專利名稱：利用磁性顆粒的干細胞靶向的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用磁性離體(用于回輸)或者體內處理干細胞的方法以及與其相關的治療方法。
以基于細胞治療形式的干細胞的應用是目前疾病治療和修復醫(yī)學方面最令人興奮和有前景的領域。顯然，對可控制例如胚胎和成人干細胞的增殖和分化的方式的基礎研究是極其重要的。
美國專利第6,548,264號公開了硅石包被的納米顆粒，該納米顆粒包括磁性金屬核心。存在于該顆粒中的磁性核心使該顆粒對磁場作出反應，由此該顆?？捎迷谠\斷、成像和記錄系統(tǒng)中。但是，現(xiàn)有技術的納米顆粒可能有這樣的缺點，即它們沒有在細胞水平上確定活化的方法。
磁珠扭曲細胞計數(shù)(magnetic bead twisting cytometry)已用于確定單個細胞的機械屬性，并且證實外部的機械力通過如整合素的跨膜細胞粘附分子可跨過細胞表面?zhèn)魉筒⒋┻^細胞骨架，參見，例如Wang，N和Ingberger，DE(1995)Probing transmembrane mechanical coupling andcytomechanics using magnetic twisting cytometry(利用磁扭曲細胞計數(shù)探測跨膜機械耦合和細胞機械學).Biochem.Cell Biol.73327-335。
在生物相容磁性納米顆粒合成、表征1-3和健康護理領域4-6中新的磁技術應用方面已有很多進展。這項工作主要涉及研究藥物的控制和定向輸送。在這些系統(tǒng)中，治療性藥物或基因可附著到磁性載體顆粒(通常為聚合物包被的磁鐵礦)，隨后通過使用空間聚焦、高梯度磁場使它們在體內的目標位點集中。一旦藥物/載體復合物在目標位點積累，藥物在該位點的釋放和吸收增強。已進行了新方法的研究，這些新方法用于基因治療的磁靶向以及理論性和試驗性檢驗和改進磁性微顆粒和納米顆粒在體外和體內模型系統(tǒng)中4，6的沉積。
其中多位研究人員7，8描述了采用扭矩將力施加到細胞膜上或其中將張力施加到如RGD或膠原分子的跨膜蛋白上的短期實驗。這些實驗采用膜的“機械”刺激引發(fā)多種細胞內鈣流動。已知，采用其它技術的機械信號可在引發(fā)骨髓基質細胞到成骨細胞的分化途徑11，特別地，低水平的跨膜機械信號可上調成骨細胞特異的轉錄因子如cbfal和cfos的表達和DNA結合活性12，13。
在這些研究中，可將力施加到數(shù)個不同的標記受體上。已經闡明我們怎樣能影響下游過程和增強抗原和其它基質蛋白的合成15。采用骨髓衍生的已調節(jié)成沿成骨和軟骨生成細胞分化的間充質干細胞，我們已經研究了下游基因表達調節(jié)對特異受體的磁性顆?；罨姆磻?。初步的數(shù)據(jù)顯示出應答人間充質干細胞中鈣通道的磁性顆粒刺激的Runx 2上調，接著有機械敏感的基質蛋白骨橋蛋白的上調。此外，我們有證據(jù)表明在刺激單層人去分化軟骨細胞后上調SOX 9。這些研究延伸到長期培養(yǎng)過程中細胞播種骨架的3D分析，以研究這些策略在體外組織工程中的結構構建中的應用。另外，包括顆粒數(shù)量和施加的力的數(shù)量效應分析的初步研究鼓舞人心，并表現(xiàn)出增加的基質合成和成骨表型的表達14。
骨髓含有能尤其分化為成纖維細胞、成骨細胞、成脂肪細胞和網織細胞的多潛能基質干細胞或間充質干細胞。這些間充質干細胞，例如人骨髓基質成纖維細胞可從自愿供血者分離并保持它們的多譜系(脂肪細胞的、軟骨形成的、成骨細胞的)潛能。使用和操作前述細胞的一個優(yōu)點在于它們無免疫原性，這為這些細胞尤其用于軟骨和骨修復提供了可能性。
到目前還未公開的我們同時待批的國際專利申請PCT/GB2003/002624將磁性納米方法與機械敏感離子通道特別是TREKK+通道方面的知識組合起來。已知TREK通道存在于成骨細胞、軟骨形成細胞和骨髓基質細胞中。為了更加精密地確定控制活化的特定受體的定向，我們采用了HIS標記的TREK基因的克隆。HIS標簽插到TREK分子的特定區(qū)域以便結合有HIS抗體或NI2+的磁性顆粒的附著，隨后其可采用磁場遠程扭轉。將細胞膜內外的離子通道蛋白位點加上標簽，以此方式，我們鑒定了分子的機械敏感區(qū)以及開關下游過程所需的信號頻率。圖2顯示了采用骨髓基質細胞的實驗結果，作為向附著到His標記的TREK通道的磁性納米顆粒施加磁場的結果，內鈣水平上調了。
已顯示，尤其是通過能將磁場在體外施加到2D單層培養(yǎng)物和3D細胞種植骨架的磁力生物反應器的開發(fā)，可得到體外調節(jié)性結締組織細胞。
但是，無論美國‘264還是Wang都沒有解決或甚至指出圍繞兩基礎性問題的難題，而該問題需要解決，其圍繞著工程細胞的臨床應用的終極目標，即(i)細胞怎樣定向到修復位點并保持在該位點；以及(ii)細胞如干細胞在體外和/或體內怎樣調節(jié)或分化。
令人吃驚的是，現(xiàn)在我們發(fā)現(xiàn)了通過外部磁操作可將用磁性納米顆粒標記的干細胞輸送或保持在特定位點的方法。另外，我們還將這些概念進一步發(fā)展，以包括遠程活化特異的細胞膜受體，其實際上涉及細胞如干細胞的定位。簡言之，這涉及干細胞在一位點如修復位點的沉積、將細胞保持在該位點以及遠程原位活化患者體內細胞。
具體而言，本發(fā)明解決了細胞上特異受體靶向的問題，用于遠程活化干細胞中跨膜離子通道。重要的是，基于磁性納米顆粒的技術越來越多地用在臨床健康護理的很多方面，例如用于MRI的相差增強。
在本發(fā)明中，我們實現(xiàn)了這些細胞類型的早期分化。另外，該實現(xiàn)的分化作為結合性策略的模型，其允許在體內遠程靶向和/或當定位后在特異位點活化。
因此，本發(fā)明使人骨髓干細胞中存在的多種干細胞受體類型，諸如機械活化的離子通道例如K+通道(TREK)、鈣通道、整合素以及表面膜結合位點如RGD的靶向成為可能。重要的是，這些受體具有遠程活化的可能。也可以實現(xiàn)其它已知的對干細胞分化重要的受體的靶向，這些受體例如已顯示出活化下游轉錄因子如Runx和Osterix的外部的生長因子(例如TGFB和BMP2)。
因此，本發(fā)明提供了尤其是人間充質干細胞的真正植入、對受傷或修復位點的干細胞的長期生物作用的機會。另外，采用磁性納米顆粒選擇、擴充和分化這些細胞以及靶向這些細胞的能力特別具有優(yōu)勢。此外，本發(fā)明的應用具有治療性含義，尤其是在基因治療和組織工程方面。
主要由具有硅石、葡聚糖或PVA包被的磁鐵礦(Fe3O4)和/或磁赤鐵礦(Fe2O3)核心組成的生物相容磁性納米顆?？捎迷诒景l(fā)明中。這些顆粒可用本領域中已知的方法合成。但是，應理解的是，也可使用其它的磁性納米顆粒。顆粒大小可從約10nm到數(shù)微米，例如1-10μm。也可以使用可購得的具有不同表面化學性質的磁性微顆粒和納米顆粒。包被層可官能化并與如上所述的那些的膜附著部分(motifs)交聯(lián)。可對磁性納米顆粒進行修飾以便尤其是定制欲檢查的顆粒內在頻率，結合效率和穩(wěn)定性，以及檢查結合對細胞活存性和功能的影響。修飾還可包括內結合位點以及外膜上位點的定制。多種包被層可用于磁性納米顆粒在人成骨細胞中的結合和加載14，15，并且這些技術可進一步優(yōu)化干細胞的結合、輸送和活化，例如采用成人原始髓人干細胞和/或胚胎干細胞。
靶向通常已知的高梯度磁體，例如外源性稀土(主要為NdFeB)高梯度磁體可用于將干細胞靶向到體外測試系統(tǒng)和/或體內特定位點。顯然，本發(fā)明優(yōu)選在體內將干細胞靶向。這些磁體產生高場/梯度產物，其對裝載進細胞中的磁性顆粒產生平移力，按照下式將它們保持在靶位點Fmag=(X2-X1)V1μ0B(▿B).]]>活化可采用例如磁調節(jié)性生物反應器實現(xiàn)遠程機械活化。這些本身為已知的生物反應器可將力施加到附著在體外多孔2D系統(tǒng)中或體內基于3D骨架的系統(tǒng)中培養(yǎng)的細胞的磁性顆粒上。如間充質干細胞的干細胞和其產生的細胞群，例如成骨細胞、軟骨形成細胞和脂肪形成細胞群可采用如STRO-1的單克隆抗體利用本身為已知的標準方法14通過磁活化細胞分選(MACS)進行分離。這些方法包括那些已知用于BMSc單層培養(yǎng)的方法和采用由諸如聚乳酸(PLLA)或膠原凝膠的生物可降解聚合物組成的3D骨架的方法21。
