專利名稱：有效抑制hif－1a表達的lna寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)HIF-1a的表達的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及LNA寡核苷酸，其可以與編碼HIF-1a的核酸特異性地雜交。已經(jīng)證實，所述LNA寡核苷酸可調(diào)節(jié)HIF-1a的表達，并公開了其藥物制品和它們治療癌癥疾病、炎性疾病和眼病的用途。
背景技術(shù)：
實體瘤必須建立血液供應并具有增強的葡萄糖代謝，才能生長到超過幾毫米。它們?nèi)绾胃兄脱?、并通過激活低氧誘導型基因和分泌血管發(fā)生因子來建立血系統(tǒng)作出反應，是癌癥生物學的關(guān)鍵。許多腫瘤含有低氧微環(huán)境，已經(jīng)將它們與惡性進展、轉(zhuǎn)移和對放療和化療的抗性相關(guān)聯(lián)。
低氧誘導因子-1(HIF-1)的發(fā)現(xiàn)，提供了對低氧誘導型基因的調(diào)節(jié)的一些洞察(US 5,882,914和WO 96/39426；WO 99/48916)。HIF-1由2個亞基HIF-1α(HIF-1alpha；在本文中稱作″HIF-1a″)和HIF-1β組成，它會結(jié)合編碼血管生成因子(例如VEGF)和糖酵解相關(guān)蛋白(例如糖酵解酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1和3(GLU-1和3))的基因的增強子中的-1低氧響應元件(HRE)。
已經(jīng)確認，反義HIF-1a質(zhì)粒的腫瘤內(nèi)基因轉(zhuǎn)移對HIF-1a的工程化減量調(diào)節(jié)，會導致VEGA的減量調(diào)節(jié)和降低的腫瘤微血管密度(WO00/76497，Sun X等，Gene Therapy(2001)8，638-645)。該質(zhì)粒含有編碼HIF-1a的5′-末端(核苷酸152-454；Genebank AF003698)的320-bp cDNA片段。
WO 2003/085110顯示了可以減量調(diào)節(jié)人HIF-1a表達的LNA反義寡核苷酸。一種化合物稱作CUR813(SEQ ID NO.11)。
本發(fā)明公開了LNA寡核苷酸，其比CUR813(SEQ ID NO.11)更有效。另外，根據(jù)本發(fā)明的特異性LNA寡核苷酸會誘導細胞凋亡和抑制增殖。另外，與小鼠HIF-1a具有100％序列同一性的LNA寡核苷酸會減量調(diào)節(jié)小鼠肝、結(jié)腸和腎中的HIF-1a表達。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)HIF-1a的表達的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及涵蓋靶向HIF-1a的2個特定基序的LNA寡核苷酸。這些基序公開為SEQ ID NO.3和4。更具體地，優(yōu)選的LNA寡核苷酸是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本發(fā)明的LNA寡核苷酸是HIF-1αmRNA表達和蛋白水平的有效抑制劑。
更具體地，本發(fā)明提供了LNA寡核苷酸，其由選自下述的序列組成5′-(Tx)GxGxcsasasgscsastscscsTxGxT-3′(SEQ ID NO.3)和5′-(Gx)TxTxascstsgscscststscsTxTxA-3′(SEQ ID NO.4)其中大寫字母代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物，小寫字母代表2-脫氧核苷酸，下劃線代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物或2-脫氧核苷酸，下標″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵，且其中在括號中的核苷酸單元(分別為(Tx)，(T)，或(Gx)，(A))代表可選存在的單元，且其中所述序列可選地延伸至多5個2-脫氧核苷酸單元。
也提供了包含本發(fā)明的LNA寡核苷酸的藥物組合物。還提供了調(diào)節(jié)細胞或組織中HIF-1a的表達的方法，其包含使所述細胞或組織接觸一種或多種本發(fā)明的LNA寡核苷酸或組合物。還公開了通過施用治療或預防有效量的一種或多種本發(fā)明的LNA寡核苷酸或組合物，治療懷疑患有或易患與HIF-1a的表達有關(guān)的疾病或狀況的動物或人的方法。另外，提供了使用LNA寡核苷酸抑制HIF-1a的表達和治療與HIF-1a活性有關(guān)的疾病的方法。
附圖簡述

圖1A顯示了與SEQ ID NO.6相比，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5在大鼠血漿(NtacSD雄性，肝素鋰(Taconic，M&B))中提高的穩(wěn)定性。在37℃，以20μM濃度溫育寡核苷酸0、4、或24小時。甚至在消化24小時后，沒有檢測到SEQ ID NO.1的降解片段。
圖1B顯示了全長SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.13(SEQ ID NO.1的硫代磷酸酯，且相同序列)在大鼠和人血清中的穩(wěn)定性。以20μM的終濃度，將寡核苷酸加入人或大鼠血清。該圖表明，在37℃，LNA寡核苷酸在人和大鼠血清中長達1-96小時的穩(wěn)定性。對于大鼠血清，圖1B的倒數(shù)第二個圖證實了甚至在48小時和96小時后仍持續(xù)的酶活性。作為陰性對照的后一個圖證實，當在37℃、不加入血漿溫育時，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.13沒有降解。
圖1C顯示了SEQ ID NO.1在人和大鼠血漿中非常長的穩(wěn)定性。在人或大鼠血漿中溫育寡核苷酸1-96小時，然后上變性凝膠。用SyBr金染色后，使用磷光計測量全長產(chǎn)物的量，并相對于時間繪圖。
圖2A顯示了LNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染的U373細胞中的HIF-1a蛋白減量調(diào)節(jié)。用2或10nM化合物轉(zhuǎn)染U373細胞，或模擬轉(zhuǎn)染，在低氧下溫育，并通過蛋白印跡分析HIF-1a蛋白減量調(diào)節(jié)。分析微管蛋白表達，作為等量上樣的對照。
圖2B顯示了用SEQ ID NO.1處理后U373成膠質(zhì)細胞瘤癌細胞系中的HIF-1α蛋白減量調(diào)節(jié)。分析Pan-肌動蛋白表達，作為等量上樣的對照。用0.2，1和10nM SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.10(它是SEQ ID NO.1的2bp mm)轉(zhuǎn)染細胞。下圖是凝膠的定量。
圖2C顯示了用靶向HIF-1a的LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1和含有LNA的雜亂對照寡核苷酸SEQ ID NO.8處理后24小時，U373細胞中的HIF-a表達的減量調(diào)節(jié)。將HIF表達與GAPDH或β-肌動蛋白相關(guān)聯(lián)，并與未轉(zhuǎn)染的對照(模擬品)相比。RNA純化后，通過QPCR定量mRNA表達。
圖3A和3B顯示了細胞凋亡的誘導，這通過用LNA寡核苷酸處理24-72小時后，常氧或低氧條件下成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U373中誘導的半胱天冬酶3/7活性的動態(tài)特征來測得。證實SEQ ID NO.1是早期細胞凋亡的有效誘導劑。
圖4A早期凋亡細胞期的誘導，這通過48小時后膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI流式細胞術(shù)分析測得。與模擬品和SEQ ID NO.12處理的細胞相比，將用LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1處理的U373細胞分類成更″早期凋亡的″。
圖4B用SEQ ID NO.1處理后，U373細胞中早期細胞凋亡的誘導的定量。用不同劑量的SEQ ID NO.1處理后48小時，迫使進入早期細胞凋亡的細胞的百分比。用SEQ ID NO.1或兩種不同的雜亂的對照寡核苷酸SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.12轉(zhuǎn)染U373細胞。收獲并與膜聯(lián)蛋白V ab和PI溫育后，通過流式細胞術(shù)測量早期細胞凋亡的細胞的數(shù)目。
圖5A和5B顯示了轉(zhuǎn)染并在低氧或常氧下溫育后24-72小時，化合物轉(zhuǎn)染的成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U373細胞。通過MTS測定測得，顯示了SEQ ID NO.1是有效的增殖抑制劑。
圖6A和圖6B顯示了使用SEQ ID NO.1的兩種給藥方案的體內(nèi)內(nèi)源肝靶物減量調(diào)節(jié)。測量HIF-1α以及下游靶物VEGF的mRNA水平，證實了SEQ ID NO.1也是所述靶物的有效抑制劑。圖6A每天腹膜內(nèi)注射有毛的小鼠，持續(xù)14天。圖6B每周2次腹膜內(nèi)注射有毛的小鼠，持續(xù)14天。
圖6C顯示了減量調(diào)節(jié)后體內(nèi)內(nèi)源腎HIF-1α，給藥方案是，每天腹膜內(nèi)注射SEQ ID NO.1給有毛的小鼠，持續(xù)14天。
圖7A顯示，在施用SEQ ID NO.1后，通過HIF-1a在肝中的體內(nèi)表達的減量調(diào)節(jié)測得，SEQ ID NO.1是有效的抑制劑。以每天18或3.6mg/kg，分別將SEQ ID NO.1的不同硫化形式(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)和SEQ ID NO.1施用給有毛的小鼠，持續(xù)14天，并處死。如M&M所述，通過QPCR，在mRNA水平測量HIF-1a的表達，并相對于β-肌動蛋白標準化。
圖7B顯示，在施用SEQ ID NO.1后，通過HIF-1a在肝中的體內(nèi)表達的減量調(diào)節(jié)測得，SEQ ID NO.1也是有效的抑制劑。以50，10或2mg/kg，分別將SEQ ID NO.1的不同硫化形式(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)和SEQ ID NO.1施用給有毛的小鼠，每周兩次，持續(xù)14天，并處死。通過QPCR，在mRNA水平測量HIF-1a的表達，并相對于β-肌動蛋白標準化。
圖7C顯示了在施用SEQ ID NO.1后，HIF-1a在腎中的體內(nèi)表達的減量調(diào)節(jié)。以每天18或3.6mg/kg，將SEQ ID NO.1的不同硫化形式(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)施用給有毛的小鼠，持續(xù)14天，并處死。通過QPCR，在mRNA水平測量HIF-1a的表達，并相對于β-肌動蛋白標準化。
圖8A顯示了通過來自異種移植物的U373腫瘤的腫瘤重量測得的，與SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12(雜亂的對照)相比，使用SEQID NO.1的優(yōu)異的體內(nèi)功效。以50mg/kg，每周2次，持續(xù)1周，將SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12施用給植入卵巢的U373異種移植小鼠。最后一次給藥后2天，處死動物。在處死時，稱量腫瘤重量，并計算各個腫瘤重量+平均腫瘤重量(紅色)，并繪圖。發(fā)現(xiàn)對照組(雜亂的對照SEQ ID NO.12)和SEQ ID NO.1處理的小鼠之間的統(tǒng)計學顯著性差異(P＝0.005)。
圖8B顯示了來自用SEQ ID NO.1處理的異種移植物的U373腫瘤中的血管密度。以50mg/kg，每周2次，持續(xù)1周，將SEQ ID NO.1施用給植入卵巢的U373異種移植小鼠。最后一次給藥后2天，處死動物。在CD31染色后計算血管密度，并與總面積相比。發(fā)現(xiàn)與鹽水組和雜亂的對照(SEQ ID NO.12)處理的小鼠之間的統(tǒng)計學顯著性差異(P＝0.005)。
圖8C顯示了來自植入卵巢、并如圖8B所述用SEQ ID NO.1處理的U373腫瘤的切片的CD 31染色。
圖8D顯示了植入卵巢、并如圖8B所述用SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.11，SEQ ID NO.12和PBS處理的U373腫瘤中，通過實時PCR定量的HIF-1α表達，并相對于GAPDH標準化。
圖9A顯示了以25mg/kg靜脈內(nèi)地施用一劑SEQ ID NO.1后，有毛的小鼠的體內(nèi)攝取(按μg/g組織計)和靶物減量調(diào)節(jié)(與β-肌動蛋白表達相關(guān)聯(lián)的HIF-1a mRNA表達的％抑制)。SEQ ID NO.1在腎中具有約46小時的半衰期，在肝中為66小時。
圖9B上圖顯示了以50mg/kg，將SEQ ID NO.1腹膜內(nèi)地施用一次給有毛的小鼠。在處理后1，3，4，5和8天后，處死5只以50mg/kg的SEQ ID NO.1處理的動物，分析HIF-1a表達，并相對于β-肌動蛋白標準化。如實施例8所述，通過QPCR，在mRNA水平測量HIF-1a的表達，并相對于β-肌動蛋白標準化。在下圖中，以25或50mg/kg，將SEQ ID NO.1靜脈內(nèi)地施用一次給有毛的小鼠。在處理后1，2，3，4，5和8天后，處死以25或50mg/kg的SEQ ID NO.1處理的5只動物，如實施例13所述，通過HPLC方法分析全長SEQ ID NO.1。將數(shù)據(jù)表達為μg SEQ ID NO.1/g組織。
圖9C顯示了在腹膜內(nèi)地施用一劑50mg/kg的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.16、并在第1和10天處死的小鼠中，小鼠肝中通過實時PCR定量的HIF-1α表達，并相對于GAPDH標準化。
圖10A顯示了施用25mg/kg持續(xù)7天、并在最后一次給藥后1或5天處死的異種移植小鼠中，抑制HIF-1a表達的SEQ ID NO.1的作用時間。
圖10B顯示了施用25mg/kg/天持續(xù)7天、并在最后一次給藥后5天處死，fam-標記的SEQ ID NO.1形式(SEQ ID NO.7)的體內(nèi)肝、皮膚、腫瘤和腎攝取。
圖10C顯示了在如實施例17所述的移植后第7，10，13和17天，用5mg/kg/天的SEQ ID NO.7、雜亂的對照SEQ ID NO.20或鹽水腹膜內(nèi)地處理的異種移植小鼠肝中，靶物減量調(diào)節(jié)(與GAPDH表達相關(guān)聯(lián)的HIF-1a mRNA表達的％抑制)和SEQ ID NO.7的體內(nèi)攝取(按μg/g組織計)。
圖10D顯示了在如實施例17所述處理的小鼠結(jié)腸中，用SEQ IDNO.7或雜亂的對照SEQ ID NO.20處理后，靶物減量調(diào)節(jié)(與β-肌動蛋白表達相關(guān)聯(lián)的HIF-1a mRNA表達的％抑制)以及SEQ ID NO.7的體內(nèi)攝取(按μg/g組織計)。
圖10E顯示了在如實施例17所述處理的異種移植腫瘤HT29和PC3中，SEQ ID NO.7的體內(nèi)攝取(按μg/g組織計)。
圖11顯示了與一個錯配對照SEQ ID NO.9相比，每3天30mg/kg的SEQ ID NO.1的5個劑量后，HIF-1a和VEGF mRNA的體內(nèi)內(nèi)源肝靶物減量調(diào)節(jié)。
圖12A，圖12B，圖12C和圖12D顯示了用靶向的HIF-1a LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1和雜亂的對照SEQ ID NO.8處理后，U373細胞中VEGFA和MMP-2的表達。在用SEQ ID NO.1或雜亂的對照(SEQ IDNO.8)處理后48小時，在U373細胞中觀察到VEGFA和MMP-2表達(分泌)的劑量依賴性減量調(diào)節(jié)。將VEGFA(圖12A，12B和12C)和MMP-2(圖12D和12E)表達與細胞數(shù)相關(guān)聯(lián)，并相對于模擬品標準化。在圖12A，12C和12D中，在處理后48小時測量VEGFA和MMP-2表達，而在圖12B和12E中，在轉(zhuǎn)染后24-120小時定量VEGFA和MMP-2的分泌。
圖13顯示了與SEQ ID NO.8和未處理對照相比，用1和5nM SEQID NO.1處理的HUVEC細胞的通過蛋白印跡測得的HIF-1α蛋白的減量調(diào)節(jié)和管形成的破壞。
圖14A整體放射發(fā)光圖顯示了在給雌性染色小鼠單次靜脈內(nèi)施用3H-標記的SEQ ID NO.1后5分鐘a)，4小時b)，24小時c)和18天d)的放射性的分布。
圖14B顯示了在5分鐘和7天時的放射性分布，和7天后在骨髓、腎、肝、肺、皮膚、脾、尿、胃粘膜、淋巴結(jié)、眼色素層和子宮中觀察到3H-標記的SEQ ID NO.1化合物的非常強的保留。
圖15顯示了通過FACS分析測得的，與未處理的細胞相比，在施用SEQ ID NO.7后1小時，骨髓、脾和外周血內(nèi)不同細胞類型中SEQID NO.1的FAM-標記形式(SEQ ID NO.7)的攝取。
圖16A顯示了用40，10和6mg/kg SEQ ID NO.1每周2次持續(xù)4周處理的短尾猴的肝和腎中，通過實時PCR測得的HIF-1α表達，并相對于18S RNA標準化。圖16B顯示了如上所述處理最后一次給藥后1天或最后一次給藥后4周(恢復動物)，短尾猴肝和腎中的SEQ ID NO.1攝取，以及恢復動物(R)的數(shù)據(jù)，在實驗結(jié)束后，將所述恢復動物保持不處理4周。
