭頸癌有關(guān))、CIA0205(與(如)膀胱癌有關(guān))、HLA-A2-R1701、(3連環(huán)蛋白(與(如)黑色素瘤有關(guān))、TCR(與(如)T-細胞非霍奇金淋巴瘤有關(guān))、BCR-abl(與(如)慢性髓細胞性白血病有關(guān))、丙糖磷酸異構(gòu)酶、KIA0205、CDC-27和LDLR-FUT，(c)過度表達的抗原，例如半乳凝集素4(與(如)結(jié)直腸癌有關(guān))、半乳凝集素9(與(如)霍奇金病有關(guān))、蛋白酶3(與(如)慢性髓細胞性白血病有關(guān))、WT1(與(如)各種白血病有關(guān))、碳酸酐酶(與(如)腎癌有關(guān))、醛縮酶A(與(如)肺癌有關(guān))、PRAME(與(如)黑色素瘤有關(guān))、HER-2/neu(與(如)乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和卵巢癌有關(guān))、甲胎蛋白(與(如)肝細胞瘤有關(guān))、KSA(與(如)結(jié)直腸癌有關(guān))、胃泌素(與(如)胰腺癌和胃癌有關(guān))、端粒酶催化蛋白MUC-1(與(如)乳腺癌和卵巢癌有關(guān))、G-250(與(如)腎細胞癌有關(guān))、p53(與(如)乳腺癌、結(jié)腸癌有關(guān))和癌胚抗原(與(如)乳腺癌、肺癌和胃腸道癌癥如結(jié)直腸癌有關(guān))，(d)共享抗原，例如，黑色素瘤-黑素細胞分化抗原如MART-l/MelanA、gp100、MC1R、黑素細胞刺激激素受體、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-l/TRPl和酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2/TRP2(與(如)黑色素瘤有關(guān))，(e)前列腺相關(guān)抗原如PAP、PSA、PSMA、PSH-P1、PSM-P1、PSM-P2，與(如)前列腺癌有關(guān)，(f)免疫球蛋白獨特型(與(如)骨髓瘤和B細胞淋巴瘤有關(guān))和(g)其它腫瘤抗原，如含有多肽-和糖-的抗原，包括(i)糖蛋白如唾液酸Tn和唾液酸Lex(與(如)乳腺癌和結(jié)直腸癌有關(guān))以及各種粘液素；糖蛋白可偶聯(lián)于載體蛋白(如MUC-1可偶聯(lián)于KLH);(ii)脂多肽(如連接有脂部分的MUC-1);(iii)多糖(如GloboH合成六糖)，可偶聯(lián)載體蛋白(如KLH)，(iv)神經(jīng)節(jié)苷脂如GM2、GM12、GD2、GD3(與(如)腦癌、肺癌、黑色素瘤有關(guān))，也可偶聯(lián)載體蛋白(如KLH)。本領(lǐng)域已知的其它腫瘤抗原包括p15、Hom/Mel-40、H-Ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、EB病毒抗原、EBNA、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原、包括E6和E7、乙肝和丙肝病毒抗原、人T-細胞嗜淋巴細胞病毒抗原、TSP-180、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、mn-23Hl、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、p16、TAGE、PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、3-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3(CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA國50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、M0V18、NB/70K、NY-C0-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2結(jié)合蛋白\親環(huán)蛋白C-相關(guān)蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS等。例如，參考文獻163和其中引用的參考文獻描述了這些和其它細胞組分。本發(fā)明中含多核苷酸的抗原一般包含編碼以上所列癌多肽抗原的多核苷酸。優(yōu)選的多核苷酸抗原包括DNA或RNA載體構(gòu)建物，如質(zhì)粒載體(如pCMV)，它們能在體內(nèi)表達癌多肽抗原。腫瘤抗原可衍生自(例如)突變或改變的細胞組分。改變后，這些細胞組分不再行使其調(diào)節(jié)功能，因此細胞可能發(fā)生不受控制的生長。改變的細胞組分的例子包括ras,p53，Rb，Wilms腫瘤基因編碼的改變的蛋白，泛素，粘液素，DCC、APC和MCC基因編碼的蛋白，以及受體或受體樣結(jié)構(gòu)，如neu、甲狀腺激素受體、血小板衍生生長因子(PDGF)受體、胰島素受體、表皮生長因子(EGF)受體和集落刺激因子(CSF)受體。參考文獻164和其中引用的參考文獻描述了這些和其它細胞組分。此外，細菌和病毒抗原可與本發(fā)明組合物聯(lián)用以治療癌癥。具體說，載體蛋白如CRM197、破傷風(fēng)類毒素或鼠傷寒沙門菌抗原可與本發(fā)明化合物聯(lián)用以治療癌癥。癌抗原聯(lián)合療法的效力和生物利用度高于現(xiàn)有療法?？梢栽?例如)參考文獻165(如表3和4)、參考文獻166(如表l)和參考文獻167-189中找到關(guān)于癌癥或腫瘤抗原的其它信息。也可用免疫接種來治療阿耳茨海默病，如采用Abeta作為抗原[190]。J.抗原制劑在本發(fā)明的其它方面，提供了吸附抗原的微粒制備方法。該方法包括(a)通過分散含有(i)水、(ii)去污劑、(iii)有機溶劑和(iv)可生物降解聚合物的混合物提供乳液，所述可生物降解的聚合物選自聚(a-羥酸)、多羥基丁酸、聚已酸內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐或聚氰基丙烯酸酯。相對于有機溶劑，該聚合物在混合物中的濃度一般約為1%-30%，而混合物中去污劑-聚合物的重量比一般約為0.00001:1-0.1:1(更一般約為0.0001:1-0.1:1，約為0.001:1-0.1:1，或約為0.005:1-0.1:1);(b)除去乳液中的有機溶劑；和(c)使抗原吸附于微粒表面上。在某些實施方式中，相對于有機溶劑，可生物降解的聚合物的濃度約為3%-10%。本文所用微粒由可滅菌、無毒和可生物降解的材料制成。這類材料包括但不限于聚(a-羥酸)、多羥基丁酸、聚已酸內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。優(yōu)選地，本發(fā)明所用微粒衍生自聚(a-羥酸)，具體說，衍生自聚(交酯)("PLA")或D,L-丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，如聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)("PLG"或"PLGA")，或D,L-丙交酯和已內(nèi)酯的共聚物。該微?？裳苌跃哂懈鞣N分子量的各種聚合物原料，在共聚物如各種丙交酯乙交酯比例的PLG情況下，選擇是主要問題，部分取決于共同給予的大分子。下面更全面地討論這些參數(shù)。參考文獻191中提供了其它制備方法和抗原(尤其是腫瘤抗原)。度學(xué)灘浙艦一旦配制好后，本發(fā)明組合物可直接給予對象。治療對象可以是動物；具體說，可治療人類對象?？蓪⒃摻M合物配制成專門用于接種兒童和青少年的疫苗?？赏ㄟ^全身和/或粘膜途徑給予它們。一般地，將該組合物制備成溶液或懸液形式的注射劑；適合在注射前用液體載體溶解或懸浮的固體形式。通常通過胃腸道外(如注射，皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)，或者遞送至組織間隙)直接遞送該組合物。也可將該組合物給予病灶。其它給藥方式包括口服給藥和肺給藥、栓劑和透皮或經(jīng)皮施用(參見例如參考文獻192》針注射和無針注射。計量治療可以是單劑量方案或多劑量方案(如包括加強劑量)。本發(fā)明疫苗優(yōu)選無菌疫苗，優(yōu)選無熱原疫苗。優(yōu)選用緩沖液使(例如)pH6-pH8，通常約為pH7。當(dāng)疫苗包含氫氧化鋁鹽時，優(yōu)選采用組氨酸緩沖液[193]。本發(fā)明疫苗可包含低水平(如<0.01%)去污劑(如吐溫，如吐溫80)。本發(fā)明疫苗可含有(如)約15mg/ml的糖醇(如甘露醇)或海藻糖，尤其是凍干時。可憑經(jīng)驗評價各抗原的最佳劑量。然而通常，本發(fā)明糖抗原的給藥劑量為每劑量各種糖0.1-100昭，典型劑量體積為0.5ml。一般劑量為每劑每種糖5-20嗎。以糖計量這些值。本發(fā)明疫苗可以是預(yù)防性(即預(yù)防感染)或治療性(即在感染后治療疾病)疫苗，但一般是預(yù)防性疫苗。本發(fā)明提供了用作藥物的本發(fā)明偶聯(lián)物。本發(fā)明也提供了誘導(dǎo)患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予患者本發(fā)明偶聯(lián)物。免疫應(yīng)答優(yōu)選能產(chǎn)生抵抗腦膜炎球菌丙、肺炎球菌病或流感嗜血桿菌的保護力，包括體液免疫應(yīng)答和/或細胞免疫應(yīng)答?；颊邇?yōu)選兒童。在已接受腦膜炎球菌、肺炎球菌或流感嗜血桿菌初免的患者中該方法可產(chǎn)生加強應(yīng)答。本發(fā)明也提供本發(fā)明偶聯(lián)物在制造誘導(dǎo)患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，其中所述患者已用與偶聯(lián)于載體的組合物所含糖抗原不同的糖抗原預(yù)先治療。本發(fā)明也提供了偶聯(lián)物在制造誘導(dǎo)患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，其中所述患者已用與偶聯(lián)不同載體的組合物所含抗原相同的糖抗原預(yù)先治療。所述藥物優(yōu)選為免疫原性組合物(如疫苗)。該藥物優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療奈瑟球菌(如腦膜炎、敗血癥、淋病等)、流感嗜血桿菌(如中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎、腦膜炎等)或肺炎球菌(如腦膜炎、敗血癥、肺炎等)引起的疾病。優(yōu)選預(yù)防和/或治療細菌性腦膜炎。可用標(biāo)準(zhǔn)動物模型檢測這些疫苗(例如參見參考文獻194)。本發(fā)明還提供了一種藥盒，其裝有a)本發(fā)明的第一種偶聯(lián)物和b)本發(fā)明的第二種偶聯(lián)物。絲本發(fā)明偶聯(lián)物可與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)用。具體說，組合物通常含有佐劑。可用于本發(fā)明組合物的佐劑包括但不限于A^存礦激處游資合激本發(fā)明中適合用作佐劑的含有礦物質(zhì)的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。這種礦物質(zhì)組合物可包括礦物鹽，例如氫氧化物(例如，羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如，參見參考文獻195的第8和9章]，或不同無機化合物的混合物(如磷酸鹽和氫氧化物佐劑的混合物，任選地含有過量磷酸鹽)，化合物可采用任何合適的形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優(yōu)選吸附于該鹽。也可將含有礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽的顆粒[196]。本發(fā)明組合物中可包含鋁鹽，A產(chǎn)劑量為每劑量0.2-1.0mg。磷酸鋁佐劑一般是無定形羥基磷酸鋁，P04/A1摩爾比為0.84-0.92，包括約0.6mgAl3+/ml?？刹捎玫蛣┝苛姿徜X吸附，如50-100)igA產(chǎn)/偶聯(lián)物/劑。采用磷酸鋁并且不需要使抗原吸附于佐劑時，在溶液中包含游離的磷酸根離子(如采用磷酸鹽緩沖液)比較有利。及浙髓適合用作本發(fā)明偶聯(lián)物作為佐劑的油乳劑組合物包含鯊烯-水乳劑，如MF59(5%鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%Span85，用微流化床配制成亞微米顆粒)[參考文獻195第10章；也參見參考文獻197-199]。將MF59用作FLUAD頂流感病毒三價亞單位疫苗的佐劑。MF59乳劑宜包含檸檬酸根離子，如lOmM檸檬酸鈉緩沖液。用于組合物的尤其優(yōu)選的佐劑是亞微米水包油乳劑。本文所用的優(yōu)選亞微米水包油乳劑是任選地含有各種含量的MTP-PE鯊烯/水乳劑，如含有4-5%w/v鯊烯、0.25-1.0%w/v吐溫80(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酉旨)和/或0.25-1.0%Span85(山梨聚糖三油酸酯)，以及任選的N-乙酰基胞壁?；?l-丙氨酰基-D-異谷氨?