專利名稱：具有抗肥胖活性的肽及其它相關(guān)應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型肽及其應(yīng)用，包括多肽及相關(guān)分子在例如減肥和治療肥胖和與如脂肪細(xì)胞質(zhì)量增加相關(guān)的情況中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
下列說明包括可以用于理解本發(fā)明的信息。并不認(rèn)為此處所提供的任何信息是現(xiàn)有技術(shù)或與本發(fā)明所述或所要求的內(nèi)容相關(guān)，或是可以用于評估專利性的參考。
特征為在其靶向組織中減少胰島素敏感性的胰島素抗性是2型糖尿病病因的基本方面，并且通常與其它疾病，如高血脂、動脈粥樣硬化和高血壓(如X綜合癥)有關(guān)。胰島素抗性的分子基礎(chǔ)是復(fù)雜且多因素的。認(rèn)為一個(gè)較近的關(guān)聯(lián)是存在于肥胖質(zhì)量和胰島素敏感性之間的變化。在這個(gè)過程中脂肪細(xì)胞的改變的功能可能起到重要作用。已報(bào)道胰島素抗性和高胰島素血發(fā)生在肥胖或脂肪代謝障礙的個(gè)體中。兩份最近的獨(dú)立基因研究說明無脂小鼠具有嚴(yán)重的胰島素抗性和高血糖癥。
脂肪組織用作甘油三酯的能量存儲庫。還指出其是可以分泌出對細(xì)胞外信號有響應(yīng)的大量生物活性分子的活性內(nèi)分泌器官。脂肪細(xì)胞分泌的產(chǎn)物在系統(tǒng)能量體內(nèi)平衡的調(diào)整中發(fā)揮作用，并且它們改變的表達(dá)和/或分泌物可能促成胰島素抗性及其相關(guān)并發(fā)癥。一種脂肪細(xì)胞分泌的產(chǎn)物是瘦素(leptin)，其是肥胖的中心調(diào)節(jié)器并且還影響葡萄糖的體內(nèi)平衡。其它脂肪細(xì)胞分泌的分子包括TNFα、游離脂肪酸和最近表征的抵抗素。在胰島素抗性狀態(tài)中脂肪組織生產(chǎn)過多的TNFα。脂肪組織中的纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)和血管緊張肽原的增加的表達(dá)和分泌物可以在肥胖和血栓血管疾病以及高血壓中起作用。
脂肪組織作為內(nèi)分泌器官的角色還反應(yīng)在最近的脂聯(lián)素(一種僅由脂肪細(xì)胞分泌的激素)研究中。有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為在許多胰島素抗性的動物模型和來自不同種族的肥胖人群和2型糖尿病患者中信使RNA(mRNA)表達(dá)和脂聯(lián)素的分泌水平會降低。進(jìn)一步，有報(bào)導(dǎo)認(rèn)為脂聯(lián)素(一種目的性的胰島素敏化劑)的補(bǔ)充會降低高血糖、恢復(fù)胰島素敏感性，并且會在不影響食物攝取的情況下引起小鼠持續(xù)的體重下降。
盡管已經(jīng)確認(rèn)了許多分泌因素，但是可以有其它的不確定因素在調(diào)整能量新陳代謝中起著重要的角色。此處公開并要求了一個(gè)我們發(fā)現(xiàn)的并且命名為“adipocyspin”的因素。
發(fā)明概述此處所述并要求的本發(fā)明具有許多特性和具體實(shí)施方案，包括但不限于發(fā)明概述中所闡明或描述或提及的。此處所述并要求的本發(fā)明并不限于發(fā)明概述中所確定的特征或具體實(shí)施方案，發(fā)明概述僅僅為了說明而非限制。
在一方面，本發(fā)明提供一種編碼adipocyspin多肽的分離的多核苷酸或一種與編碼adipocyspin多肽序列的互補(bǔ)的分離的多核苷酸。
本發(fā)明包括，例如多核苷酸，所述多核苷酸包括編碼具有減肥活性的多肽的序列，及其其活性或免疫活性片段，其包括，例如(a)編碼具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸MKCLLISLALWLGTVGTRGTEPELSETQRRSLQVALEEFHKHPPVQLAFQEIGVDRAEEVLFSAGTFVRLEFKLQQTNCPKKDWKKPECTIKPNGRRRKCLACIKMDPKGKILGRIVHCPILKQGPQDPQELQCIKIAQAGEDPHGYFLPGQFAFSRALRTK[SEQ ID NO1]；(b)編碼具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸MRRLLIPLALWLGAVGVGVAELTEAQRRGLQVALEEFHKHPPVQWAFQETSVESAVDTPEPAGIFVRLEFKLQQTSCRKRDWKKPECKVRPNGRKRKCLACIKLGSEDKVLGRLVHCPIETQVLREAEEHQETQCLRVQRAGEDPHSFYFPGGFAFSKALPRS [SEQ ID NO2]；
(c)在嚴(yán)緊條件下與例如(a)或(b)或其任一的互補(bǔ)物雜交的多核苷酸；和(d)由于遺傳密碼能簡并成如(a)、(b)或(c)所述的序列的多核苷酸序列。
在一些具體實(shí)施方案中，多核苷酸具有與(a)或(b)的多核苷酸相同或完全互補(bǔ)的至少約10、15、25、50或100連續(xù)堿基。
在其它具體實(shí)施方案中，多核苷酸是SEQ ID NO5或6的完全序列，或者其編碼具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或其任一的片段的序列的adipocyspin多肽，其包括生物活性和免疫活性肽。
可以使多核苷酸與允許或增強(qiáng)細(xì)胞(如脂肪細(xì)胞或3T3 L1細(xì)胞)中多核苷酸表達(dá)的啟動子或其它序列連接。
在另一具體實(shí)施方案中，提供一種重組載體(如表達(dá)載體)來表達(dá)adipocyspin多肽或其片段。
本發(fā)明還可以提供一種細(xì)胞(如細(xì)胞、真核生物、哺乳動物或人細(xì)胞)，其包括重組的adipocyspin多核苷酸或載體，還提供一種在多肽可以表達(dá)的條件下通過培養(yǎng)含有重組adipocyspin多核苷酸或編碼adipocyspin蛋白、肽或融合蛋白或其片段的載體來產(chǎn)生adipocyspin蛋白、肽或融合蛋白或其片段的方法。
本發(fā)明還提供分離的基本上純的或重組的adipocyspin多肽，或其生物活性或免疫片段，其包括，例如，由上述(a)-(c)編碼的多肽。在一方面，多肽具有與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2相同的氨基酸序列。另一方面，多肽具有由保守性突變(其具有至少約60％、80％或90％或更多與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2相同；)導(dǎo)致的與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2不同的氨基酸序列，和/或其與由SEQ ID NO1或SEQID NO2編碼的全長多肽具有免疫性交叉反應(yīng)的多肽。在另一方面，多肽具有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，例如其中連接至少兩個(gè)半胱氨酸殘基(例如與人類adipocyspin中半胱氨酸殘基對應(yīng)的或在小鼠adipocyspin的氨基酸位置62、72、83、86、101或116的半胱氨酸殘基)以形成分子內(nèi)二硫鍵的多肽。在一方面，多肽是融合蛋白。另一方面，例如，多肽具有天然的人類adipocyspin的活性，例如抑制前脂肪細(xì)胞形成脂肪細(xì)胞，和/或降低人體脂肪或脂肪組織質(zhì)量。
在另一具體實(shí)施方案中，提供抗體或抗體片段(例如Fab片段或單鏈抗體)或與adipocyspin多肽特異結(jié)合的片段(如噬菌體呈現(xiàn)所產(chǎn)生的)?？贵w可以是單克隆的并且使其以至少約108M-1、優(yōu)選至少約109M-1或至少約1010M-1的親和力進(jìn)行結(jié)合。本發(fā)明還提供分離的細(xì)胞或能分泌抗體、抗體片段或抗體-結(jié)合片段的雜交瘤細(xì)胞。抗體、抗體片段或抗體-結(jié)合片段可以是人類的或嵌合的或人源化的。
本發(fā)明還提供通過以下檢測樣品中adipocyspin基因產(chǎn)物和/或其片段的方法(a)使樣品與特異性結(jié)合基因產(chǎn)物和/或其片段的探針接觸，其中探針與基因產(chǎn)物和/或其片段形成復(fù)合物，并且檢測復(fù)合物的形成；或(b)在生物樣品中特異性擴(kuò)增基因產(chǎn)物和/或其片段，其中所述基因產(chǎn)物和/或其片段是多核苷酸，并且檢測擴(kuò)增產(chǎn)物；其中復(fù)合物的形成或擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與生物樣品中adipocyspin基因產(chǎn)物和/或其片段的存在有關(guān)聯(lián)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物和/或其片段是多肽，而探針是抗體。在另一不同的具體實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物和/或其片段是RNA，而探針是多核苷酸。
在另一方面，本發(fā)明提供一種確定adipocyspin活性的調(diào)制子的方法，所述方法可以包括以下步驟(a)在測試化合物存在的情況下使多肽，如adipocyspin多肽，和adipocyspin受體和/或adipocyspin受體制品接觸，和(b)將(a)中adipocyspin受體和/或adipocyspin受體制品和多肽的結(jié)合水平與沒有測試化合物的情況下的結(jié)合水平進(jìn)行比較，其中結(jié)合降低表示測試化合物是結(jié)合的抑制劑或阻斷劑，而結(jié)合增加表示測試化合物是結(jié)合的增強(qiáng)劑或激活劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，細(xì)胞表達(dá)adipocyspin多肽。
在另一方面，本發(fā)明提供用于識別或篩選adipocyspin的激動劑或拮抗劑的方法，其包括將測試樣品和adipocyspin受體制品放置在一起，其中測試樣品包括一種或多種測試化合物，而adipocyspin受體制品包括能結(jié)合到adipocyspin的adipocyspin受體蛋白；在將adipocyspin結(jié)合到受體蛋白的條件下孵育測試樣品和受體制品；然后，鑒別這些含有可檢測到地結(jié)合到受體蛋白的一種或多種測試化合物的測試樣品。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步包括為了體外或體內(nèi)刺激或抑制adipocyspin受體介導(dǎo)的活性，篩選可檢測到地結(jié)合到受體蛋白的測試樣品的步驟；并且識別這些作為adipocyspin的激動劑或拮抗劑的測試樣品。在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，通過測定來自由測試樣品產(chǎn)生的受體蛋白制品中的標(biāo)記的第一配基的置換來確定可檢測到地結(jié)合到受體蛋白的測試樣品，并且將測定的來自由測試樣品產(chǎn)生的受體蛋白制品中的標(biāo)記的第一配基的置換與來自由一種或多種已知第二配基產(chǎn)生的受體蛋白制品中的標(biāo)記的第一配基的置換相比較。標(biāo)記的第一配基和第二配基包括adipocyspin、adipocyspin激動劑或adipocyspin拮抗劑。可用的受體制品包括，例如，載有adipocyspin受體的分離的細(xì)胞、載有adipocyspin受體的分離的膜制品和分離的adipocyspin受體蛋白。當(dāng)使用分離的膜作為受體制品時(shí)，特別優(yōu)選來自基底前腦區(qū)域的膜?？梢詫⒂糜谏鲜鋈我环椒ǖ陌ㄒ环N以上測試化合物并且產(chǎn)生陽性結(jié)果的的測試樣品分離并且如需要可以復(fù)試多次，并且根據(jù)情況來識別測試樣品中對產(chǎn)生陽性結(jié)果有響應(yīng)的化合物。
在另一方面，本發(fā)明提供一種評估一種或多種試圖由已知或候選adipocyspin激動劑或拮抗劑化合物確定的受體結(jié)合特性的方法，其包括評估或測量化合物對抗結(jié)合到adipocyspin受體制品的標(biāo)記的配基的能力；并且確定試圖由所述化合物確定的受體結(jié)合特性?？梢源_定的結(jié)合特性包括，例如，結(jié)合親和力和結(jié)合特異性。
在又一方面，本發(fā)明提供確定測試樣品中需要測定的adipocyspin受體結(jié)合化合物的存在或數(shù)量的方法，包括將測試樣品與adipocyspin受體制品放置在一起；測定測試樣品對抗結(jié)合到adipocyspin受體制品的標(biāo)記的配基的能力；然后，任選地，使測試樣品中adipocyspin受體結(jié)合化合物的量與為負(fù)對照樣品測定的adipocyspin受體結(jié)合化合物的量相關(guān)聯(lián)，已知負(fù)對照樣品為非任何adipocyspin受體結(jié)合化合物，和/或使測試樣品中adipocyspin受體結(jié)合化合物的量與為正對照樣品測定的adipocyspin受體結(jié)合化合物的量相關(guān)聯(lián)，正對照樣品包含已知量的adipocyspin受體結(jié)合化合物，來確定測試樣品中存在的adipocyspin受體結(jié)合化合物的存在和量。在又一進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，例如，可以利用這個(gè)測定方法來評估adipocyspin制品的穩(wěn)定性；評估adipocyspin制品的效力和評估adipocyspin制品的可溶性。
在另一方面，可以利用本發(fā)明的受體制品使用公知方法來制備抗adipocyspin受體的抗體，包括多克隆抗血清和單克隆抗體。