發(fā)明描述本發(fā)明使用特定的LNA寡核苷酸，即包含序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的LNA寡核苷酸，用于調(diào)節(jié)編碼HIF-1a的核酸分子的功能。該調(diào)節(jié)最終是生成的HIF-1a的量的改變。在一個實施方案中，這通過提供能與編碼HIF-1a的核酸特異性地雜交的反義LNA寡核苷酸來實現(xiàn)。該調(diào)節(jié)優(yōu)選地是對HIF-1a的表達的抑制，這導致生成的功能性HIF-1a蛋白的數(shù)量的減少。
LNA寡核苷酸更具體地，本發(fā)明提供了LNA寡核苷酸，其由選自下述的序列組成5′-(Tx)GxGxcsasasgscsastscscsTxGxT-3′(SEQ ID NO.3)和5′-(Gx)TxTxascstsgscscststscsTxTxA-3′(SEQ ID NO.4)其中大寫字母代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物，小寫字母代表2-脫氧核苷酸，下劃線代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物或2-脫氧核苷酸，下標″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵，且其中在括號中的核苷酸單元(分別為(Tx)，(T)，或(Gx)，(A))代表可選存在的單元，且其中所述序列可選地延伸至多5個2-脫氧核苷酸單元。
術(shù)語″本文定義的LNA寡核苷酸″，″根據(jù)本發(fā)明的LNA寡核苷酸″，等，指上面定義的″LNA寡核苷酸″，以及下面提供的實施方案、變體、鹽、前藥等。
上面定義的基于SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的LNA寡核苷酸具有13-20個核苷酸單元的長度。如果不存在括號中的核苷酸單元(分別為(Tx)，(T)，或(Gx)，(A))，則得到最小序列長度13，如果存在括號中的核苷酸單元(分別為(Tx)，(T)，或(Gx)，(A))，且序列SFQ ID NO.3或SEQ ID NO.4延伸5個2-脫氧核苷酸單元，則得到最大序列長度20。
在一個實施方案中，不存在括號中的核苷酸單元(分別為(Tx)，(T)，或(Gx)，(A))，在另一個目前更優(yōu)選的實施方案中，存在括號中的核苷酸單元(分別為(Tx)，(T)，或(Gx)，(A))。還令人感興趣的是這樣的實施方案，其中存在5′-末端可選存在的單元(分別為(Tx)或(Gx))，且其中不存在3′-末端可選存在的單元(分別為(T)或(A))，和這樣的實施方案，其中不存在5′-末端可選存在的單元(分別為(Tx)或(Gx))，且其中存在3′-末端可選存在的單元(分別為(T)或(A))。
對于上面SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中標有下劃線的核苷酸單元，選擇β-D-氧-LNA核苷酸類似物或2-脫氧核苷酸似乎不太關(guān)鍵。但是，在一個實施方案中，兩個標有下劃線的核苷酸單元都代表2-脫氧核苷酸。在另一個目前更優(yōu)選的實施方案中，標有下劃線的核苷酸單元之一或兩者代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物。
在一個變體中，存在括號中的5′-末端核苷酸單元(分別為(Tx)或(Gx))，且3′-末端另一標有下劃線的核苷酸單元(分別為(T)或(A))代表2-脫氧核苷酸，或更優(yōu)選β-D-氧-LNA核苷酸類似物。
在另一個變體中，在括號中的5′-末端核苷酸單元(分別為(Tx)或(Gx))代表2-脫氧核苷酸，或更優(yōu)選β-D-氧-LNA核苷酸類似物，且不存在3′-末端另一標有下劃線的核苷酸單元(分別為(T)或(A))。
在另一個變體中，存在括號中的核苷酸單元，且標有下劃線的核苷酸單元之一或兩者代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物，即(i)5′-末端標有下劃線的核苷酸代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物，且3′-末端標有下劃線的核苷酸單元代表2-脫氧核苷酸，或(ii)3′-末端標有下劃線的核苷酸代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物，且5′-末端標有下劃線的核苷酸單元代表2-脫氧核苷酸，或(iii)3′-末端以及5′-末端標有下劃線的核苷酸代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物。
在另一個變體中，存在括號中的核苷酸單元(分別為(Tx)或(Gx))，且兩個標有下劃線的核苷酸單元都代表2-脫氧核苷酸。
盡管認為稱作SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列(更具體地，稱作SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列(參見下面))基本上代表所定義的LNA寡核苷酸的完全功能性，認為將SEQ ID NO.3和SEQID NO.4延伸至多5個2-脫氧核苷酸單元(例如1個單元、2個單元、3個單元、4單元、或甚至5個單元)是可能的，且不會對基本序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的有益性質(zhì)產(chǎn)生有害作用。也就是說，該序列可以在3′-末端、在5′-末端或在3′-末端以及5′-末端延伸，條件是，2-脫氧核苷酸單元的總數(shù)不超過5。
因此，在一個實施方案(其可以與前面的內(nèi)容相組合)中，該LNA寡核苷酸由15，16，17，18，19或20個選自2-脫氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸類似物的核苷酸單元組成，更具體地該LNA寡核苷酸由16個選自2-脫氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸類似物的核苷酸單元組成。在其它實施方案(其可以與前面的內(nèi)容相組合)中，該LNA寡核苷酸由13，14，15、或16個選自2-脫氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸類似物的核苷酸單元組成，更具體地該LNA寡核苷酸由14或15個選自2-脫氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸類似物的核苷酸單元組成。
至少為了制備LNA寡核苷酸的方便，經(jīng)常優(yōu)選地，在3′-末端延伸序列1個2-脫氧核苷酸單元，參見例如，下面的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。最優(yōu)選地，在SEQ ID NO.3的3′-末端延伸一個腺苷2-脫氧核苷酸單元，在SEQ ID NO.4的3′-末端延伸延伸一個胞嘧啶2-脫氧核苷酸。
如上所述，下標″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯(-O-P(O，S)-O-)鍵，且下標″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯(-O-P(O，S)-O-)鍵或磷酸二酯(-O-P(O)2-O-)鍵。序列延伸的任何2-脫氧核苷酸可以通過硫代磷酸酯(-O-P(O，S)-O-)鍵或磷酸二酯(-O-P(O)2-O-)鍵連接。
注意到，SEQ ID NO.3的子序列csasasgscsastscscsT和SEQ ID NO.4的子序列ascstsgscscststscsT表示為完全硫代磷酸酯化的，參見下標″s″。盡管目前不是優(yōu)選的，認為一個、且也可能兩個硫代磷酸酯鍵可以被替換為其它鍵，尤其是磷酸二酯鍵，且不嚴重有損LNA寡核苷酸的穩(wěn)定性。因而，這樣的變體，其中一個或兩個硫代磷酸酯鍵被替換為例如磷酸二酯鍵，也在本發(fā)明的預期范圍內(nèi)。
但是，在一個目前優(yōu)選的實施方案中，序列中的所有核苷酸單元都通過硫代磷酸酯基團相連接。
特別令人感興趣的LNA寡核苷酸的一個亞群是選自下述的那些5′-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3′(SEQ ID NO.1)，5′-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsT-3′ (SEQ ID NO.15)，和5′-GsGscsasasgscsastscscsTsGst-3′(SEQ ID NO.16)其中，5′-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3′(SEQ ID NO.1)是目前最優(yōu)選的。
特別令人感興趣的LNA寡核苷酸的另一個亞群是選自下述的那些5′-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3′(SEQ ID NO.2)，5′-GsTsTsascsts9scscststscsTsTsA-3′ (SEQ ID NO.17)，和5′-TsTsascstsgscscststscsTsTsa-3′(SEQ ID NO.18)其中，5′-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3′(SEQ ID NO.2)是目前最優(yōu)選的。
在本上下中，術(shù)語″核苷″使用它的普通含義，即其含有2-脫氧核糖或核糖單元，后者通過它的第一號碳原子鍵合到含氮堿基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或鳥嘌呤(G)之一上。
類似地，術(shù)語″核苷酸″指2-脫氧核糖或核糖單元，其通過它的第一號碳原子鍵合到含氮堿基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)或鳥嘌呤(G)之一上，且其通過它的第五號碳原子鍵合到核苷間磷酸酯基團或末端基團上。
將術(shù)語″核酸″定義為通過共價連接2個或多個核苷酸形成的分子。術(shù)語″核酸″和″多核苷酸″在本文中可互換地使用。術(shù)語″核酸類似物″指非天然的核酸結(jié)合化合物。術(shù)語″LNA單體″典型地指雙環(huán)核苷類似物，如都在這里引作參考的國際專利申請WO 99/14226和后續(xù)申請WO 00/56746，WO 00/56748，WO 00/66604，WO 00/125248，WO02/28875，WO 2002/094250和WO 03/006475所述。
β-D-氧-LNA是在本發(fā)明的LNA寡核苷酸中使用的LNA核苷酸類似物，其單體結(jié)構(gòu)(核苷)顯示在結(jié)構(gòu)式1中。
β-D-氧-LNA結(jié)構(gòu)式1在結(jié)構(gòu)式1中，Z*和Z代表與相鄰核苷或末端基團(即5′-末端基團或3′-末端基團)連接的核苷酸間鍵的位置。
β-D-氧-LNA單體的一個具體實例是胸苷LNA單體(LNA核苷類似物)(1S，3R，4R，7S)-7-羥基-1-羥甲基-5-甲基-3-(胸腺嘧啶-1基)-2，5-二氧雜-雙環(huán)[2:2:1]庚烷，即T-β-D-氧-LNA。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語″寡核苷酸″指寡聚體(也稱作寡物)或核酸多聚體(例如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA))或本領域已知的核酸類似物，優(yōu)選鎖定核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)或它們的混合物。該術(shù)語包括由天然存在的核堿基、糖和核苷間(主鏈)鍵組成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分(其起類似的功能，或具有特定改善的功能)的寡核苷酸。完全地或部分地修飾的或取代的寡核苷酸經(jīng)常是比天然形式優(yōu)選的，因為這樣的寡核苷酸具有幾種希望的性質(zhì)，例如，穿透細胞膜的能力，對細胞外和細胞內(nèi)的核酸酶的良好耐受性，對核酸靶物的高親和力和特異性。本發(fā)明的LNA寡核苷酸表現(xiàn)出上述的性質(zhì)。
術(shù)語″單元″和″核苷酸單元″應當理解為單體，即2-脫氧核苷酸或β-D-氧-LNA核苷酸類似物。
術(shù)語″至少一個″包含大于或等于1的整數(shù)，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17等。
關(guān)于核苷、核苷類似物、SEQ ID NO等使用的術(shù)語“一個(一種)”意指一個(種)或多個(種)。具體而言，表述“一種(個)組分(例如核苷、核苷類似物、SEQ ID NO等)選自...”意指可選擇一個或多個所引述的組分。因此，像“一種組分，選自A、B和C”這樣的表述意指包括A、B和C的所有組合，即A，B，C，A+B，A+C，B+C和A+B+C。
在本說明書中，詞語“包含”或其變體例如“包括”應當理解為，指包含所述的元件、整數(shù)或步驟，或元件、整數(shù)或步驟的集合，但不是排除任何其它的元件、整數(shù)或步驟，或元件、整數(shù)或步驟的集合。
LNA寡核苷酸的制備按照公開的方法和其中引用的文獻，可以制備LNA核苷酸類似物構(gòu)件(β-D-氧-LNA)，參見，例如，WO 03/095467 A1；D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)Preparation of LNAPhosphoramidites，Synthesis 6，802-808；和WO 2004/069991 A2。
可以如實施例和WO 99/14226，WO 00/56746，WO 00/56748，WO00/66604，WO 00/125248，WO 02/28875，WO 2002/094250和WO03/006475所述，制備LNA寡核苷酸。因而，可以使用有機化學領域的普通技術(shù)人員熟知的核酸化學寡聚技術(shù)，制備LNA寡核苷酸。通常，使用標準的亞磷酰胺寡聚循環(huán)方法(S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1993，49，6123；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223)，但是也可以使用例如H-膦酸酯化學、磷酸三酯化學。
對于有些單體，更長的偶合時間、和/或重復偶合和/或使用更濃縮的偶合試劑可能是必要的或有益的。
使用的亞磷酰胺典型地以令人滿意的＞95％的分步產(chǎn)率進行偶合。通常，用例如碘/吡啶/H2O實現(xiàn)三價磷(III)向五價磷(V)的氧化。去保護以后，這會產(chǎn)生天然的核苷間磷酸二酯鍵。在制備核苷間硫代磷酸酯鍵的情況下，如下進行硫化步驟將用于合成核苷間磷酸二酯鍵的普通的(例如碘/吡啶/H2O)氧化替換為使用ADTT試劑(蒼耳烷氫化物(0.01M，在乙腈∶吡啶9∶1；v/v中)的氧化。也可以使用其它硫化試劑，例如Beaucage和PADS。有效地合成硫代磷酸LNA寡核苷酸，分步偶合產(chǎn)率＞＝98％。
使用一次性反相純化柱和/或反相HPLC和/或從乙醇或丁醇中沉淀，可以實現(xiàn)LNA寡核苷酸的純化。使用毛細管凝膠電泳，反相HPLC，MALDI-MS，和ESI-MS，來證實合成的LNA寡核苷酸的純度。
鹽LNA寡核苷酸可以以多種可藥用鹽使用。本文使用的該術(shù)語是指，會保持LNA寡核苷酸的期望生物活性并顯示最小的不期望的毒理作用的鹽。這類鹽的非限定性實例可與有機氨基酸形成，堿加成鹽與金屬陽離子例如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘、鈉、鉀等形成，或與由氨、N，N-二芐基乙二胺、D-葡糖胺、四乙銨或乙二胺形成的陽離子形成；或其組合，例如單寧酸鋅鹽等。
這類鹽是由具有磷酸二酯基團和/或硫代磷酸酯基團的LNA寡核苷酸形成的，例如與合適堿形成的鹽。這些鹽包括，例如源自元素周期表第Ia、Ib、IIa和IIB族金屬的無毒金屬鹽，特別是合適的堿金屬鹽，例如鋰鹽、鈉鹽或鉀鹽，或堿土金屬鹽，例如鎂鹽或鈣鹽。它們還包括鋅鹽和銨鹽，以及與適合的有機胺形成的鹽，所述有機胺例如未取代的或羥基取代的一、二或三烷基胺，特別是一、二或三烷基胺，或與季銨化合物形成的鹽，例如與N-甲基-N-乙基胺、二乙胺、三乙胺、單、雙或三-(2-羥基-低級烷基)胺例如單、雙或三-(2-羥乙基)胺、2-羥基-叔丁基胺或三(羥甲基)甲胺、N，N-二低級烷基-N-(羥基-低級烷基)胺例如N，N-二甲基-N-(2-羥乙基)胺或三-(2-羥乙基)胺或N-甲基-D-葡糖胺或季銨化合物形成的鹽例如四丁基銨鹽。優(yōu)選鋰鹽、鈉鹽、鎂鹽、鋅鹽或鉀鹽，特別優(yōu)選鈉鹽。
前藥在一個實施方案中，LNA寡核苷酸可以是前藥的形式。實際上，寡核苷酸是帶負電荷的離子。由于細胞膜的親脂性質(zhì)，與中性的或親脂的等價物相比，寡核苷酸的細胞攝取減少。通過使用前藥方案(參見例如Crooke，R.M.(1998)in Crooke，S.T.Antisense research andApplication.Springer-Verlag，Berlin，Germany，vol.131，pp.103-140)，可以避免該極性″障礙″。在該方案中，以受保護的方式制備LNA寡核苷酸，使得LNA寡核苷酸在施用時是中性的。以細胞攝取LNA寡核苷酸時可去除保護基團的方式，設計這些保護基團。這些保護基團的實例是S-乙?；虼一?SATE)或S-特戊酰基硫代乙基(叔丁基-SATE)。這些保護基團是核酸酶抗性的，會在細胞內(nèi)被選擇性地去除。
綴合物本發(fā)明的另一個方面涉及綴合物，其包含本文定義的LNA寡核苷酸和至少一個共價結(jié)合到所述LNA寡核苷酸上的非核苷酸或非多核苷酸部分。
在本發(fā)明的一個相關(guān)的方面，本發(fā)明的LNA寡核苷酸連接到配體上形成綴合物，所述配體是為了增加綴合物相對于反義寡核苷酸的細胞攝取。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“綴合物”旨在表示異質(zhì)分子，其通過共價連接本文描述的LNA寡核苷酸(即，包含核苷或LNA核苷類似物序列的LNA寡核苷酸)和一個或多個非核苷酸或非多核苷酸部分而形成。