；?l-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰-犯-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺^丁？曰的亞微米水包油乳劑。參考文獻197和200-201詳細描述了亞微米水包油乳劑、其制備方法和免疫刺激劑(如胞壁酰肽)在本發(fā)明組合物中的應(yīng)用?？刹捎悯徬?、生育酚和吐溫80的乳液。該乳液可包含磷酸鹽緩沖鹽水。它也可含有Span85(如1%)和/或卵磷月旨。這些乳液可含有2-10%鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，鯊烯:生育酚的重量比優(yōu)選S1，因為這能使乳液更穩(wěn)定?？赏ㄟ^下述方法制備一種這樣的乳劑將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將90ml該溶液與5gDL-a-生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液可含有(如)平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。可采用含鯊烯、生育酚和Triton去污劑(如TritonX-100)的乳液?？刹捎煤徬⒕凵嚼嫠狨?0和泊洛沙姆401("PluronicTML121")的乳液。可以用磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已與用"SAF-I"佐劑(0.05-1。/0Thr-MDP、5%鳘烯、2.5%PluronicL121和0.2%聚山梨酸酯80)配的蘇氨?；?MDP—起使用[202]。也可不與Thr-MDP—起使用，例如用"AF'佐劑(5。/。鯊烯、1.25%PluronicL121和0.2%聚山梨酸酯80)[203]。優(yōu)選微流體化。也可用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)作為佐劑。C.啟^W,《參考文就/9J游第"萄皂苷制劑也可用作本發(fā)明偶聯(lián)物的佐劑。皂苷是在許多種類植物的樹皮、葉、莖干、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的甾醇糖苷和三萜糖苷的異質(zhì)群體。已廣泛研究了作為佐劑的分離自皂樹(2w"/a/flsa;o加n'fl)Molina樹皮的皂苷。皂苷也可購自麗花菝葜OSm/tocomato)(墨西哥菝葜)、滿天星(G^/wo/W〃a/^m'cw/ato)(婚紗花)和肥皂草(&po"ahaq^c/a"afc)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21以及脂質(zhì)制劑如ISCOM。QS21以商標(biāo)Stimulon出售。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。己鑒定了用這些技術(shù)純化的特定組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷優(yōu)選QS21。制備QS21的方法參見參考文獻204。皂苷制劑也可包含甾醇，如膽固醇[205]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫剌激復(fù)合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻195的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM優(yōu)選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻205-207中進一步描述了ISCOM。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[208]。開發(fā)基于皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻209和210。Z).瘋毒V、體艦毒微粒病毒小體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常包含一種或多種任選地與磷脂組合或一起配制的病毒蛋白。病毒小體和顆粒通常無病原性、不能復(fù)制，通常不含任何天然病毒基因組?？捎弥亟M方法產(chǎn)生或從全病毒分離得到這種病毒蛋白。這些適用于病毒小體或VLP中的病毒蛋白包括來源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或包膜蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、QP-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pl)的蛋白。VLP在參考文獻211-216中有進一步描述。病毒小體在(例如)參考文獻217中有進一步描述?！?^蘑或微生激好生激適用于本發(fā)明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，例如腸細菌的脂多糖(LPS)的無毒衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的無毒衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A(MPL)和3-0-脫酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脫-O-?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A與4、5或6?；湹幕旌衔?。3脫-0-酰基單磷酰脂質(zhì)A的優(yōu)選"小顆粒"形式見參考文獻218中所述。3dMPL的這種"小顆粒"小到足以在過濾除菌時通過0.22pm膜[218]。其它無毒LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，例如氨基垸基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物如RC-529[219,220]。脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌(Esc/zen'cWaco//)，如OM-174的脂質(zhì)A衍生物。(例如)參考文獻221和222中描述了OM-174。適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過磷酯鍵與鳥嘌呤連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文結(jié)構(gòu)或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激作用。CpG可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻223、224和225公開了可能的類似取代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻226-231中進一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可能導(dǎo)向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[232]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，例如CpG-AODN，或更特異地誘導(dǎo)B細胞應(yīng)答，例如CpG-BODN。參考文獻233-235中討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優(yōu)選CpG-AODN。優(yōu)選構(gòu)建CpG寡核苷酸時使其5'端可為受體所識別。任選將兩個CpG寡核苷酸序列的3'端相連接形成"免疫聚體"。參見例如，參考文獻232和236-238。細菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選該蛋白獲自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素"LT")、霍亂("CT")或百日咳("PT")菌。參考文獻239中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑，參考文獻240中描述了將其用作胃腸道外佐劑。毒素和類毒素優(yōu)選包含A和B亞單位的全毒素形式。優(yōu)選A亞單位含有脫毒突變；B亞單位優(yōu)選不突變。佐劑優(yōu)選脫毒的LT突變體如LT-K63、LT-R72和LT-G192。參考文獻241-248中描述了將ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐劑。優(yōu)選根據(jù)參考文獻249中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的排列對比對氨基酸取代基編號，該參考文獻的全部內(nèi)容特別納入本文作為參考。式I、n或in的化合物或其鹽也可用作佐劑<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>如參考文獻250所述，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、'ER804058'、'ER804059'、'ER804442'、'ER804680'、'ER804764'、'ER803022'或'ER804057'，如:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[251]、IL-23、IL-27[252]等)[253]、干擾素(例如干擾素-Y)、巨噬細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子和巨噬細胞炎性蛋白-la(MIP-Ia)和MIP-10[254]。G主激歸娜搭廯搭著效生物粘著劑和粘膜粘著劑也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質(zhì)酸微球[255]或粘膜粘著劑如聚(丙烯酸)交聯(lián)衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[256]。//.微微粒也可用作本發(fā)明的佐劑。由可生物降解和無毒材料(例如聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)，優(yōu)選聚(丙交酯-共-乙交酯)形成的微粒(即直徑約100nm-150^im，更優(yōu)選約200nm-30nm，最優(yōu)選約500nm-10pm的微粒)，這些微粒任選經(jīng)處理而具有帶負電荷表面(例如用SDS處理)或帶正電荷表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。/.應(yīng)質(zhì)沐r參考J:就第/3界〃萄適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見參考文獻257-259所述。適合用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[260]。這種制劑還包括聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑和辛苯糖醇[261]以及聚氧乙烯垸基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯糖醇[262]的混合物。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steorylether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。參考文獻263禾卩264中描述了PCPP(poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])制劑。I.應(yīng)嫌嚴適合用作本發(fā)明佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(正-MDP)和N-乙酰胞壁酰七-丙氨酰-0-異谷氨酰胺酰心丙氨酸-2-(1，-2，-二棕櫚酰-犯-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。M欲絲^麼諾^^mgw/"o/ow力眾會激適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")，見參考文獻265和266所述。見裙賓基藏嚴眾合激縮氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和篩選適合用作本發(fā)明佐劑的所有這類化合物的方法包括參考文獻267所述內(nèi)容?？s氨基硫脲在刺激人外周血單核細胞產(chǎn)生細胞因子如TNF-a方面特別有效。0.g嚴厥眾合激色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和篩選適合用作本發(fā)明佐劑的所有這類化合物的方法包括參考文獻268所述內(nèi)容。