現(xiàn)在我們已發(fā)現(xiàn)將干細胞選擇性活化和/或靶向的方法，其隨后可使細胞以遠程方式被機械操作。
術語“以遠程方式”是指例如非接觸性方式，以及在從體外進行體內的特異地活化/靶向的情況下。
因此根據(jù)本發(fā)明，我們提供了體內或體外磁操作干細胞的方法，其包括將能磁化的顆粒與干細胞結合。
該方法可包括體內過程的離體操作。此外，技術人員應理解的是細胞應被解釋成包括多種細胞。
更具體地，本發(fā)明提供了如前所述的方法，其包括結合有如上所述的干細胞的磁化顆粒的活化和/或靶向。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，我們提供了磁操作干細胞的方法，其包括將可磁化顆粒結合到細胞，特征在于該方法通過將可磁化顆粒結合到細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，我們提供了如前所述的方法，其包括分化步驟。
在本發(fā)明的這一方面，可磁化顆?？芍苯优c細胞結合?；蛘?，該方法包括將可磁化顆粒與抗體、酶等結合，隨后與細胞結合。
可磁化顆粒與細胞的結合可包括將這種顆粒引入細胞、將這種顆粒附著到細胞，如細胞外部或內部，或其任意組合。因此，可磁化顆?？杉毎麅冉Y合或細胞外結合或為細胞內和細胞外結合的組合。但是，在本發(fā)明優(yōu)選的方式中，該顆粒為細胞內結合。
當本發(fā)明的方法包括細胞內結合，這將包括與內結合位點的結合。僅舉例來說，對于TREK-1，顆?？膳c離子通道的N末端區(qū)結合。可選擇地，顆粒可與離子通道的COOH末端區(qū)結合。本領域技術人員可理解的是，多種離子通道和連接位點可用在本發(fā)明的方法中。因此，可以采用與可在TREK-1中看到的離子通道的N末端區(qū)對應的或與可在TREK-1中看到的離子通道的COOH末端區(qū)對應的內結合位點以及其它本身為已知的結合位點。
因此，我們還提供了操作機械敏感離子通道的方法，特征在于該方法包括將可磁化顆粒與離子通道直接或間接結合。
本發(fā)明的方法可包括操作哺乳動物細胞或其它細胞類型，例如細菌細胞、植物細胞等。但是，技術人員應理解的是本發(fā)明的方法可用于操作這里未提到的其它細胞類型。此外，該方法可為體外方法或體內方法，盡管優(yōu)選體內方法。
本發(fā)明的方法可包括在干細胞中上調或下調基因表達，以應答如上所述的干細胞的機械操作。通過操作基因表達模式或水平，干細胞可被引導延如本文所述的特定的分化途徑分化。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括遠程操作細胞和/或激動或拮抗離子通道，例如從體外進行操作，即遠程機械活化。
本發(fā)明的方法可用于多種本身為已知的細胞。但是，優(yōu)選地，本方法適用于哺乳動物干細胞。
本發(fā)明的方法可用于如上所述的任何通常已知的細胞內離子通道。該方法特別適用于機械敏感離子通道。這些機械敏感離子通道已在很多細胞類型中得到鑒定并主要描述為鈣或鉀離子通道，但應理解的是本發(fā)明的方法并不限于用在鈣或鉀離子通道。僅舉例來說，一種神經細胞內已經在分子水平和功能水平上很好表征的這樣的通道是染色體基因TREK-1，它是2P K+通道家族的一部分。TREK-1通道曾在骨細胞中鑒定，并已知應答剪切力、細胞膨脹和膜拉伸以及如脂肪酸和普通麻醉劑的其它外源試劑。
本發(fā)明的特別方面是提供操作機械敏感離子通道的方法。
這些“機械敏感”離子通道存在于多種哺乳動物如人和細菌細胞中，本發(fā)明使細胞在體內和/或細胞培養(yǎng)物中選擇性的活化，參見，例如Sokabe，M，F(xiàn) Sachs，A Jing(1991)Quantitative video microscopy of patch clampedmembranesStress，strain，capacitance，and stretch channel activation(膜片鉗膜的定量圖像顯微方法壓力、張力、容量和伸展的通道活化).Biophys J.59722-728；Stewart，Z，B Martinac and J Dobson(2000)Evidence formechanosensitive transmembrane ion channels of small conductance inmagnetotactic bacteria(磁性趨向細菌中小電導的機械敏感跨膜離子通道的證據(jù)).Electro-and Magnetobiol.1981-89。由于這些通道在正常細胞功能中有作用并在例如骨和結締組織的產生或外圍神經系統(tǒng)的活化中其特別重要的作用，因此能夠遠程操作，例如從體外進行操作對用于尤其是疼痛緩解如麻醉劑、治療劑、組織工程和修復以及腫瘤治療特別有利。
在本發(fā)明的另一方面中，通過將通道轉染進否則就不應答的細胞，該方法還可適用于通常非機械敏感的細胞和/或離子通道。
所有的離子通道在受力時會開放和關閉(即改變構象狀態(tài))，這是離子通道活化的原理。對于機械敏感離子通道來說，該受力導致膜變形，觸發(fā)通道的開放。電壓門和配體門控離子通道也是“機械應答的”，因為它們對庫侖力(對于電壓門離子通道)和結合力(對于配體門離子通道)引起的離子通道上的機械張力做出應答。由此，所有的離子通道可用本文描述的方法活化，只要可磁化顆粒直接或間接地偶合到通道蛋白的機械應答區(qū)。
因此，在本發(fā)明的一個方面中，離子通道為電壓門控離子通道，或者，離子通道為配體門控離子通道。
大量的各種不同的顆?？捎迷诒景l(fā)明的方法中。用在本發(fā)明方法中的可磁化顆粒可以是固有磁性的，或可選地，可以是在磁場中作出反應的顆粒。一般而言，任何磁性材料都可以采用，但是對于術語磁性，我們指例如順磁性的超順磁性的、鐵磁性的和/或反鐵磁性的材料，其實例包括元素鐵(Fe)或化合物，例如鐵鹽，諸如磁鐵礦(Fe3O4)、磁赤鐵礦(γFe2O3)和硫復鐵礦(Fe3S4)，或鉻化合物，例如鉻鹽，諸如氧化鉻(CrO2)，或上述任何組合。優(yōu)選的磁性材料包括顆粒，例如納米顆粒，其包括具有生物相容包被的磁性核心。因此，這些優(yōu)選的顆粒為納米顆粒，特別是具有核心和包被該核心的例如硅石殼的納米顆粒。但是，還可以是在核心內具有多個磁性中心的多孔顆粒。這些顆粒的實例為描述在美國專利6,548,264中的那些納米顆粒，將該專利引入本文作為參考。因此，現(xiàn)有技術的納米顆?？删哂行∮?微米的平均尺寸，每一所述納米顆粒包括(a)包括可磁化顆粒的核心和(b)包被該核心的硅石殼，其中可磁化顆粒為上述磁性材料。
微顆粒和納米顆粒(待附著到細胞)通常為大致的球形或橢圓形。顆粒的尺寸可尤其是按照可磁化材料的性質、應用等進行改變。但是，顆粒的例子可以是納米顆粒，其具有的平均尺寸如直徑為5000nm或更小，例如1nm-5000nm，優(yōu)選1nm-1000nm，更優(yōu)選1nm-1000nm，或2nm-10nm)。
用于附著到細胞的顆?？梢杂谢驘o包被層的、單結構域或多結構域。合適的顆粒的例子包括但不限于(i)Spherotech，Inc提供的有包被層的磁性微球(d＝4μm)。這些微球由包被有聚合物的磁塊狀核心(magnetically blocked core)組成。
(ii)單一結構域、摻有鐵氧體(Ferrite)的硅石納米顆粒，具有可調的尺寸(d＝50-300nm)和窄尺寸分布。
在本發(fā)明的方法中，通過將上述的可磁化顆粒附著到細胞膜的特異區(qū)域和/或離子通道自身的特異“受體”上可活化所述的離子通道。因此，隨后活化通道所需的機械力可通過作用到這些磁性顆粒上的磁場進行遠程施加。