在另一方法，使用本發(fā)明來篩選細(xì)胞系、由組織取消隔離(desegregate)的細(xì)胞和來自人或動物血液的細(xì)胞，例如來識別這些帶有adipocyspin受體的細(xì)胞。本發(fā)明的adipocyspin受體制品還可以結(jié)合到固相中并且用于多種親和色譜層析法，并且用于例如adipocyspin的純化或?qū)σ阎蚩赡芎衋dipocyspin、adipocyspin激動劑或adipocyspin拮抗劑的樣品的評估。本發(fā)明還提供一種識別adipocyspin活性的調(diào)節(jié)子的方法，例如，包括使表達(dá)重組adipocyspin多肽的細(xì)胞與測試化合物接觸并且測定在存在測試化合物的情況下發(fā)生的生物效應(yīng)，其中將誘發(fā)生物反應(yīng)的測試化合物識別為adipocyspin活性的調(diào)節(jié)子或激活子。例如，這樣的測試化合物包括，但不限于含有作為反義或RNAi多核苷酸的多核苷酸，包括能結(jié)合或修飾adipocyspin的多肽的多肽，和包括能調(diào)整能夠發(fā)揮生物效應(yīng)(如結(jié)合adipocyspin受體)的adipocyspin的水平的化合物。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，測定的生物效應(yīng)是從前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。
在另一方面，本發(fā)明提供一種制備藥用的藥物組合物的方法，包括配制adipocyspin或其活性片段，或adipocyspin活性(如，結(jié)合)的調(diào)節(jié)子。
在另一方面，本發(fā)明提供一種包含或基本上包含例如adipocyspin或其活性片段的藥物組合物。也可以包括其他的藥物上可接受的載體、賦形劑等。
本發(fā)明還提供一種通過確定化合物是否與adipocyspin或adipocyspin受體反應(yīng)來識別用于治療以下各種疾病或病征的化合物的方法例如，adipocyspin介導(dǎo)或涉及adipocyspin的疾病和病征。
本發(fā)明還提供一種通過降低或增加哺乳動物中細(xì)胞或組織內(nèi)adipocyspin的活性或表達(dá)或者對哺乳動物施用adipocyspin或其活性片段或adipocyspin的調(diào)節(jié)子來治療具有以下各種疾病或病征的病患的方法例如，adipocyspin介導(dǎo)或涉及adipocyspin的疾病和病征。在各個(gè)具體實(shí)施方案中，病征或疾病是指肥胖或與增加的脂肪組織質(zhì)量有關(guān)的病征。在其他的具體實(shí)施方案中，哺乳動物希望可以減重和/或避免重量的增加。
在另一方面，本發(fā)明提供通過降低或增加哺乳動物中的細(xì)胞或組織內(nèi)adipocyspin的活性或表達(dá)使adipocyspin或其活性片段或adipocyspin調(diào)節(jié)子在制備用于治療以下各種疾病或病征的藥物中的應(yīng)用adipocyspin介導(dǎo)或涉及adipocyspin的疾病和病征。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，病征或疾病是指肥胖或與增加的脂肪組織質(zhì)量有關(guān)的病征，增加胰島素的效果。在另一具體實(shí)施方案中，哺乳動物希望可以減重和/或避免重量的增加。
本發(fā)明還提供一種用于確定adipocyspin活性或其片段的活性的方法，其包括將測試樣品和adipocyspin受體制品放置在一起，測試樣品含有adipocyspin或其片段，而adipocyspin受體制品含有能結(jié)合adipocyspin的adipocyspin受體蛋白；在使adipocyspin或其片段能結(jié)合到受體蛋白的條件下孵育測試樣品和受體制品；然后，測定測試樣品誘發(fā)生物效果的能力。在各種實(shí)施例中，adipocyspin受體制品包括或包含前脂肪細(xì)胞(如3T3 L1細(xì)胞和/或表達(dá)adipocyspin受體的細(xì)胞，如由編碼adipocyspin受體的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)，生物效果是前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率和/或脂類的聚積和/或脂肪細(xì)胞標(biāo)記(如PPARγ或GLUT4)表達(dá)的增加或降低。
本發(fā)明還提供一種含有adipocyspin多肽的組合物，其中adipocyspin多肽是重組的、分離的、純化的或合成的。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，組合物對誘導(dǎo)1μg/mL到20μg/mL的血漿adipocyspin多肽濃度是有效的，在另一具體實(shí)施方案中，濃度為1.9μg/mL到17μg/mL。
在另一方面，本發(fā)明提供一種診斷疾病狀態(tài)存在于個(gè)體中或在個(gè)體中有發(fā)展傾向的方法，包括確定個(gè)體中adipocyspin多肽的水平，然后將該水平與未有疾病的個(gè)體的水平特征比較，其中水平的差異說明疾病的存在或發(fā)展趨勢。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，疾病狀態(tài)選自高血糖、胰島素抗性、2型糖尿病、肥胖癥、高血壓、動脈硬化、冠性心臟病、缺血性心臟病、多囊性卵巢癥候群、或與抗胰島素有關(guān)的代謝癥候群。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，該方法使用電泳、HLPC或質(zhì)譜分析。
本發(fā)明還提供一種治療與adipocyspin失調(diào)有關(guān)的疾病狀態(tài)的方法，包括施用有效量的含有adipocyspin多肽的藥物上可接受的化合物。
adipocyspin多肽在制備帶有或未帶有藥物上可接受的賦形劑、助活性劑、稀釋劑和包封容器的藥物、在制備用于哺乳動物的藥物組合物或藥物或藥劑中的應(yīng)用i)在治療與adipocyspin多肽調(diào)控有關(guān)的疾病狀態(tài)中；或ii)來增強(qiáng)胰島素的作用；或iii)抑制與增加的肥胖質(zhì)量有關(guān)的肥胖癥或狀態(tài)。


圖1表示在脂肪轉(zhuǎn)化過程中誘發(fā)的低分子量的脂肪細(xì)胞分泌的蛋白分離的2維電泳(2-DE)，其中在分化誘發(fā)的8天后，用PBS洗滌未融合的3T3-L1前脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞3次，然后和不含血清的DMEM一起培養(yǎng)4小時(shí)。收集，濃縮培養(yǎng)基，并且通過2-DE分離來自每個(gè)樣品的50μg蛋白，并且用銀染色以清楚顯現(xiàn)，用箭頭表示在脂肪細(xì)胞中優(yōu)先分泌出來的蛋白。
圖2表示通過反相HPLC和氨基酸序列測定得到的新型脂肪細(xì)胞分泌的產(chǎn)物的微觀特征。點(diǎn)對應(yīng)于如圖1的multiple考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠中切除的脂肪細(xì)胞-特異的蛋白，并且用胰蛋白酶消化。由RPHPLC分離胰蛋白酶的肽混合物來分離肽，并且圖表表示顯示RP HPLC部分的氨基酸序列。
圖3表示adipocyspin的序列分析，其中(A)是小鼠adipocyspin的氨基酸序列，(B)是小鼠adipocyspin的簡圖，(C)是小鼠adipocyspin和小鼠cystatin C的類似cystatin區(qū)域的比對。
圖4表示轉(zhuǎn)染COS 7細(xì)胞分泌的adipocyspin。COS 7由編碼COOH端被FLAG標(biāo)記的全長adipocyspin的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，然后在DMEM中生長48小時(shí)。然后收集細(xì)胞培養(yǎng)基并且使用Vivian濃縮器(分子量截至(MWCO)為5000Da)濃縮。用SDS-PAGE分離來自細(xì)胞沉淀或培養(yǎng)基的20μg蛋白，并且用抗FLAG單克隆抗體或抗-β微管蛋白單克隆抗體探測。在細(xì)胞介質(zhì)中很容易地探測到adipocyspin，而β微管蛋白無法探測。
圖5表示adipocyspin mRNA的分化依賴的表達(dá)。在激素分化后的指示時(shí)間點(diǎn)上從NIH 3T3細(xì)胞或從3T3 L1細(xì)胞中純化總RNA。使用32P標(biāo)記的adipocyspin DNA對來自每個(gè)樣品的10μg總RNA進(jìn)行RNA印跡分析。在adipocyspin邊上的18S RNA雜交信號表示為RNA加載的對照。
圖6表示肥胖小鼠(ob/ob)中adipocyspin基因表達(dá)的調(diào)節(jié)異常，通過RNA印跡分析對來自瘦肉(ob/+)或肥胖(ob/ob)頰脂墊的10μg總RNA進(jìn)行分析。如所示，用對應(yīng)于adipocyspin和脂聯(lián)素的32P標(biāo)記的cDNAs探測相同的膜。如圖5，18S RNA雜交信號表示為RNA加載的對照。
圖7顯示出adipocyspin抑制3T3 L1前脂肪細(xì)胞的分化。如圖4所示，從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS 7細(xì)胞中純化FLAG標(biāo)記的adipocyspin。從沒有20μg FLAG標(biāo)記的adipocyspin下(結(jié)果顯示于A)或從存在20μgFLAG標(biāo)記的adipocyspin下(結(jié)果顯示于B)誘發(fā)3T3 L1細(xì)胞進(jìn)行分化，其中每一個(gè)載物片在分化后第6天取出。用油紅O對細(xì)胞染色，在光學(xué)顯微鏡下目測。
圖8表示出adipocyspin抑制脂肪細(xì)胞中脂肪細(xì)胞-特異性基因產(chǎn)物的表達(dá)，其中在沒有(泳道1)或存在(泳道2)20μg FLAG標(biāo)記的adipocyspin的情況下分化3T3 L1細(xì)胞。如圖7所示，每一個(gè)載物片在分化后第6天取出，其中如圖5，通過RNA印跡分析對來自這些細(xì)胞的10μg總RNA進(jìn)行分析，并且用對用于PPARγ或GLUT4的32P標(biāo)記的cDNAs進(jìn)行探測。
圖9顯示小鼠，大鼠，人和雞的adipocyspin的cDNA序列。
圖10顯示人和雞的adipocyspin的蛋白序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明不限于所述中的特定方法、方案、細(xì)胞系、載體、組合物和試劑，因?yàn)樗鼈兪强梢宰兓?。還要知道此處所用的術(shù)語僅為了描述特定具體實(shí)施方案的目的，而并非限定權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的范圍。
I.普通技術(shù)除非另外說明，本發(fā)明的實(shí)踐可以使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、核酸化學(xué)、和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其均在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。在如下文獻(xiàn)中全部說明了這些技術(shù)例如，Molecular CloningA Laboratory Manual，second edition(Sambrook et al.，1989)和Molecular CloningA Laboratory Manual，thirdedition(Sambrook和Russel，2001)，(此處聯(lián)合作為“Sambrook”引用)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，including supplements through 2001)；PCR；The Polymerase ChainReaction，(Mullis et al.，eds.，1994)；；Harlow和Lane(1988)Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York，和Harlow和Lane(1999)Using AntibodiesA Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(此處聯(lián)合作為“Harlow and Lane”引用)，Beaucage et al，eds.，Current Protocols inNucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons，Inc.，New York 2000)。
II.定義此處所用的術(shù)語“等位基因”或“等位序列”是指編碼adipocyspin多肽的基因(如編碼adipocyspin多肽的多核苷酸)的天然的交替形式。等位基因得自突變(如核酸序列的變化)，且有時(shí)會產(chǎn)生變化的和/或不同調(diào)整的mRNAs或多肽，其結(jié)構(gòu)和/或功能可以或不發(fā)生變化。會產(chǎn)生等位基因的普通突變歸于可能或不影響編碼的氨基酸的核苷酸的自然缺失、添加或取代。這些類型的變化的每一種可以單獨(dú)發(fā)生、與其他的一起發(fā)生或在給定的基因、染色體或其他細(xì)胞多核苷酸中發(fā)生一次或多次。任何給定的基因可以沒有、或有一個(gè)或多個(gè)等位基因形式。如此處所用，術(shù)語“等位基因”是指從基因轉(zhuǎn)錄過來的任一或全部基因或mRNA。
如此處所用，術(shù)語“氨基酸”是指天然或合成的氨基酸，以及氨基酸類似物，非天然的氨基酸，和以類似于天然的氨基酸的方式運(yùn)作的氨基酸模擬物。天然的氨基酸是那些由遺傳編碼編碼的氨基酸，和那些隨后修飾的氨基酸，如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，如結(jié)合到氫、羧基、氨基和R基團(tuán)的α-碳，如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。這樣的類似物具有修飾的R基團(tuán)(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保持與天然的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有與氨基酸普通化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，但以類似于天然的氨基酸的方式運(yùn)作的化學(xué)化合物。
術(shù)語“反義序列”是指具有序列互補(bǔ)或理想地或有用地與RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸。這些術(shù)語特別表示結(jié)合到mRNA或其部分來通過核糖體阻斷mRNA的翻譯的核酸序列。反義方法通常是本領(lǐng)域公知的(見，如PCT出版物WO 94/12633和Nielsen等人，1991，Science2541497；OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES，A PRACTICALAPPROACH，edited by F.Eckstein，IRL Press at Oxford University Press(1991)；ANTISENSE RESEARCH AND APPLICATIONS(1993，CRCPress))。