色胺酮化合物在刺激人外周血單核細胞產(chǎn)生細胞因子如TNF-a方面特別有效。尸.樣體敘激可將各種核苷類似物用作佐劑，如(a)Isatombine(ANA-245;7-硫雜-8-氧代鳥苷)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)參考文獻269-271所述的化合物;(f)下式化合物及其前藥:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>式中:R，和R2各自獨立地是氫、鹵素、-NRaRb、-OH、Cw垸氧基、取代的Q-6烷氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、C6-u)芳基、取代的Q.h)芳基、Cl6院基或取代的C"焼基；R3不存在，或者是H、Cw烷基、取代的Cl6院基、Q.h)芳基、取代的(:6.10芳基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；R4和Rs各自獨立地是氫、鹵素、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、-C(O)-Rd、Cl6院基、取代的Cw烷基，或結(jié)合在一起形成5元環(huán)，如&.5:在^"所示鍵處實現(xiàn)結(jié)合。X,和X2各自獨立地是N、C、O或S;Rs是氫、鹵素、-OH、Q-6垸基、<:2.6烯基、<:2.6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-0-Rc、-0-(d.6垸基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd;R9是氫、Cl6院基、取代的Cl6院基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基或R9a，其中R化是在"^所示鍵處實現(xiàn)結(jié)合。RlO和Rn各自獨立地是氫、鹵素、CL6烷氧基、取代的Cw垸氧基、-NRaRfe或-OH;Ra和Rb各自獨立地是氫、Cl6院基、取代的Cl6院基、-C(O)Rd、(:6.1()芳基；Re各自獨立地是氫、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、Cl6院基或取代的dV烷基；Rd各自獨立地是氫、鹵素、d-6垸基、取代的Cl6院基、CL6烷氧基、取代的CL6烷氧基、-nh2、-^1((:1_6垸基)、-:^映取代的(:1-6垸基)、-n(d-6烷基)2、-n(取代的Cl6院基)2、<:6.1()芳基或雜環(huán)基；Re各自獨立地是氫、Cl6院基、取代的Cl6院基、C6-h)芳基、取代的。6.1()芳基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；Rf各自獨立地是氫、Cl6院基、取代的Cl6院基、-C(O)Rd、磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯基；n各自獨立地是0、1、2或3;p各自獨立地是0、l或2;或者(g)(a)-(f)中任一項的藥學(xué)上可接受的鹽，(a)-(f)中任一項的互變異構(gòu)體，或互變異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽。Q連接于含磷酸無環(huán)主鏈的脂質(zhì)含有連接于含磷酸無環(huán)主鏈的脂質(zhì)的佐劑包括TLR4拮抗劑E5564[272,273]:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>SMIP包括N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2,N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；1-(2-甲基丙基)^2-丙基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺;l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯；4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l,3-二氫-2H-咪唑[4,5-c]喹啉-2-酮；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2,N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑[4，5-c]喹啉-l-基卜2-甲基丙-2-醇；l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-l-基]-2-甲基丙-2-醇；N4,N4-二節(jié)基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑[4,5-c]喹啉-2,4-二胺。S.蛋離沐一種佐劑是由第一種革蘭陰性菌制備的外膜蛋白蛋白質(zhì)體制劑與衍生自第二種革蘭陰性菌脂多糖制劑的組合，其中外膜蛋白蛋白質(zhì)體和脂多糖制劑形成穩(wěn)定的非共價連接佐劑復(fù)合物。這種復(fù)合物包括"IVX-908"，它是由腦膜炎奈瑟球菌外膜和脂多糖組成的復(fù)合物，己用作流感疫苗的佐劑[274]。r.將皮*參考文獻195和275中公開了用作免疫刺激劑的其它物質(zhì)。其它有用的佐劑物質(zhì)包括甲基肌苷5'-單磷酸酯("MIMP")[276]。，多聚水合吡咯雙烷類化合物[277]，如下式化合物式中，R選自氫，直鏈或支鏈、未取代或取代、飽和或不飽和的酰基、垸基(如環(huán)烷基)、烯基、炔基和芳基，或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物。例子包括但不限于:木麻黃(casuarine)、木麻黃-6-a-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黃、7-表-木麻黃、3,7-二表-木麻黃等oY菊糖[278]或其衍生物，如algammulin。參考文獻279所述化合物。參考文獻280所述化合物，包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環(huán)二酮化合物、氨基氮雜乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[281，282]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、異HS唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[283]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶化合物和吲哚化合物[284]。Loxoribine(7-烯丙基-8-氧代鳥苷)[285]。陽離子脂質(zhì)與(通常為中性)共脂質(zhì)(co-lipid)，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙銨-二植?；字?乙醇胺("VaxfectinTM")或氨基丙基-二甲基-雙十二垸基氧基-溴化丙銨-二油?；字?乙醇胺("GAP-DLRIE:DOPE")的制劑。優(yōu)選含有(士)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2,3-雙(順-9-四癸烯氧基)-l-丙銨鹽的制劑[286]。本發(fā)明也可包括以上鑒定的一種或多種佐劑各方面的組合。例如，以下組合可用作本發(fā)明佐劑組合物(1)皂苷和水包油乳劑[287];(2)皂苷(如QS21)+無毒LPS衍生物(如3dMPL)[288];(3)皂苷(如QS21)+無毒LPS衍生物(如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任選+固醇)[289];(5)3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳劑的組合[290];(6)SAF,含有10%鯊烯、0.4°/。吐溫80、5%普朗尼克-嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP，或微流體化成為亞微米乳液或渦旋振蕩產(chǎn)生粒度較大的乳液。(7)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem)，含有2%鯊烯、0.2%吐溫80和一種或多種細菌細胞壁組分，所述組分選自單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯CTDM)或細胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(Detox);(8)—種或多種無機鹽(如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(如3dMPL);和(9)一種或多種無機鹽(如鋁鹽)+免疫刺激性寡核苷酸(如含CpG基序的核苷酸序列)。定義術(shù)語"含有"包括"包含"以及"由…組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值x相關(guān)的術(shù)語"約"表示，例如xil0。/。。可認為本文中所有數(shù)值都由"約"限定，除非文中另有說明。術(shù)語"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的組合物可能完全不含Y。必要時，可從本發(fā)明定義中刪去術(shù)語"基本上"。附圖簡要說明圖1顯示了載體和糖抗原的各種可能組合，(A)兩種單價偶聯(lián)物，(B)各載體蛋白分子可結(jié)合于一種以上糖抗原分子的一種單價偶聯(lián)物，和(C)一種以上抗原性不同的糖連接于各載體蛋白分子的多價偶聯(lián)物。圖2顯示了血清抗MenCIgG抗體應(yīng)答。用劑量遞減的N19-MenC或CRM-MenC(2.5、0.625、0.156和0.039嗎MenC/劑量)和0.5mg氫氧化鋁免疫每組六只BALB/c小鼠三次。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集血清樣品，分別測試以定量MenC-特異性IgG抗體效價。圖中各點代表各時間點各組的平均抗體效價(±1SD)。圖3顯示了如前所述免疫小鼠的各血清樣品的抗載體IgG抗體應(yīng)答。用兩種偶聯(lián)物之一等量的MenC免疫小鼠，接受CRM-MenC的小鼠組和接受N19-MenC的小鼠組的載體蛋白的最終含量稍有不同，這是由于這兩種構(gòu)建物中糖:蛋白質(zhì)比例稍有不同。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集血清樣品，分別測試以定量載體-特異性的IgG抗體。圖中各點代表各時間點各組的平均抗體效價(±1SD)。圖4顯示了用劑量遞減的N19-MenC或CRM-MenC(2,5嗎、0.625嗎、0.156嗎、0.039嗎MenC/劑量)和0.5mg氫氧化鋁免疫三次的小鼠血清樣品的殺菌活性。顯示了在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集的合并血清樣品的殺菌抗體效價。結(jié)果表示為產(chǎn)生50%以上細菌殺傷的最高血清稀釋度的倒數(shù)值。圖5顯示了血清抗MenA和抗MenC抗體應(yīng)答。在0.06mg磷酸鋁存在下，單用或聯(lián)用的劑量遞減的N19-MenA和N19-MenC或CRM-偶聯(lián)物(0.625、0.156和0.039嗎MenA和/或MenC/劑量)免疫每組六只BALB/c小鼠三次。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集血清樣品，測定抗MenA和MenC-特異性IgG抗體效價。圖中各點代表各時間點各組的平均抗體效價(±1SD)。圖6顯示了劑量逐漸提高的N19四價聯(lián)合偶聯(lián)疫苗對血清組特異性抗體應(yīng)答的影響。以0.06mg磷酸鋁作為佐劑，用劑量遞減的N19-MenACWY(實線)或CRM-MenACWY(虛線)(2-0.074嗎各MenPS/劑量)免疫每組六只BALB/c小鼠。第0、21和35天免疫接種，在各次免疫之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)測定血清抗MenA、抗MenC、抗MenW和抗MenY特異性IgG抗體效價。圖中各點代表各時間點各組的平均抗體效價(ilSD)。圖7顯示了用每劑量0.074ng各PS(N19-MenACWY或CRM-MenACWY)免疫小鼠兩次(免疫2次后)和三次(免疫3次后)，獲自小鼠的單份血清對C和W-135的殺菌活性。效價表示為產(chǎn)生至少50%細菌殺傷的最高血清稀釋度的倒數(shù)值。圖中各點代表各時間點各組的平均抗體效價(iSD)。圖8顯示了用材料和方法中詳述的N19-MenACWY或CRM-MenACWY免疫后，小鼠產(chǎn)生的抗MenC抗體的動態(tài)親合力概況。用改進的ELISA法測定合并血清的高親合力IgG效價。