因此，LNA寡核苷酸可以例如是與非核苷酸或非多核苷酸部分綴合的或形成嵌合體，所述非核苷酸或非多核苷酸部分包括肽核酸(PNA)、蛋白(例如靶蛋白的抗體)、大分子、低分子量藥物、脂肪酸鏈、糖殘基、糖蛋白、聚合物(例如聚乙二醇)、膠束形成基團、抗體、碳水化合物、受體結(jié)合基團、甾族化合物例如膽固醇、多肽、嵌入劑例如吖啶衍生物、長鏈醇、樹枝狀聚合物、磷脂和其它親脂基或它們的組合等，正如LNA寡核苷酸可以以二聚化或樹枝狀結(jié)構(gòu)排列。LNA寡核苷酸或綴合物也可綴合或進一步綴合至活性藥物，所述活性藥物例如阿司匹林、布洛芬、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗菌劑、化療劑或抗生素。
這種方式的綴合會為LNA寡核苷酸帶來了藥物動力學特征方面的有益性質(zhì)。更具體地，這種方式的綴合實現(xiàn)了增加的細胞攝取。
在一個實施方案中，LNA寡核苷酸連接到配體上形成綴合物，所述配體是為了增加綴合物相對于反義LNA寡核苷酸的細胞攝取。該綴合可出現(xiàn)在末端位置5′/3′-OH，但是該配體也可以出現(xiàn)在糖和/或堿基處。更具體地，反義LNA寡核苷酸可以綴合的生長因子可以包含轉(zhuǎn)鐵蛋白或葉酸?？梢灾苽滢D(zhuǎn)鐵蛋白-聚賴氨酸-寡核苷酸復合物或葉酸-聚賴氨酸-寡核苷酸復合物，用于由表達高水平的轉(zhuǎn)鐵蛋白或葉酸受體的細胞攝取。綴合物/配體的其它實例是膽固醇基團，雙鏈體嵌入劑例如吖啶，聚-L-賴氨酸，以一個或多個核酸酶抗性的連接基團例如單硫代磷酸酯“封端”等。
Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，3410-3414(1990)描述了作為寡核苷酸攝取入細胞中的載體的轉(zhuǎn)鐵蛋白復合物的制備。Low等，美國專利5,108,921描述了通過葉酸受體胞吞作用細胞遞送葉酸-大分子綴合物，包括遞送反義寡核苷酸。也參見，Leamon等，Proc.Natl.Acad.Sci.88，5572(1991)。
藥物組合物本發(fā)明的一個特別令人感興趣的方面涉及藥物組合物，其包含本文定義的LNA寡核苷酸或本文定義的綴合物，和可藥用的稀釋劑、載體或輔劑。該藥物組合物優(yōu)選地適于注射、局部施用或眼內(nèi)施用(參見下面)。
藥物組合物制備的指導，可見于Alfonso R.Gennaro的“RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy”和下文中。
可藥用的稀釋劑、載體或輔劑是藥物組合物的一部分。膠囊劑、片劑和丸劑等可含有例如下列化合物作為粘合劑的微晶纖維素、樹膠或明膠、作為賦形劑的淀粉或乳糖、作為潤滑劑的硬脂酸鹽、各種甜味劑或矯味劑。對于膠囊劑，單位劑型可含有液體載體，例如脂肪油。同樣，糖劑或腸劑的包衣可以是單位劑型的一部分。藥物組合物也可以是活性藥物成分(包括LNA寡核苷酸)和會形成微膠粒乳劑的脂類的乳劑。
LNA寡核苷酸可以與不損害期望作用的任何物質(zhì)混合，或與補充期望作用的物質(zhì)混合。這些物質(zhì)可包括其它藥物，包括其它寡核苷化合物。
對于腸胃外、皮下、皮內(nèi)或局部施用，制劑可包括無菌稀釋劑(例如水)、緩沖劑、張力和離子強度的調(diào)節(jié)劑和抗菌劑。有活性的LNA寡核苷酸可以和載體一起制備，該載體可以促進攝取、保護免于降解或保護免于從機體立即排出，包括具有控釋性質(zhì)的植入物或微膠囊。對于靜脈內(nèi)施用，優(yōu)選的載體是生理鹽水(0.9％)或緩沖鹽水(例如磷酸鹽緩沖鹽水)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，LNA寡核苷酸的注射或輸注施用在新血管形成位置或附近。例如，本發(fā)明的LNA寡核苷酸可以遞送到眼中的視網(wǎng)膜色素上皮細胞。優(yōu)選地，LNA寡核苷酸局部地施用到眼睛，例如以液體或凝膠形式遞送到下眼瞼或結(jié)膜穹窿，這是本領域技能水平之內(nèi)的(參見，例如，Acheampong AA等，2002，Drug Metabol.andDisposition 30421-429，其完整內(nèi)容在這里引作參考)。
本發(fā)明的藥物組合物可用多種方式施用，這取決于期望的是局部還是系統(tǒng)性治療及待治療的區(qū)域。施用可以是(a)口服(b)經(jīng)肺，例如通過吹入或吸入粉末或氣溶膠，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)；(c)局部，包括表皮、透皮、眼和包括陰道和直腸的粘膜遞送；或(d)腸胃外的，包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或腦室內(nèi)施用。在一個實施方案中，有活性的LNA寡核苷酸通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)口、局部地或作為推注注射施用或直接施用到靶器官。
目前認為，最合適的給藥形式是通過靜脈輸注或經(jīng)口。
用于局部給藥的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳霜、凝膠、滴劑、噴霧劑、栓劑、液體劑和粉末劑。常規(guī)藥物載體、水性、粉末或油性基質(zhì)、增稠劑等可能是必需的或期望的。包被的避孕套、手套等也是有用的。優(yōu)選的局部制劑包括其中本發(fā)明的寡核苷酸和局部遞送劑相混合的那些，所述局部遞送劑例如為脂類、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑?？诜慕M合物和制劑包括但不限于粉末或顆粒、微顆粒、納米粒、在水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、小藥囊、片劑或小片劑。腸胃外、鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給藥的組合物和制劑可包括無菌水溶液，其還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其他合適的添加劑，例如但不限于滲透增強劑、載體化合物和其他藥學可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑和含脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可由許多組分形成，這些組分包括但不限于預制液(preformed liquid)、自乳化固體和自乳化半固體。藥物向腫瘤組織的遞送可以通過載體介導的遞送增強，其包括但不限于陽離子脂質(zhì)體、環(huán)糊精、卟啉衍生物、支鏈樹形分子(dendrimer)、聚乙烯亞胺聚合物、納米顆粒和微球體(Dass CR.J Pharm Pharmacol 2002；54(1)3-27)。
一種特別優(yōu)選的腸胃外給藥途徑是眼內(nèi)給藥。應當理解，本發(fā)明的LNA寡核苷酸的眼內(nèi)給藥可以通過注射或直接(例如，局部地)施用于眼睛來實現(xiàn)，只要給藥途徑允許LNA寡核苷酸進入眼睛。除了上述的向眼睛的局部給藥途徑以外，合適的眼內(nèi)給藥途徑包括玻璃體內(nèi)的，視網(wǎng)膜內(nèi)的，視網(wǎng)膜下的，subtenon，眼周和眼后的，透角膜的和透虹膜的給藥。
對于眼內(nèi)給藥，可以局部地施用藥物組合物，例如，通過貼劑或通過直接應用于眼睛，或通過離子電滲療法。通過本領域已知的眼遞送系統(tǒng)，例如棉棍或點眼藥器，可以遞送軟膏劑、噴霧劑或滴液。組合物可以直接施用于眼睛的表面或眼瞼內(nèi)。這樣的組合物可以包括粘液模仿物例如玻璃酸，硫酸軟骨素，羥丙基甲基纖維素或聚乙烯醇，防腐劑例如山梨酸，EDTA或苯扎氯銨，和通常用量的稀釋劑和/或載體。
本發(fā)明的LNA寡核苷酸可以提供在持續(xù)釋放組合物中，例如在美國專利號5,672,659和5,595,760中所述的那些。使用立即釋放還是持續(xù)釋放組合物，取決于待治療的病癥的性質(zhì)。如果該病癥包含急性或超急性病癥，用立即釋放形式進行治療勝過延長釋放組合物?；蛘?，對于某些預防性或長期治療，持續(xù)釋放組合物可以是合適的。
LNA寡核苷酸可以注射進眼內(nèi)，例如用針頭或其它遞送裝置。
在一個實施方案中，藥物組合物包含本發(fā)明的LNA寡核苷酸(例如，0.1-90重量％)或其生理上可接受的鹽，其與生理上可接受的載體介質(zhì)相混合。優(yōu)選的生理上可接受的載體介質(zhì)是水、緩沖水、生理鹽水、0.4％鹽水、0.3％甘油、玻璃酸等。
本發(fā)明的藥物組合物也可以包含常規(guī)的藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括生理上生物相容的緩沖劑(例如，氨基丁三醇鹽酸鹽)，加入螯合劑(例如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合復合物(例如Ca-DTPA，CaNaDTPA-雙酰胺)，或任選地，加入鈣或鈉鹽(例如，氯化鈣，抗壞血酸鈣，葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)。可以包裝本發(fā)明的藥物組合物，以液體形式使用，或可以凍干。
對于固體組合物，可以使用常規(guī)的無毒的固體載體；例如，藥用級的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石粉，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂，等。
優(yōu)選地，LNA寡核苷酸以足以向患者遞送治療有效量、且不造成所治療患者的嚴重副作用的量包含在單元制劑中，例如在可藥用載體或稀釋劑中。
根據(jù)制藥工業(yè)熟知的常規(guī)技術(shù)，可以制備本發(fā)明的藥物制劑，其可以方便地作為單位劑型存在。這樣的技術(shù)包括使活性成分接觸藥用載體或賦形劑的步驟。通常，通過使活性成分均勻地且緊密地接觸液體載體、或細分的固體載體、或二者，然后在必要時將產(chǎn)物成形，來制備制劑。
本發(fā)明的組合物可配制成多種可能的劑型中的任一種，例如但不限于片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿劑、軟凝膠劑和栓劑。本發(fā)明的組合物也可配制成在水性、非水性或混合介質(zhì)中的懸浮液。水性懸浮液可進一步包含增加懸浮劑粘性的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。該懸浮液也可以含有穩(wěn)定劑。
在藥物組合物的優(yōu)選實施方案中，LNA寡核苷酸被配制在水性載體中，更具體地，該水性載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強度。
術(shù)語“水性載體”是指所討論的藥物組合物是液體形式，并且該液體載體主要由水組成，即至少80％(w/w)、或至少90％(w/w)、或甚至至少95％(w/w)的載體由水組成。也可以使用其它液體成分，例如乙醇、DMSO、乙二醇等。
該水性載體優(yōu)選包含鹽水或用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑。優(yōu)選地，該緩沖劑將保持pH在5.0-8.0的范圍內(nèi)，例如在6.0-7.5的范圍內(nèi)，例如緩沖鹽水，例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
藥物組合物的離子強度/張力也是重要的。因此，液體藥物組合物一般具有20-2000mM范圍內(nèi)的離子強度，例如在50-1500mM的范圍內(nèi)，或者在100-1000mM的范圍內(nèi)。
聯(lián)合藥物應當理解，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可選地包含其它反義化合物、化療劑、抗炎化合物、抗病毒化合物、細胞生長抑制化合物、抗血管生成化合物、抗增殖化合物、促凋亡化合物、信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)劑、激酶抑制劑和/或免疫調(diào)節(jié)化合物。目前認為，特別令人感興趣的是，組合LNA寡核苷酸和至少一種化療劑。
如所述的，本發(fā)明的藥物組合物還可以包含至少一種化療劑。該化療化合物典型地選自腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，例如強的松、地塞米松(dexamethasone)或地塞米松(decadron)；六甲蜜胺(克瘤靈、hexamethylmelamine(HMM))、氨磷汀(氨磷汀針粉劑)、氨魯米特(氨魯米特片劑)、安吖啶(M-AMSA)、阿那曲唑(瑞寧得)、雄激素例如睪酮、天冬酰胺酶(愛施巴)、卡介苗、比卡魯氨(康士德)、博來霉素(硫酸博來霉素)、白消安(馬利蘭)、碳鉑(伯爾定)、卡莫斯汀(BCNU、BiCNU)、苯丁酸氮芥(留可然)、氯脫氧腺嘌呤(2-CDA、克拉屈濱、leustatin)、順鉑(platinol)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡包嗪(DTIC)、放線霉素D(actinomycin-D、cosmegen)、柔紅霉素(鹽酸柔紅霉素)、多西他賽(泰索帝)、阿霉素(adriomycin)、表柔比星、雌莫司汀(emcyt)、雌激素例如己烯雌酸(DES)、etopside(VP-16、依托泊甙、凡畢復)、氟達拉濱(fludara)、氟他胺(eulexin)；5-FUDR(氟尿苷)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他濱(健擇)、戈舍瑞林(zodalex)、曲妥單抗(司徒曼布)、羥基脲(hydrea)、依達比星(鹽酸依達比星)、異環(huán)磷酰胺、IL-2(重組白細胞介素-2、阿地白介素)、干擾素α(intron A、roferon A)、依立替康(camptosar)、醋酸亮丙瑞林(亮丙瑞林)、左旋咪唑(ergamisole)、洛莫司汀(CCNU)、鹽酸氮芥(mustargen、氮芥)、美法侖(愛克蘭)、巰嘌呤(purinethol、6-MP)、氨甲蝶呤(mexate)、絲裂霉素-C(mutamucin)、米托蒽醌(諾消靈)、奧曲肽(善寧)、脫氧助間型霉素(2-噴斯他丁、nipent)、普卡霉素(光輝霉素、mithracin)、prorocarbazine(鹽酸甲基芐肼)、鏈脲霉素、他莫昔芬(諾瓦得士)、泰素(紫杉醇)、替尼泊苷(衛(wèi)萌、VM-26)、噻替哌、托泊替康(鹽酸拓撲替康)、維A酸(vesanoid、全反式維A酸)、長春堿(valban)、長春新堿(硫酸長春新堿)和長春瑞濱(諾維本)。
對于多發(fā)性骨髓瘤的治療，美法侖，環(huán)磷酰胺，強的松，長春新堿，多柔比星，亞硝脲氮芥，地塞米松，沙利度胺，bortezomib，和biphosphanate等化療劑是優(yōu)選的。
對于腎癌的治療，吉西他濱，5-氟尿嘧啶(5-FU)，5-氟脫氧尿苷，紫杉醇，卡鉑，異環(huán)磷酰胺，多柔比星，長春堿，IFN-α，和IL-2等化療劑是優(yōu)選的。
在一個變體中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有(a)一種或多種LNA寡核苷酸和(b)一種或多種其它的通過非反義機理起作用的化療化合物。當與LNA寡核苷酸一起使用時，這類化療化合物可以單獨使用(例如光輝霉素和寡核苷酸)、先后使用(例如，使用光輝霉素和寡核苷酸一段時間，再使用另一種藥劑和寡核苷酸)、或與一種或多種其它這類化療化合物組合或與放療組合。本領域技術(shù)人員已知的所有化療化合物包括上面清楚描述的那些化合物，都被引入本文，作為與本發(fā)明的LNA寡核苷酸的聯(lián)合治療。
在一個實施方案中，藥物組合物和紫杉烷化合物組合施用。
術(shù)語“紫杉烷化合物”旨在包括紫杉醇(Taxol_)、紫杉醇衍生物、多西他賽、泰索帝、經(jīng)修飾的紫杉烷和紫杉烷類似物。紫杉醇(Taxol_)是分離自西方(太平洋)紫杉即短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)的樹皮的二萜，并代表具有紫杉烷環(huán)系的一類治療劑。紫杉醇及其類似物已通過從10-去乙酰基漿果赤霉素III(獲自紅豆杉針葉和小枝的前體)部分合成及通過全合成得到制備。見Holton.，等，J.Am.Chem.Soc.1161597-1601(1994)和Nicolaou等，Nature367630(1994)。已顯示紫杉醇在幾種人類腫瘤的臨床試驗中具有療效。見McGuire等，Ann.Int.Med.11237-279(1989)；Holmes等，J.Natl.Cancer Inst.831797-1805(1991)；Kohn等J.Natl.CancerInst.8618-24(1994)；和Kohn等，American Society for ClinicalOncology 12(1993)。經(jīng)修飾的紫杉烷和紫杉烷類似物是那些具有帶經(jīng)修飾側(cè)鏈的紫杉烷環(huán)的化合物。許多這些類似物具有改進的性質(zhì)，例如比天然產(chǎn)生的紫杉醇更高的水溶性和穩(wěn)定性。這些類似物是本領域技術(shù)人員已知的，并公開于例如美國專利第5,278,324號、5,272,171號、5,254,580、5,250,683號、5,248,796號和5,227,400號中，它們的公開內(nèi)容在此全部引用作為參考。紫杉醇和泰索帝可以通過WO93/18210、EP0 253 739、EP 0 253 739和WO92/09589中的方法制備，它們的公開內(nèi)容在此全部引用作為參考。在具體的實施方案中，紫杉烷化合物是紫杉醇或泰索帝。
所述組合物中紫杉烷化合物與LNA寡核苷酸之間的重量比典型地是在下述范圍內(nèi)50∶1至1∶25、例如25∶1至1∶25、或10∶1至1∶25、或1∶1至1∶25、或50∶1至1∶10、或1∶1至1∶50、或25∶1至1∶10。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以含有一種或多種LNA寡核苷酸和一種或多種靶向第二種核酸靶物的另外的反義化合物。兩種或多種組合的化合物可以一起使用或先后使用。