術(shù)語“組合物”是指包括特定的或其他含量的特定成分的產(chǎn)物，和任何直接或間接得自特定的或其他含量的特定成分的組合的產(chǎn)物。
當(dāng)描述多肽時(shí)，術(shù)語“保守性取代”是指多肽的氨基酸組合物的變化，其基本上沒有改變多肽的活性，如氨基酸被與其它具有相似性質(zhì)的氨基酸取代，以使甚至主要(even critical)的氨基酸的取代基本上沒有改變活性。提供功能相似的氨基酸的保守性取代圖表是本領(lǐng)域公知的。下列六組的每一個(gè)都含有與另一個(gè)進(jìn)行保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(1)；2)天門冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天門冬酰胺(N)，谷酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(1)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V)；和6)苯基丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)(見，Creighton，1984，Proteins，W.H.Freeman and Company)。
除了上述的保守性取代以外，氨基酸殘基的其他修飾會導(dǎo)致“保守性修飾的變體”。例如，一個(gè)可以與所有的作為彼此置換的帶電氨酸有關(guān)，無論其是陽性或是陰性。此外，保守性修飾的變體還可以得自單獨(dú)的取代、缺失或添加，其改變、添加或去掉單獨(dú)氨基酸或小部分氨基酸(如通常在編碼序列中少于5％)。進(jìn)一步地，保守性修飾的變體還可以通過用相同氨基酸的不同密碼子來取代用于自然或野生類基因的氨基酸密碼子來從重組多肽中制得。
術(shù)語“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”包括增強(qiáng)子、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、復(fù)制起點(diǎn)、染色體整合序列、5′和3′非翻譯區(qū)域，其中多肽或其它生物分子相互作用來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或翻譯。對于真核細(xì)胞，控制序列包括啟動子和優(yōu)選地增強(qiáng)子，如來自免疫球蛋白基因，SV40，巨細(xì)胞病毒，和多聚腺苷酸化序列，并且可以包括剪接供體和受體序列。根據(jù)所使用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的包括組成型的和可誘導(dǎo)的啟動子的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。當(dāng)涉及adipocyspin時(shí)，除自然與adipocyspin編碼序列有關(guān)的啟動子以外的啟動子可以為“異源”啟動子。
如此處所用，“衍生而得的”多核苷酸、寡核苷酸或核酸是指包括衍生取代基的寡-和多核苷酸。在一些具體實(shí)施方案中，取代基基本上不妨礙與互補(bǔ)多核苷酸的雜交。由附屬的化學(xué)取代基修飾的(如通過已經(jīng)合成的寡-或多核苷酸修飾，或通過在合成過程中加入修飾基或主鏈類似物)衍生而得的寡-或多核苷酸可以加入到代謝狀態(tài)的活性真核細(xì)胞中來與adipocyspin DNA、RNA或蛋白雜交，其中它們會對現(xiàn)有(local)DNA、RNA或蛋白產(chǎn)生改變或化學(xué)修飾?；蛘?，衍生而得的寡-或多核苷酸可以相互作用并且改變adipocyspin多肽，或者可以與adipocyspin DNA或adipocyspin基因產(chǎn)物相互作用，或者改變或調(diào)整adipocyspin DNA、RNA或蛋白的表達(dá)或功能的蛋白。示例性的附加化學(xué)取代基包括，例如德卟啉(texaphyrin)銪(III)，交聯(lián)劑，補(bǔ)骨脂素，金屬螯合物，(如用于鐵催化分裂的鐵/EDTA螯合物)，拓樸異構(gòu)脢，核酸內(nèi)切酶，核酸外切酶，連接酶，磷酸二酯酶，光力學(xué)卟啉，化學(xué)療法藥物(如阿霉素，doxirubicin)，嵌入劑，堿基修飾劑，免疫球蛋白鏈，和寡核苷酸。鐵/EDTA是通常使用的化學(xué)取代基，其中核酸序列的現(xiàn)有分裂是理想的(Hertzberg等人，1982，J.Am.Chem.Soc.104313；Hertzberg and Dervan，1984，Biochemistry 233934；Taylor et al.，1984，Tetrahedron 40457；Dervan，1986，Science 232464)。示例性的添加化學(xué)物包括直系，如通過附屬活性氨基(Corey and Schultz，1988，Science，2381401)和其它直系化學(xué)物，盡管鏈霉抗生物素蛋白/生物素和異羥基洋地黃毒甙配基/抗異羥基洋地黃毒甙配基d抗體鏈方法也可以使用。連接化學(xué)取代基的方法描述于美國專利5,135,720，5,093,245，和5,055,556，其它連接的化學(xué)物可以由專業(yè)人員自行決定使用。
如此處所用，“可檢測標(biāo)記”具有本領(lǐng)域的常規(guī)含義，且表示檢測或用于檢測(如，由于物理或化學(xué)性質(zhì))的原子(如放射性核)、分子(如熒光素)或復(fù)合物，表示分子的存在或其能通過共價(jià)鍵或其它與另一分子連接。術(shù)語“標(biāo)記”還表示共價(jià)鍵連或其它連接的分子(如酶的雙分子)，其可以作為基質(zhì)來產(chǎn)生可檢測到的原子、分子或復(fù)合物。適用于此處的可檢測標(biāo)記包括，例如，通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)，化學(xué)儀器等可檢測到的任何組合物。
術(shù)語“抗原決定部位”具有其在由抗體識別的抗原上的位置的傳統(tǒng)含義。典型地，抗原決定部位是作為整個(gè)多肽的小部分的氨基酸片段。抗原決定部位可以是構(gòu)象的(如不連續(xù)的)。也就是，它們可以從由通過蛋白折疊效應(yīng)相鄰的原始序列的不鄰接部分編碼的氨基酸中形成。
術(shù)語“融合蛋白”表示復(fù)合多肽，如單獨(dú)鄰近的氨基酸序列，由兩個(gè)(或兩個(gè)以上)在單一氨基酸序列中通常不會融合在一起的明顯異源的多肽組成。因此，融合蛋白可以包括含有兩個(gè)完全不同的氨基酸序列或兩個(gè)相似或相同的多肽序列(條件是這些序列通常在自然界的單一氨基酸序列的相同構(gòu)象中不能一起發(fā)現(xiàn))的單一氨基酸序列。通常使用重組核酸的方法來制備融合蛋白，即從重組基因熔融產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯中獲得，其熔融包括編碼多肽的片段和編碼異源多肽的片段，或通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成方法來制備融合蛋白。
術(shù)語“基因產(chǎn)物”表示從基因或由基因編碼的多肽中或從RNA翻譯的RNA分子。
此處所用的用于如IgG抗體的術(shù)語“高親和力”表示至少約106M-1，優(yōu)選至少約108M-1，更優(yōu)選至少約109M-1或更高，例如至多1012M-1或更高的結(jié)合常數(shù)(Ka)。但是，“高親和力”結(jié)合對其它抗體的同位型發(fā)生變化。
術(shù)語“免疫原”和“致免疫的”具有它們在本領(lǐng)域中的原始含義，即免疫原為能在對人體或動物進(jìn)行注射后引起適應(yīng)性免疫響應(yīng)的分子，如多肽或其它抗原。
以其各種形式在此使用的前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的術(shù)語“調(diào)節(jié)子”和“調(diào)整”表示與特定細(xì)胞表面受體、優(yōu)選adipocyspin受體相關(guān)的活性的對抗作用、主動作用，部分對抗作用和/或部分主動作用。在各種具體實(shí)施方案中，“調(diào)節(jié)子”可以抑制或刺激adipocyspin表達(dá)或活性。這樣的調(diào)節(jié)子包括與adipocyspin功能或表達(dá)促進(jìn)或?qū)沟男》肿樱环戳x和核酶核酶的三聯(lián)多核苷酸；基因療法等。
術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”可交互使用，表示脫氧核苷酸或核糖核酸及其單-或雙鏈形式的聚合物。除非特別限定，多核苷酸序列的公開也表示互補(bǔ)的序列。如此處所用，術(shù)語“多核苷酸”包括寡核苷酸。
術(shù)語“寡核苷酸”或“低聚物”表示具有大約7個(gè)核苷酸或更多，多至大約100個(gè)核苷酸的核酸序列，例如其可以用作引物或探針。通常，寡核苷酸在長度上具有約10到約50個(gè)核苷酸，優(yōu)選具有約12到約50核苷酸，經(jīng)常在約15到約25核苷酸之間變化。
術(shù)語“可操作地連接”表示兩個(gè)或兩個(gè)以上多核苷酸(如DNA)片段之間的功能性關(guān)系如啟動子或增強(qiáng)子可操作地與編碼序列鏈接，如果其能在合適的宿主細(xì)胞或其它表達(dá)系統(tǒng)中刺激序列的轉(zhuǎn)錄。通常，可操作鏈接的序列是鄰近的，在單個(gè)序列的情況下，均是鄰近的且在可讀相中。但是，增強(qiáng)子并不需要處于接近其轉(zhuǎn)錄需要增強(qiáng)的編碼序列。
術(shù)語“肽類似的”或“類似的”表示具有基本上與一個(gè)或多個(gè)adipocyspin多肽相同結(jié)構(gòu)的或功能特征的合成化學(xué)化合物。通常，肽類似物用于藥物工業(yè)中來作為非肽藥物，其具有與三聯(lián)肽類似的性質(zhì)。這些類型的非肽化合物為“肽類似的”(Fauchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber and Fieidinger TINS p.392(1985)；和Evans等人，J.Med.Chem.301229(1987)，其均并入此處作為參考)。結(jié)構(gòu)類似于治療使用的肽的肽類似物可以用于產(chǎn)生相當(dāng)或增加的治療或預(yù)防性效果。通常，肽類似物與示例性多肽(即具有生物或藥物活性的多肽)結(jié)構(gòu)相似，如adipocyspin，但是具有任選有選自以下的鍵替代的一個(gè)或多個(gè)肽鍵如，-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(順式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-，和-CH2SO-。類似物可以全部由氨基酸的合成的非天然類似物組成，或者其是部分天然肽的氨基酸和氨基酸的部分非天然類似物的嵌合分子。類似物還可以與任何量的天然氨基酸的保守性取代基結(jié)合，只要這些取代基基本上不會改變類似物的結(jié)構(gòu)和/或活性。例如，在本專利中可以確定類似的化合物，如果它具有進(jìn)行結(jié)合或adipocyspin酶活性的能力。
通過“藥物上可接受的”表示，例如，能與配方的其它成分相溶的載體、稀釋液或賦形劑，并且對其的接受者不會有害或不理想地具有害處。
術(shù)語“多肽”在此處可與術(shù)語“蛋白”交互使用，并且表示由酰胺鍵連接的氨基酸殘基組成的聚合物，包括合成的，天然的和非天然的它們的類似物(氨基酸和鍵)。肽是多肽的例子。
如此處所用，當(dāng)用于描述多核苷酸和抗體時(shí)，“探針”表示特異性的或理想地結(jié)合其它分子的分子。探針的一個(gè)例子是“核酸探針”，其可以是DNA、RNA或其它多核苷酸。當(dāng)給出核酸探針的特定序列時(shí)，已知也可以確定和包括互補(bǔ)的鏈股?；パa(bǔ)的鏈股在靶向?yàn)樘禺愋越Y(jié)合(如退火或雜交)到基本上互補(bǔ)的核酸上的雙鏈核酸的位置上同樣運(yùn)行。探針的另一個(gè)例子是特異性結(jié)合到相應(yīng)抗原或抗原決定部位的“抗體探針”。
術(shù)語“重組”表示體外合成或操作的多核苷酸(如“重組多核苷酸”)，表示使用重組多核苷酸在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法，或表示由重組多核苷酸編碼的多肽(“重組蛋白”)。因此，例如，可以通過其產(chǎn)生方法或其結(jié)構(gòu)定義“重組”多核苷酸。當(dāng)涉及產(chǎn)生方法時(shí)，過程為重組核酸技術(shù)的使用，如，包括核苷酸序列中的人為干涉，典型地選擇或生產(chǎn)?；蛘?，通過產(chǎn)生包括兩個(gè)片段(其彼此是非天然相近的，但表示排除自然產(chǎn)物)的融合的序列來制得多核苷酸。因此，例如，當(dāng)產(chǎn)物是含有通過任何合成寡核苷酸的方法衍生的序列的多核苷酸時(shí)，可以包括通過任何非天然的載體轉(zhuǎn)換細(xì)胞得到的產(chǎn)物。類似地，“重組”多核苷酸是從重組多核苷酸表達(dá)的一種。
術(shù)語“選擇性雜交”表示與特定靶向DNA或RNA序列雜交、雙連或結(jié)合至理想程度的多核苷酸探針，當(dāng)靶序列存在于總細(xì)胞DNA或RNA的制備中時(shí)。
當(dāng)涉及抗體與蛋白或多核苷酸之間的相互作用時(shí)，術(shù)語“特異性免疫活性的”或“特異性結(jié)合”表示以相對高的親和力特異性識別和結(jié)合到蛋白，如adipocyspin，以使得這樣的結(jié)合可以確定在異種類群蛋白或其它生物體中蛋白的存在的抗體。因此，在指定的免疫測定條件下，特異性抗體與特定多肽結(jié)合并且不會以明顯或特別不理想的量與其它存在于樣品中的多肽結(jié)合?？梢允褂酶鞣N免疫測定形式來選擇對特定多肽具有免疫活性或特異性免疫活性的抗體。例如，可以常規(guī)地使用固相ELISA免疫測定來選擇對多肽具有特異性免疫活性的單克隆抗體。見，Harlow，1988，ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New York(此處為“Harlow”)，其是用于確定特異性免疫活性的免疫測定形式和條件的描述。