結(jié)果表示為親合力指數(shù)(AI)，其對應(yīng)于各次免疫后(第1次免疫后、第2次免疫后、第3次免疫后)用75mMNH4SCN洗脫的各組結(jié)合抗體的百分數(shù)。圖9顯示了第三次免疫后獲得的合并血清對載體及其母體蛋白的抗體應(yīng)答。圖中各點代表如上所述三次免疫后各組的抗體效價(士lSD)。圖10顯示了血清抗MenA抗體應(yīng)答。用劑量遞減的偶聯(lián)于N19或CRM的MenA與偶聯(lián)于CRM或N19的MenCWY相混合制備的四價制劑(N19-MenA+CRM-MenCWY，反之亦然CRM-MenA+N19-MenCWY)免疫每組六只BALB/c小鼠三次。對照組接受只含有一種載體蛋白的四價制劑(N19-MenACWY或CRM-MenACWY)。小鼠接受以0.06mg磷酸鋁作為佐劑的劑量遞減的四價制劑(0.67嗎-0.074嗎各MenPS/劑量)。為了簡便，我們僅報告接種最高(0,67嗎)和最低(0.074嗎)免疫劑量后獲得的結(jié)果。圖11顯示了用劑量遞減的上述雙載體或單載體制劑免疫三次后BALB/c小鼠的血清殺菌活性。測定了第二次(免疫2次后)和第三次(免疫3次后)免疫后收集的合并血清樣品的殺菌抗體效價。結(jié)果表示為產(chǎn)生大于50%細菌殺傷的最高血清稀釋度的倒數(shù)。圖12顯示了抗莢膜IgG抗體應(yīng)答。在0.06mg磷酸鋁存在下用N19-MenACWY或CRM-MenACWY(0.67或0.22嗎各MenPS/劑量)偶聯(lián)物免疫BALB/c或C57BL/6小鼠組兩次。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后和免疫2次后)收集血清樣品，測定MenA、MenC、MenW、MenY-特異性IgG抗體效價。圖中各點代表各時間點各組的平均抗體效價(±1SD)。圖13顯示了抗莢膜IgG抗體應(yīng)答。在0.06mg磷酸鋁的存在下用N19-MenACWY或CRM-MenACWY(0.67嗎各PS/劑量)免疫BALB/cH-2d、BALB/BH-2b、B10.BRH-2k、B10.D2NH-2q和BlO.DlH-2d小鼠三次。在各次免疫之前(免疫前)和之后(免疫1次后、免疫2次后和免疫3次后)收集血清樣品，測定MenA、MenC、MenW、MenY-特異性IgG抗體效價。圖中各柱代表平均抗體效價，符號對應(yīng)于各時間點各組的每只小鼠。圖14顯示了用N19-MenACWY或CRM-MenACWY(0.67|ig各MenPS/劑量)和0.06mg磷酸鋁免疫三次具有不同遺傳背景的小鼠的血清殺菌活性。顯示了第三次免疫后(免疫3次后)收集的合并血清樣品的殺菌抗體效價。結(jié)果表示為產(chǎn)生大于50%細菌殺傷的最高血清稀釋度的倒數(shù)。圖15顯示了N19表位-特異性T細胞增殖反應(yīng)。檢測用N19-MenACWY(6嗎N19/劑量)免疫3次的小鼠脾細胞在存在0.9-30pM三種肽(P2TT、P23TT、P30TT)之一和0.312-10嗎/ml游離或偶聯(lián)于PS的N19蛋白時的體外細胞增殖，如圖所示。結(jié)果表示為刺激指數(shù)(SI)氣cpm實驗/cpm未刺激背景)。*=N19濃度為0.312-10pg/ml圖16顯示了N19表位-特異性T細胞增殖反應(yīng)。檢測用N19-MenACWY(6嗎N19/劑量)免疫兩次的小鼠脾細胞在存在0.12-30pM各個肽(P2TT、P21TT、P23TT、P30TT、P32TT、HA、HBsAg)和0.004-1pMN19時的體外細胞增殖，如圖所示。結(jié)果表示為刺激指數(shù)(SI)氣cpm實驗/cpm未刺激背景)。*=1^19濃度為1-0.004一圖17顯示了用N19-MenACWY免疫的同類系小鼠的T-細胞增殖反應(yīng)。在0.06mg磷酸鋁存在下用N19-MenACWY(6嗎N19/劑量)免疫具有不同H-2單倍型的小鼠品系三次。測試脾細胞在1.7-15^N19肽(見表l)和0.1-10ng/ml游離或偶聯(lián)于MenPS的N19蛋白存在時的體外細胞增殖。結(jié)果表示為刺激指數(shù)(SI)氣cpm實驗/cpm未刺激背景)。SI〉2被認為是陽性。圖18顯示了P23TT、HA和HBsAg特異性T細胞的激活。用增殖試驗測定對同源肽和N19蛋白的刺激指數(shù)。用50pl含有用CFA1:1乳化的50嗎單種肽在尾根部免疫每組三只小鼠。7天后，摘取淋巴結(jié)，測定LN細胞在不同濃度的同源肽或N19蛋白存在下的增殖能力。結(jié)果獲自每只小鼠一式三份培養(yǎng)物。結(jié)果表示為以實驗組cpm/背景cpm平均值計算的刺激指數(shù)(SI)。實施本發(fā)明的方式多表泣節(jié)，游教辦靴。在含有100pg/ml氨芐青霉素的LB-瓊脂平板上37°C0/N培養(yǎng)攜帶重組質(zhì)粒pQE-N19的大腸桿菌菌株。然后將培養(yǎng)的細菌接種到500ml含有100pg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37rO/N培養(yǎng)。然后將500ml稀釋加入到發(fā)酵罐中的5升培養(yǎng)基中。在優(yōu)化條件下培養(yǎng)。當(dāng)OD60ton值達到4.2時，加入1mMIPTG(異丙基-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)該多表位蛋白表達3.5小時，直到OD,^為7.2。在加入IPTG前的時間零點(toOD4.2)和表達終止時間點(t終止OD7.2)收集兩份細菌培養(yǎng)上清樣品。將獲得的沉淀重懸于樣品緩沖液，對應(yīng)于不同細菌培養(yǎng)物OD作連續(xù)稀釋后加到12.5%SDS-PAGE上。用JA10轉(zhuǎn)頭(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)以5000g4。C離心全部細菌培養(yǎng)物20分鐘。將60g獲得的細胞沉淀懸浮于500ml裂解緩沖液(6M鹽酸胍，100mMNaH2P04，2mMTCEP(Pierce)pH8)中，室溫攪拌1小時，然后37。C孵育1小時。用J20轉(zhuǎn)頭(Beckman)以12000rpm室溫離心20分鐘收集溶解有蛋白質(zhì)的上清液，進行固相金屬親和色譜(IMAC)。樣品吸附于IMAC柱之前，加入先前證明是純化必需的1mMTCEP(三(2-羧基乙基)鹽酸膦，Pierce),以避免共同純化通過二硫鍵共價結(jié)合于N19的污染物。將溶解物加到裝有360ml鎳活化IDA(亞氨基二乙酸)螯合瓊脂糖快流(Pharmacia，Uppsala，Sweden)XK50柱上，然后，用5體積裂解緩沖液洗滌該柱。然后，加入300ml梯度液，即含有l(wèi)mMTCEP的6M鹽酸胍pH8至8M脲pH8。用3體積緩沖液B(8M脲，100mMNaH2P04，pH7)洗滌該柱，用1800ml緩沖液B配的0-200mM咪唑梯度液洗脫蛋白質(zhì)。在12.5%SDS-PAGE(BioRad)上定量分析從該柱收集的組分，用Bradford蛋白測定法(BioRad蛋白實驗)定量。對含有純化重組蛋白的所選梯度組分進行陽離子交換色譜(CEC)。將600ml合并組分加到裝有120mlSP-瓊脂糖快流樹脂(Pharmacia，Uppsala,Sweden)的XK50柱上。用5體積緩沖液C(7M脲，20mMNaH2PO4pH7，10mM卩-巰基乙醇)洗漆該柱，用1300ml緩沖液C配的0-500mMNaCl梯度液洗脫蛋白質(zhì)。合并用12.5%SDS-PAGE分析選擇的含有純化重組蛋白的梯度液各組分(BioRad)，用10mMNaH2P04，150mMNaCl，10%甘油透析。按照廠商說明書用microBCA法測定最終蛋白濃度(Pierce)。在12.5。/。SDS-PAGE(BioRad)上分析蛋白質(zhì)。測定各條帶的光密度進行完整性評價(ImageMasterIDElitev4.00LabScanComputerProgram)。由質(zhì)量控制部門(ChironVaccineSiena)用鱟變形細胞裂解物(LAL)動態(tài)比濁法測定最終蛋白質(zhì)制劑中的內(nèi)毒素水平。入2產(chǎn)錄凝。用腦膜炎球菌疫苗生產(chǎn)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法(291)自腦膜炎奈瑟球菌菌株純化腦膜炎球菌血清組A、C、W、Y多糖。然后，使純化莢膜多糖解聚并活化，以偶聯(lián)載體蛋白，如前所述(292，293)。簡言之，我們在本文中描述了腦膜炎球菌血清組C寡糖的制備方法。用10mM乙酸鈉緩沖液pH5.0水解純化的MenC莢膜多糖，以降低其平均聚合度(DP)。8(TC進行該反應(yīng)12小時，直到DP達到IO。在水解期間可通過分析起始多糖溶液中的總唾液酸含量(在水解期間恒定)和氧化后各鏈末端基團釋放的甲醛在線跟蹤DP。此實時DP測定得以外推(得到)水解的最終時間。用Q-瓊脂糖FF離子交換色譜對寡糖進行篩分，該色譜柱上能保留分子量較高的多糖，而用5mM乙酸鈉緩沖液，100mMNaCl，pH6.5洗脫柱上的低分子量寡糖(DP〈6)。然后，用0.7M四丁基溴化銨(TAB)(帶正電的抗衡離子)洗脫所需寡糖組分，TAB取代柱上帶負電的寡糖。然后在3K截取膜上用水滲濾除去過量TAB并濃縮制劑中的MenC寡糖。滲濾后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟干燥殘余物。然后，還原胺化MenC寡糖，產(chǎn)生具有末端伯胺基的寡糖。使反應(yīng)混合物含有10%DMSO、卯％甲醇、50mM乙酸銨和10mM氰基硼氫化鈉，在加蓋水浴中50'C孵育24小時。然后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)反應(yīng)混合物，以降低胺化反應(yīng)混合物中的甲醇含量，以避免在以后滲濾步驟中可能與硅管和滲濾膜發(fā)生的相互反應(yīng)。通過用8體積0.5MNaCl、然后4倍體積20mMNaCl濃縮滲濾純化試劑(氰基硼氫化物，DMSO，甲醇)中的胺化寡糖。真空下干燥純化胺化寡糖，為活化步驟作準(zhǔn)備。將MenC寡糖溶解于水，然后加入DMSO混合物中。加入三乙胺(TEA),以保證寡糖伯氨基和己二酸的二-N-羥基琥珀酰亞胺(雙-NHS)酯充分去質(zhì)子化。加入摩爾過量的雙NHS，以有利于一種寡糖聚合物與雙NHS酯各分子形成共價連接。在該反應(yīng)混合物中加入丙酮沉淀活化寡糖，這種方法也用于分離寡糖與DMSO、雙NHS酯和TEA。真空干燥沉淀，稱重并儲存于-20'C，直到用于偶聯(lián)。純化其它PS的方法基本相同，反應(yīng)時間和溫度稍有修改[294]。,3淑"微f麟炎鄉(xiāng)絲純化、篩分和活化后，使寡糖隨后與N19蛋白偶聯(lián)[295]。開始偶聯(lián)實驗之前，我們初步評價了該多糖與Ni活化樹脂的潛在非特異性吸附。在典型的偶聯(lián)實驗中，將343.2nmolN19載體蛋白溶解于鹽酸胍pH8，100mMNa2HP04，并吸附于預(yù)先填裝的用相同緩沖液平衡的5mlNi-活化瓊脂糖快流樹脂(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。用50ml100mM磷酸鹽緩沖液pH7.5洗滌樹脂除去鹽酸胍，然后將1ml100mM含有6864nmol活化腦膜炎球菌寡糖(MenA、MenC、MenW或MenY)的磷酸鹽緩沖液pH7.5加入該柱，室溫下反復(fù)循環(huán)2小時。用50ml100mMNa2HP04pH7.5洗滌該柱，以去除過量未偶聯(lián)的寡糖。最后，用300mM咪唑，pH7，100mMNaH2P04洗脫偶聯(lián)產(chǎn)物，在7.5。/。SDS-PAGE上分析。合并含偶聯(lián)物的選出組分，用PBS透析。分析該糖偶聯(lián)物的糖和蛋白質(zhì)含量。通過測定唾液酸定量MenC、MenW和MenY偶聯(lián)物的糖含量(143)，同時通過甘露糖胺-l-磷酸色譜測定MenA偶聯(lián)物的糖含量(121)。用microBCA試驗測定蛋白質(zhì)含量(Pierce，Rockford，IL)。由糖-蛋白質(zhì)重量比計算糖基化程度。由生產(chǎn)部(ChironVaccineSiena)制備在本研究中用作參比的CRM偶聯(lián)疫苗(CRM-MenA、CRM-MenC、CRM-MenW、CRM-MenY)?！?.V、廣/^系。除非另有說明，采用每組六只雌性7周齡小鼠BALB/c。在另一實驗中，采用具有以下H-2單倍型的四只同類系7-周齡雌性小鼠與BALB/C(H-2d，B10.BR(H-2k)同類的BALB/B(H-2b)，與C57BL/6(H-2"同類的B10.D2N(H-2q)、B10.Dl(H-2d)。小鼠購自CharlesRiver(Calco，Italy)或JacksonLaboratories(BarHarbor,Maine)。丄V、嚴:^^;^^務(wù)薪/^/。如下所述，在第0、21和35天用0.5ml以0，/。NaCl緩沖液稀釋的糖含量為基礎(chǔ)的單價、二價、四價或雙載體偶聯(lián)疫苗(N19或CRM偶聯(lián)物)的不同制劑皮下免疫小鼠。在第1天(免疫前)、第20天(第1次免疫后)、第34天(第2次免疫后)和第45天(第3次免疫后)采取單份血清樣品，冷凍于-20'C待用。收集用N19-偶聯(lián)物免疫的小鼠的脾臟，如本文細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答章節(jié)所述，評價T-細胞增殖。