特別是，本發(fā)明的方法包括通過將一種或多種識別細胞內關鍵細胞元件的特異抗體或蛋白質結合基序(motif)標記到顆粒而對上述的可磁化顆粒進行修飾。這些包括跨膜粘附分子，例如整合素、鈣粘素、選擇素以及免疫球蛋白或分散的膜粘附蛋白如RGD(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸)，參見，例如J.Chen，B.Fabry，E.L.Schiffrin，和N.Wang(2001)Twisting integrin receptors increases endothelin-1 gene expression inendothelial cells(扭曲整合素受體來增加內皮細胞中內皮素-1的基因表達)Am J Physiol Cell Physiol 2801475-84；A.R.Bausch，U.Hellerer，M.Essler，M.Aepfelbacher，and E.Sackmann(2001)Rapid stiffening of integrinreceptor-actin linkages in endothelial cells stimulated with thrombinamagnetic bead microrheology study(由凝血酶刺激的內皮細胞中整合素受體-肌動蛋白連接的快速鋼化磁株流變學研究)Biophys J 802649-57；Cartmell SH，J Dobson，S Verschueren，A El Hai(2002)Development ofmagnetic particle techniques for long-term culture of bone cells withintermittent mechanical activation(利用間歇機械活化開發(fā)用于骨細胞長期培養(yǎng)的磁顆粒技術).IEEE Transactions on NanoBioscience 192-97。
本發(fā)明的方法是特別有利的，因為它提供了治療多種病癥的方法。實際上本發(fā)明提供了治療方法，其可應用到一種或多種離子通道在其中起作用的任何病癥。此外，本發(fā)明提供了潛在控制離子通道活化包括疼痛緩解如麻醉作用的方法。
因此根據(jù)本發(fā)明，我們提供了治療患有其中離子通道起作用的病癥的患者的方法，其包括向這種患者施用如上所述的可磁化顆粒并利用磁場操作這些顆粒。
上述的治療方法不應被理解為限制到組織和/或骨修復，而是在組織和/或骨修復中特別有利。通過向身體的靶標區(qū)提供疼痛緩解，例如用于局部麻醉的方法，該治療方法可用于促進進一步的治療。
這些細胞的性質可隨目標組織的性質而變化。例如用于生長新的韌帶的細胞可為韌帶細胞，肌腱細胞用于生長新的肌腱?？蛇x擇地，細胞可以是軟骨細胞和/或其它基質細胞，例如軟骨細胞祖細胞。
因此本發(fā)明的方法可包括組織再生或諸如皮膚、軟骨、韌帶、肌腱、肌肉或骨的人工組織產生。
可選擇地，所述方法可包括傷口愈合和/或組織粘附。
在優(yōu)選的實施方案中，該方法可包括骨修復和/或骨生長。
在另一備選方案中，本發(fā)明的方法可包括例如牙科應用和/或獸醫(yī)應用。
所述方法還可用作在體內選擇性殺傷細胞(例如腫瘤細胞)的途徑。這時，可磁化顆粒附著到靶細胞膜或離子通道蛋白，且磁場施加到體內靶區(qū)。細胞膜中離子通道快速的進行開放和關閉循環(huán)(通過應用隨時間變化的磁場)和/或保持關閉(通過應用靜態(tài)磁場)使離子(例如Ca++)涌入細胞，引起滲透壓休克，接著細胞死亡。
因此，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，我們還提供了破壞細胞或抑制細胞生長的方法，其包括通過將可磁化顆粒結合到細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道。
所述方法可包括誘導細胞滲透壓休克的方法，例如通過將可磁化顆粒結合到細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道。該方法在治療或減少腫瘤細胞如癌癥細胞方面特別有用。
因此，所述方法可包括通過采用靶向的靜態(tài)磁場保持離子通道開放而殺死細胞?；蛘?，該方法可包括通過采用靶向的隨時間變化磁場使離子通道進行開放和關閉的循環(huán)而殺死細胞。
在本發(fā)明的方法中，磁場可尤其隨待治療病癥的性質而變化，但可為例如0.1-10Hz的頻率。然而，也可采用這個范圍之外的頻率。磁場將典型地具有(但不限于)10mT-1400mT數(shù)量級的通量密度。
在本發(fā)明的方法中，可在體外產生體內應用的磁場，且可由永磁體或電磁體產生。該磁場可以為恒定或可變場，例如永磁體可相對所述細胞移動。對于電磁體，磁場可通過向電磁體提供合適的電流水平而產生，可任意地與交變電流組合。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，我們提供了在細胞中誘導治療作用的方法，其包括通過將可磁化顆粒結合到細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道并磁操作該可磁化顆粒。
另外，我們提供了治療方法，其包括施用治療性活性試劑，該活性設計與激動或拮抗細胞內離子通道的可磁化顆粒同時、分開或依次施用。
我們還提供將治療性活性試劑定向到細胞的方法，其包括通過將可磁化顆粒結合到細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道，磁操作該可磁化顆粒并同時、分開或依次施用治療性活性試劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，我們還提供了可磁化顆粒在磁操作體內細胞方法中的應用。
所述應用可包括體內過程的離體操作。更加具體地，本發(fā)明提供可磁化顆粒在制備用于磁操作細胞的系統(tǒng)中的應用，該系統(tǒng)包括將可磁化顆粒結合到細胞并激動或拮抗細胞內的離子通道。
在本發(fā)明的這一方面中，可磁化顆粒可直接與細胞結合?？蛇x擇地，所述應用包括將可磁化顆粒與抗體、酶等結合，其隨后與細胞結合。
當本發(fā)明的應用包括細胞內結合時。僅舉例說明，對于TREK-1，顆粒可與該離子通道的N末端區(qū)結合?？蛇x擇地，顆?？膳c該離子通道的COOH末端區(qū)結合。
本發(fā)明的應用包括操作哺乳動物細胞或其它細胞類型，例如細菌細胞、植物細胞等。該應用可以為體外應用或體內應用，盡管優(yōu)選體內應用。
優(yōu)選地，本發(fā)明的應用包括操作細胞和/或激動或拮抗離子通道，例如從體外操作，即遠程機械活化。
本發(fā)明的應用可應用到多種本身為已知的細胞。但是，優(yōu)選該應用適用于哺乳動物體細胞，例如骨、軟骨、肌肉(骨骼肌和心肌)、淋巴細胞、內分泌細胞、泌尿系統(tǒng)細胞、與生殖系統(tǒng)有關的細胞、神經細胞和腫瘤細胞。
本發(fā)明的應用可用于如前所述的細胞內任何通常已知的離子通道。該應用特別適用于上述的機械敏感離子通道。
本發(fā)明的特別方面是提供在制備用于操作機械敏感離子通道的系統(tǒng)中的應用。
在本發(fā)明的另一方面中，通過將通道轉染進否則就不應答的細胞，該應用還適用于通常為非機械敏感細胞和/或離子通道。
在本發(fā)明的一個方面中，所述的離子通道為電壓門控離子通道，或者，所述離子通道為配體門控離子通道。
大量的各種不同的顆粒可用在本發(fā)明的應用中。一般而言，任何磁性材料都可以采用，其例子包括元素鐵(Fe)或鐵化合物，例如鐵鹽，諸如磁鐵礦(Fe3O4)、磁赤鐵礦(γFe2O3)和硫復鐵礦(Fe3S4)，或鉻化合物，例如鉻鹽，諸如氧化鉻(CrO2)，或上述的任何組合。優(yōu)選的磁性材料包括顆粒，其包括具有生物相容包被層的磁性核心。因此，這些優(yōu)選的顆粒為納米顆粒，特別是具有核心和包被該核心的例如硅石殼的納米顆粒。但是，還可以是在核心內具有多個磁性中心的多孔顆粒。這些顆粒的例子為描述在美國專利6,548,264中的那些納米顆粒，將該專利引入本文作為參考。