抗炎藥物(包括但不限于非甾族抗炎藥物和皮質(zhì)類固醇)，抗病毒化合物及免疫調(diào)節(jié)藥物，也可組合在本發(fā)明的組合物中。兩種或多種組合的化合物可以一起使用或先后使用。
另外，包含LNA寡核苷酸的藥物組合物可以與放療等組合使用。
醫(yī)學治療本發(fā)明的LNA寡核苷酸可以用于本文所述的多種治療應用。總體而言，本發(fā)明的治療方法包括，施用治療有效量的LNA-修飾的寡核苷酸給哺乳動物，尤其是人。
因此，本發(fā)明也涉及用作藥物的本文定義的LNA寡核苷酸或本文定義的綴合物。
給藥量取決于待治療的疾病狀態(tài)的嚴重性和反應性，療程可持續(xù)幾天至幾個月，或直至實現(xiàn)治愈或達到疾病狀態(tài)的減輕。通過測量患者體內(nèi)的藥物或通過代用品標記，也可以評價最佳給藥方案。
最佳劑量可隨各寡核苷酸的相對功效而變化。一般而言，它可根據(jù)在體外和體內(nèi)動物模型上發(fā)現(xiàn)有效的EC50來估計。一般地，劑量在每公斤體重0.01μg至lg的范圍內(nèi)，并且可以每天、每周、每月或每年施用一次或多次，或甚至每2至10年施用一次，或連續(xù)輸注幾小時長達幾個月。給藥的重復頻率可根據(jù)所測定的藥物在體液或組織中的停留時間和濃度估計。成功治療后，可能希望患者接受維持治療以預防疾病狀態(tài)的復發(fā)。目前認為，最適當?shù)膭┝渴敲抗矬w重0.01mg至100mg、例如0.1mg至40mg、或0.5mg至10mg。這樣的劑量可以每天施用一次，但是更優(yōu)選更低的頻率，例如每周1-3次，持續(xù)1-4周?？梢岳^續(xù)維持治療，例如每月1-4次，或甚至更低的頻率，例如每年1-10次。
本領域的技術(shù)人員會明白，LNA寡核苷酸可以用于通過許多不同的原理對抗HIF-1a相關(guān)的疾病，因而這在本發(fā)明的精神內(nèi)。
如本文使用的，術(shù)語″靶核酸″包括編碼HIF-1a的DNA，從這樣的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA(包括mRNA前體和mRNA)，以及源自這樣的RNA的cDNA。
如本文使用的，術(shù)語″基因″指包含外顯子、內(nèi)含子、非編碼5′和3′區(qū)和調(diào)節(jié)元件的基因，及其所有目前已知的變體和可以闡明的任何其它的變體。
如本文使用的，術(shù)語″LNA寡核苷酸″指可以在人中誘導希望的治療作用的寡核苷酸，例如通過氫鍵結(jié)合到靶基因上(″Chimeraplast″和″TFO″)，或結(jié)合到靶基因的RNA轉(zhuǎn)錄物上(″反義抑制劑″，″siRNA″，″miRNA″，″核酶″和″寡酶″)，或結(jié)合到靶基因編碼的蛋白上(″適體″，″spiegelmer″或″誘餌″)。
如本文使用的，術(shù)語″mRNA″指靶向基因的目前已知的mRNA轉(zhuǎn)錄物，和可以鑒別的任何其它的轉(zhuǎn)錄物。
如本文使用的，術(shù)語″調(diào)節(jié)″指增加(刺激)或減少(抑制)基因的表達。在本發(fā)明中，抑制是調(diào)節(jié)基因表達的優(yōu)選形式，且mRNA是優(yōu)選的靶物。
如本文使用的，術(shù)語將反義化合物″靶向″特定靶核酸指，以使反義化合物能結(jié)合和調(diào)節(jié)它的目標靶物的功能的方式，將反義寡核苷酸提供給細胞、動物或人。
LNA寡核苷酸可以設計為siRNA，它們是小雙鏈RNA分子，被細胞用于沉默特定的內(nèi)源或外源基因，這通過仍然不太理解的″反義樣″機理來實現(xiàn)。
反義寡核苷酸的臨床有效性在很大程度上取決于它們的藥物動力學，例如吸收、分布、細胞攝取、代謝和排泄。反過來，這些參數(shù)又由寡核苷酸的基本化學及其大小和三維結(jié)構(gòu)顯著支配。
另外，調(diào)節(jié)本發(fā)明LNA寡核苷酸的藥物動力學性質(zhì)可通過多種不同部分的連接來達到。例如，可以通過將諸如脂類部分連接到寡核苷酸上，增強寡核苷酸通過細胞膜的能力，所述脂類部分是例如膽固醇部分、硫醚、脂族鏈、磷脂或多胺。同樣，可通過將與膜內(nèi)的分子(其介導向細胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運)相互作用的部分綴合到寡核苷酸上，來增加LNA寡核苷酸向細胞內(nèi)的攝取。
根據(jù)本發(fā)明，使用會增加LNA寡核苷酸攝取、提高生物穩(wěn)定性(例如提高LNA寡核苷酸對降解的抗性)和/或增加寡核苷酸與靶序列(例如mRNA序列)的雜交特性的特異性和親和性的基團，可以改善藥物動力學性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以用于治療許多種不同的疾病。如同癌細胞，增殖血管內(nèi)皮細胞是對HIF-1a表達的減量調(diào)節(jié)敏感的。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物因此可以用于治療特征在于造成血管發(fā)生的異常疾病的疾病。這類疾病的實例是總體的癌癥和動脈粥樣硬化，銀屑病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，類風濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘，炎性腸病，疣，變應性皮炎和卡波西肉瘤。
一般而言，本發(fā)明的一個方面涉及治療患有或易患由異常血管發(fā)生造成的疾病的哺乳動物的方法，其包含給哺乳動物施用治療有效量的本文定義的LNA寡核苷酸或綴合物。
而且，本發(fā)明還涉及抑制血管發(fā)生的方法，其包含施用本文定義的LNA寡核苷酸或本文定義的綴合物或本文定義的藥物組合物。
本發(fā)明的一個令人感興趣的方面涉及本文定義的LNA寡核苷酸或本文定義的綴合物在制備藥物中的應用，所述藥物用于治療選自下述的疾病動脈粥樣硬化，銀屑病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，類風濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘，炎性腸病，疣，變應性皮炎，炎癥，和皮膚炎癥，或其它皮膚相關(guān)疾病。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物也可以用于治療炎性疾病，炎癥例如皮膚炎癥或其它皮膚病或病癥，例如銀屑病和類風濕性關(guān)節(jié)炎。
類似地，本發(fā)明的另一個令人感興趣的方面涉及治療選自下述的疾病的方法動脈粥樣硬化，銀屑病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，類風濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘，炎性腸病，疣，變應性皮炎，炎癥，和皮膚炎癥，所述方法包含，將本文定義的LNA寡核苷酸或本文定義的綴合物或本文定義的藥物組合物施用給有此需要的患者。
特別令人感興趣的是血管生成性疾病，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，銀屑病，類風濕性關(guān)節(jié)炎，炎性腸病，和其它炎性疾病。這些疾病的特征在于，新血管形成區(qū)域中新形成的血管對正常組織的破壞。例如，在黃斑變性中，脈絡膜被毛細管侵入和破壞。在黃斑變性中血管發(fā)生-驅(qū)動的對脈絡膜的破壞，最終會導致部分或完全失明。
本發(fā)明方法優(yōu)選地用于治療或預防癌癥造成的疾病，尤其是用于治療可能發(fā)生在下述組織中的癌癥，例如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、甲狀腺癌、腎癌、腦癌、睪丸癌、胃癌、腸癌、脊髓癌、竇癌、膀胱癌、泌尿道癌、或卵巢癌。
而且，本文所述的本發(fā)明包括預防或治療癌癥的方法，其包含向需要這樣的治療的人施用治療有效量的調(diào)節(jié)HIF-1a的LNA寡核苷酸，包括但不限于高劑量的LNA寡核苷酸。本發(fā)明還包括短時間施用調(diào)節(jié)HIF-1a的LNA寡核苷酸的應用。正常的、非癌的細胞以特定細胞類型特有的頻率進行分裂。當細胞已經(jīng)轉(zhuǎn)化成癌狀態(tài)時，會產(chǎn)生不受控的細胞增殖和減少的細胞死亡，因此雜亂的細胞分裂或細胞生長是癌細胞類型的標志。
癌癥類型的實例包括但不限于，非何杰金淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、白血病(例如急性白血病，例如急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、慢性髓細胞樣白血病、慢性淋巴細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤)、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、子宮頸癌、睪丸癌、肺癌、膀胱癌、黑素瘤、頭頸部癌、腦癌、未知原發(fā)部位的癌、瘤、外周神經(jīng)系統(tǒng)癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、腫瘤(例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管肺癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯瘤、小細胞肺癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、腦膜瘤、神經(jīng)母細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤)、重鏈病、轉(zhuǎn)移或以不受控制或異常細胞生長為特征的任何疾病或病癥。
術(shù)語“癌”是指上皮來源的惡性腫瘤。上皮組織覆蓋或襯在機體內(nèi)外的體表面。上皮組織的實例是皮膚及襯在體腔和內(nèi)部器官(例如腸、膀胱、子宮等)的粘膜和漿膜。上皮組織也可以延伸入更深的組織層以形成腺體，例如粘液分泌腺。
術(shù)語“肉瘤”是指由結(jié)締組織(例如軟骨、脂肪、肌肉、腱和骨)長出的惡性腫瘤。
本文使用的術(shù)語“神經(jīng)膠質(zhì)瘤”旨在涵蓋起源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞的惡性腫瘤。
在本發(fā)明的LNA寡核苷酸或本發(fā)明的綴合物用于生產(chǎn)治療癌癥的藥物的應用中，所述癌癥可以合適地是實體瘤的形式。而且，所述癌癥也可以合適地是癌。癌典型地選自惡性黑素瘤，基底細胞癌，卵巢癌，乳腺癌，非小細胞肺癌，腎細胞癌，膀胱癌，復發(fā)性淺表膀胱癌，胃癌，前列腺癌，胰腺癌，肺癌，子宮頸癌，子宮頸非典型增生，喉乳頭狀瘤病，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌和類癌瘤。更典型地，所述癌選自惡性黑素瘤，非小細胞肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌和腎細胞癌。惡性黑素瘤典型地選自淺表性擴張性黑素瘤，結(jié)節(jié)性黑素瘤，惡性雀斑樣痣黑素瘤，肢端黑素瘤，無黑素性黑素瘤和結(jié)締組織增生性黑素瘤。
或者，癌癥可以合適地是肉瘤。肉瘤典型地是選自下述的形式骨肉瘤，尤因肉瘤，軟骨肉瘤，惡性纖維組織細胞瘤，纖維肉瘤和卡波西肉瘤。
或者，癌癥可以是神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
還認為，本文定義的LNA寡核苷酸和綴合物特別適用于治療選自下述的癌癥多發(fā)性骨髓瘤，腎癌，子宮頸癌，腦癌，和乳腺癌。
本發(fā)明也提供了治療癌癥的方法，所述方法包含，將本文定義的LNA寡核苷酸或本文定義的綴合物或本文定義的藥物組合物施用給有此需要的患者。在一個變體中，癌癥是實體瘤的形式。實體瘤可以合適地是上面討論的癌或肉瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
因此，本發(fā)明的另一個方面涉及本文定義的LNA寡核苷酸或本文定義的綴合物在生產(chǎn)治療癌癥的藥物中的應用，其中所述藥物還包含選自上面在″聯(lián)合藥物″下定義的那些的化療劑。適當?shù)?，另外的化療劑選自紫杉烷類，例如泰素、紫杉醇或多西他賽。
換而言之，本發(fā)明另外涉及治療癌癥的方法，所述方法包含，將本文定義的LNA寡核苷酸、或本文定義的綴合物或本文定義的藥物組合物施用給有此需要的患者，且還包含，施用另一種化療劑。所述另外施用可以是這樣的，所述另外的化療劑綴合到本發(fā)明的LNA寡核苷酸上，存在于藥物組合物中，或在分開的制劑中施用。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有(a)一種或多種反義化合物，和(b)一種或多種其它化療劑，所述化療劑會阻止在姐妹染色單體的動粒處的微管解聚和張力形成，但不會阻止微管向動粒的結(jié)合。這樣的化療劑包括上面定義的紫杉烷類，更具體地泰素、紫杉醇和多西他賽。當與本發(fā)明的LNA寡核苷酸一起使用時，這樣的化療劑應當序貫使用，開始用寡核苷酸治療一段時間，通過降低腫瘤細胞和腫瘤血管系統(tǒng)的增殖內(nèi)皮細胞中的HIF-1a蛋白水平，使靶細胞對隨后的化療劑共同治療敏化。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用根據(jù)本發(fā)明的LNA寡核苷酸的醫(yī)學治療與放療相組合。當與本發(fā)明的LNA寡核苷酸一起使用時，放療應當序貫使用，開始用寡核苷酸治療一段時間，通過降低腫瘤細胞和腫瘤血管系統(tǒng)的增殖內(nèi)皮細胞中的HIF-1a蛋白水平，使靶細胞對隨后的附加放療敏化。
本發(fā)明的LNA寡核苷酸也可以用作研究試劑，用于診斷、治療和預防中。在研究中，該反義寡核苷酸可用于特異性抑制細胞和試驗動物中HIF-1a基因的合成，由此方便對靶的功能性分析，或評價其作為治療干預目標的有效性。在診斷中，該反義寡核苷酸可用于檢測和定量細胞和組織中的HIF-1a表達，這通過RNA印跡、原位雜交或類似的技術(shù)來實現(xiàn)。對于治療，疑似患有可通過調(diào)節(jié)HIF-1a表達進行治療的疾病或病癥的動物或人，可通過施用本發(fā)明的反義LNA寡核苷酸來治療。還提供了治療動物(特別是小鼠和大鼠)和治療人的方法，所述動物和人懷疑患有與HIF-1a表達相關(guān)的疾病或病癥或者對其易感，所述方法包括施用治療或預防有效量的一種或多種本發(fā)明的反義LNA寡核苷酸或綴合物或藥物組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及誘導細胞凋亡的方法，其包含施用本文定義的LNA寡核苷酸、本文定義的綴合物或本文定義的藥物組合物。該凋亡的誘導可以在體外或體內(nèi)。該誘導可以在細胞測定中或組織樣品內(nèi)或活的哺乳動物內(nèi)完成。
本發(fā)明的相關(guān)方面涉及防止細胞增殖的方法，其包含施用本文定義的LNA寡核苷酸、或本文定義的綴合物或本文定義的藥物組合物。該細胞增殖的防止可以是體外或體內(nèi)的。該防止可以在細胞測定中或組織樣品內(nèi)或活的哺乳動物內(nèi)進行。
另外，本發(fā)明也涉及治療血管發(fā)生性疾病的方法，其包含施用本文定義的LNA寡核苷酸、本文定義的綴合物或本文定義的藥物組合物，從而抑制與血管發(fā)生性疾病有關(guān)的血管發(fā)生。
在一個實施方案中，血管發(fā)生性疾病包含與癌癥有關(guān)的腫瘤，也參見上面。癌癥優(yōu)選地選自乳腺癌，肺癌，頭頸部癌，腦癌，腹部癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，食道癌，胃腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，肝癌，舌癌，成神經(jīng)細胞瘤，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，視網(wǎng)膜母細胞瘤，維爾姆斯瘤，多發(fā)性骨髓瘤，皮膚癌，淋巴瘤，和血癌?；蛘?，癌癥選自多發(fā)性骨髓瘤，腎癌，子宮頸癌，結(jié)腸癌，腦癌，和乳腺癌。
血管發(fā)生性疾病也可以選自糖尿病性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，和炎性疾病。更具體地，血管發(fā)生性疾病是選自炎性腸病、銀屑病和類風濕性關(guān)節(jié)炎的炎性疾病。
認為黃斑變性的治療與本發(fā)明的LNA寡核苷酸特別相關(guān)。
試劑盒如果液體形式的藥物組合物處于經(jīng)受會有損LNA寡核苷酸的穩(wěn)定性的條件下的危險中，可優(yōu)選地制備固體形式的含有LNA寡核苷酸的成品，例如作為凍干產(chǎn)品，并以這樣的固體形式保藏產(chǎn)品。在施用前，可以在鹽水或立即可以使用的緩沖鹽水中重配(例如，溶解或懸浮)該產(chǎn)品。
因此，本發(fā)明也提供了試劑盒，其包含(a)第一種組分，其含有固體形式的上文定義的LNA寡核苷酸或綴合物，和(b)第二種組分，其含有適合重配(例如，溶解或懸浮)所述LNA寡核苷酸的鹽水或緩沖溶液(例如緩沖鹽水)。
優(yōu)選地，所述鹽水或緩沖鹽水具有4.0-8.5的pH和20-2000mM的體積摩爾濃度。在一個優(yōu)選的實施方案中，鹽水或緩沖鹽水具有6.0-8.0的pH和100-500mM的體積摩爾濃度。在一個最優(yōu)選的實施方案中，鹽水或緩沖鹽水具有7.0-8.0的pH和120-250mM的體積摩爾濃度。
對于這樣的試劑盒，LNA寡核苷酸優(yōu)選地選自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17，和SEQ ID NO.18。更具體地，LNA寡核苷酸選自SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2。
下面的實施例以非限制性的方式進一步解釋了本發(fā)明。
實驗實施例1單體合成按照公開的方法和其中引用的文獻，制備LNA單體構(gòu)件及其衍生物，參見，例如WO O3/095467 A1和D.S.Pedersen，C.Rosenbohm，T.Koch(2002)Preparation of LNAPhosphoramidites，Synthesis 6，802-808.