3.1單價腦膜炎球菌C偶聯(lián)疫苗。用0.5mg氫氧化鋁作佐劑的劑量遞減的N19-MenC或CRM-MenC(2.5-0.039嗎MenC/劑量)免疫小鼠。如下所述測定抗體效價。含有N19的偶聯(lián)物的免疫原性高于含有CRM的偶聯(lián)物(圖2)。兩次免疫后，N19-構(gòu)建物誘導(dǎo)的血清抗MenCIgG抗體效價顯著高于三種劑量的CRM-MenC偶聯(lián)物誘導(dǎo)的抗體效價(如0.625嗎N19-MenC免疫兩次后與0.625昭CRM-MenC免疫三次后相比[PO.01];0.156嗎N19-MenC免疫兩次后與0.156嗎CRM-MenC免疫三次后相比[P0.05])。此外，三次劑量后，較低量的N19偶聯(lián)物足以誘導(dǎo)顯著高于CRM-MenC偶聯(lián)物所誘導(dǎo)的抗MenCIgG抗體(如0.156昭N19-MenC與0.625昭CRM-MenC相比[PO.Ol])。用CRM-偶聯(lián)物兩次和三次免疫誘導(dǎo)了對CRM的強烈抗載體抗體應(yīng)答，即使是最低的測試劑量(即0.3嗎和更低)。相反，N19-特異性抗體應(yīng)答總是可以忽略，僅在最高劑量(即6)ig)下可以檢測到(即使效價非常低)(圖3)。這些低效價抗N19抗體不能識別固相的破傷風(fēng)類毒素。這些結(jié)果明確顯示，N19多表位的強輔助作用不伴隨誘導(dǎo)顯著水平的抗其本身或天然蛋白的抗體。由于對MenC的保護性免疫力主要依賴于在補體存在下殺傷細菌的殺菌抗體，所以測定了誘導(dǎo)抗體的功能活性。與ELISA所獲結(jié)果相符，圖4顯示了N19偶聯(lián)物能夠在低于CRM-偶聯(lián)物所用劑量的免疫劑量下誘導(dǎo)殺菌抗體。值得注意的是，用最高劑量免疫一次后，N19-MenC偶聯(lián)物誘導(dǎo)的殺菌抗體的效價類似于兩個劑量的CRM-MenC偶聯(lián)物誘導(dǎo)的效價。用劑量較低的N19-MenC免疫兩次的小鼠產(chǎn)生的殺菌抗體效價高于用CRM-MenC免疫的小鼠。這些CRM-MenC免疫的小鼠需要第三個劑量方能達到殺菌作用的抗體效價，相當(dāng)于N19偶聯(lián)物誘導(dǎo)的效價。因此，與CRM相比，N19顯示了更強的載體作用，在較少注射次數(shù)和較小劑量時能誘導(dǎo)對MenC有顯著功能活性的抗體。3.2二價腦膜炎球菌AC偶聯(lián)疫苗。以0.06mg磷酸鋁作佐劑，分別用N19-MenA和N19-MenC或聯(lián)用、或者分別用CRM-MenA和CRM-MenC或聯(lián)用(0.625、0.156或0.039嗎各MenPS/劑量)免疫小鼠。用ELISA測定抗體效價，如下所述。如圖5的上圖所示，不出所料，一起給予含有N19或CRM載體的MenA和MenC偶聯(lián)物時，與給予單價偶聯(lián)物相比對MenA的免疫原性顯著降低(如0.156嗎N19-MenA與N19-MenAC免疫2次后相比[PO.05];0.625嗎N19-MenA與N19-MenAC免疫3次后相比[PO.05];0.625嗎CRM-MenA與CRM-MenAC免疫2次后相比[PO.05];0.156嗎CRM-MenA與CRM-MenAC免疫3次后相比[P〈0.05])。然而，含有N19或CRM載體的兩種二價制劑在兩次和三次免疫后誘導(dǎo)的抗MenA的抗體效價相當(dāng)(無統(tǒng)計學(xué)差異)。單價和二價偶聯(lián)疫苗中的N19載體能夠誘導(dǎo)更快的抗MenA抗體應(yīng)答，在第一個劑量后已經(jīng)產(chǎn)生抗體應(yīng)答，而CRM偶聯(lián)物不能誘導(dǎo)任何可檢測的抗體效價。同時，注射N19偶聯(lián)物兩次后，傾向于引發(fā)比CRM偶聯(lián)物更高的抗體應(yīng)答，但僅在最低劑量的單價疫苗中有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(如0.039嗎N19-MenA與CRM-MenA免疫2次后相比[P0.05])。測定抗MenC抗體應(yīng)答時(圖5的下圖)，比較單價和二價制劑時沒有觀察到兩次或三次劑量后效價降低。降低單價疫苗的免疫劑量一次給藥后，用CRM偶聯(lián)物不能獲得抗MenC抗體水平，而用N19偶聯(lián)物獲得的抗體水平保持穩(wěn)定。通過比較用二價疫苗一次免疫后獲得的效價，CRM偶聯(lián)物顯示不能產(chǎn)生顯著的抗MenC抗體應(yīng)答，而N19偶聯(lián)物以劑量反應(yīng)方式誘導(dǎo)較高水平(抗體)。"微廯厳麟爿C肝傳微欺。將含糖量相等的N19-MenA、N19-MenC、N19-MenW和N19-MenY(N19-MenACWY)混合在一起制備四價制齊U。作為參比，我們采用臨床級批次的CRM偶聯(lián)疫苗(ChironVaccine,Siena)，該疫苗是臨用前將液體CRM-MenCWY與凍干CRM-MenA相混合而配制的。小鼠接受以0.06mg磷酸鋁作佐劑的劑量遞減的四價制劑(2嗎-0.074嗎各MenPS/劑量)。圖6顯示用所有給定劑量的N19-MenACWY免疫兩次或三次對四種血清組莢膜多糖中任意一種產(chǎn)生了相似的IgG效價。比較三次免疫后對CRM偶聯(lián)物的抗體應(yīng)答與兩次免疫后對N19偶聯(lián)物的抗體應(yīng)答時，沒有發(fā)現(xiàn)對所有四種血清組的顯著性差異。第二個劑量后，偶聯(lián)N19時抗血清組A和C的抗體效價顯著高于偶聯(lián)CRM時獲得的抗體效價(抗MenA和抗MenC的IgG:所有給定劑量的N19與CRM免疫2次后相比P<0.05)。在第一次免疫后，N19偶聯(lián)物誘導(dǎo)產(chǎn)生了對所有四種多糖的抗體，而CRM偶聯(lián)物則不。特別是抗MenC抗體，如圖6的圖B所示，用N19偶聯(lián)物在所有給定劑量時獲得的抗體效價顯著較高(所有給定劑量的N19與CRM免疫1次后相比[P<0.05])。圖A和C中顯示，當(dāng)N19偶聯(lián)物給予一次時，抗MenA和MenW的抗體效價在最高劑量時顯著較高(2嗎N19與CRM免疫1次后相比[P<0.05])。兩種偶聯(lián)物誘導(dǎo)的抗體主要是IgGl(數(shù)據(jù)未顯示)。重要的是，我們注意到，與用CRM偶聯(lián)物相比，尤其是第一劑量和第二劑量后，用N19偶聯(lián)物免疫時應(yīng)答小鼠(respondermice)的數(shù)目較多，而第三劑量后，所有小鼠都產(chǎn)生應(yīng)答(表2)。表2:各組小鼠對四種PS抗原(MenACWY)產(chǎn)生應(yīng)答的小鼠的百分數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>N19-MenACWY能高度有效地誘導(dǎo)抗所有四種Men多糖的殺菌抗體。具體說，與CRM偶聯(lián)物相比，給予兩次N19偶聯(lián)物后，所有給定劑量產(chǎn)生的抗C組殺菌效價明顯較高。逐漸提高劑量，N19載體的效能突出，由于限制了劑量，與CRM偶聯(lián)物誘導(dǎo)的抗體相比，N19偶聯(lián)物誘導(dǎo)的抗所有四種多糖的殺菌抗體效價更高。具體分析用最低劑量(0.074嗎)免疫小鼠的單份血清抗MenC和MenW的殺菌抗體效價。圖7顯示，就ELISA效價而言，在兩次或三次劑量后用N19偶聯(lián)物獲得的血清殺菌抗體(SBA)效價也相當(dāng)。用N19偶聯(lián)物免疫2次后，抗MenC殺菌效價已經(jīng)顯著高于注射CRM偶聯(lián)物三次后獲得的殺菌效價(SBA抗MenC:N19免疫2次后與CRM免疫3次后相比[P<0.05])。用N19-或CRM-偶聯(lián)物免疫2次或3次后，比較抗MenW殺菌效價時，我們發(fā)現(xiàn)，N19偶聯(lián)物誘導(dǎo)的殺菌抗體效價顯著更高(SBA抗MenWN19與CRM免疫2次后相比[PO.05];N19與CRM免疫3次后相比[P<0.05])。用僅檢測高親和力抗體的該量抗原結(jié)合試驗詳細分析血清組A和C抗體的功能活性[296]。圖8的結(jié)果顯示，一次免疫后用2pgN19偶聯(lián)物獲得的抗MenC抗體已經(jīng)具有高親合力。兩次免疫足以誘導(dǎo)幾乎所有抗體有效地親合力成熟。用劑量較低的N19偶聯(lián)物或CRM偶聯(lián)物免疫的其它小組顯示相似的成熟特征，僅在兩個劑量后，高親合力抗體的比例從基線增加到約50%(為了簡化，僅顯示了用最高和最低劑量免疫的小組)。為了評價四種多糖共享的載體蛋白對誘導(dǎo)載體蛋白本身抗體的影響，我們檢測了所用兩種載體蛋白的抗體(圖9)。此外，我們分析了所產(chǎn)生的抗載體抗體是否也能結(jié)合母體蛋白。圖9的圖A顯示，用CRM偶聯(lián)物產(chǎn)生的抗體同樣能良好地識別CRM的母體蛋白DT。相反，N19偶聯(lián)物的抗體不與其母體蛋白，如產(chǎn)生N19表位的破傷風(fēng)類毒素(TT)和流感病毒血凝素(HA)發(fā)生交叉反應(yīng)。應(yīng)注意，N19中含有TT的10個表位(五個重復(fù)兩次)，占該序列的50%以上。"贈沐賺腐厳鄉(xiāng)爿C^T錄微欲。通過將偶聯(lián)N19或CRM的MenA與偶聯(lián)CRM或N19的MenCWY混合在一起制備四價制劑(N19-MenA+CRM-MenCWY和反之亦然CRM-MenA+N19-MenCWY)。對照組接受含有一種載體的四價制劑(N19-MenACWY或CRM-MenACWY)。小鼠接受以0.06mg磷酸鋁作佐劑的劑量遞減的四價制劑(0.67嗎-0.074嗎各Men多糖/劑量)。用下述方法測定抗體效價。第一次給予N19-MenACWY后產(chǎn)生的抗MenA效價與兩次給予CRM基疫苗后獲得的效價相當(dāng)(圖6)。而且，用N19偶聯(lián)物免疫兩次的小鼠產(chǎn)生的抗MenA殺菌效價顯著高于用CRM偶聯(lián)物免疫產(chǎn)生的殺菌效價(圖10)。我們觀察到，當(dāng)N19-MenA與CRM-MenCWY同時給予時，或反之交換MenA上的載體時，抗體應(yīng)答顯著高于含唯一載體的四價制劑(如0.67嗎N19-MenA+CRM-MenCWY與N19-MenACWY免疫2次后相比[PO.05];0.67嗎N19-MenA+CRM-MenCWY與CRM-MenACWY免疫3次后相比[PO.01];0.22嗎CRM-MenA+N19-MenCWY與CRM-MenACWY免疫2次后相比[PO.OOl])。然而我們注意到，降低這兩種雙載體制劑的免疫劑量時，抗MenA的IgG抗體效價顯著降低，但其殺菌效價在兩次或三次免疫后不顯著降低(圖10)。而且，這兩種雙載體疫苗在所有劑量下誘導(dǎo)的殺菌效價相當(dāng)(圖11)。值得注意的是，所有制劑中存在N19只需一次免疫就一致地誘發(fā)抗體應(yīng)答，而單獨CRM則沒有這種作用(圖10)。3.5^有不展遺傳夢*游/力1^系。在初步實驗中，用0.67或0.22昭N19-MenACWY或CRM-MenACWY和0.06mg磷酸鋁免疫兩組BALB/c和C57BL/6小鼠兩次。在另一實驗中，用含有如上所述制備的0.06mg磷酸鋁的四價制劑N19-MenACWY或CRM-MenACWY(0.67嗎各Men多糖/劑量)免疫同類系小鼠三次。BALB/c小鼠用作對照。根據(jù)BALB/c小鼠獲得的上述結(jié)果，我們決定僅用兩種不同劑量的含有N19或CRM的四價制劑免疫小鼠兩次，測定對抗四種多糖的抗體應(yīng)答(圖12)。再次證明在BALB/c小鼠中，在該四價疫苗中與CRM相比，N19尤其是誘導(dǎo)抗MenA抗體的更強載體(BALB/cO,22嗎N19與CRM免疫2次后相比[PO.OOl])。我們觀察到，含有N19或CRM的兩種偶聯(lián)物在C57BL/6中的免疫原性低于在BALB/c小鼠中的免疫原性，抗體應(yīng)答更加可變。而且，與在BALB/c中所觀察的結(jié)果相比，N19對所有四種多糖的載體效應(yīng)是否較佳證據(jù)較少。然而，N19偶聯(lián)物在第一次免疫后已經(jīng)能夠一致地引發(fā)對所有四種多糖的抗體效價，而CRM偶聯(lián)物沒有這種效果。如圖13所示，在BALB/cH-2d和B10.D1H-2q品系小鼠中，N19和CRM偶聯(lián)物對四種偶聯(lián)物的免疫原性較高。通常，與用CRM偶聯(lián)物相比，用N19偶聯(lián)物免疫時應(yīng)答的小鼠更多。與CRM-偶聯(lián)物相比，與BALB/c小鼠單倍型相同的B10,D2NH-2d小鼠是更佳的N19-偶聯(lián)物接受者。另一方面，與N19-偶聯(lián)物相比，與BALB/e小鼠同類的BALB/BH-2b是CRM-偶聯(lián)物的更佳接受者。另一方面，CRM偶聯(lián)物在B10.BRH-2k小鼠中不能引發(fā)對四種多糖中任意一種的抗體應(yīng)答，而N19偶聯(lián)物能夠引發(fā)。顯然，在所有測試小鼠品系中，第一次給予N19偶聯(lián)物后引發(fā)對四種多糖的顯著抗體應(yīng)答，在低免疫力品系中有少許例外。用于此研究的遺傳背景不同的大多數(shù)小鼠能產(chǎn)生對四種多糖的抗體，表明用N19-偶聯(lián)物免疫后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答缺乏任何明顯的遺傳限制。如圖14所示，與ELISA測定的IgG應(yīng)答相符，用N19和CRM偶聯(lián)物獲得的殺菌效價也是BALB/cH-2d接受者較高。