特別是，本發(fā)明的應用包括通過將一種或多種識別細胞內關鍵細胞元件的特異抗體或蛋白質結合基序連接到所述顆粒而對上述的可磁化顆粒進行修飾。這些包括跨膜粘附分子，例如整合素、鈣粘素、選擇素以及免疫球蛋白或如RGD(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸)的分散的膜粘附蛋白。
本發(fā)明的應用是特別有利的，因為它提供了適用于用在多種病癥治療中的系統(tǒng)。實際上本發(fā)明提供了在制備適用于治療的藥物中的應用，其可應用到一種或多種離子通道在其中起作用的任何病癥。此外，本發(fā)明提供了潛在控制離子通道活化的應用包括疼痛緩解如麻醉作用。
因此根據(jù)本發(fā)明，我們提供了可磁化顆粒在制備藥物中的應用，該藥物適用于治療患有離子通道在其中起作用的病癥的患者，其包括向這種患者施用如上所述的可磁化顆粒并利用磁場磁場操作這些顆粒。
上述的應用不應被理解為限制到組織和/或骨修復，而是在組織和/或骨修復中特別有利。通過向身體的靶區(qū)提供疼痛緩解的方法，例如用于局部麻醉，該應用可用于促進進一步的治療。
這些細胞的性質可隨目標組織的性質而變化。例如用于生長新的韌帶的細胞可為韌帶細胞，肌腱細胞用于生長新的肌腱。可選擇地，細胞可以是軟骨細胞和/或其它基質細胞，例如軟骨細胞祖細胞。
因此所述應用可包括組織再生或人工組織如皮膚、軟骨、韌帶、肌腱、肌肉或骨的產生。
可選擇地，所述應用可包括傷口愈合和/或組織粘附。
在優(yōu)選的實施方案中，所述應用可包括骨修復和/或骨生長。
在另一備選方案中，本發(fā)明的應用可包括例如牙科應用和/或獸醫(yī)應用。
所述應用還可用作如上所述在體內選擇性殺傷細胞(例如腫瘤細胞)的途徑。
因此，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，我們還提供了可磁化顆粒在制備一系統(tǒng)中的應用，該系統(tǒng)用于破壞細胞或抑制細胞生長，其包括通過將可磁化顆粒結合到細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道。
所述應用可包括用在誘導細胞滲透壓休克的方法中，例如通過將可磁化顆粒結合到細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道。本發(fā)明這一方面中的應用在治療或減少如癌癥細胞的腫瘤細胞方面特別有用。
因此，所述應用可包括通過采用靶向的靜態(tài)磁場保持離子通道開放而殺死細胞。可選擇地，所述應用可包括通過采用隨時間變化的靶向磁場使離子通道循環(huán)開放和關閉而殺死細胞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，我們提供了可磁化顆粒在制備用于在細胞中誘導治療作用的系統(tǒng)中的應用，其包括通過將可磁化顆粒結合到所述細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道并磁操作該可磁化顆粒。
另外，我們提供了可磁化顆粒在制備包括治療性活性試劑的系統(tǒng)中的應用，其中該活性試劑可與激動或拮抗細胞內離子通道的可磁化顆粒同時、分開或依次施用。
我們還提供了可磁化顆粒在制備用于將治療性活性試劑靶向到細胞的系統(tǒng)中的應用，其包括通過將可磁化顆粒結合到所述細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道，磁操作該可磁化顆粒并同時、分開或依次施用所述的治療性活性試劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，我們提供了包括治療性活性試劑的試劑盒或用于將可磁化顆粒與細胞結合的裝置。
技術人員應理解的是，任何通常已知的治療性活性試劑或治療性活性試劑的組合可用在本發(fā)明的試劑盒中。
由此，該試劑盒可包括含有治療性活性試劑的容器、可磁化顆粒源和用于同時、次序或分開施用它們的說明書。本發(fā)明的試劑盒可包括其它本身為已知的試劑。本發(fā)明還包括上述試劑盒在制備藥物中的用途。
本發(fā)明以下將僅通過實施例并參考附圖進行說明，其中

圖1a)為代表TREK-1結構的示意圖，顯示用以機械操作的用于標記磁珠的12×組氨酸插入的三位點；圖1b)顯示具有膜結合RGD包被的羧基鐵磁性顆粒(4μm)的原始人星形細胞(放大倍數(shù)×1000)；圖2為TREK離子通道的示意圖，顯示該蛋白中His.標簽的結構和位點。紅圓圈表示在三個位置的His標簽的位點，主環(huán)、COOH末端和NH末端；圖3代表通過下游細胞內鈣變化而監(jiān)測的Trek-1的磁活化；以及圖4代表TREK-1的磁活化誘導共轉染有flashpericam的HEK293T細胞內鈣的瞬間上升。
實施例1靶向模型系統(tǒng)所述的模型系統(tǒng)由連接到向瓊脂凝膠塊中通道加樣的管的蠕動泵組成。所述磁體可相對于通道放置在不同位置，靶位點的磁場和梯度采用高斯計(gaussmeter)界面連接的軸向霍耳(Hall)探測器測量。由稀土磁體產生的磁場采用該項目中所需的Redcliffe Diagnostic MagScan場強圖繪制系統(tǒng)進行表征。在每次實驗運行后，凝膠通道會被切開并采用染色技術分析細胞捕獲。磁性顆粒捕獲通過對冷凍干燥的凝膠塊進行超導量子干涉儀(SQUID)磁力測定而進行定量。模型可用于優(yōu)化遞送和靶向參數(shù)，諸如磁場強度和幾何形狀、磁性顆粒特征、每細胞的顆粒數(shù)等。
實施例2采用磁性細胞計數(shù)的非特異性膜變形特別地，取決于骨架尺寸，將106-109BMSc種植于骨架，在放置在生物反應器中之前培養(yǎng)24小時。構建物隨后接受不同的磁負載方案，例如1Hz頻率1小時，每顆粒上的力為1-100pN。這些參數(shù)為可控的，并允許對不同的細胞類型和骨架材料進行系統(tǒng)的優(yōu)化。處理之后，可取出細胞并在活化后接受不同點的RNA和蛋白質分析。采用蛋白印跡、FAC分析和定量PCR技術，可對如runx 2和osterix的成骨細胞轉錄因子、以及如骨橋蛋白、1型膠原的基質蛋白、堿性磷酸酶和骨鈣素進行測試。
實施例3在動物模型中證實新骨形成以確認這些磁性微顆粒和納米顆粒的適用性采用小鼠SCID模型，通過將細胞保持在體內皮下擴散室中以遠程活化干細胞而促進骨細胞分化和新骨形成的能力得到了這項技術的動物實驗的支持。以此方式，可與體外實驗進行比較。還可建議將細胞靶向到特異組織。
實施例4體內骨形成的證實可采用來自間充質干細胞的人衍生骨祖細胞。體內骨形成可采用重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的皮下移植模型和擴散室模型進行評估。這提供了在體內確認磁性微顆粒和納米顆粒靶向效果的快速和可靠的模型。通過與宿主細胞相對的植入細胞，擴散室試驗提供了骨形成的明確證明。皮下植入模型保持評估骨骼組織形成的產業(yè)標準不變，在授予RO(30/1759)的項目許可之下，我們之一(RO)公開了sc和DC模型在骨組織工程評估方面的應用。簡言之，選擇的人骨祖細胞皮下植入到SCID小鼠4周，對于擴散室研究，細胞和磁性顆粒復合物放置進每一擴散室及腹膜內植入無胸腺裸鼠(MFI-nu-nu；4-6周大；Harlan UK Ltd)的這些室中10周。此后，取出擴散室，固定過夜(95％乙醇，4℃)并在4℃無脫鈣地包埋在聚(甲基丙烯酸羥甲酯)樹脂中。通過包括冷凍、石蠟和甲基丙烯酸甲酯可塑性的切片的組織學技術評估新骨的形成。軟骨和骨形成的評估將通過采用甲苯胺藍姬姆薩、阿爾新藍/天狼星紅和番紅-O染色進行組織學檢測。該模型目前正在Southampton在授予RO(30/1759)的項目許可之下運行。
實施例5體內將細胞靶向到特異位點這項工作集中在經動脈內和靜脈內注射將裝載有磁性顆粒的細胞遞送到特定組織位點。簡言之，用磁性顆粒裝載選擇的和擴充的間充質干細胞，并經尾靜脈注射入麻醉的MF1nu/nu小鼠。采用外部高梯度NdFeB磁體，這些細胞被定位在特定的靶位點。對照小鼠也將被注射，但是無磁體用于靶向。在4、7和14天后采用MRI(磁性納米顆粒在臨床MR成像中用作對比增強劑)和SQUID磁力測定分析切片的凍干靶組織來評價靶向效果。采用上述技術的初步實驗已在人骨衍生的間充質干細胞(Cambrex poietics-hMSC)上進行。在含有10％FCS和1％抗生素、抗壞血酸(50微克/ml)和β-甘油磷酸(10mM)的αMEM中培養(yǎng)5天(樣品組E-H)。