如此處所用，“基本上序列相同”或“基本上相同”(用于對比兩個(gè)或兩個(gè)以上多肽或多核苷酸的上下文中)表示具有至少60％，優(yōu)選80％，最優(yōu)選90％，95％，98％或99％核苷酸或氨基酸殘基相同的兩個(gè)或兩個(gè)以上序列或子序列，當(dāng)通過使用下列序列對比算法或通過目測來對比和排列最大對應(yīng)程度時(shí)。可以根據(jù)全長(如，如果它們具有基本上不同的長度，全長為兩個(gè)中稍短的長度)或根據(jù)子序列(如至少約50，約100，約200，約500或約1000鄰近的核苷酸或至少約10，約20，約30，約50或約100鄰近的氨基酸殘基)來比較兩個(gè)序列。如此處所用的基本上相同的多肽優(yōu)選具有普通功能的活性(如生物活性)。
對于序列的比較，典型地，一個(gè)序列作為參考序列，測試序列與該序列相比。當(dāng)使用序列對比算法時(shí)，將測試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，指明子序列坐標(biāo)，如果需要，指明序列算法程序參數(shù)。然后序列對比算法計(jì)算出測試序列相對于參考序列相同的序列百分?jǐn)?shù)，以指明的程序參數(shù)計(jì)。
可以通過Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部相同算法，通過Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的相同排列算法，通過Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444(1988)對類似方法的研究，通過這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA)，或通過目測(見，Ausubel等人，Current Protocols In Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(2001年的增刊))來進(jìn)行最佳化排列的序列的對比。當(dāng)使用上述任何算法時(shí)，使用“Window”長度、空隙罰分等默認(rèn)參數(shù)。
適于確定序列相同百分率和序列相似度的算法的一個(gè)例子是BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.BioI.215403-410(1990)。進(jìn)行BLAST分析的軟件是公開的，來自National Center forBiotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。這個(gè)算法包括通過確定詢問序列中長度W的短字符來首先確定高分的序列對(HSPs)其當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列的相同長度的字符排列時(shí)匹配或滿足一些正的閾值T。T表示鄰域字符閾值(Altschun等人，supra)。這些最初的鄰域字符的碰擊作為發(fā)起搜索包含它們的較長HSPs的種子。然后沿著每個(gè)序列的兩個(gè)方向延伸這些字符的碰擊直至積累的排列分值有所增加。每個(gè)方向中字符碰擊的延伸會停止當(dāng)通過從其最大的可達(dá)到值定量X來使積累排列分值下降時(shí)；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)值殘基的排列的累積累積排列分值會達(dá)到0或更低；或到達(dá)任一序列的終端。BLAST算法參數(shù)W，T和X確定排列的敏感度和速度。BLAST程度使用11個(gè)的字符長度(W)，BLOSUM 62分值矩陣(見，Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))，50的排列(B)，10的預(yù)期(E)，M＝5，N＝4且兩股的比較作為默認(rèn)值。
除計(jì)算序列相同百分率以外，還可以使用BLAST算法進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似度的統(tǒng)計(jì)分析(見，如Karlin & Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一種相似度的測量是最小的加合可能性(P(N))，其提供一種在兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶然發(fā)生的匹配的可能性的指示。例如，如果測試核酸和參考核酸的對比中的最小加合可能性為小于約0.1，優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001時(shí)，認(rèn)為核酸與參考序列相似。
兩種核酸序列或多肽基本上相同的進(jìn)一步指示是第一多肽(如由第一核酸編碼的多肽)與第二多肽(如由第二核酸編碼的多肽)免疫性交叉反應(yīng)。因此，典型地，多肽基本上與第二多肽相同，例如其中兩種肽僅僅保守性取代不同。
兩種核酸序列基本上相同的另一指示是在嚴(yán)格條件下兩個(gè)分子互相雜交。當(dāng)?shù)湫偷?，使用衍生自探針核苷酸序列的至少約50個(gè)鄰近核苷酸，在嚴(yán)格雜交作用下使這些片段與鏈股或其互補(bǔ)物雜交時(shí)，存在基本上的相同。
典型地，如果偶然發(fā)生的觀察到的不同的可能性(p值)小于一些預(yù)定水平時(shí)，確定為“統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的”不同。如此處所用的“統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的不同”表示小于0.05，優(yōu)選小于0.01，最優(yōu)選小于0.001的p值。
典型地，“嚴(yán)格的雜交條件”表示靶向序列的溶解溫度(Tm)以及精確或接近精確補(bǔ)充靶向的探針以下的約5℃到約20℃或25℃的范圍內(nèi)。如此處所用，溶解溫度是雙鏈核酸分子群半分離成單鏈時(shí)的溫度。計(jì)算核酸Tm的方法是本領(lǐng)域公知的(見，如Berger和Kimmel，1987，Methods In Enzymology，Vol.152Guide To Molecular CloningTechniques)San DiegoAcademic Press)Inc.和Sambrook等人，supra；(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Vols.1-3，ColdSpring Harbor Laboratory)。如標(biāo)準(zhǔn)參考所示，可以通過以下方程式計(jì)算Tm值的簡單評估Tm＝81.5+0.41(％G+C)，當(dāng)核酸為1M NaCl的溶液時(shí)(見，如Anderson和Young，“Quantitative Filter Hybridization”inNucleic Acid Hybridization(1985))。其它參考包括需要考慮用于計(jì)算Tm結(jié)構(gòu)和序列特征的更復(fù)雜計(jì)算。雜交的溶解溫度(由此為嚴(yán)格雜交的條件)受各種因素影響，如探針的長度和性質(zhì)(DNA，RNA，堿性組合物)和靶向的性質(zhì)(DNA，RNA，堿性組合物，存在于溶液中或非流動的，等)，和鹽和其它組分的濃度(如，存在或不存在甲酰胺，葡聚糖硫酸酯，聚乙二醇)。這些因素的影響是已知的，且在本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考中有所討論(見，如Sambrook，supra，和Ausubel，supra)。典型地，嚴(yán)格雜交條件為小于約1.0M鈉離子，典型在7.0-8.3pH值時(shí)約0.01-1.0M鈉離子的鹽濃度，和對短探針(如10到50核苷酸)為至少約30℃和對長探針(如大于50核苷酸)為至少約60℃的溫度。如所知，還可以通過加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺來達(dá)到嚴(yán)格條件，其中可以使用低溫。
當(dāng)涉及蛋白或多肽，如adipocyspin時(shí)，術(shù)語“基本上純的”或“分離的”表示整個(gè)或部分從蛋白或其它與它們自然相關(guān)的內(nèi)容物中分離出來的那些多肽。如，當(dāng)含有蛋白的組合物中的蛋白占大于約50％總蛋白含量時(shí)，典型地大于約60％總蛋白含量時(shí)，認(rèn)為蛋白或多肽是基本上純的。更典型地，基本上純的或分離的蛋白或多肽占總蛋白的至少75％，更優(yōu)選至少90％。優(yōu)選地，蛋白占組合物中總蛋白的大于約90％，更優(yōu)選大于約95％。當(dāng)涉及多核苷酸時(shí)，術(shù)語“基本上純的”或“分離的”通常表示從一般與如脂類，蛋白或其它多核苷酸相關(guān)的內(nèi)容物中分離出來的多核苷酸?；旧霞兊幕騿为?dú)的多核苷酸大于約50％的純度。典型地，這些多核苷酸大于約60％純度，更典型地為約75％到約90％純度，優(yōu)選為約95％到約98％純度。
術(shù)語“治療有效量“表示由研究人員、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)師試圖引出的組織、系統(tǒng)、動物或人體的生物或醫(yī)學(xué)響應(yīng)的目標(biāo)化合物的量。
如此處所用，“生物效果”包括前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
我們發(fā)現(xiàn)并且描述了一種新型的脂肪細(xì)胞分泌的因子，稱之為“adipocyspin”(具有17kDa的清楚分子量和9.4的pI值)。其優(yōu)選從3T3 L1脂肪細(xì)胞中表達(dá)并分泌出來，但不會來自相應(yīng)的前脂肪細(xì)胞。我們還發(fā)現(xiàn)下列氨基酸序列分析和cDNA克隆，其中這個(gè)蛋白含有假定的分泌作用的信號肽，隨后是與半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有一些序列同源的區(qū)域。在3T3 L1前脂肪細(xì)胞中不能目測到adipocyspin mRNA，而在隨后的激素引發(fā)的脂肪轉(zhuǎn)化中明顯增加。其在脂肪組織中的表達(dá)在肥胖狀態(tài)下明顯增加。
從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS 7細(xì)胞中純化的FLAG標(biāo)記的adipocyspin的處理后3T3 L1細(xì)胞對脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化受到明顯抑制。脂肪細(xì)胞上的調(diào)節(jié)表達(dá)模型和抑制效果支持我們的發(fā)現(xiàn)，即adipocyspin在脂肪形成的反饋調(diào)節(jié)中起作用。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)adipocyspin可以下調(diào)前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。該化合物的使用包括，例如在關(guān)于增加的或降低的或異常的或不理想的前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率的情況下的施用或抑制，如與脂肪細(xì)胞增生有關(guān)的那些。使用還包括肥胖的治療和用于減重和/或防止體重增加。
其它的應(yīng)用包括脂聯(lián)素或其活性片段的施用。施用可以在缺乏脂聯(lián)素的狀態(tài)，或在其中額外的或增加的脂聯(lián)素活性是理想的狀態(tài)或情況下。
在一方面，提供具有哺乳動物(如大鼠，小鼠或人)的adipocyspin基因或DNA或RNA的序列或子序列的多核苷酸。多核苷酸(如RNA，DNA，PNA或嵌合體)可以是單鏈的、雙鏈的或混合的雜種。
多核苷酸可以具有編碼SEQ ID NO1(圖1)或SEQ ID NO2的序列或其任何子序列(如含有至少約15，至少約25，至少約50，至少約100，至少約200，或至少約500基的多核苷酸或其變體)的多肽的序列。也包括基本上與此處公開的adipocyspin多核苷酸的序列相同的多核苷酸。因此，還提供哺乳動物(如人)adipocyspin基因的天然的等位基因，如人的編碼SEQ ID NO2的分子的adipocyspin多核苷酸的等位基因變體。
如此處所述，在一些具體實(shí)施方案中，多核苷酸對具有與SEQ IDNO1(圖1)，SEQ ID NO2，SEQ ID NO9，或SEQ ID NO10類似的基本序列的多肽編碼，或編碼這種多肽(包括如融合蛋白)的生物活性或免疫活性片段；或衍生自該片斷的嵌合、變異和/或進(jìn)化形式。由于遺傳編碼的退化，還包括編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的多肽或其生物活性或免疫活性片段的不同多核苷酸。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供不必需編碼adipocyspin多肽而用于，如探針、引物、反義、三聯(lián)、RNAi或核酶試劑等的adipocyspin多核苷酸。
還提供表達(dá)載體、細(xì)胞、細(xì)胞系和基因轉(zhuǎn)錄的生物體，其包括一種或多種編碼adipocyspin的adipocyspin多核苷酸和/或一種或多種這種多肽的生物活性或免疫活性片段。在一些具體實(shí)施方案中，載體、細(xì)胞和生物體能夠表達(dá)編碼的adipocyspin多肽和片段。
可以通過重組的方式產(chǎn)生adipocyspin多核苷酸和多肽，或其任一的片段。見，如Sambrook等人，Berger和Kimmel，(1987)Methods InEnzymology，Vol.152Guide To Molecular Cloning Techniques，SanDiegoAcadmic Press，Inc.；Ausubel等人，Current Protocols In MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(2001)?；蛘?，可以使用本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法化學(xué)合成adipocyspin多核苷酸、多肽或其任一的片段(見，如Narang等人，1979，Meth.Enzymol，6890；Brown等人，1979，Meth.Enzymol.68109；Beaucage等人，1981，Tetra.Lett.，221859)。在一些具體實(shí)施方案中，adipocyspin多核苷酸包括，如非天然產(chǎn)生的堿基，如脫氧肌苷(見，Batzer等人，1991，Nucleic AcidRes.195081；Ohtsuka等人，1985，J.Biol.Chem.2602605-2608；Rosslini等人，1994，Mol.Cell.Probes 891-98)或修飾的主鏈殘基或鍵，如肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯主鏈、硫代磷酸酯(phosphorothioate)主鏈等。