我們觀察到，N19偶聯(lián)物在所有測試品系小鼠中誘導(dǎo)的抗四種多糖的殺菌效價高于CRM偶聯(lián)物，除了在BALB/B小鼠中抗MenA的效價。用血清殺菌試驗評價所產(chǎn)生抗體的殺菌活性，進一步證實N19的載體作用比CRM更佳。4.麟被級餘魏卿腳方泉"蘑厳麟血微丄C、,5釘多籍-特微/gG。按照已描述的試驗測定各小鼠單份血清中的MenA、MenC、MenW和MenY特異性免疫球蛋白G(IgG)效價[297]。4'C在5pg/ml甲基化人血清白蛋白存在下用5pg/ml純化腦膜炎奈瑟球菌血清組A、C、W或Y多糖分別包被NuncMaxisorp96孔平底板過夜。用含有0.33%Brij-35的PBS(PBS-Brij)洗滌該板三次，然后用200p1/孔PBS(含有5%FCS和0.33。/oBrij-35)(PBS-FCS-Brij)室溫下飽和1小時。用PBS-FCS-Brij稀釋單份血清，分別測定對四種多糖的抗體效價。4'C孵育平板過夜。第二天，用PBS-Brij洗滌平板，加入用PBS-FCS-Brij稀釋的偶聯(lián)堿性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG(SigmaChemicalCo.，SALouis，Mo.)，37。C孵育該平板2小時。用lmg/ml對硝基苯基-磷酸(SigmaChemicalCo.，SALouis，Mo.)的二乙醇胺溶液顯示結(jié)合抗體。孵育20分鐘后，讀取405nm吸光度。得到的免疫前血清值一致地低于0.1OD值。用平行線分析法最大程度降低平板之間的差異，結(jié)果表示為相對于內(nèi)部參比血清的效價。用參比線試驗計算IgG效價[298]，表示為EU/ml的對數(shù)。4.2腦膜炎球菌血清組A和C多糖特異性同種型IgGl/IgG2a為了測定抗MenA和抗MenC特異性IgGl和IgG2a抗體，如上所述4'C用5pg/ml甲基化的人血清白蛋白和5Hg/ml純化的MenA或MenC的PBS溶液包被平板過夜，進行IgGELISA。然后用PBS-FCS-Brij室溫洗滌和封閉平板1小時。用PBS-FCS-Brij在兩塊平板中從1:100開始平行稀釋血清樣品，37'C孵育2小時。加入生物素-偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgGl或lgG2a抗體(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.)。37。C孵育2小時后，將辣根過氧化物酶-偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白(DAKO)加入各孔中，37°C孵育該平板1小時。用底物二鹽酸鄰苯二胺使平板顯色(Sigma)。計算的效價為OD為0.5(450nm)時血清稀釋度的倒數(shù)。《3A^久、rr-、/^-或oM-、z)r-淳岸絲/gG貧體。如前所述[299，300]，測定合并血清中的N19、CRM197載體蛋白和其母體蛋白，即破傷風(fēng)類毒素(TT)、流感嗜血桿菌血凝素(HA)和白喉類毒素(DT)的抗體效價。簡言之，用分別含有2昭/mlN19、TT、HA或CRM197或5嗎/mlDT抗原的200plPBS溶液4"C包被96孔板(NuncMaxisorp)過夜。然后用PBS-BSA1%37。C洗滌和封閉平板1小時。用PBS-BSA1%-吐溫200.05%在平板中從1:100開始稀釋血清樣品，37°C孵育2小時。用偶聯(lián)堿性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG和對硝基苯基-磷酸進行檢測。如上所述顯示抗原-特異性抗體的存在。用平行線分析法最大程度降低平板之間的差異，結(jié)果表示為相對于內(nèi)部參比血清的效價。按照已經(jīng)建立的方法[301，302]，用合并血清的ELISA洗脫試驗評價腦膜炎球菌血清組A和C特異性IgG抗體的親合力，釆用75mM硫氰酸銨[NH4SCN]作為離液劑。試驗驗證包括抗原穩(wěn)定性的評價，隨后用4MNH4SCN孵育[303]。4'C用5^g/ml純化的腦膜炎奈瑟球菌血清組A和C多糖分別包被NuncMaxisorp96孔平底板過夜。吸棄溶液，用PBS-Brij洗滌各孔三次，用封閉緩沖液(PBS-FCS-Brij)室溫封閉1小時。用洗滌緩沖液(PBS-Brij)洗滌平板。用稀釋緩沖液PBS-FCS-Brij稀釋測試和參比血清，在一塊微孔板中一式兩份地兩倍連續(xù)稀釋。37。C孵育2小時后，洗滌平板3次。將其中一份的血清樣品與用血清稀釋緩沖液PBS-FCS-Brij配的75mMNH4SCN一起室溫孵育15分鐘，另一份單用稀釋緩沖液孵育。洗滌后，平板用偶聯(lián)堿性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG抗體(SigmaChemicalCo.，SALouis，Mo.)孵育，方法與上述ELISA試驗相同。參照標(biāo)準(zhǔn)ELISA曲線對應(yīng)于100%結(jié)合抗體，以ELISA單位計算用75mMNH4SCN洗脫后保持與平板結(jié)合的抗體量。用與時間有關(guān)的％結(jié)合抗體代表高親合力IgG效價。5.鄉(xiāng)厳微蘑樣丄C、W釘顏艨殺朦微。以前報道了測定殺菌抗體效價的方法(94)。在巧克力瓊脂平板上37°C、5%C02培養(yǎng)腦膜炎奈瑟球菌血清組A(菌株F8238)、C(菌株ll)、W(菌株240070)或Y(菌株240539)靶菌株過夜(從凍存母液開始)。將600nm吸光度為0.05-0.1的菌落懸浮于7ml含有0.25%葡萄糖的MuellerHinton肉湯中，37°C、5%C02振搖孵育1.5小時使600nm吸光度達至1」~0.24-0.4。用GBSS緩沖液(Gey平衡鹽溶液)(SIGMA)和P/。BSA(試驗緩沖液)稀釋細菌細胞懸液，產(chǎn)生約105CFU/ml。在96-孔平底組織培養(yǎng)-處理平板(Costar，Inc.,Cambridge,Mass.)中用緩沖液連續(xù)兩倍稀釋(起始稀釋度4的倒數(shù))熱滅活(56。C30分鐘)的單份血清樣品或合并血清樣品(50nl)。溫和地混合等體積細胞懸液與合并的小兔補體(25%)，取25^加入連續(xù)稀釋血清。各孔的最終溶液體積為50^1。對照包括(i)細菌-補體-緩沖液(補體依賴性對照)和(ii)熱滅活的測試血清-細菌-緩沖液(補體不依賴性對照)。加入小兔補體后，立即用傾斜法將10^對照加到Mueller-Hinton瓊脂平板上(時間零點，t0)。37°C、5%(302孵育所有含血清組靶菌株的微量滴定板1小時。孵育后，取10pl各樣品點加到Mueller-Hinton瓊脂平板上形成圓點，而通過傾斜法加入10pl對照(時間1，tl)。37°C、5%(302孵育瓊脂平板18小時，計對應(yīng)于tO和tl的菌落數(shù)。tl時的菌落是補體或血清的最終毒性的對照，必須是tO菌落的1.5倍。殺菌效價表示為與血清和補體孵育之前(t0)存在的靶細胞數(shù)量相比產(chǎn)生^50。/。殺傷時血清稀釋度的倒數(shù)。如果其后面至少兩種血清稀釋產(chǎn)生^90%細菌殺傷則認為該效價可信。用斯氏t檢驗(2尾)比較組間和不同時間之間的抗體效價。P值<0.05時認為有統(tǒng)計學(xué)顯著性。6.潘齡導(dǎo)戯艦芬。6.1對N19-MenACWY初免的BALBc小鼠用N19-表位、N19或N19-偶聯(lián)物(刺激)的體外增殖試驗。為了評價用N19-偶聯(lián)物免疫是否能使載體-表位特異性T細胞初敏，在最后一次免疫10天后摘取上述用四價N19-MenACWY(~6或2嗎蛋白/劑量)免疫二或三次的小鼠脾臟，測試用組成N19的一種肽或者游離或偶聯(lián)的N19體外剌激后它們的增殖能力[304]。用于此試驗的純化N19不含可能產(chǎn)生干擾的可檢測的LPS。合并各組小鼠的脾臟，手工分散。洗滌和計數(shù)后，用RPMI(GIBCOBRLLifeTechnologies)在平底96-孔細胞培養(yǎng)板(ComingNY)中以5X105細胞/孔密度培養(yǎng)細胞，RPMI添加了25mMHEPES緩沖液、100U/ml青霉素、100ng/ml鏈霉素、502-巰基乙醇、0.15mML-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、維生素、丙酮酸鈉和非必需氨基酸的混合物(GIBCOBRLLifeTechnologies1%的100X母液)和5。/。胎牛血清(Hyclone)。在每孔存在0.12-30pM(兩倍或三倍稀釋)(0.15-50ng/ml)各個肽的情況下一式三份培養(yǎng)細胞，或者將用相同培養(yǎng)基稀釋的0.004-1游離或偶聯(lián)的N19加入三復(fù)孔，使每孔總體積200pl。用完全培養(yǎng)基或10pg/mlConcanvalinA作對照，以證明細胞的增殖能力。37°C、5%(:02孵育平板。五天后，用每孔0.5nCi[3H]胸苷(AmershamBioscienceslmCi/ml母液)脈沖處理細胞18小時，用Filtermate收集儀收獲，用液體閃爍計數(shù)器(PackardBioscience)計數(shù)。增殖試驗的結(jié)果表示為刺激指數(shù)(SI)，用刺激的實驗培養(yǎng)物每分鐘計數(shù)(cpm)與未刺激對照培養(yǎng)物(背景)每分鐘計數(shù)的比率計算。對三復(fù)孔培養(yǎng)物作平行測定。SI〉2時判為陽性。為了測定N19在小鼠系統(tǒng)中的強效T細胞輔助作用是否由N19中原來包含的某種CD4+表位所介導(dǎo)，評價用N19-MenACWY(6嗎N19/劑量)免疫兩次或三次BALB/c小鼠脾細胞的T-細胞增殖。用不同濃度的游離或偶聯(lián)多糖的N19肽或用完整N19體外刺激脾細胞。如圖15所示，在游離或偶聯(lián)的N19存在時淋巴細胞顯著增殖。我們也觀察到，在所有我們的實驗中，用P23TT肽刺激T細胞均增殖(圖15和16)。用其它測試肽，我們觀察到P30TT、P32TT、HA和HBsAg誘導(dǎo)了T細胞增殖，即使僅在較高濃度時出現(xiàn)。用C57BL/6小鼠進行此試驗時，這些表位都不刺激淋巴細胞增殖，N19僅在最高濃度時刺激細胞。而且，我們在同類系小鼠中檢測了N19-特異性T細胞的活化研究是否存在任何MHC-限制模式。通過測定在不同濃度的l)游離N19或2)偶聯(lián)多糖的N19,或3)—種N19組成肽或4)游離多糖組分存在時遺傳背景不同的小鼠脾細胞增殖反應(yīng)，體外分析活化情況。我們觀察到，游離N19在所有品系小鼠中誘導(dǎo)T細胞活化，但N19偶聯(lián)物在測試品系中產(chǎn)生有差異的增殖反應(yīng)(圖17)。評價背景基因(BALB或B10)對H-2反應(yīng)的影響時，我們觀察到H-2d單倍型小鼠產(chǎn)生不同表位的特異性T細胞。在兩種遺傳上不相關(guān)的小鼠(BALB/cH-2d和B10.BRH-2"中產(chǎn)生P23TT表位的記憶T細胞。另一方面，具有不同H-2d單倍型的同類系小鼠(BALB或B10)產(chǎn)生不同的表位-特異性T細胞增殖反應(yīng)，這表明MHC復(fù)合物以外的遺傳因素也影響該反應(yīng)。然而，遺傳背景相同的小鼠(BALB)產(chǎn)生了P30TT表位反應(yīng)性T細胞?？傊?，盡管這些肽的H-2限制水平不同，但用N19偶聯(lián)物(免疫的)所有品系小鼠對所有四種多糖都能產(chǎn)生良好的抗體應(yīng)答。而且，我們觀察到，四種多糖中任何一種都能夠在任何測試品系小鼠中誘導(dǎo)增殖，表明它們是非T-細胞依賴性抗原，與載體蛋白的偶聯(lián)不會干擾其特性，如誘導(dǎo)多糖特異性T細胞活化的能力。6.2評價小鼠表位-特異性T-細胞增殖免疫方案和增殖試驗。95。/。純的合成肽(P2TT、P21TT、P23TT、P30TT、P32TT、HA和HBsAg)購自Primms.r丄(意大利)。每只小鼠用50pl體積在尾根部皮下免疫每組三只BALB/c小鼠，50pl體積中含有用完全弗氏佐劑(CFA)乳化的50嗎單一肽(P2TT、P30TT、P23TT、P32TT、HA、HBsAg)或N19。7天后，處死小鼠，取出各組小鼠腹股溝和主動脈周淋巴結(jié)并合并，制備單細胞懸液。在平底96孔細胞培養(yǎng)板(CostarCorp.，Cambridge,Mass.)中用完全培養(yǎng)基(上述補充后的RPMI，用于脾細胞)以3乂105細胞/孔密度培養(yǎng)脾細胞。將三種不同濃度(15、7.5和3.75mM所有肽;10、1和0.1pg/mlN19)的用相同培養(yǎng)基稀釋的N19或同源肽加入單只小鼠的或合并的培養(yǎng)細胞的三復(fù)孔中。37°C、5%<302孵育5天后，用0.5pCi卩H]胸苷脈沖細胞16小時，然后如上所述收獲細胞。在這些實驗中將衍生自肺炎衣原體表面蛋白的不相關(guān)肽CH60(計算機預(yù)測能結(jié)合HLA-A2)用作陰性對照。圖18顯示，用單種肽免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生對P23TT、HA、HBsAg肽和N19的特異性T細胞應(yīng)答，但對不相關(guān)CH60肽則不。用P32TT免疫的小鼠不能對相同肽產(chǎn)生應(yīng)答。佐劑對照小鼠的細胞對ConA刺激產(chǎn)生增殖反應(yīng)，但對任何肽或N19不產(chǎn)生增殖反應(yīng)，從而證明這些肽不是促分裂性肽。