電壓門鈣離子通道受體的抗體的生物素化α2/δ-1亞基包被磁性微顆粒(d-4μm)。4天后，通過鈣通道受體將顆粒附著到干細胞40分鐘。40分鐘后，細胞暴露于1Hz的磁場，該磁場對每個顆粒施加約30微微牛頓的力(約2顆粒/細胞)。2小時40分鐘后，將顆粒與細胞分開并通過抽吸取出。將起初的培養(yǎng)基返回到樣品，隨后進一步培養(yǎng)另一24小時的時間段。在第5天收集對照和刺激組的RNA。對每一樣品進行基因芯片分析。采用HG-Focus人基因組芯片(Affymetrix)分析8000基因/樣品對磁活化的反應(兩倍的增加/下降視為上調和下調)。
這些實驗的基因芯片數(shù)據(jù)顯示機械刺激導致如神經生長因子和成纖維細胞生長因子下調的某些基因(表1)。這顯示利用磁性顆粒施加機械力引導干細胞分化偏離神經元和成纖維細胞途徑。如tetranectin的上調的基因對機械力施加的反應表明細胞向成骨途徑分化。涉及細胞骨架重構和細胞粘附蛋白的基因上調與施加機械力后期望的細胞過程相關。
表達的基因的總數(shù) 82(42▲40)表達的基因的選擇 胰島素樣GF結合蛋白1(2.1倍▲)FK506結合蛋白(2.1倍▲)關節(jié)蛋白(Zyxin)(2.1倍▲)整合素α5(2倍▲)早期生長反應因子-1(Early growth response 1)(2倍▲)IV型膠原α3(2.1倍)神經GF(2倍)成纖維細胞GF 7和9(2.1和2.5倍)Tetranectin(2.1倍▲)表1基因芯片分析結果顯示，與分化和機械刺激有關的特定基因的活性以及它們相對于非刺激的對照培養(yǎng)的相對上調和下調。符號上調和＝下調。
權利要求
1.將干細胞選擇性活化和/或靶向的方法，所述方法能夠以遠程方式機械地操作所述的細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的遠程方法為非接觸方式，且在從體外進行體內的特異地活化/靶向的情況下。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括通過將可磁化顆粒與干細胞結合而在體內或體外磁操作干細胞。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括(i)將干細胞靶向到修復位點和/或在所述位點保持所述細胞；以及(ii)體外和/或體內調節(jié)和/或分化。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括在體內靶向干細胞。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括操作人干細胞。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括將可磁化納米顆粒標記所述干細胞，該顆粒通過外部磁操作能被遞送到或保持在特定修復位點。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括遠程活化特異干細胞膜受體。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括在位點沉積干細胞、將所述細胞保持在所述位點并在患者內原位遠程活化所述細胞。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括靶向干細胞上的特定受體，用于遠程活化干細胞內的跨膜離子通道。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括細胞類型的早期分化。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括靶向人骨髓干細胞中存在的多種干細胞受體類型。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于所述的干細胞受體類型選自機械活化的離子通道，例如K+通道(TREK)、鈣通道，整合素以及表面膜結合位點，例如RGD。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于所述的方法包括靶向外部生長因子的受體(例如TGFB和BMP2)，所述受體表現(xiàn)出活化諸如Runx2和Osterix的(對干細胞分化為關鍵性的)下游轉錄因子。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的干細胞為間充質干細胞。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于所述的方法包括將人間充質干細胞植入損傷或修復位點。
17.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法提供治療處理。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于所述的治療處理選自基因治療和組織工程。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于所述的位點為組織修復位點。
20.如權利要求1所述的方法，其特征在于在功能水平上所述干細胞分化為神經元細胞。
21.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括干細胞結合、遞送和活化。
22.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括采用成人原始骨髓人干細胞和/或人胚胎干細胞。
23.如權利要求1所述的方法，其特征在于生物反應器將力施加到附著到干細胞的磁性顆粒上，所述干細胞培養(yǎng)在體外多孔2D系統(tǒng)或體內基于3D骨架系統(tǒng)。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于間充質干細胞包括選自成骨、軟骨形成和脂肪形成細胞群的細胞群。
25.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括利用單克隆抗體的磁活化細胞分選(MACS)。
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于所述的單克隆抗體為STRO-1。
27.如權利要求23所述的方法，其特征在于所述的方法包括采用由生物可降解聚合物構成的3D骨架，單層的BMSc培養(yǎng)。
28.如權利要求27所述的方法，其特征在于所述的生物可降解聚合物選自聚乳酸(PLLA)和膠原凝膠。
29.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括體內過程的離體操作。
30.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法包括將可磁化顆粒與干細胞活化和/或靶向。
31.磁操作干細胞的方法，其包括將可磁化顆粒結合到細胞，其特征在于所述方法包括通過將可磁化顆粒結合到細胞從而激動或拮抗細胞內的離子通道。
32.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的方法包括分化步驟。
33.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的可磁化顆粒直接結合到所述干細胞。
34.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的方法包括將所述可磁化顆粒結合到抗體或酶，隨后抗體或酶結合到所述干細胞。
35.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的方法包括將顆粒引進干細胞或將顆粒附著到干細胞。