編碼adipocyspin的多核苷酸可以適于各種突變或進(jìn)化的方法來產(chǎn)生公開序列的變體?？梢赃x擇變體來保持所希望的生物活性，并且可以理想地在這樣的活性中變化變體。在這樣的變體產(chǎn)生之后或過程中發(fā)生該選擇過程?？梢允褂没瘜W(xué)或生物的突變方法，包括分離的核苷酸或宿主細(xì)胞的化學(xué)處理、定點(diǎn)突變技術(shù)、隨機(jī)生物突變方法(包括在較差保真條件下的復(fù)制)、和定向的進(jìn)化技術(shù)。多核苷酸可以適于使用此處所述的序列的DNA改組技術(shù)，如Stemmer所述那些(美國專利Nos.5,605,793；5,811,238；5,830,721)。多核苷酸可以適于體系的組合式突變方法，如Huse所述的那些。還可以使用在蛋白每一位置上的所有突變體的體系分析，并且可以使用一系列位置-特異性的退化核苷酸來完成分析(見，美國專利Nos.6,054,267；5,939,250；5,763,239；6,537,776；6,238,884；6,171,820；5,830,696；5,965,408和5,955,358)。還可以使用偏向的突變方法，包括基于取代矩陣的文庫的使用(Schellenberger等的2002年10月24日公開的美國專利2020155460A1)。還提供這些方法的結(jié)合。提供產(chǎn)生這些突變體的方法，來作為此處所述的加入這些adipocyspin變體的adipocyspin的使用方法。
在一方面，提供編碼adipocyspin多肽及其片段的多核苷酸，如具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的adipocyspin多肽，其生物活性或免疫活性(如抗原的)片段，其變體(如保守性的或等位變體)，或adipocyspin融合多肽。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，多核苷酸包括、基本上由、或由編碼SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO9、或SEQID NO10序列的多核苷酸或其片段組成。在另一方面，多核苷酸編碼具有不同序列(如由于種類序列的區(qū)別和/或遺傳編碼的退化)的天然的adipocyspin多肽或片段。在一些具體實(shí)施方案中，多核苷酸是除表達(dá)序列標(biāo)記H67224、AI1131555、AA215577、AW190975或AI769466或編碼牛PPR 1的多核苷酸(Matsuoka等人，1993，Biochem Biophys ResComm 194540-11)以外的那些。
例如，多核苷酸可以用于調(diào)整adipocyspin多核苷酸(如正義或反義DNAs和RNAs)和多肽、或其任一的片段的表達(dá)。用于重組多核苷酸和多肽的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域公知的。典型地，在用于制備adipocyspin多肽和多核苷酸及其片段的表達(dá)載體中使用多核苷酸。典型地，表達(dá)載體可以包括轉(zhuǎn)錄的和/或翻譯的控制信號(如轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件、啟動子、核糖體-結(jié)合位點(diǎn)，和ATG起始密碼子)。此外，可以通過適于使用中的細(xì)胞體系的增強(qiáng)子來增強(qiáng)表達(dá)的效果。例如，可以使用SV40增強(qiáng)子或CMV增強(qiáng)子來增加哺乳動物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
因此，例如將編碼adipocyspin多肽或片段的DNA插入能導(dǎo)入到體外宿主細(xì)胞中和在體外宿主細(xì)胞中表達(dá)的DNA構(gòu)建子中，所述細(xì)胞例如細(xì)菌(如E.Coli，Bacillus subtilus)、酵母菌(如Saccharomyces)、昆蟲(如Spodoprera frugiperda)、或哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)體系。用于多肽表達(dá)和產(chǎn)生的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)體系的例子包括人胚腎細(xì)胞系(293；Graham et al.，1977，IGen.Virol.3659)；CHO(ATCC CCL 61和CRL 9618)；人宮頸癌細(xì)胞(He La，ATCC CCL 2)；和本領(lǐng)域其它公知的。可用的人和非人類細(xì)胞系來源很廣，例如來自American TypeCulture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108(見http//www.atcc.org)。表達(dá)多肽的哺乳動物組織細(xì)胞培養(yǎng)物的使用通常描述于Winnacker，F(xiàn)ROM GENES TO CLONES(VCH Publishers，N.Y.，1987)和Ausubel，supra。
在各個(gè)體系中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子可以用于哺乳動物細(xì)胞系中的表達(dá)。適合的啟動子是組成型的、細(xì)胞類型特異性的、階段特異性的、和/或可調(diào)整或可控制的(如通過如糖皮質(zhì)激素的激素)?？捎玫膯幼影?，但不限于金屬硫蛋白啟動子、組成型的腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導(dǎo)的MMTV啟動子、SV40啟動子和本領(lǐng)域公知的啟動子-增強(qiáng)子結(jié)合物。
可以使用通過本領(lǐng)域公知方法能整合到宿主細(xì)胞染色體的適當(dāng)表達(dá)載體來在基因轉(zhuǎn)錄的動物(小鼠、羊、牛等)和植物(煙草、擬南芥(Arabidopsis)等)中表達(dá)adipocyspin和多肽或其任一的片段。
還提供用于檢測或擴(kuò)增adipocyspin多核苷酸的寡核苷酸或多核苷酸探針和/或引物。多核苷酸(如探針和引物)可以包括，或基本上由，或由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2多肽中的編碼至少約5個(gè)氨基酸，通常至少約10-12個(gè)氨基酸，典型地至少約15個(gè)氨基酸，通常至少約18個(gè)氨基酸，普遍至少約25個(gè)氨基酸(盡管它們還可以是50-100個(gè)氨基酸或更多)的連續(xù)堿基組成。當(dāng)使用adipocyspin多核苷酸來作為探針或引物時(shí)，它們通常在長度上少于約3000堿基；典型地，它們含有約12到約500個(gè)編碼與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2相同或精確互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸，更普遍為約12到約50連續(xù)核苷酸，甚至更普遍為約15到約25連續(xù)核苷酸。
還可以通過將限制位點(diǎn)加入探針或引物來修飾探針和引物。引物或探針還可以包括額外的序列，例如連接子。此外，可以用可檢測標(biāo)記修飾引物或探針。例如，引物和探針可以是放射性標(biāo)記的，可以進(jìn)行化學(xué)修飾，如衍生，加入修飾核苷酸堿基、或可以含有能與抗配體(如生物素)結(jié)合的配體。
Adipocyspin探針和引物可以用于多個(gè)目的中，如用于檢測或擴(kuò)增生物樣品中adipocyspin多核苷酸，如此處進(jìn)一步所討論的。例如根據(jù)此處的指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇特異性擴(kuò)增樣品中所有或一部分adipocyspin基因、mRNA或cDNA的引物對。優(yōu)選地，選擇引物對和擴(kuò)增條件來不擴(kuò)增其它多核苷酸序列，如樣品中其它的信使RNAs(由于adipocyspin引物的3′端堿基和其它基因序列之間的互補(bǔ)性)。
還提供抑制性多核苷酸，如反義、三聯(lián)、和核酶和RNAi試劑，其靶向或雜交adipocyspin多核苷酸。
在另一方面，提供可以用于抑制或下調(diào)adipocyspin基因的表達(dá)的反義寡核苷酸和多核苷酸。一些治療方法可以包括在體內(nèi)生物條件下施用用于抑制和/或刺激adipocyspin活性的寡核苷酸，并且在這些條件下在足以產(chǎn)生治療效果的時(shí)間內(nèi)相對穩(wěn)定。使用本領(lǐng)域公知方法，可以修飾多核苷酸來賦予這樣的穩(wěn)定性并且有助于將寡核苷酸靶向傳送至所需組織、器官或細(xì)胞中。
反義多核苷酸可以包括或基本上由與從至少約10個(gè)堿基、典型至少約12-14個(gè)，至多約800連續(xù)核苷酸中轉(zhuǎn)錄的序列或整個(gè)轉(zhuǎn)錄長度特異性雜交的反義序列組成。更普遍地，反義多核苷酸可以是約12到約50核苷酸的長度，或約15到約25核苷酸的長度。通常，反義多核苷酸應(yīng)該足夠長以形成穩(wěn)定的雙鏈，但根據(jù)傳送模式要足夠短以進(jìn)行體內(nèi)施用，如需要。需要與靶向序列特異性雜交的多核苷酸的最小長度取決于幾個(gè)因素，如G/C含量，錯(cuò)配堿基的配置(如果有)，與靶向多核苷酸類群相比的序列的唯一性程度，和多核苷酸的化學(xué)性質(zhì)(如甲基膦酸鹽主鏈、肽核酸、硫代磷酸酯)；及其它因素。
通常，要確保特異性雜交，反義序列基本上與靶向adipocyspinmRNA序列互補(bǔ)。在特定具體實(shí)施方案中，反義序列與至少部分靶向序列完全互補(bǔ)。反義多核苷酸還可以包括核苷酸取代、插入、缺失、轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)位或修飾，或其它核酸序列或非核酸部分，只要能保留特異性的或理想的結(jié)合到對應(yīng)adipocyspin RNA或其基因的相關(guān)靶向序列作為多核苷酸的功能性質(zhì)。
在一方面，反義序列與adipocyspin mRNA的相對易接近的序列(如相對缺少二級結(jié)構(gòu))互補(bǔ)。通過使用如MFOLD程序(Genetics ComputerGroup，Madison WI)分析預(yù)先的RNA二級結(jié)構(gòu)并且根據(jù)本領(lǐng)域的公知進(jìn)行體內(nèi)或體外測試來確定該反義序列。另一個(gè)確定有效的反義組合物的可用方法使用寡核苷酸的合并排列(見，如Milner et al.，1997，Nature Biotechnology 15537)。
還提供具有除反義序列以外的序列的反義多核苷酸(即除反-adipocyspin-義序列以外的)。在這種情況中，可以在較長序列的多核苷酸中包含反義序列。在另一具體實(shí)施方案中，多核苷酸的序列基本上由反義序列組成，或是反義序列。
可以使用任何適于產(chǎn)生核酸的方法(如此處公開的化學(xué)合成和重組方法)來制得反義核酸(DNA，RNA，PNA修飾的，類似物等)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，例如，可以通過重新(de novo)的化學(xué)合成或通過克隆來制備反義RNA分子。例如通過在可操作性連接至載體(如質(zhì)體)中的啟動子的相反方向插入(連接)adipocyspin DNA序列來制得與adipocyspin mRNA雜交的反義RNA。只要適當(dāng)放置啟動子和優(yōu)選地終止子和多聚腺苷化信號，所插入的對應(yīng)非編碼的鏈的序列的鏈就可以轉(zhuǎn)錄并且其可以作為反義寡核苷酸?？梢允褂梅戳x寡核苷酸來抑制非細(xì)胞浸出物、細(xì)胞和動物(包括哺乳動物和人)中的adipocyspin活性。
對于關(guān)于反義多核苷酸的常規(guī)方法，見ANTISENSE RNA ANDDNA，(1988)，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)和Dagle等人，1991，Nucleic Acids Research，191805。對于反義治療，見Uhlmann等人，Chem，Reviews，90543-584(1990)及其它。
還提供的是寡-和多核苷酸(如DNA，RNA，PNA，修飾的，類似物(或類似的)，其結(jié)合到雙鏈或雙鏈的adipocyspin核酸上(如在adipocyspin RNA的折疊區(qū)域或在adipocyspin基因中)，以形成含有三重螺旋、或“三聯(lián)”核酸。三重螺旋形式會通過如防止adipocyspin基因的轉(zhuǎn)錄，由此降低或消除細(xì)胞中的adipocyspin活性來抑制或下調(diào)adipocyspin表達(dá)。不打算被任何特定的行為理論或機(jī)理限制，認(rèn)為三重螺旋對損害了雙重螺旋打開足以使聚合酶、轉(zhuǎn)錄因素或控制分子發(fā)生結(jié)合的能力。