盡管是人表位，但這些發(fā)現(xiàn)可解釋N19在小鼠系統(tǒng)中也具有強載體作用。應(yīng)理解，通過實施例只是描述了本發(fā)明，可對實施例作一些修改但仍屬于本發(fā)明的范圍和構(gòu)思。參考文獻(將其內(nèi)容全部納入本文)Armand等(1982)J5,o/.&am^10:335-339。[2]Cadoz等(1985)^cc/"e3:340-342。MMWR(1997)46(RR-5)1-10。Peltola(2000)C""M'c油'o/iev13:302-317Wuorimaa和Kayhty(2002)ScandJImmunol56:111-129Balmer等(2002)JMedMicrobiol51:717-722Eltinger(1990)Science249:423-425Alexander等(2000)JImmunol164:1625-1633WO99/55730Falugi等(2001)EurJImmunol31:3816-3824[12]Demotz，S.等(1993)EurJImmunol23:425-32。[13]Ho，P.C等(199t))EurJImmunol20:477-83。[14]Sinigaglia，F(xiàn).等(1988)Nature336:778-80。Panina國Bordignon，R等(1989)EurJImmunol19:2237-42。O'Sullivan,D.等(1991)JImmunol147:2663-9。Falugi，F(xiàn).等(2001)￡wi/wmw"o/.31:3816-24。Greenstein，J丄.等(1992)JImmunol148:3970-7。Rothbard，J.B.等(1988)Cell52:515-23。WO02/34771WO03/093306WO04/041157WO2005002619PCT紐004/003366WO03/007985《疫苗》(Vaccine)(Plotkin等編)第四版ISBN0-7216-9688-0[27]Wessels等(1990)JClinInvest86:1428-33。[28]Wessels等(1989)InfectImmun57:1089-94。[29]WO03/080678Ravenscroft等(1999)Vaccine17:2802-2816。Lei等(2000)DevBiol(Basel)103:259-264。WO00/38711;美國專利6,146,902。Lees等(1996)Vaccine14:190-198。W095扁48。同W098/42721美國專利4,882,317美國專利4,695,624MoUmm漏l，1985，22，907-919EP-A-0208375WOOO/10599Gever等，MedM/cra6/o/./mmw"o/，165:171-288(1979)。[43]美國專利4,057,685。美國專利4,673,574;4,761,283;4,808,700。美國專利4,459,286。美國專利4,965,338美國專利4,663,160。美國專利4,761,283美國專利4,356,170Lei等(2000)DevBiol(Basel)103:259-264。WO00/38711;美國專利6,146,902。W099/24578W099/36544WO99/57280WO00/22430。Tettelin等(2000)Science287:1809-1815[57]W096/29412Pizza等(2000)Science287:1816-1820[59]WOO1/52885Bjune等(1991)Lancet338(8775):1093-96[61]Fukasawa等(1999)Vaccine17:2951-2958。Rosenqvist等(1998)Z)ev.Ao/.5tow/.92:323-333。Costantino等(1992)Vaccine10:691-698。Costantino等(1999)Vaccine17:1251-1263。WO03細7985。WO00/66791WOO1/64922WOO1/64920WO03/020756WO2004/032958WO2004/048頓。W098/18931WO98/18930美國專利6,699，703美國專利6,800,744WO97/43303WO97/37026Watson(2000)PediatrInfectDisJ19:331-332。[79]Rubin(2000)PediatrClinNorthAm47:269-285，v。[80]Jedrzejas(2001)MicrobiolMolBiolRev65:187-207。[81]WO02/22167。Paoletti等(1990)JBiolChem265:18278-83。[83]Wessels等(1990)JClinInvest86:1428-33。[84]Baker等(2004)JInfectDis171:879-84。[85]WO02/34771[86]WO2005/032582[87]WO02/094851Dale,Vaccine(1999)17:193-200Dale,Vaccine14(10):944-948Dale(1999)InfectDisClinNorthAm13:227-43，viii.Ferretti等(2001)PNASUSA98:4658-4663。WO02/1859593]W099/5856294]McMichael(2000)Vaccine19Suppl1:S101-107。:95〗Gustafsson等(1996)W五"g/./A/ed334:349-355。:96]Rappuoli等(1991)TIBTECH9:232-23S。:97]Kuroda等(2001)Lancet357(9264):1225-1240;也參見第1218-1219頁。98]WO00/56360:99]InfectImmun.2001年5月；69(5):3510-3515:100]WO03/093306:101]Schuchat(1999)Lancer353(9146):51-6102]WO2004/041157:103]WO2005/002619:104〗Zhu等，Vaccine(2004)22:660-669105〗Price等，InfectionandImmunity(2004)71(1):277-283):106〗Plante等，JInfectiousDisease(2000)182:848-855):107]WO02/079243108]WO00/37494:109]WO03/049762:110]WO03/068811111]W099/28475。:112]美國專利6,756,361:113]Covacci和Rappuoli(2000)/Med19:587-592。:114]WO93/18150:115]WO99/53310:116〗Covacci等(1993)Ato/.」c^/.SW.USA90:5791-5795。:117]Tummuru等(1994)/"/e"./wmzm.61:1799-1809。:118]Marchetti等(1998)Vaccine16:33-37。:119]Telford等(1994)J~.Med179:1653-1658。:120]Evans等(1995)Gene153:123-127。:121]WO96/01272和WO96/01273,尤其是SEQIDNO:6。W097/25429。WO98/04702。Houghton等，Hepatology(1991)14:381[156]Hsu等(1999)ClinLiverDis3:901-915。[157]Dreesen(1997)Vaccine15增刊:S2-6。MMWRMorbMortalWklyRep1998年1月16日；47(1):12，19。WO2004/92360美國專利5,378,814美國專利6,333,164WOOO/15255美國專利申請20020007173。美國專利5,693,522。Moingeon(2001)Vaccine19:1305-1326。Dermine，S.等，"癌癥疫苗和免疫治療"(CancerVaccinesandImmunotherapy),BritishMedicalBulletin,2002，62，149-162Espinoza-DelgadoL，"癌癥疫苗"(CancerVaccines),TheOncologist,2002，7(增刊3):20-33Davis，LD。等，"人類癌癥免疫治療的合理方法"(Rationalapproachestohumancancerimmunotherapy)JournalofLeukocyteBiology，2003，23:3-29VandenEyndeB，等，"T細胞識別的新型腫瘤抗原"(NewtumorantigensrecognizedbyTcells),Cw/r.7mmw"o/.，1995，7:674-81RosenbergSA，"以鑒定的編碼癌癥回歸抗原的基因為基礎(chǔ)的癌癥疫苗"(CancerVaccinesbasedontheidentificationofgenesencodingcancerregressionantigens),Immunol.Today,1997，18:175-82OffringaR等，"癌癥抗原特異性疫苗接種方案的設(shè)計和評價"(Designandevalutationofantigen-specificvaccinationstrategiesagainstcancer),Cw/rewf/mm柳o/.，2000，2:576-582RosenbergSA，"基于編碼癌抗原的基因的癌癥免疫治療的新紀(jì)元"(Aneweraforcancerimunotherapybasedonthegenesthatencodecancerantigens),Immunity,1999，10:281-7SahinU等，"人類腫瘤抗原的血清學(xué)鑒定"(Serologicalidentificationofhumantumorantigens),Cm;t.Tmmwwo/.，1997，9:709-16OldLJ等，"人類癌癥血清學(xué)中的新途徑"(Newpathsinhumancancerserology),Meof.，1998，187:1163-7Chaux等，"HLA-DR分子提呈給CD4(+)T淋巴細胞的MAGE-3表位的鑒定"(IdentificationofMAGE-3epitopespresentedbyHLA-DRmoleculestoCD4(+)Tlymphocytes),/五x;.i^ed，1999，189:767-78GoldP，等，"人類消化系統(tǒng)的特異性癌胚抗原"(Specificcarcinoembryonicantigensofthehumandigestivesystem),/￡!xp.Mecf.，1965，122:467-8LivingstonPO，等，"誘導(dǎo)抗癌抗體的糖疫苗基本原理"(Carbohydratevaccinesthatinduceantibodiesagainstcancer:Rationale)，CancerImmunol.Immunother.，1997，45:1-6LivingstonPO，等，"誘導(dǎo)抗癌抗體的糖疫苗既有經(jīng)驗和未來計劃"(Carbohydratevaccinesthatinduceantibodiesagainstcancer:Previousexperienceandfiitureplans)，CancerImmunol.Immunother.，1997，45:10-9Taylor-PapadimitriouJ，"癌相關(guān)粘蛋白的生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)"(Biology,biochemistryandimmunologyofcarcinoma-associatedmucins),Immunol.Today,1997，18:105-7ZhaoX-J等，"GD2寡糖細胞毒性T淋巴細胞的靶點"(GD2oligosaccharide:targetforcytotoxicTlymphocytes),五x/.M"ec/.，1995，182:67-74TheobaldM，等，"作為通用腫瘤抗原的靶向p53"(Targetingp53asageneraltumorantigen),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995，92:11993-7GaudernackG，"抗突變ras的T細胞應(yīng)答新型癌癥疫苗的基礎(chǔ)"(Tcellresponsesagainstmutantras:abasisfornovelcancervaccine)Immunotechnology,1996，2:3-9W091/02062美國專利6,015,567WOO1/08636WO96/30514美國專利5,846,538美國專利5,869,445Ingram(2001)TrendsNeurosci24:305-307美國專利6,884,435。WO98/20734。[193]WO03/009869[194]WO01飾90。VaccineDesign…(1995)，Powell和Newman編，ISBN:030644867X.Plenum.[196]WO00/23105。[197]WO90/14837。Podda(2001)Vaccine19:2673-80。[199]Frey等(2003)Vaccine21:4234-7。[200]美國專利6,299,884。[201]美國專利6,451,325。Hariharan等(1995)CancerRes55:3486-9。美國專利5,057,540。W096/33739。