實施例2寡核苷酸合成在Expedite 8900/MOSS合成儀(Multiple OligonucleotideSynthesis System)上使用亞磷酰胺方法，以1μmol或15μmol的規(guī)模合成寡核苷酸。對于更大規(guī)模合成，使用_kta Oligo Pilot。在合成的最后(具有DMT)，在室溫下使用氨水1-2小時，從固體支持物上裂解下寡核苷酸，并進一步在65℃下脫保護4個小時。通過反相HPLC(RP-HPLC)純化該寡核苷酸。除去DMT基團后，該寡核苷酸通過AE-HPLC、RP-HPLC和CGE表征，并且通過ESI-MS進一步證實分子量。更詳細見下。
LNA-固體支持物的制備LNA琥珀酰半酯的制備將5’-O-Dmt-3’-羥基-LNA單體(500mg)、琥珀酸酐(1.2當量)和DMAP(1.2當量)溶解在DCM(35ml)中。該反應物在室溫下攪拌過夜。用0.1M的NaH2PO4，pH 5.5(2x)和鹽水(1x)萃取后，用無水Na2SO4進一步干燥有機層，過濾并蒸發(fā)。以95％的收率獲得該半酯衍生物，其無需任何進一步純化即使用。
LNA-支持物的制備將以上制備的半酯衍生物(90μmol)溶解在最少量DMF中，加入DIEA和pyBOP(90μmol)并在一起混合1分鐘。將該預活化的混合物與LCAA-CPG(500_，80-120目徑，300mg)在手動合成器里混合并攪拌。室溫下1.5小時后，濾掉支持物，并用DMF、DCM和MeOH洗滌。干燥后，上樣確定為57μmol/g(見Tom Brown，Dorcas J.S.Brown.Modernmachine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis.InF.Eckstein編，Oligonucleotides and Analogues APracticalApproach.OxfordIRL Press，199113-14)。
寡核苷酸的延伸通過使用乙腈中0.1M 5’-O-DMT-保護的amidite溶液和乙腈中的DCI(4，5-二氰咪唑)(0.25M)作為活化劑，進行亞磷酰胺(A(bz)，G(ibu)，5-甲基-C(bz))或T-β-氰乙基-亞磷酰胺)的偶聯(lián)。通過使用蒼耳烷氯化物(在乙腈吡啶10％中的0.01M)進行硫化反應。其余的試劑是寡核苷酸合成中常用的那些。將供應商提供的方案合適地優(yōu)化。
RP-HPLC純化柱XterraRP18流速3ml/min緩沖液0.1M醋酸銨pH 8和乙腈縮寫DMT二甲氧三苯甲基DCI4，5-二氰咪唑DMAP4-二甲氨基吡啶DCM二氯甲烷DMF二甲基甲酰胺
THF四氫呋喃DIEAN，N-二異丙基乙胺PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷鏻Bz苯甲?；鵌bu異丁酰基實施例3LNA寡核苷酸的設計表1-LNA寡核苷酸
在表1中，大寫字母代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物(β-D-氧-LNA)，小寫字母代表2-脫氧核苷酸，下劃線代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物或2-脫氧核苷酸，下標″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間沒有下標代表磷酸二酯鍵，且下標″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵，且括號中的核苷酸單元(分別例如(Tx)或(Gx))代表可選存在的單元。所有LNA-C單體是5-甲基-C(MeC)。
化合物的解鏈溫度(Tm)的測量將3μM SEQ ID NO.1在10mM磷酸鈉/100mM NaCl/0.1nMEDTA，pH 7.0中的溶液與它的互補DNA/RNA(3μM，在10mM磷酸鈉/100mM NaCl/0.1nM EDTA，pH 7.0中)一起在90℃混合1分鐘，并冷卻至室溫。然后，通過每分鐘升高1℃，把溫度從25升高至95℃，確定雙鏈體的Tm。在下面的表2中，顯示了SEQ ID NO.1的Tm。
表2
實施例4LNA寡核苷酸在人或大鼠血漿中的穩(wěn)定性在來自人或大鼠的血漿(也可以是小鼠、猴或狗血漿)中，測試了LNA寡核苷酸穩(wěn)定性。在45μl血漿中，加入5μl LNA寡核苷酸(終濃度20μM)。在37℃，將LNA寡核苷酸在血漿中溫育0-96小時(測試血漿的核酸酶活性長達96小時，證實沒有核酸酶剪切模式差異)。在指定的時間，將樣品快速冷凍在液氮中。通過加入15μL水和3μL 6x上樣染料(Invitrogen)，稀釋2μL(等于40pmol)在血漿中的LNA寡核苷酸。使用10bp梯(Invitrogen 10821-015)作為標志物。向1μl梯中，加入1μl 6x上樣(染料)和4μl水?；旌蠘悠?，加熱至65℃ 10min，上樣到預試凝膠(16％丙烯酰胺，7M尿素，1xTBE，在50瓦特預試1h)，并在50-60瓦特跑2.5小時。隨后，用在1x TBE中的1x SyBR金(Molecular probes)對凝膠染色15min。使用來自Biorad的phosphoimager，觀察條帶(參見圖1A大鼠血漿&圖1B人和大鼠血漿)。
在來自人的血漿(也可以是大鼠、小鼠、猴或狗血漿)中，測試了LNA寡核苷酸穩(wěn)定性。將終濃度為20μM(1或5μL)的LNA寡核苷酸加入20μL總體積的血漿中，溫育0-24小時(可以最高達72小時——已經(jīng)測試了血漿的核酸酶活性長達72小時，沒有剪切模式差異)。在指定的時間，將樣品保藏在-80℃。在水中10x稀釋1μL(等于20pmol)在血漿中的LNA寡核苷酸，并與10bp梯(來自Invitrogen(目錄號10821-015))在16％丙烯酰胺、7M尿素凝膠上電泳。凝膠在約40瓦特跑2-3小時，然后用在1x TBE中的1x SyBR金(Molecularprobes)染色15min。使用來自Biorad的phosphoimager，觀察條帶(參見圖1)。
實施例5體外模型細胞培養(yǎng)LNA寡核苷酸對靶核酸表達的影響，可在多種細胞類型中的任何一種中檢測，條件是目標核酸以可測量的水平存在。靶物可內(nèi)源性表達，或通過編碼所述核酸的核酸的瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達。
靶核酸的表達水平可使用例如RNA印跡分析、定量PCR、核糖核酸酶保護測試按常規(guī)確定。為示例目的提供以下細胞類型，但是其它細胞類型也可按常規(guī)使用，條件是靶物在所選細胞類型中表達。
細胞培養(yǎng)在如以下所述的合適培養(yǎng)基中，并保持在37℃、95-98％濕度和5％ CO2中。當在低氧或缺氧下培養(yǎng)時，O2水平分別保持在1-2％或0-0.5％。細胞每周按常規(guī)傳代2-3次。
15PC3人前列腺癌細胞系15PC3由F.Baas博士，NeurozintuigenLaboratory，AMC，The Netherland惠贈，并培養(yǎng)在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+慶大霉素中。
PC3人前列腺癌細胞系PC3購自ATCC，并培養(yǎng)在含有谷氨酰胺的F12 Coon′s(Gibco)+10％ FBS+慶大霉素中。
518A2人黑素瘤癌細胞系518A2由B.Jansen博士，Section ofexperimental Oncology，Molecular Pharmacology，Department ofClinical Pharmacology，University of Vienna惠贈，并培養(yǎng)在DMEM(Sigma)+10％胎牛血清(FBS)+Glutamax I+慶大霉素中。
U373U373成膠質(zhì)細胞瘤細胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清+Glutamax I、NEAA、丙酮酸鈉和慶大霉素的EMEM(Sigma)中，在37℃，95％濕度和5％ CO2。
HeLa子宮頸癌細胞系HeLa培養(yǎng)在含有10％胎牛血清、慶大霉素的MEM(Sigma)中，在37℃，95％濕度和5％ CO2。
MPC-11鼠多發(fā)性骨髓瘤細胞系MPC-11購自ATCC，并維持在含有4mM Glutamax+10％馬血清的DMEM中。
DU-145人前列腺癌細胞系DU-145購自ATCC，并維持在含有Glutamax+10％ FBS的RPMI中。
RCC-4+/-VHL用表達VHL的質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人腎癌細胞系RCC4購自ECACC，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行維持。
786-0人腎細胞癌細胞系786-0購自ATCC，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行維持。
HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細胞系HUVEC購自Camcrex，并維持在EGM-2培養(yǎng)基中。
K562人慢性髓細胞性白血病細胞系K562購自ECACC，并維持在含有Glutamax+10％ FBS的RPMI中。
U87MG人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U87MG購自ATCC，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行維持。
B16鼠黑素瘤細胞系B16購自ATCC，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行維持。
LNCap人前列腺癌細胞系LNCap購自ATCC，并維持在含有Glutamax+10％ FBS的RPMI中。
實施例6體外模型用反義寡核苷酸處理細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染在37℃(5％ CO2)，將U373或HeLa細胞接種于12-孔細胞培養(yǎng)板中的添加了10％ FBS，Glutamax I和慶大霉素的D生長培養(yǎng)基中。當細胞60-70％匯合時，使用Lipofectamine 2000(2.5-5μg/ml)，用不同濃度的寡核苷酸(0.2-100nM)一式兩份地轉(zhuǎn)染它們?；旧先鏒ean等(1994，JBC 26916416-16424)所述，進行轉(zhuǎn)染。簡而言之，用在OptiMEM中的Lipofectamine溫育細胞10分鐘，隨后加入寡核苷酸至總體積0.5ml轉(zhuǎn)染混合物/孔。4小時后，去除轉(zhuǎn)染混合物，洗滌細胞，在適當?shù)纳L培養(yǎng)基中，在常氧或低氧下，在37℃生長約20小時(mRNA分析和蛋白分析)。然后，收獲細胞進行蛋白和RNA分析。
實施例7體外模型RNA的提取和cDNA合成總RNA分離使用RNeasy小試劑盒(Qiagen目錄號74104)或使用Trizol試劑(Life technologies目錄號15596)，分離總RNA。
關(guān)于使用RNeasy小試劑盒(Qiagen)的總RNA分離，用PBS洗滌細胞，將添加了1％巰基乙醇的細胞裂解緩沖液(RTL，Qiagen)直接加入孔中。幾分鐘后，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，處理樣品。
使用Retsch 300MM勻漿機勻漿化組織樣品，并根據(jù)生產(chǎn)商所述，使用Trizol試劑或RNeasy小試劑盒分離總RNA。
第一鏈合成按照生產(chǎn)商的說明書(Qiagen)，使用OmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒或M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(基本上如生產(chǎn)商(Ambion)所述)進行第一鏈的合成。當使用OmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶時，對每個樣品，將0.5μg總RNA調(diào)整到12μl，并與0.2μl多(dT)12-18(0.5g/ml)(LifeTechnologies)、2μl dNTP混合物(每種5mM)、2μl 10X RT緩沖液、0.5μl RNAguardTMRNA酶抑制劑(33單位/ml，Amersham)和1μl OmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶混合，隨后在37℃溫育60分鐘，并在93℃熱滅活5分鐘。
當使用隨機十聚體和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行第一鏈的合成(基本上如生產(chǎn)商(Ambion)所述)時，在H2O中將每個樣品的0.25μg總RNA調(diào)節(jié)至10.8μl。加入2μl十聚體和2μl dNTP混合物(每種2.5mM)。將樣品加熱至70℃ 3分鐘，并立即在冰水中冷卻，加入3.25μl含有(2μl 10xRT緩沖液；1μl M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶；0.25μl RNA酶抑制劑)的混合物。在42℃合成cDNA60min，隨后在95℃熱滅活步驟10分鐘，最后冷卻至4℃。
實施例8體外和體內(nèi)模型通過實時PCR分析寡核苷酸對HIF-1a表達的抑制可用本領域已知的多種方法測定HIF-1a表達的反義調(diào)節(jié)。例如，HIF-1a mRNA水平可通過例如RNA印跡分析、競爭性聚合酶鏈式反應(PCR)、核糖核酸酶保護測定(RPA)或?qū)崟rPCR來定量。目前，實時定量PCR是優(yōu)選的。RNA分析可對總細胞RNA或mRNA進行。
RNA分離和RNA分析方法，如RNA印跡分析，在本領域是常規(guī)的，并在如John Wiley and Sons的Current Protocols in MolecularBiology中有教導。
使用可從BioRAD商購的市售iQ多色實時PCR檢測系統(tǒng)，可方便地實現(xiàn)實時定量PCR。
HIF-1a mRNA水平的實時定量PCR分析按照制造商的指導，使用iQ多色實時PCR檢測系統(tǒng)(BioRAD)，通過實時定量PCR確定mRNA水平的量。
實時定量PCR是本領域公知的技術(shù)，并在如Heid等人Real timequantitative PCR，Genome Research(1996)，6986-994中有教導。
Platinum Quantitative PCR SuperMix UGD 2x PCR master mix購自Invitrogen目錄號11730。引物和TaqMan_探針購自MWG-BiotechAG，Ebersberg，德國。
甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，18S RNA或β-肌動蛋白mRNA量用作標準化樣品制備中的任何變異的內(nèi)源對照。
根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用人GAPDH ABI Prism預開發(fā)的Taqman測定試劑(Applied Biosystems目錄號4310884E)，定量人GAPDHmRNA的樣品含量。
對于人HIF-1a，PCR引物是正向引物5′-CTCATCCAAGAAGCCCTAACGTGTT-31(SEQ ID NO.21)(測定中的終濃度；0.9μM)反向引物5′-GCTTTCTCTGAGCATTCTGCAAAGC-3′(SEQ IDNO.22)(測定中的終濃度；0.9μM)，且PCR探針是5′FAM-CCTCAGGAACTGTAGTTCTTTGACTCAAAGCGACA-TAMRA 3′(SEQ ID NO.23)(測定中的終濃度；0.1μM)。
對于短尾猴HIF-1a，PCR引物是I正向引物5′-GCTTACCATCAGCTATTTGCGTGTG-3′(測定中的終濃度；0.9μM)(SEQID NO.24)反向引物5′-GAACCATAACAAAACCATCCAAGGC-3′(SEQ IDNO.25)(測定中的終濃度；0.9μM)，且PCR探針是5′FAM-TCATCTTCAATATCCAAATCACCAGCATCCAGAAG-TAMRA 3′(SEQ ID NO.26)(測定中的終濃度；0.1μM)。
對于18S核糖體RNA的定量，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用TaqMan真核18S rRNA內(nèi)源對照試劑(PART# 4310875，Applied Biosystems)。
對于小鼠GAPDH mRNA的定量，設計了下面的引物和探針有義引物5′-AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3′(SEQ ID NO.27)(0.3μM終濃度)，反義引物5′-GTCAGATCCACGACGGACACATT-3′(SEQ ID NO.28)(0.6μM終濃度)，TaqMan探針5′-FAM-GAAGCTCACTGGCATGGCATGGCCTTCCGTGTTC-TAMRA-3′(SEQID NO.29)(0.2μM終濃度)。