使用三重螺旋形式的堿基配對原則(見，如Cheng等人，1988.JBiol.Chem.26315110；Felrin and Camerini-Otero，1991，Science3541494；Ramdas等人，1989，JBiol.Chem 26417395；Strobel等人，1991，Science 2541639；和Rigas等人，1986，Proc.Natl.Acad，Sci，U.S.A.839591)和adipocyspin mRNA和/或基因序列來構(gòu)建三聯(lián)寡-和多核苷酸。典型地，三聯(lián)形式的寡核苷酸包括或基本上由或由與adipocyspinRNA或基因的特異性序列互補(bǔ)的約10到至少約25核苷酸或更長(即足夠長以形成穩(wěn)定的三重螺旋形式，但足夠短，根據(jù)釋放模式用于體內(nèi)施用，如需要)的特異性序列組成。在本文中，“互補(bǔ)”意味著能形成穩(wěn)定的三螺旋。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，寡核苷酸特異性結(jié)合到adipocyspin基因(例如adipocyspin 5′旁側(cè)序列、啟動子和增強(qiáng)子)的控制區(qū)域中，或結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(如在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的約-10到約+10)。對于使用三聯(lián)DNA的最近治療發(fā)展，見Gee等人，in Huber andCarr，1994，MOLECULAR.AND IMMUNOLOGIC APPROACHES，F(xiàn)utura Publishing Co.Mt Kisco NY和Rininsland等人，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 945854。
還提供用于抑制或下調(diào)adipocyspin活性的核酶。核酶結(jié)合且特異性切割且失活adipocyspin mRNA。可用的核酶可以包括與adipocyspinmRNA互補(bǔ)的5′-和3′-端基序列，并且根據(jù)此處公開的adipocyspinmRNA序列由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行操作(見，PCT公開WO 93/23572，supra)。核酶包括具有具有族I內(nèi)含子核酶特征的那些(Cech，1995，Biotechnology 13323)，和其他錘頭核酶(Edgington，1992，Biotechnology 10256)。
核酶包括具有分裂位點(diǎn)(如GUA，GUU和GUC)的那些。其它對adipocyspin活性具有核酶-介導(dǎo)抑制的最佳分裂位點(diǎn)包括描述于PCT公開WO 94/02595和WO93/23569中的那些。可以用為使寡核苷酸更理想化的二級結(jié)構(gòu)特征來評估對應(yīng)于靶向adipocyspin基因的含有分裂位點(diǎn)的長度在約15到約20核糖核苷酸的短RNA寡核苷酸。還可以通過使用核酶保護(hù)方法測定與互補(bǔ)寡核苷酸的雜交的可達(dá)性，或根據(jù)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法測定體外核酶活性，來評估分裂位點(diǎn)的適宜性。
如Hu等人于PCT公開WO 94/03596所述，可以在單個(gè)的寡核苷酸中結(jié)合反義和核酶的作用。而且，核酶可以包括或基本上由或由一種或多種修飾核苷酸或核苷酸之間的修飾連接組成，如上與示例性反義寡核苷酸結(jié)合所述。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，核酶通常在體外產(chǎn)生并且加入到細(xì)胞或病患體內(nèi)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，基因治療方法用于體內(nèi)或體外的靶向細(xì)胞中的核酶的表達(dá)。
還提供用于通過如RNA干擾(RNAi)的方法抑制adipocyspin活性的多核苷酸，其還可以包括協(xié)同抑制和壓制?；蛞种频倪@種和其它技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。這種技術(shù)描述于Science 2881370-1372(2000)。RNAi在轉(zhuǎn)錄后水平上操作并且是序列特異性的。該方法包括將具有部分或全部雙鏈特征的RNA，或該RNA的前體或能夠編碼這樣的RNA加入到細(xì)胞或細(xì)胞外環(huán)境中。
如Fire等人在美國專利No.6,506,559中所述，RNA可以包括聚合的核糖核苷酸的一個(gè)或多個(gè)鏈。可以通過單個(gè)的自身互補(bǔ)的RNA鏈或兩個(gè)互補(bǔ)的RNA鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)。RNA可以包括對磷酸鹽-糖主鏈或核苷酸(如上與示例性反義寡核苷酸結(jié)合所述的)進(jìn)行修飾?？梢詮募?xì)胞的里面或外面引發(fā)RNA雙鏈體的形成。
研究標(biāo)明一種或多種核糖核酸酶會特異性結(jié)合至雙鏈RNA和將雙鏈RNA分裂成短片段。核糖核酸酶與這些片段保持關(guān)聯(lián)，其依次特異性結(jié)合至互補(bǔ)的mRNA上，即特異性結(jié)合至用于adipocyspin編碼的轉(zhuǎn)錄mRNA上。Adipocyspin的mRNA還通過核糖核酸酶降解成短的片段，因此避免adipocyspin基因的翻譯和表達(dá)，從而抑制或下調(diào)adipocyspin活性。此外，RNA聚合酶可以有助于大量重復(fù)的短片段的合成，其指數(shù)地增加系統(tǒng)的效率。這種基因抑制途徑的獨(dú)特的特征是沉默并不限于已經(jīng)引發(fā)的細(xì)胞?；虺聊Ч梢詡魉椭辽矬w的其它部分，且甚至通過胚系遺傳至幾代。
還提供用于產(chǎn)生基因構(gòu)建物的多核苷酸以沉默adipocyspin基因。多核苷酸還用于產(chǎn)生編碼對adipocyspin基因特異性的單個(gè)自身互補(bǔ)的RNA序列的基因構(gòu)建物。可以通過任何本領(lǐng)域公知或發(fā)現(xiàn)的方法傳送基因構(gòu)建物和/或adipocyspin特異性的自身互補(bǔ)的RNA序列。在基因構(gòu)建物中，正義和反義序列中排列使用以適當(dāng)?shù)倪B接方向排列的供體和受體接合位點(diǎn)的內(nèi)含子序列。另一方法可以使用各種長度的間隔序列，而不是離散的內(nèi)含子序列來產(chǎn)生可操作且有效的構(gòu)成物。在adipocyspin基因構(gòu)成物產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄后過程中，剪切內(nèi)含子序列，使正義和反義序列和接合連接序列結(jié)合形成雙鏈RNA。選擇核糖核酸酶與雙鏈RNA結(jié)合并剪切該雙鏈RNA，由此引發(fā)導(dǎo)致adipocyspin mRNA基因序列降解的級聯(lián)(cascade of events)，和對adipocyspin基因的沉默。
或者，除了使用基因構(gòu)建物來表達(dá)自身互補(bǔ)的RNA序列以外，可以將adipocyspin特異性雙鏈RNA片段傳送到一個(gè)或多個(gè)靶向面積上以使其在細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)在化來產(chǎn)生基因沉默效果。以每細(xì)胞傳送至少一個(gè)復(fù)制品的量加入RNA。較高劑量的雙鏈材料可以產(chǎn)生更有效的抑制作用。抑制作用是序列-特異性的，這是由于對應(yīng)于RNA的雙向區(qū)域的核苷酸序列可以靶向基因的抑制或下調(diào)。含有與部分adipocyspin基因相同的核苷酸序列的RNA優(yōu)選用于抑制或下調(diào)。還發(fā)現(xiàn)帶有與靶向序列相關(guān)的插入、缺失和單點(diǎn)突變的RNA序列對抑制和下調(diào)有效。因此，通過本領(lǐng)域已知的比對算法來最佳化序列的一致性并且計(jì)算核苷酸序列之間的差別百分比。或者，可以將RNA的雙向區(qū)域功能定義為能雜交部分靶向基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。
治療方法包括施用能夠在體內(nèi)生物條件下抑制、下調(diào)或刺激adipocyspin活性的寡核苷酸，并且在這些條件下在足以產(chǎn)生治療效果的時(shí)間中相對穩(wěn)定。如上所述，修飾的核酸可以用于給出這樣的穩(wěn)定性，和用于靶向傳送寡核苷酸到所需組織、器官或細(xì)胞中。
可以直接在適當(dāng)?shù)乃幬锱浞街幸运幤坊蜷g接地將核酸加入到細(xì)胞中(包括如脂類、免疫脂類、ballistics、對細(xì)胞的直接攝入等)來傳送寡-和多核苷酸。對于疾病的治療，將寡核苷酸以治療有效量施用于病患。治療有效量是足以改善疾病癥狀或調(diào)整靶向細(xì)胞中的adipocyspin活性的量。用于傳送治療目的的寡核苷酸的方法描述于，例如，美國專利5,272,065。其它施用藥物有效的化合物和包含其的組合物的其他細(xì)節(jié)是公知或在此處有所提供的。在另一具體實(shí)施方案中，可以使用基因治療或其它重組DNA表達(dá)策略傳送寡-和多核苷酸。
基因治療是指加入在其被轉(zhuǎn)移入的(典型地)哺乳動物細(xì)胞上產(chǎn)生治療上有用的表型效果的外源多核苷酸。在一方面，提供基因治療方法和組合物來治療與adipocyspin有關(guān)的情況。在示例性具體實(shí)施方案中，基因治療包括向細(xì)胞中加入載體，該載體表達(dá)或誘導(dǎo)adipocyspin基因產(chǎn)物的表達(dá)(如基本上與具有SEQ ID NO1或2序列的adipocyspin多肽相似的來增加adipocyspin活性的adipocyspin蛋白，或降低活性的抑制性adipocyspin多肽)，表達(dá)具有adipocyspin基因或mRNA序列的核酸(如降低adipocyspin活性的反義RNA)，表達(dá)影響adipocyspin基因產(chǎn)物的表達(dá)的多肽或多核苷酸(如指向adipocyspin mRNA來降低adipocyspin活性的核酶)或替代或分裂內(nèi)源adipocyspin序列(如基因的替換和基因的敲除，控制序列的加入或缺失)。根據(jù)此處所公開的，大量具體實(shí)施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，包括生理上可接受的載體和可操作編碼adipocyspin多肽的裸露多核苷酸的制劑可以加入來產(chǎn)生其表達(dá)。加入包括裸露多核苷酸的配方的組合物描述于PCT公開No.WO 90/11092(Vical Inc.)，PCT公開No.WO 95/11307(Institut Pasteur，INSERM，Universit d’Ottawa)，和Tacson等人的Nature Medicine，2(8)888-892(1996)和Huygen等人的Nature Medicine 2(8)893-898(1996)。還可以使用Bolistic方法。
用于adipocyspin基因治療的載體可以是病毒的或非病毒的，并且包括已知或此處所述關(guān)于adipocyspin表達(dá)系統(tǒng)的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知基因治療載體可以包括啟動子和其它控制或加工序列，如該公開所述。通常載體包括啟動子和任選的，驅(qū)動寡-核糖核苷酸或多核苷酸轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子(從包含在啟動子序列中分離出來的)，以及如需要提供保持游離的基因或染色體的整合或高水平的轉(zhuǎn)錄的其它控制元件。用于基因治療的質(zhì)?？梢园ㄆ渌δ茉?，如可選擇的標(biāo)記，識別區(qū)域和其它序列。其他的序列可以對細(xì)胞內(nèi)外所給予穩(wěn)定性，將adipocyspin核苷酸序列(正義或反義)靶向傳送至特定器官、組織或細(xì)胞群、調(diào)整進(jìn)入細(xì)胞的、調(diào)整進(jìn)入細(xì)胞核和/或調(diào)整核DNA的整合起作用。例如，可以使用類似寡核苷酸配基(aptamer-like)的DNA構(gòu)建或其它蛋白結(jié)合位點(diǎn)來將載體介導(dǎo)結(jié)合到細(xì)胞表面受體上或結(jié)合到連接受體的血清蛋白上，由此增加DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞的效果。其它DNA位點(diǎn)和構(gòu)建可以直接或間接結(jié)合到核膜中的受體上或結(jié)合到進(jìn)入核的其它蛋白上，由此有助于載體的核攝入。其它DNA序列可以直接或間接影響整合的效果。
適合的基因治療載體可以或不具有一個(gè)或多個(gè)復(fù)制原點(diǎn)。例如，在載體中包括一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)用于在施用到病患以前的載體繁殖是有用的。但是，如果指明載體來整合入宿主染色體DNA或結(jié)合到宿主mRNA或DNA，那么在施用以前去除復(fù)制的原點(diǎn)。
如所述，還提供用于基因替換治療的方法和試劑(即通過內(nèi)源adipocyspin基因與重組基因同源重組進(jìn)行的替換)?？梢允褂锰貏e指明用于通過同源重組的整合的載體。最佳化同源重組的因素包括，例如，序列一致性的程度、與染色體序列同源的長度。介導(dǎo)同源重組的特異性序列也是重要的，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)錄活性的DNA中整合更易發(fā)生。用于構(gòu)成同源靶向構(gòu)建物的方法和材料描述于Mansour等人，1988，Nature，336348；Bradley等人，1992，Bio/Technology 10534，還有美國專利Nos.5,627,059，5,487,992，5,631,153和5,464,764。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，基因替換治療還包括改變或替換所有或部分控制需要進(jìn)行調(diào)整的基因的表達(dá)的控制序列。例如，可以通過插入或刪除轉(zhuǎn)錄控制部位或插入外源啟動子來降解adipocyspin啟動子序列(如圖5所示)以改變adipocyspin表達(dá)。
還提供用于體外或動物內(nèi)的adipocyspin“基因敲除”的方法和試劑。使用重組產(chǎn)生的載體通過內(nèi)源adipocyspin基因的同源重組進(jìn)行的缺失或降解來進(jìn)行。在基因敲除中，靶向序列是控制序列(如adipocyspin啟動子)、或RNA或蛋白標(biāo)記的序列。改變內(nèi)源基因表達(dá)的同源重組的應(yīng)用描述于美國專利No.5,272,071，WO 91/09955，WO93/09222，WO 96/29411，WO 95/31560和WO 91/12650。還見，Moynahan等人，1996，Hum.Mol.Genet，5875?？梢詫⒒蛑委熭d體通過體內(nèi)、體外的或回體(ex vivo)的方式加入細(xì)胞或組織中。對于回體治療，可以將載體加入來自病患的細(xì)胞(如干細(xì)胞)中，且為了自身移植進(jìn)行克隆繁殖在回到同一病患體內(nèi)(見，美國專利Nos.5,399,493和5,437,994)。