EP-A-0109942。W096/11711。WO00/07621。Barr等(1998)AdvancedDrugDeliveryReviews32:247-271。[210]Sjolanderet等(1998)AdvancedDrugDeliveryReviews32:321-338。[211]Niikum等(2002)Virology293:273-280。[212]Lew等(2001)JImmunol166:5346-5355。[213]Pinto等(2003)JInfectDis188:327-338。[214]Gerber等(2001)Virol75:4752-4760。[215]WO03/024480[216]WO03/024481Gluck等(2002)Vaccine20:B10-B16。[218]EP-A-0689454。Johnson等(1999)BioorgMedChemLett9:2273-2278。[220]Evans等(2003)ExpertRevVaccines2:219-229。[221]Meraldi等(2003)Vaccine21:2485-2491。[222]Pajak等(2003)Vaccine21:836-842。[223]Kandimalla等(2003)NucleicAcidsResearch31:2393-2400。[224]WO02/26757。[225]W099/62923。Krieg(2003)NatureMedicine9:831-835。McCluskie等(2002)FEMSImmunology禾卩MedicalMicrobiology32:179-185。WO98/40100。[229]美國專利6,207,646。[230]美國專利6,239,116。[231]美國專利6,429,199。Kandimalla等(2003)BioChemicalSocietyTransactions31(第3部分)654-658。Blackwell等(2003)JImmunol170:4061-4068。[234]Krieg(2002)TrendsImmunol23:64-65。[235]WOO1/95935。Kandimalla等(2003)BBRC306:948-953。[237]Bhagat等(2003)BBRC300:853-861。[238]WO03/035836。[239]W095/17211。[240]W098/42375。Beignon等(2002)InfectImmun70:3012-3019。Pizza等(2001)Vaccine19:2534-2541。Pizza等(2000)IntJMedMicrobiol290:455-461。Scharton誦Kersten等(2000)InfectImmun68:5306-5313。Ryan等(1999)InfectImmun67:6270-6280。Partidos等(1999)ImmunolLett67:209-216。Peppoloni等(2003)ExpertRevVaccines2:285-293。Pine等(2002)JControlRelease85:263-270。Domenighini等(1995)MolMicrobiol15:1165-1167。WO03/011223。WO99/40936。MatsuiM等(2004)J.Virol78:9093。[253]W099/44636。LillardJW等(2003)2月1曰;101(3):807-14.Epub2002年9月12曰。Singh等(2001)JContRelease70:267-276。WO99/27960。美國專利6,090，406美國專利5,916,588EP-A-0626169。W099/52549。WO01/21207。WOO1/21152。Andrianov等(1998)Biomaterials19:109-115。Payne等(1998)AdvDrugDeliveryReview31:185-196。Stanley(2002)ClinExpDermatol27:571-577。Jones(2003)CurrOpinInvestigDrugs4:214-218。WO04/60308WO0幅759。US6,924,271。US2005/0070556。US5,658,731。Wong等(2003)JClinPharmacol43(7):735-42。[273〗US2005/0215517。[274]WO02/072012?！兑呙缱魟┲苽浞椒ê脱芯糠桨浮?VaccineAdjuvants:PreparationMethodsandResearchProtocols)(分子藥物方法系列的第42巻)。ISBN:1-59259-083-7。O'Hagan編。Signorelli和Hadden(2003)IntImmunopharmacol3(8):1177-86。[277〗WO200概4715。Cooper(1995)PharmBiotechnol6:559-80。[279]PCT/US2005/022769。WO200術(shù)153。[281]US6,605,617。[282]WO02/18383。[283]WO2004/018455。[284]WO03/082272。[285]美國專利5,011,828。[286〗US-6586409。[287]W099/11241。[288]W094細153。[289〗W098/57659。歐洲專利申請0835318,0735898和0761231。[291]Costantino，R等(1992)Vaccine10:691-8。[292]Costantino,P.等(1999)Vaccine17:1251-63。[293]Ravenscroft,N.，G.等(1999)Vaccine17:2802-16。[294]WO03/007985Porro，M.，P.等(1985)MolImmunol22:907-19。Goldblatt，D.等(1998)JlnfectDis177:1112-5Carlone,G,M.等(1992)JClinMicrobiol30:154-9。Grabowska，K.等(2002)JImmunolMethods271:1-15。Barakio，K.等(2004)InfectImmun72:4884-7。Mawas，F(xiàn),等(2004)JInfectDis190:1177-82。Granoff，D.M.等(1998)ClinDiagnLabImmunol5:479-85。Schallert，N.等(2002)EurJImmunol32:''52-60。Valmori，D.等(1992)JImmunol149:717-21。權(quán)利要求1.一種含有兩種或多種單價偶聯(lián)物的組合的組合物，其中所述兩種或多種單價偶聯(lián)物各自包含(i)載體蛋白，其包含偶聯(lián)于(ii)糖抗原的兩種或多種病原體的T細胞表位。2.—種包含偶聯(lián)同一載體蛋白分子的兩種或多種抗原性不同的糖抗原的多價偶聯(lián)物，其中所述載體蛋白包含兩種或多種病原體的T細胞表位。3.—種組合物，其包含兩種或多種權(quán)利要求2所述的多價偶聯(lián)物。4.一種組合物，其包含一種或多種權(quán)利要求2所述的多價偶聯(lián)物和一種或多種權(quán)利要求1所述的單價偶聯(lián)物。5.如權(quán)利要求l、3或4所述的組合物，其特征在于，所述兩種或多種偶聯(lián)物中的載體蛋白相同。6.如權(quán)利要求l、3或4所述的組合物，其特征在于，各偶聯(lián)物中的載體蛋白相同。7.如權(quán)利要求l、3、4、5或6所述的偶聯(lián)物，其特征在于，至少一種載體蛋白表位不衍生自糖抗原的同一病原體。8.如權(quán)利要求1或3-7中任一項所述的偶聯(lián)物，其特征在于，沒有一種載體蛋白表位衍生自所述糖抗原的同一病原體。9.如權(quán)利要求l或4-8中任一項所述的組合物，其特征在于，所述單價偶聯(lián)物中的所述載體蛋白分子偶聯(lián)一個以上所述糖抗原分子。10.如權(quán)利要求1或4-8中任一項所述的組合物，其特征在于，各單價偶聯(lián)物中的各載體蛋白分子偶聯(lián)于一種以上糖抗原分子。11.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，其特征在于，所述載體蛋白包含6個表位。12.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，其特征在于，所述載體蛋白包含19個表位。13.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，其特征在于，所述載體蛋白包含至少一種CD4+T細胞表位。14.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，其特征在于，所述載體蛋白包含至少一種細菌表位和至少一種病毒表位。15.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，其特征在于，所述至少一種載體蛋白表位衍生自甲肝病毒、乙肝病毒、麻疹病毒、流感病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、牛型結(jié)核菌和麻風(fēng)分枝桿菌和/或鏈球菌菌株的熱激蛋白。16.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，其特征在于，所述至少一種載體蛋白表位選自破傷風(fēng)毒素(TT)、惡性瘧原蟲CSP(PfCs)、乙肝病毒核衣殼(HBVnc)、流感病毒血凝素(HA)、HBV表面抗原(HBsAg)或流感病毒基質(zhì)(MT)蛋白。17.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，其特征在于，所述至少一種載體蛋白表位選自P23TT(SEQIDNO:1)、P32TT(SEQIDNO:2)、P21TT(SEQIDNO:3)、PfCs(SEQIDNO:4)、P30TT(SEQIDNO:5)、P2TT(SEQIDNO:6)、HBVnc(SEQIDNO:7)、HA(SEQIDNO:8)、HBsAg(SEQIDNO:9)或MT(SEQIDNO:10)。18.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，其特征在于，所述至少一種糖抗原衍生自腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、流感嗜血桿菌、綠膿假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、傷寒沙門菌、克雷伯菌、白假絲酵母和/或新型隱球菌。19.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，還包含佐劑。20.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物，還包含非糖抗原。21.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物在治療中的應(yīng)用。22.如前述任一項權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物或組合物在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。23.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的偶聯(lián)物或組合物在制造誘導(dǎo)患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。24.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的偶聯(lián)物或組合物在制造誘導(dǎo)患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述患者已用與偶聯(lián)載體的所述組合物中所含糖抗原不同的糖抗原預(yù)先治療。25.如權(quán)利要求1-20中任一項所述的偶聯(lián)物或組合物在制造誘導(dǎo)患者產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述患者已用與偶聯(lián)不同載體的所述組合物中所含糖抗原相同的糖抗原預(yù)先治療。26.—種藥盒，其包括a)本發(fā)明的第一種偶聯(lián)物和b)本發(fā)明的第二種偶聯(lián)物。全文摘要本發(fā)明提供含有兩種或多種單價偶聯(lián)物相組合的組合物，所述兩種或多種單價偶聯(lián)物各自含有載體蛋白，所述載體蛋白包含偶聯(lián)糖抗原的兩種或多種病原體的T細胞表位。本發(fā)明也提供多價偶聯(lián)物，其包含偶聯(lián)于同一載體蛋白分子的兩種或多種抗原性不同的糖抗原，所述載體蛋白包含兩種或多種病原體的T細胞表位。其它組合物包含一種或多種所述單價偶聯(lián)物和一種或多種所述多價偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了制備所述組合物的方法和所述組合物的應(yīng)用。實施例包括將N19載體蛋白偶聯(lián)于腦膜炎球菌寡糖。文檔編號A61K39/116GK101111261SQ200580047420公開日2008年1月23日申請日期2005年12月23日優(yōu)先權(quán)日2004年12月24日發(fā)明者G·德爾古迪斯,K·巴拉爾多申請人:啟龍有限公司