36.如權利要求35所述的方法，其特征在于顆粒為細胞內或細胞外結合。
37.如權利要求36所述的方法，其特征在于顆粒為細胞內結合。
38.如權利要求37所述的方法，其特征在于所述的細胞內結合包括與內結合位點的結合。
39.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的方法包括操作干細胞內的機械敏感離子通道，特征在于所述方法包括將可磁化顆粒直接或是間接地結合到離子通道。
40.如權利要求39所述的方法，其特征在于顆粒結合到所述離子通道的N末端區(qū)。
41.如權利要求39所述的方法，其特征在于顆粒結合到所述離子通道的COOH末端區(qū)。
42.如權利要求39所述的方法，其特征在于所述額方法包括遠程操作干細胞和/或遠程激動或拮抗離子通道。
43.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的方法包括利用應答剪切力、細胞膨脹和細胞拉伸和/或外部試劑的已知干細胞。
44.如權利要求43所述的方法，其特征在于所述的外部試劑為脂肪酸或普通麻醉劑。
45.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的方法結合入疼痛緩解、麻醉、治療、組織工程和修復和/或癌癥治療的應用中。
46.如權利要求45所述的方法，其特征在于所述的干細胞分化為結締組織或神經組織。
47.如權利要求45所述的方法，其特征在于所述的干細胞分化為骨、神經元、心肌細胞或其任意組合。
48.如權利要求39所述的方法，其特征在于所述的離子通道為機械敏感離子通道。
49.如權利要求39所述的方法，其特征在于所述的機械敏感離子通道已轉染進細胞。
50.如權利要求39所述的方法，其特征在于所述的方法包括利用導致膜變形、引發(fā)所述通道或電壓門控和配體門控離子通道開放的力。
51.如權利要求50所述的方法，其特征在于所述的離子通道為電壓門控離子通道。
52.如權利要求50所述的方法，其特征在于所述的離子通道為配體門控離子通道。
53.如權利要求39所述的方法，其特征在于所述的離子通道選自鈉通道、鉀通道、鈣通道、氯通道和非選擇性陽離子通道或其任意組合。
54.如權利要求53所述的方法，其特征在于所述的離子通道選自鈣或鉀離子通道。
55.如權利要求54所述的方法，其特征在于所述的離子通道為鉀離子通道。
56.如權利要求55所述的方法，其特征在于所述的鉀離子通道為TREK-1通道。
57.如權利要求56所述的方法，其特征在于所述的方法包括利用骨細胞中的TREK-1通道。
58.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的方法包括采用外部高梯度稀土磁體來靶向。
59.如權利要求58所述的方法，其特征在于所述的稀土磁體為NdFeB磁體。
60.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的磁體產生高場/梯度產物，其對裝載到細胞的磁性顆粒施加平移力，按照下式將它們保持在目標位點Fmag=(X2-X1)V1μoB(▿B).]]>
61.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的活化包括采用磁調節(jié)性生物反應器實現(xiàn)的遠程機械活化。
62.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于用在本發(fā)明所述方法中的可磁化顆粒可為固有磁性的，或備選地，可以是在磁場中反應的顆粒。
63.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于用所述的可磁化顆粒為磁性的。
64.如權利要求63所述的方法，其特征在于所述的磁性材料為順磁性的超順磁性的、鐵磁性的和/或反鐵磁性的。
65.如權利要求62所述的方法，其特征在于所述的磁性材料選自包括元素鐵(Fe)或其化合物、鉻化合物或上述組合的組。
66.如權利要求65所述的方法，其特征在于所述的鐵化合物為鐵鹽。
67.如權利要求66所述的方法，其特征在于所述的鐵鹽選自包括磁鐵礦(Fe3O4)、磁赤鐵礦(γFe2O3)和硫復鐵礦(Fe3S4)或上述任意組合的組中。
68.如權利要求65所述的方法，其特征在于所述的鉻化合物為鉻鹽。
69.如權利要求68所述的方法，其特征在于所述的鉻鹽為氧化鉻(CrO2)。
70.如權利要求63所述的方法，其特征在于所述的磁性材料包括顆粒，所述顆粒包括具有生物相容包被層的磁性核心。
71.如權利要求70所述的方法，其特征在于所述的生物相容磁性納米顆粒包括具有硅石、葡聚糖或PVA包被層的磁鐵礦(Fe3O4)和/或磁赤鐵礦(γFe2O3)核心。
72.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的顆粒為納米顆粒。
73.如權利要求72所述的方法，其特征在于所述的納米顆粒具有1nm-10μm的顆粒尺寸。
74.如權利要求73所述的方法，其特征在于所述的顆粒具有5000nm或更小的平均尺寸。
75.如權利要求74所述的方法，其特征在于所述的顆粒具有1nm-5000nm平均尺寸。
76.如權利要求72所述的方法，其特征在于所述的磁性納米顆粒具有10nm直至數(shù)微米的顆粒尺寸。
77.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的包被層為功能化的并被交聯(lián)到膜附著部分。
78.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的磁性納米顆粒經修飾以便定制顆粒內在頻率、結合效率、穩(wěn)定性以及結合對細胞活性和功能的影響。
79.如權利要求78所述的方法，其特征在于所述的修飾包括定制內結合位點以及外膜上的位點。
80.如權利要求71所述的方法，其特征在于所述的顆粒具有核心和包被所述核心的硅石殼。
82.如權利要求70所述的方法，其特征在于所述的顆粒為在所述核心中具有多個磁性中心的多孔顆粒。
83.如權利要求1或31所述的方法，其特征在于所述的方法包括對所述可磁化顆粒施加遠程磁場。
84.如權利要求34所述的方法，其特征在于所述的顆粒被標記識別細胞內關鍵細胞元件的一種或多種特異抗體或蛋白質結合基序。
85.如權利要求84所述的方法，其特征在于所述的特異抗體或蛋白質結合基序選自跨膜細胞外基質分子、粘附分子或分散膜粘附蛋白或細胞外基質蛋白。
86.如權利要求85所述的方法，其特征在于所述跨膜粘附分子選自整合素、鈣粘素、選擇素以及免疫球蛋白。
87.如權利要求86所述的方法，其特征在于所述的特異抗體或蛋白質連接部分選自分散膜粘附蛋白。
88.如權利要求87所述的方法，其特征在于所述的分散膜粘附蛋白為RGD(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸)。
89.治療患有離子通道在其中起作用的病癥患者的方法，包括向這種患者施用可磁化顆粒并采用體外磁場操作所述干細胞離子通道或所述干細胞。
90.治療或減少腫瘤細胞的方法，其包括權利要求89所述的方法。
91.如權利要求90所述的方法，其特征在于所述的腫瘤細胞為癌癥細胞。
92.如權利要求91所述的患者的治療方法，其特征在于所述的方法包括采用靶向的靜態(tài)磁場通過保持離子通道開放而殺死細胞。
93.如權利要求91所述的患者的治療方法，其特征在于所述的方法包括采用靶向的隨時間變化磁場通過循環(huán)地開放和關閉離子通道而殺死細胞。
94.如權利要求91所述的治療方法，其中病癥可涉及體內的多種組織，其中離子通道在正常細胞動態(tài)平衡中起關鍵作用。
95.如權利要求94所述的方法，其特征在于所述的細胞為心肌細胞。
96.如權利要求94所述的方法，其特征在于所述的方法包括治療高血壓。
97.如權利要求94所述的方法，其特征在于所述的方法包括緩解疼痛。
98.如權利要求97所述的方法，其特征在于所述的方法包括麻醉。
99.如權利要求98所述的方法，其特征在于所述的麻醉為局部的。