還提供轉(zhuǎn)基因非人類的多細(xì)胞生物體(如植物和非人類的動物)或單一細(xì)胞的生物體(如酵母菌)，其含有外源adipocyspin基因序列(其可以是編碼序列或控制(如啟動子)序列)。多細(xì)胞生物體的例子包括植物、昆蟲和如大鼠、小鼠、兔子、猴子、猿、豬的非人類動物和其它非人類哺乳動物。單一細(xì)胞生物體的例子是酵母菌。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，生物體表達(dá)具有人adipocyspin蛋白的序列的外源adipocyspin多肽。還提供單一細(xì)胞和多細(xì)胞生物體(或來自其的細(xì)胞)，其中編碼adipocyspin的基因是變異或缺失的(如在編碼區(qū)或控制區(qū)域)，以使得不表達(dá)天然adipocyspin，或當(dāng)與野生類型的細(xì)胞或生物體相比，以降低的水平表達(dá)，或以不同的活性表達(dá)。這樣的細(xì)胞和生物體通常是指“基因敲除”的細(xì)胞或生物體。
本專利進(jìn)一步提供其中加入和表達(dá)外源adipocyspin基因或變體(如人adipocyspin)的細(xì)胞和生物體。外源adipocyspin基因或變體可以增加或替代內(nèi)源adipocyspin基因。這種類型的細(xì)胞和生物體可以用作確定adipocyspin活性或表達(dá)的調(diào)節(jié)子或確定adipocyspin基因中突變效果的模型系統(tǒng)。
特異基因(如內(nèi)源adipocyspin基因)的改變或分裂方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，見，如Baudin等人，1993，Nucl.Acids Res.213329；Wach等人，1994，Yeast 101793；Rothstein，1991，Methods Enzymol，194281；Anderson，1995，Methods Cell Biol，4831；Pettitt等人，1996，Development 1224149-4157；Ramirez-Soilis等人，1993，MethodEnzymol，225855；和Thomas等人，1987，Cell 51503。典型地，這些方法包括，如改變或替換所有或部分的控制將要被調(diào)整的特異基因的表達(dá)的控制序列?？梢愿淖?nèi)缣烊粏幼拥目刂菩蛄?。一個(gè)用于基因靶向突變的傳統(tǒng)技術(shù)包括將含有感興趣的基因的基因組DNA片段放置在載體中，然后克隆與在含有胸腺嘧啶脫氧核苷激酶的載體中的可選擇的抗新霉素組合體周圍的靶向基因有關(guān)的兩個(gè)基因組臂。然后將“敲除”構(gòu)成物轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(即小鼠的胚干(ES)細(xì)胞)，其隨后進(jìn)行正選擇(使用G418，例如選擇抗新霉素)和負(fù)選擇(使用如FIAU來去除缺少胸腺嘧啶脫氧核苷激酶的細(xì)胞)，來選擇與敲除載體進(jìn)行同源重組的細(xì)胞。這種方法會使感興趣的基因失活。見，例如美國專利5,464,764；5,631,153；5,487,992和5,627,059。
還可以通過同源重組進(jìn)行內(nèi)源基因的“敲除”表達(dá)來將異源核酸加入到感興趣的基因的控制序列(如啟動子)中。改變閱讀框或破壞啟動子的簡單突變可以適用于防止功能酶或產(chǎn)物的表達(dá)。還可以使用“基因陷阱插入”降解宿主基因，小鼠ES細(xì)胞可以用于產(chǎn)生敲除的轉(zhuǎn)基因動物，如Holzschu(1997)Transgenic Res 697-106中所述。其他方法是本領(lǐng)域公知的。
為了上調(diào)表達(dá)，可以用誘發(fā)更高水平轉(zhuǎn)錄的異源啟動子取代天然啟動子。
使用包括正被討論的結(jié)構(gòu)基因的核酸序列通過同源重組來改變內(nèi)源基因的表達(dá)。上游序列可以用來靶向異源重組構(gòu)建物。使用adipocyspin結(jié)構(gòu)基因序列信息，如編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的多肽的基因組多核苷酸序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以僅通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生同源重組構(gòu)建物。
改變內(nèi)源基因的表達(dá)的同源重組描述于，如美國專利5,272,071，和WO 91/09955，WO 93/09222，WO 96/29411，WO 95/31560和WO91/12650。動物中同源重組描述于Moynahan(1996)Hum.Mol.Genet.5875，而植物中的同源重組描述于Offringa(1990)EMBO J.93077。
還提供分離的基本上純的或重組的adipocyspin多肽和adipocyspin多肽的免疫片段。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，adipocyspin多肽或片段具有與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的序列或其子序列相同或基本相同的氨基酸序列。
還提供基本上純的分離的或重組的adipocyspin多肽。在一些具體實(shí)施方案中，adipocyspin多肽具有與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。在其他具體實(shí)施方案中，adipocyspin多肽是由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸殘基的保守性取代表征的變體和突變體。
多肽可以是如圖3所示的物種的全長(如含有約150氨基酸)或可以編碼全長蛋白的片段(如包括至少20、至少40、至少60或至少100殘基的adipocyspin多肽或變體)。還提供相對于SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO9、或SEQ ID NO10的氨基酸序列以一些方式例如切斷、變異、衍生進(jìn)行修飾的adipocyspin多肽；或融合到其他序列(如形成融合蛋白)的adipocyspin多肽。一些adipocyspin多肽包括相對于公開的序列的氨基酸殘基的插入、缺失或置換。例如，可以進(jìn)行保守性的氨基酸置換，即用具有相似結(jié)構(gòu)特征(如凈電荷、疏水性、極性、大小等)的不同氨基酸對選擇的氨基酸進(jìn)行置換。
Adipocyspin變體可以與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO9、或SEQ ID NO10的adipocyspin多肽結(jié)構(gòu)上或功能相似。通過如大量序列一致性(如上所述)或免疫交叉反應(yīng)性表明結(jié)構(gòu)相似性。功能相似性通過如抑制前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化來指明。
在一些具體實(shí)施方案中，adipocyspin變體可以包括在相當(dāng)?shù)陌被嵛稽c(diǎn)上圖3B中所示的人adipocyspin氨基酸位點(diǎn)62、72、83、86、101和116上的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基?？梢詫⒁粋€(gè)半胱氨基與另一個(gè)半胱氨酸相連以形成分子內(nèi)雙硫鍵，以使adipocyspin和/或adipocyspin異構(gòu)體可以含有至多3個(gè)分子內(nèi)雙硫鍵。如上所述的相對于SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列修飾的adipocyspin變體能形成其他分子內(nèi)或分子間雙硫鍵，例如，他們可以包括能形成分子內(nèi)雙硫鍵的其他半胱氨酸?？梢酝ㄟ^突變或缺失一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸將修飾Adipocyspin變體修飾來消除一個(gè)或多個(gè)雙硫鍵，其可以改進(jìn)穩(wěn)定性、氧敏感性或藥理性質(zhì)。
在一些具體實(shí)施方案中，可以轉(zhuǎn)錄地、轉(zhuǎn)錄后地或翻譯后地修飾adipocyspin多肽來產(chǎn)生各種adipocyspin變體和/或異構(gòu)體。這樣的修飾是本領(lǐng)域公知的，并且可以包括選擇剪接、RNA編輯、蛋白水解、糖基化、磷酸化、聚乙二醇化(pegylation)、?；⒓谆?、硫酸化、異戊二烯化等。多肽可以具有通過基因的和/或化學(xué)方法加入能夠糖基化或聚乙二醇化的位點(diǎn)，其可以改進(jìn)adipocyspin的生物半衰期或其他藥理性質(zhì)。
在一些具體實(shí)施方案中，adipocyspin多肽或其片段可以用作免疫原(如產(chǎn)生抗adipocyspin的抗體)。典型地，致免疫的adipocyspin片段包括至少約6或更多SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO9、或SEQ ID NO10的連續(xù)殘基，更普遍包括至少約8、至少約10、或至少約12、或約16個(gè)連續(xù)殘基。
基本上純的分離的或重組的adipocyspin多肽的特征在于它們與具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示的序列的多肽具有特異性免疫反應(yīng)的抗體的結(jié)合能力。特異性的免疫反應(yīng)性的特征在于抗體與其配體(如adipocyspin)的特異性結(jié)合親和力至少約107、108、109、或1010M-1。
對于許多應(yīng)用，期望提供作為標(biāo)記個(gè)體的adipocyspin多肽，即共價(jià)結(jié)合或鍵連到可檢測的標(biāo)記或基團(tuán)，或可交叉鏈接的基團(tuán)，來有助于給定環(huán)境中確定、檢測或量化多肽。這些可檢測的基團(tuán)可以包括可檢測的多肽基團(tuán)，例如可測定的酶或抗體表位。或者，可檢測的基團(tuán)選自各種其他的可檢測基團(tuán)或標(biāo)記，如放射性標(biāo)記(如125I，32P，35S)或致化學(xué)發(fā)光或熒光基團(tuán)。類似地，可檢測基團(tuán)可以是底物、輔因子、抑制劑或親和配體。
此外，通過用相同類型的D-氨基酸取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(如D-賴氨酸替代L-賴氨酸)來產(chǎn)生具有額外穩(wěn)定性的肽。類似地，還可以使用氨基或羧基端基的修飾來給予多肽穩(wěn)定性，如羧基端基的酰胺化或氨基端基的胺化或聚乙二醇化的衍生物。
使用重組或合成方法制備adipocyspin多肽，或者從天然細(xì)胞源中分離adipocyspin多肽。
用于從adipocyspin多核苷酸中表達(dá)adipocyspin多肽的適合重組技術(shù)是公知的，或此處公開的。還見，Sambrook等人，1989，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，(2nded.)Vols.1-3，Cold SpringHarbor Laboratory和Ausubel，supra。用于合成多肽(如adipocyspin多肽、變體或片段)的合成方法描述于Merrifield(1963)Amer.Chem.Soc.852149-2456，Atherton等人，1989，SOLID PHASE PEPTIDESYNTHESISA PRACTICAL APPROACH，IRL Press，和Merrifield，1986.Science 232341-347。
通過本領(lǐng)域通常公知的方法進(jìn)行adipocyspin多肽的分離和純化。這些方法包括，但不限于離子交換、疏水性相互作用、HPLC、或親和色譜法，來達(dá)到所需純度。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以使用免疫親和色譜法純化adipocyspin多肽。例如，將從adipocyspin多肽或其免疫片段(如具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的序列或子序列)中提出的抗體與適合的固體載體偶合并且在有助于將這種多肽與抗體結(jié)合的條件下與含有adipocyspin多肽(的多肽混合物如脂肪細(xì)胞的勻漿)接觸。一旦adipocyspin多肽與免疫抗體結(jié)合，那么清洗固體載體來去除未結(jié)合的材料和/或非特異性結(jié)合的多肽。可以通過改變pH或緩沖液的鹽濃度來以基本上純的形式從固體載體中洗脫所需多肽。
盡管以上以“蛋白”或“多肽”進(jìn)行描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道上述多肽的結(jié)構(gòu)類似物和衍生物(如肽類似物等)可以用作adipocyspin的取代物，如作為adipocyspin激動劑或作為adipocyspin拮抗劑。模擬肽(peptidomimetics)或肽擬態(tài)是通常在藥物工業(yè)中用作非肽藥物的肽類似物，其性質(zhì)(如生物活性)與模板肽的相似(Fauchere，1986，Adv.Drug Res.1529；Evans等人，1987，J.Med.Chem.301229)。例如，通常借助于電腦化分子模型來開發(fā)他們。與藥物上可用的肽結(jié)構(gòu)類似的肽擬態(tài)可以用于產(chǎn)生相當(dāng)或基本相當(dāng)?shù)闹委熜Ч?。肽擬態(tài)可以在多肽具體實(shí)施方案中具有明顯的優(yōu)勢，包括，如更經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)率和更好的化學(xué)穩(wěn)定性。
還提供抗體或抗體結(jié)合的片段，包括scFvs，其特異性或理想地與哺乳動物的adipocyspin多肽(如嚙齒動物或人的adipocyspin)免疫反應(yīng)。由此，抗體或結(jié)合片段可以特異性識別和結(jié)合具有與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2或其免疫片段的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的多肽?？贵w通常顯示至少約107、108、109、或1010M-1的adipocyspin的特異性結(jié)合親和力。