使用Taqman探針的實時PCR將來自如實施例6所述進行的第一鏈合成的cDNA稀釋2-20倍，并通過實時定量PCR進行分析。將引物和探針與2x PlatinumQuantitative PCR SuperMix UDG(cat.#11730，Invitrogen)混合，并加入到3.3μl的cDNA中，達到最終體積25μl。每個樣品一式三份分析。測定對從表達目標RNA的細胞系中純化的材料制備的cDNA的2倍稀釋物，生成該測定的標準曲線。使用無菌水代替cDNA，用作無模板對照。PCR程序50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，隨后95℃ 15秒、60℃1分鐘循環(huán)40次。
使用iCycler iQ實時檢測系統(tǒng)軟件，從計算的閥值循環(huán)確定目標mRNA序列的相對量(參見圖2)。
SyBR Green實時PCR為了確定相對小鼠HIF1α mRNA水平，在使用來自BioRad的iCycler的定量PCR分析中使用cDNA。
向8μl 5-倍稀釋的cDNA中，加入52μl含有29.5μlPlatinum qPCR Supermix-UDG(invitrogen)、1030nM每種引物、0.57X SYBR Green(Molecular probes)和11.4nM熒光素(Molecularprobes)的混合物。
將25μl一式兩份用于Q-PCR50℃ 120秒、95℃ 120秒、和40個循環(huán)[95℃ 30秒和60℃ 60秒]。
將HIF1α mRNA表達相對于小鼠β-肌動蛋白mRNA標準化，后者使用Q-PCR類似地定量。
引物mHIF1α5′-TGGGACTTTCTTTTACCATGC-3′(SEQ ID NO.30)和5′-GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3′(SEQ ID NO.31)mβ-肌動蛋白5′-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3′(SEQ ID NO.32)和5′-GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3′(SEQ ID NO.33)mVEGF5′-CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC-3′(SEQ ID NO.34)和5′-GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3′(SEQ ID NO.35)BCL-2正向5′-gccctgtggatgactgagta-3′(SEQ ID NO.36)，和反向5′-cagccaggagaaatcaaacag-3′(SEQ ID NO.37)將從未處理的小鼠成纖維細胞(Ltk細胞)合成的cDNA(稀釋5倍，并表達HIF1α和β-肌動蛋白)的2-倍稀釋液用于制備測定標準曲線。使用iCycler iQ實時檢測系統(tǒng)軟件，從計算的閾值循環(huán)，確定HIF1αmRNA的相對量。
實施例9體外分析HIF-1a蛋白水平的蛋白印跡分析通過蛋白印跡，確定HIF-1a LNA寡核苷酸對轉(zhuǎn)染的細胞中HIF-1a蛋白水平的體外影響。
收獲細胞，在添加了蛋白酶抑制劑混合物(Roche)的50mMTris-HCl pH 6.8、10％甘油、2.5％SDS、5mM DTT和6M尿素中裂解。使用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce)，測量總蛋白濃度。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Invitrogen)，在MOPS緩沖液中的12％Bis-Tris凝膠上或3-8％Tris醋酸鹽凝膠上，跑20-100μg總蛋白，并印跡到PVDF膜上。在封閉緩沖液(添加了5％低脂奶粉的PBS-T)中溫育過夜后，將膜與抗-HIF-1a抗體、Bcl-2抗體、VEGF抗體或檢測HIF-1a的其它下游產(chǎn)物的抗體一起溫育過夜。作為上樣對照，使用來自Neomarker的單克隆抗體檢測微管蛋白或肌動蛋白。將膜與二抗一起溫育，并使用發(fā)色免疫檢測試劑盒(Invitrogen)或化學發(fā)光ECL+檢測試劑盒(Amersham)，觀察HIF-1a(參見圖2A和圖2B)。
實施例10體外分析使用反義寡核苷酸對人HIF-1a表達的反義抑制，和它們對下游靶物VEGFA和MMP-2的影響LNA寡核苷酸還對在U373細胞培養(yǎng)基中的下游靶物VEGFA和MMP-2有影響。將U373細胞以0.3×106細胞接種于T25燒瓶(時間研究)，或以0.6×106細胞接種于T80燒瓶(48小時濃度研究)。在37℃(5％CO2)，將U373細胞置于添加了10％FBS、Glutamax I和慶大霉素的生長培養(yǎng)基中。接種的次日，使用Lipofectamine 2000(2.5μg/ml)，使用不同濃度的寡核苷酸(0.2-10nM)，用LNA寡核苷酸一式兩份或一式三份地轉(zhuǎn)染細胞。基本上如Dean等(1994，JBC 269 p.16416-16424)所述，進行轉(zhuǎn)染。簡而言之，用在OptiMEM中的Lipofectamine溫育細胞10min，隨后加入寡核苷酸。4小時后，去除轉(zhuǎn)染混合物，洗滌細胞，在適當?shù)纳L培養(yǎng)基中，在常氧或低氧下，在37℃生長約20小時(mRNA分析和蛋白分析)。在指定的時間，收獲來自細胞的上清液。加入蛋白酶抑制劑，然后保藏在-80℃。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用來自RD systems的人VEGFAelisa(目錄號DVE-00)和MMP-2 elisa(目錄號DMP-200)。根據(jù)收獲時間，在測量前將上清液稀釋5-50倍。參見圖12A-E。
實施例11LNA寡核苷酸誘導細胞凋亡細胞培養(yǎng)在37℃、95％濕度和5％CO2，在添加了10％胎牛血清、GlutamaxI、NEAA、丙酮酸鈉和慶大霉素的MEM(Sigma)中，培養(yǎng)成膠質(zhì)細胞瘤細胞系U373(ATCC)。當細胞達到60-70％匯合時，使用Lipofectamine2000(2.5μg/ml)轉(zhuǎn)染細胞。
在37℃、95％濕度和5％CO2，在含有10％胎牛血清、慶大霉素的MEM(Sigma)中，培養(yǎng)子宮頸癌細胞系HeLa。當細胞達到60-70％匯合時，使用Lipofectamine 2000(5μg/ml)轉(zhuǎn)染細胞。
測量有活性的半胱天冬酶3/7活性轉(zhuǎn)染前日，將U373細胞以每孔7000個細胞的密度接種在白色96孔板(Nunc 136101)內(nèi)的完全MEM中。第二天，在預熱的OptiMEM里洗滌細胞一次，隨后加入72μl含有2.5μg/ml Lipofectamine2000(Invitrogen)的OptiMEM。將細胞溫育7分鐘后，加入18μl在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸。最終寡核苷酸濃度在0.2nM到100nM的范圍內(nèi)。處理6小時后，將細胞在OptiMEM中洗滌，并加入100μl含血清的DMEM。在常氧或在低氧/缺氧下(通過將96孔平板置于anaerocult袋(Merck)中直到收獲時)培養(yǎng)含有處理的U373細胞的類似96孔平板。在指定的時間，將平板平衡至室溫15min。將100μl高敏感的半胱天冬酶3/7-GloTM試劑(Promega)直接加給在96孔平板中的細胞，并將平板溫育1小時，然后在另外延遲1分鐘時間后，在來自ThermoLabsystems的Luminoskan Ascent裝置中記錄發(fā)光(螢光素酶活性)。將螢光素酶活性測量為每秒的相對光單位(RLU/s)。使用Ascent軟件2.4.2處理數(shù)據(jù)，使用Excel繪制相對于模擬品的誘導倍數(shù)圖。
通過與半胱天冬酶3/7抑制劑(其會阻斷有活性的半胱天冬酶3/7活性)一起溫育轉(zhuǎn)染的細胞，證實細胞凋亡反應的特異性。另外，十字孢堿、喜樹堿或紫杉醇誘導的細胞用作陽性對照(參見圖3A和圖3B)。
膜聯(lián)蛋白V-FITC流式細胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染前日，將1×106HeLa細胞接種進T75燒瓶。在轉(zhuǎn)染的當天，在37℃ OptiMEM里洗滌細胞一次，隨后加入7ml含有2.5μg/mlLipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。將細胞溫育7分鐘后，加入1700μl在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸，至終濃度1-25nM。模擬轉(zhuǎn)染的細胞用作對照。處理4小時后，將細胞在OptiMEM中洗滌，并加入10ml培養(yǎng)基。用寡核苷酸處理后，使細胞恢復24-72小時，然后通過刮除收獲它們，并在PBS中洗滌2次。將2×105細胞與5μl膜聯(lián)蛋白V-FITC和10μl碘化丙啶(PI-10mg/ml)一起在室溫、在黑暗中溫育15min。與純化的重組膜聯(lián)蛋白V(10μg)一起溫育轉(zhuǎn)染的細胞，然后加入膜聯(lián)蛋白V-FITC，證實染色的特異性和選擇性。另外，使用TRAIL(Apo2L)誘導的HeLA細胞(0.5μg/ml)作為陽性對照。
轉(zhuǎn)染前日，將0.6×106U373細胞接種進T75燒瓶。在轉(zhuǎn)染的當天，在37℃ OptiMEM里洗滌細胞一次，隨后加入7ml含有2.5μg/mlLipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。將細胞溫育7分鐘后，加入1700μl在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸，至終濃度1-25nM。模擬轉(zhuǎn)染的細胞用作對照。處理6小時后，將細胞在OptiMEM中洗滌，并加入10ml培養(yǎng)基。用寡核苷酸處理后，使細胞恢復24-48小時，然后通過刮除收獲它們，并在PBS中洗滌2次。將2×105細胞與5μl膜聯(lián)蛋白V-FITC和10μl碘化丙啶(PI-10mg/ml)一起在室溫、在黑暗中溫育15min。與純化的重組膜聯(lián)蛋白V(10μg)一起溫育轉(zhuǎn)染的細胞，然后加入膜聯(lián)蛋白V-FITC，證實染色的特異性和選擇性。另外，使用十字孢堿(0.2μM)誘導的U373細胞作為陽性對照(參見圖4A和4B)。
實施例12LNA寡核苷酸對增殖的抑制根據(jù)實施例11處理細胞。
測量增殖的活細胞(MTS測定)轉(zhuǎn)染前日，將U373細胞以每孔7000個細胞的密度接種在透明96孔板(Scientific Orange no.1472030100)內(nèi)的DMEM中。第二天，在預熱的OptiMEM里洗滌細胞一次，隨后加入72μl含有2.5μg/mlLipofectamine 2000(Invitrogen)的OptiMEM。將細胞溫育7分鐘后，加入18μl在OptiMEM中稀釋的寡核苷酸。最終寡核苷酸濃度在5nM到100nM的范圍內(nèi)。處理6小時后，將細胞在OptiMEM中洗滌，并加入100μl含血清的DMEM。在常氧或在低氧/缺氧下(通過將96孔平板置于anaerocult袋(Merck)中直到收獲時)培養(yǎng)含有處理的U373細胞的類似96孔平板。在指定的時間，通過加入20μl四唑鎓化合物[3-(4，5-二甲基-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，內(nèi)鹽；MTS]和電子偶聯(lián)試劑(吩嗪硫酸乙酯；PES)(Cell Titer 96_AQueous One Solution Cell Proliferation Assav，Promega)，測量活細胞。在Powerwave(Biotek Instruments)中，在490nm和650nm測定活細胞。
相對于模擬品(設定為100％)，針對LNA寡核苷酸濃度繪制對生長速率ΔOD(490-650nm)/h的抑制的圖(參見圖5A和圖5B)。
實施例13LNA寡核苷酸的體內(nèi)攝取和靶物減量調(diào)節(jié)在14天內(nèi)腹膜內(nèi)注射鹽水或SEQ ID NO.1和其不同硫化形式，每天或每周二次(5次)地處理有毛的小鼠。SEQ ID NO.5是部分地硫化的(在間隙中)，而SEQ ID NO.6具有磷酸二酯主鏈。用10mg/kg/14天、50mg/kg/14天、或250mg/kg/14天的總劑量，每天或每周兩次地施用，處理小鼠。
來自組織的RNA純化和cDNA合成在添加了1％巰基乙醇的400μl RTL緩沖液(Qiagen)中，勻漿約10mg組織。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用RNeasy小試劑盒(Qiagen)分離總RNA。
使用隨機十聚體和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行第一鏈的合成(基本上如生產(chǎn)商(Ambion)所述)。對于每種樣品，在H2O中將0.25μg總RNA調(diào)節(jié)至10.8μl。加入2μl十聚體和2μl dNTP混合物(每種2.5mM)。將樣品加熱至70℃3分鐘，并立即在冰水中冷卻，加入3.25μl含有(2μl 10xRT緩沖液；1μl M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶；0.25μl RNA酶抑制劑)的混合物。在42℃合成cDNA60min，隨后在95℃熱滅活步驟10分鐘，最后冷卻至4℃。
定量實時PCR分析為了確定處理的和未處理的樣品中相對小鼠HIF1α mRNA水平，在使用來自BioRad的iCycler的定量PCR分析中，使用制備的cDNA。
向8μl 5-倍稀釋的cDNA中，加入52μl含有29.5μlPlatinum qPCR Supermix-UDG(invitrogen)、1030nM每種引物、0.57X SYBR Green(Molecular probes)和11.4nM熒光素(Molecularprobes)的混合物。
將25μl一式兩份用于Q-PCR50℃120秒、95℃120秒、和40個循環(huán)[95℃ 30秒和60℃ 60秒]。
將HIF1α mRNA表達相對于小鼠β-肌動蛋白和/或Gapdh mRNA標準化，后者使用Q-PCR類似地定量。
mHIF1α5′-TGGGACTTTCTTTTACCATGC-S′(SEQ ID NO.30)和5′-GGAGTGTTTACGTTTTCCTGAAG-3′(SEQ ID NO.31)mβ-肌動蛋白5′-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAA-3′(SEQ ID NO.32)和5′-GCTCAGGAGGAGCAATGATCT-3′(SEQ ID NO.33)mVEGF5′-CACGACAGAAGGAGAGCAGAAGTC-3′(SEQ ID NO.34)和5′-GTCGGGGTACTCCTGGAAGATGT-3′(SEQ ID NO.35)mGAPDH5′-AGCCTCGTCCCGTAGACAAAAT-3′(SEQ ID NO.38)和5′-GTTGATGGCAACAATCTCCACTTT-3′(SEQ ID NO.39)mBcl-2正向5′-gccctgtggatgactgagta-3′(SEQ ID NO.36)和反向5′-cagccaggagaaatcaaacag-3′(SEQ ID NO.37)將從未處理的小鼠成纖維細胞(Ltk細胞)合成的cDNA(稀釋5倍，并表達HIF1α和β-肌動蛋白)的2-倍稀釋液用于制備測定標準曲線。使用iCycler iQ實時檢測系統(tǒng)軟件，從計算的閾值循環(huán)，確定HIF1α mRNA的相對量。
從組織提取LNA寡核苷酸在500μl提取緩沖液(0.5％Igepal CA-630，25mM Tris pH 8.0，25mM EDTA，100mM NaCl，含有1mg/ml RNA酶A)中，機械地勻漿約100mg組織，并在37℃溫育過夜。用參照寡核苷酸摻加500ml，并通過加入1ml苯酚-異戊醇-氯仿(25∶1∶24(v/v/v))進行提取。將水相轉(zhuǎn)移到新試管，再次提取。如果需要，凍干提取物。
提取的LNA寡核苷酸的IEXHPLC分析通過配有保護柱DNAPac PA-100(2×50毫米，Dioex)的DNAPacPA-100(2×250毫米，Dioex)柱分離體積為50μl的樣品。將柱子加熱到40℃。流速0.25ml/min，檢測波長260nm。流動相的梯度，ATRIS(20mM)、EDTA(1mM)和高氯酸鈉(10mM)pH7.6，BTRIS(20mM)、EDTA(1mM)和高氯酸鈉(1M)pH7.6，(0-13分鐘，A20％、B20％；14-18分鐘，A40％、B60％；22-28分鐘，A0％、B100％；33-38分鐘，A80％、B20％)。