100.如權利要求89所述的患者的治療方法，其特征在于所述的方法包括組織和/或骨修復。
101.如權利要求100所述的治療方法，其特征在于所述的細胞選自韌帶細胞、肌鍵細胞、軟骨細胞和其它基質細胞(例如軟骨祖細胞)。
102.如權利要求100所述的治療方法，其特征在于所述的方法包括組織再生或人工組織如皮膚、軟骨、韌帶、肌鍵、肌肉或骨的產生。
103.如權利要求100所述的治療方法，其特征在于所述的方法包括遠程活化離子通道。
104.如權利要求100所述的治療方法，其特征在于所述的方法包括傷口愈合和/或組織粘附。
105.如權利要求100所述的治療方法，其特征在于所述的方法包括骨修復和/或骨生長。
106.如權利要求89所述的治療方法，其特征在于所述的方法包括牙科或獸醫(yī)應用。
107.如權利要求98所述的治療方法，其特征在于所述的方法通過采用體外磁場的離子通道調節(jié)作用而建立局部麻醉。
108.如權利要求89所述的治療方法，其特征在于所述的方法包括采用0.1-10Hz頻率的磁場。
109.如權利要求89所述的治療方法，其特征在于所述的方法包括采用典型地具有10mT-1400mT通量密度的磁場。
110.在干細胞中誘導治療作用的方法，其包括通過將可磁化顆粒結合到所述細胞而激動或拮抗細胞內的離子通道，并機械地操作所述可磁化顆粒。
111.治療方法，其包括施用治療性活性試劑，所述的活性試劑可與激動或拮抗細胞內離子通道的可磁化顆粒同時、分開或依次施用。
112.將治療性活性試劑靶向到干細胞的方法，包括通過將可磁化顆粒結合到所述細胞而激動或拮抗所述細胞內的離子通道，磁操作所述可磁化顆粒并同時、分開或依次施用所述治療性活性試劑。
113.可磁化顆粒在磁操作干細胞方法中的用途，其中所述的方法包括將可磁化顆粒結合到細胞。
114.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括選擇性活化和/或靶向干細胞，其隨后能夠以遠程方式機械地操作所述的細胞。
115.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的遠程方法為非接觸方式，且在從體外特異地進行體內的活化/靶向的情況下。
116.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括通過將可磁化顆粒與干細胞結合而在體內或體外磁操作干細胞。
117.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括(i)將干細胞靶向到修復位點和/或在所述位點保持所述細胞；以及(ii)體外和/或體內調節(jié)和/或分化。
118.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括在體內靶向干細胞。
119.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括操作人干細胞。
120.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括將可磁化納米顆粒與所述干細胞結合，該顆粒通過外部磁操作能被遞送到或保持在特定修復位點。
121.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括遠程活化特異干細胞膜受體。
122.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括在位點沉積干細胞、將所述細胞保持在所述位點并在患者內原位遠程活化所述細胞。
123.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括靶向干細胞上特異受體，用于遠程活化干細胞內的跨膜離子通道。
124.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括細胞類型的早期分化。
125.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括定向人骨髓干細胞中存在的多種干細胞受體類型。
126.如權利要求125所述的用途，其特征在于所述的干細胞受體類型選自機械活化的離子通道，例如K+通道(TREK)、鈣通道，整合素和表面膜結合位點，例如RGD。
127.如權利要求126所述的用途，其特征在于所述的用途包括定向外部生長因子的受體(例如TGFB和BMP2)，這些受體表現(xiàn)出活化諸如Runx2和Osterix的(對干細胞分化為關鍵性的)下游轉錄因子。
128.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的干細胞為間充質干細胞。
129.如權利要求128所述的用途，其特征在于所述的用途包括將人間充質干細胞植入所述損傷或修復位點。
130.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途提供治療處理。
131.如權利要求130所述的用途，其特征在于所述的治療處理選自基因治療和組織工程。
132.如權利要求131所述的用途，其特征在于所述的位點為組織修復位點。
133.如權利要求113所述的用途，其特征在于在功能水平上所述干細胞分化為神經元細胞。
134.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括干細胞結合、遞送和活化。
135.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括采用成人原始骨髓人干細胞和/或人胚胎干細胞。
136.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述生物反應器將力施加到附著到干細胞的磁性顆粒上，所述干細胞培養(yǎng)在體外多孔2D系統(tǒng)或體內基于3D骨架系統(tǒng)。
137.如權利要求136所述的用途，其特征在于所述間充質干細胞包括選自成骨、軟骨形成和脂肪形成細胞群的細胞群。
138.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的用途包括利用單克隆抗體的磁活化細胞分選(MACS)。
139.如權利要求138所述的用途，其特征在于所述的單克隆抗體為STRO-1。
140.如權利要求136所述的用途，其特征在于所述的用途包括采用由生物可降解聚合物構成的3D骨架單層的BMSc培養(yǎng)。
141.如權利要求140所述的用途，其特征在于所述的生物可降解聚合物選自聚乳酸(PLLA)和膠原凝膠。
142.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括體內過程的離體操作。
143.如權利要求113所述的用途，其特征在于所述的用途包括將可磁化顆粒與干細胞活化和/或靶向。
144.可磁化顆粒在療法制備中的用途，其包括通過將可磁化顆粒與干細胞結合而激動或拮抗干細胞內的離子通道。
145.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的用途包括分化步驟。
146.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于可磁化顆粒直接結合到所述干細胞。
147.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的用途包括將所述可磁化顆粒結合到抗體或酶，隨后所述抗體或酶結合到所述干細胞。
148.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的用途包括將顆粒引進干細胞或將顆粒附著到干細胞。
149.如權利要求148所述的用途，其特征在于顆粒為細胞內或細胞外結合。
150.如權利要求149所述的用途，其特征在于顆粒為細胞內結合。
151.如權利要求150所述的用途，其特征在于所述的細胞內結合包括與內結合位點的結合。
152.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的用途包括操作干細胞內的機械敏感離子通道，特征在于所述用途包括將可磁化顆粒直接或是間接地結合到離子通道。
153.如權利要求152所述的用途，其特征在于顆粒結合到所述離子通道的N末端區(qū)。
154.如權利要求152所述的用途，其特征在于顆粒結合到所述離子通道的COOH末端區(qū)。
155.如權利要求152所述的用途，其特征在于所述的用途包括遠程操作干細胞和/或遠程激動或拮抗離子通道。
156.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的用途包括利用應答剪切力、細胞膨脹和細胞拉伸和/或外部試劑的已知干細胞。
157.如權利要求156所述的用途，其特征在于所述的外部試劑為脂肪酸或普通麻醉劑。
158.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的應用并入疼痛緩解、麻醉、治療、組織工程和修復和/或癌癥治療的應用中。
159.如權利要求158所述的用途，其特征在于所述的干細胞分化為結締組織或神經組織。
160.如權利要求158所述的用途，其特征在于所述的干細胞分化為骨、神經元、心肌細胞或其任意組合。
161.如權利要求152所述的用途，其特征在于所述的離子通道為機械敏感離子通道。
162.如權利要求152所述的用途，其特征在于所述的機械敏感離子通道已轉染進細胞。
163.如權利要求152所述的用途，其特征在于所述的用途包括利用導致膜變形、引發(fā)所述通道或電壓門控和配體門控離子通道開放的力。
164.如權利要求163所述的用途，其特征在于所述的離子通道為電壓門控離子通道。
165.如權利要求163所述的用途，其特征在于所述的離子通道為配體門控離子通道。
166.如權利要求152所述的用途，其特征在于所述的離子通道選自鈉通道、鉀通道、鈣通道、氯通道和非選擇性陽離子通道或其任意組合。
167.如權利要求166所述的用途，其特征在于所述的離子通道選自鈣或鉀離子通道。
168.如權利要求167所述的與他，其特征在于所述的離子通道為鉀離子通道。
169.如權利要求168所述的用途，其特征在于所述的鉀離子通道為TREK-1通道。
170.如權利要求169所述的應用，其特征在于所述的應用包括利用骨細胞中的TREK-1通道。
171.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的應用包括采用外部高梯度稀土磁體來靶向。
172.如權利要求171所述的用途，其特征在于所述的稀土磁體為NdFeB磁體。
173.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的磁體產生高場/梯度產物，其對裝載到所述細胞的磁性顆粒施加平移力，按照下式將它們保持在目標位點Fmag=(X2-X1)V1μoB(▿B).]]>
174.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的活化包括采用磁調節(jié)性生物反應器實現(xiàn)的遠程機械活化。
175.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于用在本發(fā)明用途中的所述可磁化顆?？蔀楣逃写判缘模騻溥x地，可以是在磁場中反應的顆粒。
176.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的可磁化顆粒為磁性的。
177.如權利要求176所述的用途，其特征在于所述的磁性材料為順磁性的超順磁性的、鐵磁性的和/或反鐵磁性的。
178.如權利要求175所述的用途，其特征在于所述的磁性材料選自包括元素鐵(Fe)或其化合物、鉻化合物或其組合的組。
179.如權利要求178所述的用途，其特征在于所述的鐵化合物為鐵鹽。
180.如權利要求179所述的用途，其特征在于所述的鐵鹽選自包括磁鐵礦(Fe3O4)、磁赤鐵礦(γFe2O3)和硫復鐵礦(Fe3S4)或其任意組合的組中。
181.如權利要求178所述的用途，其特征在于所述的鉻化合物為鉻鹽。
182.如權利要求181所述的用途，其特征在于所述的鉻鹽為氧化鉻(CrO2)。
183.如權利要求176所述的用途，其特征在于所述的磁性材料包括顆粒，所述顆粒包括具有生物相容包被層的磁性核心。
184.如權利要求183所述的用途，其特征在于所述的生物相容磁性納米顆粒包括具有硅石、葡聚糖或PVA包被層的磁鐵礦(Fe3O4)和/或磁赤鐵礦(γFe2O3)核心。
185.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的顆粒為納米顆粒。
186.如權利要求185所述的用途，其特征在于所述的納米顆粒具有1nm-10μm的顆粒尺寸。
187.如權利要求187所述的用途，其特征在于所述的顆粒具有5000nm或更小的平均尺寸。
188.如權利要求187所述的用途，其特征在于所述的顆粒具有1nm-5000nm平均尺寸。
189.如權利要求185所述的用途，其特征在于所述的磁性納米顆粒具有10nm直至數(shù)微米的顆粒尺寸。
190.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的包被層為功能化的并被交聯(lián)到膜附著部分。
191.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的磁性納米顆粒經修飾以便定制顆粒內在頻率、結合效率、穩(wěn)定性以及結合對細胞活存和功能的影響。
192.如權利要求191所述的用途，其特征在于所述的修飾包括定制內結合位點以及外膜上的位點。
193.如權利要求184所述的用途，其特征在于所述的顆粒具有核心和包被所述核心的硅石殼。
194.如權利要求193所述的用途，其特征在于所述的顆粒選自包括(a)包含可磁化顆粒的核心和(b)包被所述核心的硅石殼的那些顆粒。
195.如權利要求183所述的用途，其特征在于所述的顆粒為在所述核心中具有多個磁性中心的多孔顆粒。
196.如權利要求113或144所述的用途，其特征在于所述的用途包括對所述可磁化顆粒施加遠程磁場。
197.如權利要求147所述的用途，其特征在于所述的顆粒結合識別細胞內關鍵細胞元件的一種或多種特異抗體或蛋白質結合基序。
198.如權利要求197所述的用途，其特征在于所述的特異抗體或蛋白質結合基序選自跨膜細胞外基質分子、粘附分子或分散膜粘附蛋白或細胞外基質蛋白。
199.如權利要求198所述的用途，其特征在于所述的跨膜粘附分子選自整合素、鈣粘素、選擇素以及免疫球蛋白。
200.如權利要求199所述的用途，其特征在于所述的特異抗體或蛋白質連接部分選自分散膜粘附蛋白。
201.如權利要求200所述的用途，其特征在于所述的分散膜粘附蛋白為RGD(精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸)。
202.結合到干細胞的可磁化顆粒在制備治療中的應用，所述治療用于處置患有離子通道在其中起作用的病癥的患者，其包括向這種患者施用可磁化顆粒并采用體外磁場操作所述干細胞離子通道或所述干細胞。
203.可磁化顆粒在制備用于將治療性活性試劑靶向到細胞的系統(tǒng)中的用途，其包括通過將可磁化顆粒結合到所述細胞而激動或拮抗所述細胞內的離子通道，磁操作所述可磁化顆粒并同時、分開或依次施用所述治療性活性試劑。
204.一種試劑盒，包括治療性活性試劑和用于將可磁化顆粒結合到細胞的裝置。
205.一種方法或應用，基本上如參考附圖所述。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種選擇性活化和/或靶向干細胞的方法，其能夠以遠程方式機械地操作所述的細胞，其中所述方法包括通過將可磁化顆粒與該干細胞結合而在體內或體外磁操作干細胞。
文檔編號A61K49/18GK1898378SQ200480038043
公開日2007年1月17日 申請日期2004年12月8日 優(yōu)先權日2003年12月18日
發(fā)明者喬恩·道波森, 艾麗西亞·艾爾哈吉 申請人:基爾大學