圖6A和圖6B顯示了體內(nèi)攝取(按μg/g組織計)和靶物減量調(diào)節(jié)(每天或每周二次腹膜內(nèi)施用SEQ ID NO.1持續(xù)14天(如上所述)后，相對于鹽水處理的小鼠，與β-肌動蛋白表達相關(guān)聯(lián)的HIF-1a mRNA表達的％抑制))圖6C顯示了每天腹膜內(nèi)注射有毛的小鼠持續(xù)14天的施用SEQ IDNO.1方案的體內(nèi)內(nèi)源腎靶物減量調(diào)節(jié)。
圖7A顯示，在每天施用后，通過Q-PCR測得，SEQ ID NO.1在肝中對于HIF-1a表達是有效的抑制劑。
圖7B顯示，在每周2次施用后，通過Q-PCR測得，SEQ ID NO.1在肝中對HIF-1a表達也是有效的抑制劑。
圖7C證實，在每天施用后，通過Q-PCR測得，SEQ ID NO.1在腎中對HIF-1a表達是有效的抑制劑。
實施例14SEQ ID NO.1在攜帶U373異種移植腫瘤的小鼠中的體內(nèi)功效使用不同的腫瘤細胞系，可以測量寡核苷酸處理對裸鼠腫瘤異種移植物的生長的影響。這樣的細胞系的實例是人腫瘤細胞系U87(成膠質(zhì)細胞瘤)，U373(成膠質(zhì)細胞瘤)，15PC3(前列腺癌)，PC3(前列腺癌)，DU145(前列腺癌)，LNCap(前列腺癌)和鼠腫瘤細胞系B16(黑素瘤)。
使用LNA寡核苷酸處理裸鼠的皮下腫瘤異種移植物。皮下地植入腫瘤細胞，然后通過3次連續(xù)移植而連續(xù)傳代。用krocar針，將1mm的腫瘤碎片皮下地植入NMRI裸鼠。或者，將懸浮于300μLmatrigel(BD Bioscience)中的癌細胞(典型地106至107細胞)皮下注射進NMR1裸鼠的側(cè)腹。通過腹膜內(nèi)注射5mg/kg/天，處理小鼠。當腫瘤體積達到50mm3時，開始小鼠的個體治療。當對照(鹽水處理)組的平均腫瘤體積達到50mm3時，開始PBS治療。當任何組的腫瘤達到最大允許尺寸時，終止實驗。通過測徑器測量，每天測量所有小鼠的腫瘤大小。將治療的效果測量為腫瘤大小和腫瘤生長速率。
在另一項使用SEQ ID NO.1的研究中，將來自U373供體小鼠的活腫瘤碎片移植到裸鼠卵巢的脂肪組織上(第0天)。在移植后第4天和第9天，以50mg/kg的LNA寡核苷酸處理小鼠(腹膜內(nèi)地)。在最后一次給藥(第11天)后2天，處死小鼠，測量腫瘤重量，用CD-31ab對腫瘤染色(參見圖8A和8C)。
圖8B和8C顯示了來自用SEQ ID NO.1處理的異種移植物的U373腫瘤中的血管密度。圖10D顯示了通過QPCR測得的U373腫瘤中的HIF-1α mRNA表達。
以50mg/kg，每周2次，持續(xù)1周，將SEQ ID NO.1施用給植入卵巢的U373異種移植小鼠。在最后一次給藥后2天，處死動物。CD31染色后，計算血管密度，并與總面積相關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)鹽水組和用雜亂對照(SEQ ID NO.12)處理的小鼠之間的統(tǒng)計學顯著性差異(P＝0.005)。
實施例15SEQ ID NO.1在肝和腎中的組織半衰期和靶物擊倒將60只NMRI雌性小鼠(約25g)分成5只小鼠的組，在第0，3，7，10和14天，腹膜內(nèi)地(10mL/kg，2.5mg/ml)施用30mg/kg SEQ ID NO.1。在第14天將組中動物處死(take down)。對照組施用0.9％鹽水。取組織樣品，并隨后制備RNA。
圖11顯示了5次腹膜內(nèi)地施用SEQ ID NO.1 30mg/kg后，小鼠的體內(nèi)攝取(按μg/g組織計)和靶物減量調(diào)節(jié)(與β-肌動蛋白表達相關(guān)聯(lián)的HIF-1a和VEGF mRNA表達的％抑制)。
實施例16作用持續(xù)時間和LNA寡核苷酸體內(nèi)攝取作用持續(xù)時間將20只Balb/cA-nu雌性小鼠(約25g)PC3前列腺癌細胞系(ECACC#90112714)分成5只小鼠的組，在第7天至第13天，每天腹膜內(nèi)地(10mL/kg，2.5mg/ml)施用25mg/kg SEQ ID NO.7。在給藥后1天和5天將組中動物處死。對照組施用0.9％鹽水。取組織樣品，并在隨后制備RNA。圖10A顯示了治療后1和5天，mRNA表達的作用持續(xù)時間。
LNA寡核苷酸攝取福爾馬林固定化后，用石蠟包埋組織。將組織置于Holt氏溶液(30g蔗糖，1g阿拉伯膠，15mg麝香草酚，蒸餾水至100ml)中過夜，并冷凍。將4my′s的冷凍切片封固到包被的玻璃上，并置于DAPI溶液中。在熒光顯微鏡中觀察熒光染料。圖10B顯示了來自肝、腎和腫瘤的組織的組織學結(jié)果，它們來自用25mg/kg/天的fam-標記形式的SEQ ID NO.1處理7天、并在最后一次處理后5天處死的小鼠。皮膚照片來自以相同方式處理的小鼠，但是在最后一次處理后那天處死，并感光過度，以便觀察皮膚基底細胞的弱染色(下面的藍線)。這些數(shù)據(jù)提示了下面的內(nèi)容肝肝細胞的染色主要集中在細胞質(zhì)中腎近端小管的非常強的染色和遠端小管的較弱染色。
腫瘤內(nèi)皮細胞，巨噬細胞被染色(小鼠細胞)。
皮膚真皮(內(nèi)皮細胞和巨噬細胞)的強染色和表皮基底層的細胞質(zhì)中實施例17LNA寡核苷酸攝取和體內(nèi)功效在第0天，將0.3×106細胞(PC3和HT29)與300μl matrigel相混合，并植入Balb/cA-nu雌性小鼠(約25g)。在第7，10，13，17天，通過腹膜內(nèi)注射5mg/kg/天的鹽水、SEQ ID NO.1的fam標記形式(SEQ ID NO.7)或SEQ ID NO.8的fam標記形式(SEQ ID NO.20)，處理小鼠。最后一次給藥后3天(第20天)或10天(第27天)，處死動物。鹽水對照組施用0.9％鹽水。取組織樣品，并隨后制備RNA，直到通過HPLC分析測量LNA寡核苷酸含量或分析HIF-1a mRNA減量調(diào)節(jié)(參見圖10C-E)。
顯現(xiàn)LNA寡核苷酸攝取福爾馬林固定化后，用石蠟包埋組織。將組織置于Holt氏溶液(30g蔗糖，1g阿拉伯膠，15mg麝香草酚，蒸餾水至100ml)中過夜，并冷凍。將4my′s的冷凍切片封固到包被的玻璃上，并置于DAPI溶液中。在熒光顯微鏡中觀察熒光染料(數(shù)據(jù)證實了與圖10B相同的生物分布-數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例18HIF-1α和VEGF的體內(nèi)LNA寡核苷酸特異性研究錯配研究將15只NMRI雌性小鼠(約25g)分成5只小鼠的組，在第0，3，7，10，14天，經(jīng)30秒腹膜內(nèi)地(10mL/kg，3.0mg/ml)施用30mg/kg SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.9。對照組施用0.9％鹽水。在最后一次注射后3-4小時將組中動物處死。取組織樣品，并隨后制備RNA。
圖11顯示了與一個錯配對照SEQ ID NO.9相比，每3天30mg/kg的SEQ ID NO.1的5個劑量后，HIF-1a和VEGF mRNA的體內(nèi)內(nèi)源肝靶物減量調(diào)節(jié)。
實施例1914聚體形式的SEQ ID NO.1的體內(nèi)效力通過腹膜內(nèi)注射5mg/kg/天的SEQ ID NO.1，處理NMRI雌性小鼠(0.025kg)。鹽水動物用作對照動物，并施用0.9％鹽水。在給藥后1天或10天，處死5只動物。取組織樣品，并隨后制備RNA，直到如M&M所述通過QPCR測量HIF-1a mRNA表達并相對于β-肌動蛋白標準化。
實施例20制備三維主動脈環(huán)培養(yǎng)物使用經(jīng)過改進的最初為大鼠主動脈報道的方法(Masson等，2002Biol Preoced Online 4(1)p.24-31)，通過在三維膠原凝膠中培養(yǎng)小鼠主動脈環(huán)，研究血管發(fā)生。以10mg/kg至50mg/kg的劑量用LNA寡核苷酸靜脈內(nèi)地處理有毛的小鼠一次。給藥后3天，從小鼠取出胸主動脈(小鼠通過頸脫位處死)，并立即轉(zhuǎn)移到含有冰RPMI培養(yǎng)基(Invitrogen)的培養(yǎng)皿中，所述冰RPMI培養(yǎng)基含有10％胎牛血清。用精細顯微解剖鑷和虹膜切除剪，小心地去除主動脈周圍的纖維脂肪組織，特別注意不要破壞主動脈壁。切1mm長主動脈環(huán)(約15/主動脈-主動脈最大1.5cm)，在含有FBS的RPMI中連續(xù)充分沖洗3次。然后將小鼠主動脈的環(huán)狀外植物包埋在96孔平板孔內(nèi)的60μLmatrigel(BD biosciences-Matrigel356234)中。插入主動脈后，加入另外40μL matrigel，在37℃放置10min，進行固化。向孔中加入100μL含有和不含有生長因子的EGM2(Cambrix)。作為對照，另外用含有10μM Ciplatin的EGM2培養(yǎng)基覆蓋主動脈環(huán)。每2天更換培養(yǎng)基。
實施例21單次靜脈內(nèi)施用3H-標記的SEQ ID NO.1后，小鼠中的定量整體放射自顯影研究在尾靜脈，給9只雌性C57B1/6J(8周，Taconic，DK)小鼠靜脈內(nèi)地施用50mg/kg的每種實驗物，1.5mCi/kg3H-SEQ ID NO.1。
3H-SEQ ID NO.1具有155μCi/mL的比活。
給每只動物施用的體積是10mL/kg的實驗制劑。在施用每種實驗物后5min，15min，1小時，4小時，24小時，2天，4天，7天和18天，殺死各小鼠。
關(guān)于整體放射自顯影，用異氟烷麻醉小鼠，然后立即浸入用干冰冷卻至-80℃的己烷中，ABR-SOP-0130/04。將冷凍尸體包埋在含水的羧甲基纖維素(CMC)凝膠中，在乙醇中冷凍，用干冰冷卻(-80℃)，根據(jù)標準方法ABR-SOP-0131/04，進行矢狀切片，用于整體放射自顯影。在約-20℃的溫度，使用低溫切片機(LeicaCM 3600)，從每只動物在不同水平切下20μm切片。將得到的切片放置在帶(MinnesotaMiningand Manufacturing Co.，No.810)上，用放射性墨水連續(xù)編號。在-20℃冷凍干燥約24小時后，用薄層滑石粉覆蓋選擇的切片，并置于成像板(Fuji，Japan)上。選擇切片用于磷成像，以最好地代表目標組織和器官。與一組3H校正標準物一起，用滑石粉薄層覆蓋切片，并置于成像板上。由于3H的低能量，使用滑石粉代替塑料箔，以便保護成像板。在室溫暴光成像板3-7天，包封在鉛板屏盒子中的不透光盒中，以保護免受環(huán)境輻射。
曝光后，使用BAS 2500(Fuji Film Sverige AB，Sweden)，以50μm的象素大小，掃描成像板。使用AIDA，2.43版(Raytest，Germany)，定量目標組織和器官。
將3H放射性的水溶性標準實驗溶液與全血一起混合，并用于生成校正標度。標準系列由65.44至0.30nCi/mg的10個稀釋度組成。為了定量的目的，假設所有組織具有與全血類似的密度和淬滅特征。將組織密度設定為1g/ml。將定量限定義為對背景的8次測量的平均濃度值+3倍這些測量的標準偏差值。
在放射自顯影圖上或在對應的組織切片上，鑒別各組織和器官。在該研究中使用的術(shù)語眼色素層包括眼的視網(wǎng)膜色素上皮(其代表含有黑色素的結(jié)構(gòu))、脈絡膜和鞏膜(參見圖14A和14B)。
實施例22用SEQ ID NO.1轉(zhuǎn)染的HUVEC細胞的蛋白印跡如實施例所述，使用2和5nM SEQ ID NO.1或5nM SEQ ID NO.8，轉(zhuǎn)染在Cambrix-EGM2培養(yǎng)基中培養(yǎng)的正常人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)細胞。轉(zhuǎn)染后，將細胞暴露于低氧(1％氧)環(huán)境16小時。在收獲時，在PBS中洗滌細胞，并在含有SDS的裂解緩沖液中裂解(如實施例所述)。將50μg上樣到Tris-醋酸鹽凝膠，并在150V跑1小時。如實施例所述進行蛋白印跡，并將印跡在抗-人-HIF-1a(1∶500)中溫育，然后通過增強化學發(fā)光進行觀察。觀察到SEQ ID NO.1的有效減量調(diào)節(jié)，而雜亂的對照SEQ ID NO.8不減量調(diào)節(jié)HUVEC細胞中的HIF-1a表達。
實施例23體外管形成/毛細管樣結(jié)構(gòu)形成測定使用Matrigel，進行管形成的誘導(Venetsanakos E，MirzaA，F(xiàn)anton C等Induction of tubulogenesis in telomerase-immortalized human microvascular endothelial cells byglioblastomacells.Exp Cell Res 2002；27321-33)。在冰上融化Matrigel，防止過早聚合；將50μl的等分試樣置于96-孔組織培養(yǎng)板(Nunc)的各孔中，在37℃聚合至少30分鐘。通過用胰蛋白酶0.05％-EDTA處理，取出轉(zhuǎn)染的HUVEC細胞。在含有血清的培養(yǎng)基中洗滌細胞，然后重新懸浮成2-×105細胞/ml。在每個培養(yǎng)孔中，加入100-μl轉(zhuǎn)染的或未轉(zhuǎn)染的HUVEC細胞在含有生長因子(VEGF，hFGF-B，R3-IGF-1，hEGF，含有FBS(2％))和肝素的培養(yǎng)基中的懸浮液(n＝10)。使用未處理的、模擬轉(zhuǎn)染的以及用雜亂的對照寡物(SEQ ID NO.8)轉(zhuǎn)染的HUVEC細胞作為對照。在6-10個單獨的孔中，測定對照或?qū)嶒灮衔锏膭┝?，實驗進行至少3次。為了定量管形成，將孔照像(參見圖13)。
實施例24脾、骨髓和外周血中的細胞攝取的FACS分析用SEQ ID NO.1的fam標記形式SEQ ID NO.7(50mg/kg)或等量的Fam amidite分子(3mg/kg)或0.9％鹽水，處理NMRI雌性小鼠(0.025kg)。在注射后1小時，處死動物，從脾、外周血(1ml，向其中加入1ml含有0.1％疊氮化鈉的PBS+50ml硫酸肝素-置于冰上)或骨髓收獲細胞。
脾將脾置于金屬網(wǎng)中，用1ml含有疊氮化物的R10(R10組織培養(yǎng)基，含有10％ FCS)濕潤。將組織壓過網(wǎng)，用共4ml R10+疊氮化物沖洗。取出0.5ml組織懸浮液，拋棄剩余物。通過加入50ml紅細胞裂解緩沖液混合物，裂解懸浮液中的紅細胞，并在室溫放置10min。離心2000rpm 10min。如果需要去除殘余的紅細胞，重復該過程。計數(shù)和封閉細胞。
沉降細胞，并重新懸浮于1.0ml含有疊氮化物的FACS緩沖液中。假定要封閉細胞數(shù)5×106細胞/脾，并加入5μl鼠CD16/CD32/106細胞(加入25μl封閉液)。
外周血通過加入50ml紅細胞裂解溶液，裂解紅細胞。沉降細胞，如果需要，重復該過程。用PBS洗滌細胞一次，重新懸浮，并計數(shù)。通過以5μl/106細胞的比例加入鼠CD16/CD32，封閉非特異性抗體結(jié)合。在室溫放置10min，然后進行譜系染色。
骨髓使用無菌剪刀，離每一端盡可能近地切割骨。將1ml無菌PBS抽入裝有25號針頭的1ml注射器中。將針頭插入骨的一端(通常在膝蓋處最容易)，用PBS沖洗骨。重復，直到骨清潔。將骨髓抽入針頭中數(shù)次，破碎骨髓。如果擔心紅細胞的數(shù)目，可以如上使用裂解步驟。
計數(shù)細胞，并如上封閉。將150,000細胞置于在冰上的無菌埃彭道夫管中，用于骨髓培養(yǎng)。
FACS染色使用特異性的標志，進行譜系染色。如下所述染色1.CD4 APC，CD8 PE FITC，7AAD T-細胞2.Gr-1 PE，f4/80 APC 嗜中性粒細胞，巨噬細胞3.Gr-1 PE，Mac-1APC 髓-單核細胞4.CD34 PE譜系APC 干細胞5.B220 APC，CD19 PE B細胞6.CD11b PE，CD11c APC 樹突細胞同種型7.美國倉鼠IgG1 APCCD11c8.大鼠IgG2a APC CD4，B2209.大鼠IgG2a PEcd8a，CD19，CD3410.大鼠IgG2b PE Gr-1 CD11b在96孔中進行染色，用100μl染色混合物(同種型對照或特異性的譜系標志)對共100μl封閉的細胞染色。染色在冰上進行，并放置30min。將細胞以2000rpm離心2min。吸出上清液，用200μlFACS緩沖液洗滌細胞，重復離心步驟。洗滌共3次。最后，將細胞重新懸浮于200μl FACS緩沖液，并加入FACS試管，后者中已經(jīng)含有200μl FACS+5μl 7AAD。
使用Becton Dickinson FACS Calibur，進行FACS分析(參見圖15)。
顯示在施用SEQ ID NO.7后5天，外周血的內(nèi)皮細胞、粒細胞和CD4+淋巴細胞和巨噬細胞，骨髓的樹突細胞和粒細胞，和脾的粒細胞，對FAM-標記是染色陽性的。
實施例25在短尾猴組織中的Hif-1α和SEQ ID NO.1寡核苷酸含量在短尾猴中進行的主要毒性研究中，將組織(包括肝和腎樣品)快速冷凍，并保藏在-70℃用于后續(xù)分析(參見圖16A和16B)。已經(jīng)通過靜脈內(nèi)注射0，6，10和40mg/kg/次，每周2次，持續(xù)4周，處理猴子。在接受0，10或40mg/kg/次的動物組中，對有些動物追蹤沒有處理的4周恢復期。
如實施例13所述，從樣品提取RNA，如實施例8所述，測量HIF-1amRNA含量(參見圖16A)。如下所述，測量寡核苷酸含量(參見圖16B)。
樣品制備從肝和腎組織提取化學藥品/試劑蛋白酶K(25.1mg/ml)SigmaP4850.
苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1(v/v/v)，用10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA飽和SigmaP2069Igepal CA-630Sigma，I8896.
提取緩沖液0.5％ Igepal CA-630，25mM Tris pH 8.0，25mMEDTA，100mM NaCl，pH 8.0(用1N NaOH調(diào)節(jié))。
1mg/ml在提取緩沖液中的蛋白酶K在每次提取前制備。
稱量組織(約100mg)(在稱量之前和之后，組織保藏在干冰上)。加入500μl含有蛋白酶K(1mg/ml)的提取緩沖液。機械地勻漿組織，將勻漿在37℃溫育過夜。
通過在相關(guān)的濃度范圍，將SEQ ID NO.2溶于提取緩沖液中，制備參照樣品。準確地稱量100mg來自未處理的動物的肝組織(在稱量之前和之后，保藏在干冰上)。將含有參照物的提取緩沖液(含有蛋白酶K，1mg/ml)加入組織樣品，至總體積0.5ml。機械地勻漿組織，將勻漿在37℃溫育過夜。將來自這些樣品的SEQ ID NO.2檢測信號用于制備標準曲線，其涵蓋在處理的動物中發(fā)現(xiàn)的最低和最高濃度。
將組織樣品轉(zhuǎn)移到具有螺帽的2ml微型管。加入1ml苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1(v/v/v))，劇烈搖動5min。通過在4000RPM離心15min，實現(xiàn)相分離。將水相(上面相)轉(zhuǎn)移到新試管(適用于蒸發(fā)器)，向有機相(第一次提取的殘余物)加入500μl Milli-Q-H2O。再次劇烈攪拌試管5min，然后在4000RPM離心15min(SAN039，在115室)。合并水相(來自1.提取和洗滌的水相)，并蒸發(fā)至干(80℃，在氮氣下)。將殘余物重配于200μl Milli-Q-水中，在4000RPM離心15min。將樣品轉(zhuǎn)移于HPLC-瓶，用于分析。
肝和腎組織中寡核苷酸的HPLC分析在提取后，通過離子交換HPLC分析SEQ ID NO.2柱Dionex，DNApac PA1002×50mm(保護)，2×250mm(分析).
柱溫度42℃注射體積50μl洗滌溶劑Milli-Q-H2O清洗溶劑Milli-Q-H2O檢測UV，260nm溶劑緩沖液A1mM EDTA，20mM TRIS-Cl，10mM NaClO4，pH7.6(1N NaOH)緩沖液B1mM EDTA，20mM TRIS-Cl，1M NaClO4，pH7.6(1N NaOH)實施例26使用SEQ ID NO.1的體內(nèi)處理的作用持續(xù)時間通過一次腹膜內(nèi)注射50mg/kg SEQ ID NO.1，處理有毛的小鼠。在給藥后第1和10天(參見圖9C)或在給藥后第1，2，3，4，5和10天(參見圖9B)，處死每組中的5只動物。通過實時QPCR，分析HIF-1αmRNA表達，并相對于GAPDH標準化。
實施例27體內(nèi)眼病角膜模型小鼠和麻醉。BALB/c小鼠6-8周齡。使用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(分別為120mg/kg體重和20mg/kg體重)，麻醉小鼠。
縫合線誘導的炎性角膜新血管形成的小鼠模型。如Streilein JW，Bradley D，Sano Y，SonodaY.Immunosuppressiveproperties oftissues obtained from eyes with experimentally manipulatedcorneas.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1996；37413-424以前所述，使用縫合線誘導的炎性角膜新血管形成(CNV)的小鼠模型。簡而言之，將2-mm-直徑角膜環(huán)鋸輕輕置于麻醉的小鼠的中央角膜上，僅僅為了標記中央角膜區(qū)域。然后，以2個間質(zhì)切口，各自延伸超過120°角膜圓周，間質(zhì)內(nèi)地放置3根11-0縫合線。選擇的縫合線放置的外點為角膜緣和2-mm環(huán)鋸界定的界限之間的中途；內(nèi)縫合線點是在離2-mm環(huán)鋸線相同的距離，以得到標準化的血管生成反應。將縫合線留在原位7天。對小鼠實施安樂死，切離具有角膜緣的角膜，進行flat-mount雙免疫組織化學染色。在摘出術(shù)后在10％低聚甲醛中固定的塑料包埋的角膜的蘇木精曙紅-染色的系列切片中，定量縫合線放置后1周時炎性細胞在正常角膜中的存在和它們向角膜中的募集。另外，為了進一步表征募集到角膜處的炎性細胞，用巨噬細胞標記CD11b對角膜全mount和冷凍切片進行雙免疫組織化學染色。還對切片染色內(nèi)皮細胞(CD31對管染色)，VEGF和VEGFR的標記。
實施例28角膜微袋測定如前所述進行角膜微袋測定(Cao Y，等Vascular endothelialgrowth factor Cinduces angiogenesis in vivo.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998；9514389-14394)。簡而言之，使用改進的線狀刀，建立角膜微袋，并將包被有hydron聚合物(含有200ngVEGF-A164(R&D)或200ng重組bfgf(RDI，F(xiàn)landers，New Jersey，USA))的蔗糖硫酸鋁微粒(0.4×0.4mm)植入每個袋中。將微粒放置在離角膜緣0.6-0.8mm，將該位置覆蓋抗生素軟膏(紅霉素)，并在該位置放置10天(各自n＞5-10小鼠)。如上所述，使用CD31/LYVE-1雙免疫染色，定量血管生成和淋巴管生成反應。對于兩種管類型，以4種類別，半定量地分級下角膜緣和微粒之間的血管和淋巴管生長的最大程度0，無生長；1，小于1/3角膜緣-微粒距離的生長；2，1/3至2/3角膜緣-微粒距離的生長；3，達到微粒的管。
實施例29體內(nèi)銀屑病模型體內(nèi)人皮膚/SCID小鼠嵌合體按照yWrone-Smith T，Nickoloff BJDermal injection ofimmunocytes induces psoriasis.J Clin Invest 1996，981878-1887以前所述的方法，將人皮膚異種移植物常位地移植到7至8周齡SCID小鼠(Taconic，DK)。簡而言之，用可吸收的5-0 Vicryl Rapide縫合線(Ethicon，Somerville，NJ)，將測量為1.5×1.5×0.5cm的人皮膚異種移植物縫合到SCID小鼠的側(cè)腹，并用三溴酚鉍輔料(Kendall Co.，Mansfield，MA)覆蓋。1周后去除敷料，在研究中維持動物無病原體。移植后1-3周，用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7處理小鼠，每周2次，劑量為50mg/kg。處理2-3周后，殺死人皮膚/SCID小鼠嵌合體，從每個異種移植物得到4-mm打孔活檢(Baker′s活檢穿孔器，Cummins Derm，Miami，F(xiàn)L)。將活檢組織固定在中性-緩沖福爾馬林中用于石蠟包埋，和/或封固在西黃蓍膠上(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)，在液氮冷卻的異戊烷中快速冷卻，并保藏在-80℃。
免疫染色對皮膚的冷凍切片染色相關(guān)標記，包括內(nèi)皮細胞(CD31/CD34)，巨噬細胞(cd11b)VEGF，VEGFR或HIF-1a。用蘇木精和曙紅復染切片(如前所述)。檢查所有載玻片，并照像。
序列表<110>Santaris Pharma A/s<120>有效抑制HIF-1A表達的LNA寡核苷酸<130>16372PCT00<160>39<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>1tggcaagcat cctgta16<210>2<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵
<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>2gttactgcct tcttac16<210>3<211>15<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>3tggcaagcat cctgt 15<210>4<211>15<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>4gttactgcct tctta 15<210>5<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>5tggcaagcat cctgta16<210>6<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>6tggcaagcat cctgta16<210>7
<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>7tggcaagcat cctgta16<210>8<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>8cgtcagtatg cgaatc16<210>9<211>16<212>DNA<213>人工
<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>9tggcaaacat cctgta16<210>10<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>mnisc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>10tgacaagcat ccagta16<210>11<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(4)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(16)<223>LNA修飾的核苷酸<400>11tggtgaggct gtccga16<210>12<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(4)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(12)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(16)<223>LNA修飾的核苷酸<400>12ttgcggactc ggatgg16<210>13<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<400>13tggcaagcat cctgta16<210>14<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(14)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>5-甲基修飾的LNA胞嘧啶<400>14ttcctatgct gtatcc16<210>15<211>15<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(16)<223>LNA修飾的核苷酸<400>15tggcaagcat cctgt 15<210>16<211>14<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(13)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(13)<223>LNA修飾的核苷酸<400>16ggcaagcatc ctgt 14<210>17<211>15<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>17gttactgcct tctta 15<210>18<211>14<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(14)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(13)<223>LNA修飾的核苷酸<400>18ttactgcctt ctta 14<210>19<211>15<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(14)<223>硫代磷酸酯鍵
<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(14)<223>LNA修飾的核苷酸<400>19tggcaagcat cctgt 15<210>20<211>16<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3)<223>LNA修飾的核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>硫代磷酸酯鍵<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(15)<223>LNA修飾的核苷酸<400>20cgtcagtatg cgaatc16<210>21<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>21ctcatccaag aagccctaac gtgtt 25<210>22<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>22gctttctctg agcattctgc aaagc 25
<210>23<211>35<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>23cctcaggaac tgtagttctt tgactcaaag cgaca 35<210>24<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>24gcttaccatc agctatttgc gtgtg 25<210>25<211>25<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>25gaaccataac aaaaccatcc aaggc 25<210>26<211>35<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>26tcatcttcaa tatccaaatc accagcatcc agaag 35<210>27<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>27
aaggctgtgg gcaaggtcat c 21<210>28<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>28gtcagatcca cgacggacac att23<210>29<211>34<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>29gaagctcact ggcatggcat ggccttccgt gttc34<210>30<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>30tgggactttc ttttaccatg c 21<210>31<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>31ggagtgttta cgttttcctg aag23<210>32<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>32ccttccttct tgggtatgga a 21<210>33<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>33gctcaggagg agcaatgatc t 21<210>34<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>34cacgacagaa ggagagcaga agtc 24<210>35<211>23<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>35gtcggggtac tcctggaaga tgt23<210>36<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>36gccctgtgga tgactgagta20<210>37<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>37cagccaggag aaatcaaaca g 21<210>38<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>38agcctcgtcc cgtagacaaa at 22<210>39<211>24<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>39gttgatggca acaatctcca cttt 2權(quán)利要求
1.LNA寡核苷酸，其由選自下述的序列組成5′-(Tx)GxGxcsasasgscsastscscsTxGxT-3′(SEQ ID NO.3)和5′-(Gx)TxTxascstsgscscststscsTxTxA-3′(SEQ ID NO.4)其中大寫字母代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物，小寫字母代表2-脫氧核苷酸，下劃線代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物或2-脫氧核苷酸，下標″s″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵，且下標″x″代表相鄰核苷酸/LNA核苷酸類似物之間的硫代磷酸酯鍵或磷酸二酯鍵，且其中在括號中的核苷酸單元各自代表可選存在的單元，且其中所述序列可選地延伸至多5個2-脫氧核苷酸單元。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的LNA寡核苷酸，其中分別存在括號中的核苷酸單元(Tx)或(Gx)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中的任一項的LNA寡核苷酸，其中標有下劃線的核苷酸單元之一或兩者代表β-D-氧-LNA核苷酸類似物。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項的LNA寡核苷酸，其中所述LNA寡核苷酸由15，16，17，18，19或20個選自2-脫氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸類似物的核苷酸單元組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的LNA寡核苷酸，其中所述LNA寡核苷酸由16個選自2-脫氧核苷酸和β-D-氧-LNA核苷酸類似物的核苷酸單元組成。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項的LNA寡核苷酸，其中所述序列在3′-末端延伸一個2-脫氧核苷酸單元。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項的LNA寡核苷酸，其中序列中的所有核苷酸單元都通過硫代磷酸酯基團連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的LNA寡核苷酸，它選自5′-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3′(SEQ ID NO.1)，5′-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsT-3′(SEQ ID NO.15)，和5′-GsGscsasasgscsastscscsTsGst-3′(SEQ ID NO.16)
9.根據(jù)權(quán)利要求8的LNA寡核苷酸，它是5′-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3′(SEQ ID NO.1)，
10.根據(jù)權(quán)利要求1的LNA寡核苷酸，它選自5′-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3′(SEQ ID NO.2)，5′-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsA-3′(SEQ ID NO.17)，和5′-TsTsascstsgscscststscsTsTsa-3′(S EQ ID NO.18)
11.根據(jù)權(quán)利要求10的LNA寡核苷酸，它是5′-GsTsTsascstsgscscststscsTsTsAsc-3′(SEQ ID NO.2)，
12.綴合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-11中的任一項的LNA寡核苷酸和至少一個共價結(jié)合到所述LNA寡核苷酸上的非核苷酸或非多核苷酸部分。
13.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物，和可藥用的稀釋劑、載體或輔劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的藥物組合物，其包含水性載體，所述載體包含用于將pH維持在4.0-8.5范圍內(nèi)的緩沖劑，并具有20-2000mM的離子強度。
15.根據(jù)權(quán)利要求13-14中的任一項的藥物組合物，它適用于眼內(nèi)給藥。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中的任一項的藥物組合物，還包含至少一種化療劑。
17.權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物用作藥物。
18.權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物在制備治療癌癥的藥物中的應用。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的應用，其中所述癌癥是實體瘤的形式。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的應用，其中所述癌癥選自多發(fā)性骨髓瘤，腎癌，子宮頸癌，結(jié)腸癌，腦癌，和乳腺癌。
21.治療癌癥的方法，所述方法包括，將權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物或權(quán)利要求13-16中的任一項定義的藥物組合物施用給有此需要的患者。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述癌癥選自多發(fā)性骨髓瘤，腎癌，子宮頸癌，結(jié)腸癌，腦癌，和乳腺癌。
23.權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物在制備藥物中的應用，所述藥物用于治療選自下述的疾病動脈粥樣硬化，銀屑病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，類風濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘，炎性腸病，疣，變應性皮炎，炎癥，和皮膚炎癥。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的應用，其中所述疾病選自炎性腸病、銀屑病和類風濕性關(guān)節(jié)炎。
25.治療選自下述的疾病的方法動脈粥樣硬化，銀屑病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，類風濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘，炎性腸病，疣，變應性皮炎，炎癥，和皮膚炎癥，所述方法包括，將權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物或權(quán)利要求13-16中的任一項定義的藥物組合物施用給有此需要的患者。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述疾病選自炎性腸病、銀屑病和類風濕性關(guān)節(jié)炎。
27.治療患有或易患由異常血管發(fā)生造成的疾病的哺乳動物的方法，其包括給哺乳動物施用治療有效量的權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物。
28.抑制血管發(fā)生的方法，其包括施用權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物或權(quán)利要求13-16中的任一項定義的藥物組合物。
29.誘導細胞凋亡的方法，其包括施用權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物或權(quán)利要求13-16中的任一項定義的藥物組合物。
30.防止細胞增殖的方法，其包括施用權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物或權(quán)利要求13-16中的任一項定義的藥物組合物。
31.治療血管發(fā)生性疾病的方法，其包括施用權(quán)利要求1-11中的任一項定義的LNA寡核苷酸或權(quán)利要求12定義的綴合物或權(quán)利要求13-16中的任一項定義的藥物組合物，從而抑制與血管發(fā)生性疾病有關(guān)的血管發(fā)生。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述血管發(fā)生性疾病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病，黃斑變性，和炎性疾病。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述血管發(fā)生性疾病是選自炎性腸病、銀屑病和類風濕性關(guān)節(jié)炎的炎性疾病。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述血管發(fā)生性疾病是黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病。
全文摘要
本發(fā)明涉及LNA寡核苷酸，其由選自5′－(
文檔編號A61K31/7125GK101068826SQ200580041216
公開日2007年11月7日 申請日期2005年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月9日
發(fā)明者F·W·拉斯馬森, M·韋斯特加德, H·F·漢森, C·A·斯魯 申請人:桑塔里斯制藥公司