抗adipocyspin抗體和片段具有許多用途，如adipocyspin多肽的分離(如通過免疫親和色譜法)、adipocyspin多肽的檢測和用于adipocyspin活性的抑制(如體內(nèi)或體外)。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多方法制得抗adipocyspin抗體，如supra所述。如所述，此處可以廣泛定義抗體，并且包括片段、嵌合體和相似的結(jié)合劑(如噬菌體顯示技術(shù)的產(chǎn)物)，該抗體可以特異性或理想地結(jié)合到adipocyspin多肽或表位。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體包括重組制備的單鏈或雙鏈或多鏈多肽，其含有抗體輕和重鏈可變區(qū)(其足以進(jìn)行抗原-特異性結(jié)合)和至少抗體輕和重鏈保守區(qū)的片段(如重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域)(其足以在雙鏈多肽情況中保持兩個(gè)多肽的關(guān)聯(lián))。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體是單鏈抗體(sFv)，如包括抗體輕和重鏈可變區(qū)，典型地，該抗體由適當(dāng)?shù)倪B接而適于結(jié)合adipocyspin或adipocyspin表位。
制備多克隆或單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。見，如Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites等人，(eds.)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(7thed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，及其參考(“Stites”)；Goding MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，New York，NY(1986)；Kohler and Milstein，1975t Nature 256495-97；和Harlow and Lane。這些技術(shù)包括通過從噬菌體或類似載體中的重組抗體庫中選擇抗體來制備抗體。見，Huse等，1989，Science 2461275-81；和Ward等人，1989，Nature 341544-46。
為了制備多克隆抗體，選擇適合的靶向免疫系統(tǒng)，典型地小鼠或兔子，但還包括山羊、綿羊、牛、雞、天竺鼠、猴子和大鼠?？梢酝ㄟ^包括親和純化的常規(guī)方法對得自宿主的免疫球蛋白進(jìn)行沉淀、分離和純化。如需要，通過多克隆血漿的色譜純化得到基本上單一特異性的抗體群。
對于單克隆抗體，將選擇適當(dāng)?shù)膭游锴译S后進(jìn)行所需的免疫作用。抗體可以是任何同位型，如IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，優(yōu)選IgG、IgA和IgM，最優(yōu)選IgG。優(yōu)選的單克隆抗adipocyspin抗體中和(即抑制或阻斷)adipocyspin的一種或多種生物活性。通過篩選所需的20抑制的活性的雜交瘤上層清液來得到這樣的抗體?？梢酝ㄟ^下述描述的方法產(chǎn)生具有108升/摩爾，優(yōu)選109或1010或更強(qiáng)的親和力的單克隆抗體。非人(如鼠科、兔科、馬)的單克隆抗體的生產(chǎn)是公知的，并且通過如用包含adipocyspin或其片段的制劑對宿主動物進(jìn)行免疫來完成。對得自免疫動物的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞無限增殖和篩選，或?qū)Y(jié)合到adipocyspin多肽的抗體先篩選再無限增殖。
可以以本領(lǐng)域公知技術(shù)人源化或嵌合制得單克隆抗體。一些抗adipocyspin單克隆抗體是人源化的、人的或嵌合的，來減少它們潛在的抗原性，而不降低它們對其靶向的親和力。人源化的抗體可以如本領(lǐng)域所述制得，見如，30 Queen等人，1989，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA8610029；美國專利Nos.5,563,762；5,693,761；5,585,089和5,530,101。用于人類化的人抗體序列可以是天然的人抗體的序列或是幾個(gè)人抗體的共有序列。見，Kettleborough等人，Protein Engineering 4773(1991)；Kolbinger等人，Protein Engineering 6971(1993)?？筧dipocyspin的人源化單克隆抗體還可以使用具有人免疫系統(tǒng)的元件的轉(zhuǎn)基因動物制得(見，如美國專利Nos.5,569,825；5,545,806；5,693,762；5,693,761；和5,7124,350)。
可用的抗adipocyspin抗體還可以使用噬菌體顯示技術(shù)制得(見，如Dower等人，WO 91/17271和McCafferty等人，WO 92/01047)。在這些方法中，可以產(chǎn)生噬菌體庫，其中成員在其外表面顯示出不同的抗體。抗體通常顯示為Fv或Fab片段?？梢酝ㄟ^對adipocyspin多肽的親和選擇富集顯示具有所需特異性的抗體的噬菌體。使用本領(lǐng)域公知的方法制得單鏈抗體(見，如Colcher等人，(1999)Ann.N Y Acad.Sci.880263-80；Reiter)(1996)Clin.Cancer Res.2245-52)；美國專利Nos.4,946,778；5,260,203；5,455,030；5,518,889；和5,534,621)。
一旦表達(dá)，可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(包括硫酸銨沉淀、親和色譜法、凝膠電泳等)純化整個(gè)抗體、其二聚物、單個(gè)的輕和重鏈或其它免疫形式(見，PROTEIN PURIFICATIONPRINCIPLES ANDPRACTICE 3RDEDITION(Springer-Verleg，N.Y.，1994))。
當(dāng)存在于制劑中的至少約80％、更普遍至少約90％、甚至更普遍至少約95、，最普遍至少約99％或更高的多肽分子特異結(jié)合到相同抗原(如adipocyspin多肽)時(shí)，抗體(如抗adipocyspin抗體或其片段)是基本上純的。對于藥物上的使用，至少約90-95％同源性的抗adipocyspin免疫球蛋白是優(yōu)選的，最優(yōu)選98-99％或更高的同源性。
可以使用修飾或未修飾的抗體。通常，通過(共價(jià)或非共價(jià))連接提供可檢測信號的底物來標(biāo)記抗體。這樣的標(biāo)記包括本領(lǐng)域公知的那些，如放射性標(biāo)記、熒光或生物活性(如酶的)標(biāo)記。作為標(biāo)記的結(jié)合體，抗體可以特別地用于診斷應(yīng)用中。
還提供雜交或“雙特異性”抗體，其會具有抗adipocyspin多肽的抗體的特異性，但是還能特異性結(jié)合到第二部分。在雜交抗體中，一個(gè)重和輕鏈對來自一個(gè)抗體而另一對來自抗其它表位的抗體。這會導(dǎo)致多重功能效價(jià)的性質(zhì)，如同時(shí)結(jié)合到至少兩個(gè)不同表位的能力?？梢酝ㄟ^產(chǎn)生各個(gè)組分抗體的雜交瘤的融合作用或通過重組技術(shù)來形成這樣的雜交體。
在一些具體實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生抗adipocyspin單克隆或多克隆抗血清，其特異性或理想地與adipocyspin免疫反應(yīng)，并且對其進(jìn)行選擇來具有低的或所需水平的抗其它蛋白(如例如cystatin的同源蛋白)的交叉反應(yīng)性；在用于免疫測定之前通過免疫吸收從多克隆抗血清中去除這樣的交叉反應(yīng)性。篩選和表征具有特異性的單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域公知的，且描述于Harlow and Lane，supra。為了產(chǎn)生抗SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的蛋白的多克隆抗血清(如用于免疫測定)，使用本領(lǐng)域公知的方法制備多克隆抗血清，包括此處所述的方法。例如，在哺乳動物細(xì)胞系中制備重組蛋白。使用標(biāo)準(zhǔn)佐劑，如Freund’s佐劑和用SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的蛋白對小鼠近交系(如balb/c)進(jìn)行免疫(見，Harlow and Lane，supra)?；蛘?，衍生自一種或多種此處公開的序列并且與載體蛋白結(jié)合的合成肽可以用作免疫原。收集多克隆抗血清并在免疫測定中、如在具有固定在固體載體上的免疫原的固相免疫測定中對免疫原進(jìn)行滴定。選擇具有104或更高滴定度的多克隆抗血清并且使用競爭性結(jié)合免疫測試測定其抗其它人半胱氨酸蛋白酶(如一種或多種cystatin或已知同系物)的交叉反應(yīng)性，如Harlow andLane，supra，頁570-573所描述。競爭性結(jié)合形式的免疫測定可以用于確定交叉反應(yīng)性。例如將adipocyspin固定在固體載體上。加入到測定中的蛋白與抗血清和固定抗原的結(jié)合競爭。將上述蛋白與抗血清和固定抗原的結(jié)合競爭的能力與adipocyspin比較。使用合適的方法計(jì)算上述蛋白的交叉反應(yīng)性的百分比。選擇并匯集具有少于10％交叉反應(yīng)性的這些抗血清，其每一個(gè)蛋白都列于以上。然后通過免疫吸收上述蛋白從富集的抗血清中去除交叉反應(yīng)抗體。
在一方面，可以監(jiān)測或確定adipocyspin的表達(dá)來對與adipocyspin控制有關(guān)的疾病狀態(tài)或趨向于疾病狀態(tài)的個(gè)體進(jìn)行診斷或評估。在各種具體實(shí)施方案中，疾病狀態(tài)是肥胖癥和/或糖尿病，例如2型糖尿病，和/或已知為“綜合癥X”或“代謝綜合癥”的疾病(包括異常葡萄糖敏感性和/或葡萄糖非敏感性)。
可以從生物液體，如血漿、血清、尿、唾液或血液中得到adipocyspin，并且通過電泳、HPLC、質(zhì)譜法、免疫法等分析adipocyspin。通過此處所述的或本領(lǐng)域公知的任何方法監(jiān)測表達(dá)情況。
通過監(jiān)測個(gè)體中adipocyspin的水平來完成監(jiān)測。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，將個(gè)體中的水平或表達(dá)情況與對照樣比較，從統(tǒng)計(jì)上與對照樣的顯著對比關(guān)系是對疾病的診斷。
還提供包括篩選具有調(diào)整adipocyspin活性能力的分子的測定方法。包括評估推定的adipocyspin功能的特異性激動劑或拮抗劑的方法。特別感興趣的是調(diào)整前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的分子。因此，還考慮的是這些化合物在對調(diào)整adipocyspin防止前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力的化合物的篩選測定的制備和執(zhí)行中的應(yīng)用?？梢酝ㄟ^這樣的方法測定的示例性的分子包括有機(jī)分子、無機(jī)分子、聚合物、小分子、包括反義和siRNA分子的多核苷酸或?qū)ζ涞那绑w、adipocyspin的變體和變化形式、和抗體。
當(dāng)至少一些已經(jīng)識別的化合物是可能的adipocyspin調(diào)節(jié)子時(shí)，通過對能結(jié)合到adipocyspin受體或結(jié)合配體的化合物篩選來進(jìn)行初步篩選。結(jié)合測定通常包括，例如使adipocyspin激動劑(如adipocyspin蛋白)與一種或多種測試化合物接觸，然后進(jìn)行足夠的時(shí)間使蛋白和測試化合物形成結(jié)合的復(fù)合物。使用一些確定的分析技術(shù)之一來檢測任何形成的結(jié)合的復(fù)合物。蛋白結(jié)合測定包括，但不限于，測量在非變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的共沉淀、共遷移和Western印跡上的共遷移的方法。用于這些測定的adipocyspin蛋白可以是天然表達(dá)的、克隆的或合成的adipocyspin。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，測定是基于細(xì)胞測定，并且使用穩(wěn)定或瞬時(shí)與具有編碼adipocyspin受體或結(jié)合配體的核酸序列的載體或表達(dá)盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在適于adipocyspin受體表達(dá)的條件下保持細(xì)胞，并且使其在適于結(jié)合發(fā)生的條件下與推定試劑接觸。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測結(jié)合。例如相對于適合的對照物來確定結(jié)合的程度(如相對于缺少推定試劑的背景，或相對于已知配體)。任選地，含有受體的細(xì)胞成份(如膜成份)可以用于整個(gè)細(xì)胞的環(huán)境中。
可以直接或間接檢測到結(jié)合或絡(luò)合的形成。例如，用合適的標(biāo)記(如熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記等)來標(biāo)記推定試劑，并且通過檢測標(biāo)記來確定結(jié)合?？梢允褂萌缗潴w的競爭劑的非標(biāo)記試劑進(jìn)行競爭或置換來估定特異性和/或抗結(jié)合。
在其它具體實(shí)施方案中，可以使用結(jié)合抑制測定來評估化合物。在這些測定中，使用如在NIH 3T3 L1細(xì)胞中表達(dá)的adipocyspin受體來評估作為配體結(jié)合的抑制劑的化合物。在這個(gè)具體實(shí)施方案中，adipocyspin受體與配體(如adipocyspin)接觸并且測定配體的結(jié)合。然后在配體(如重組adipocyspin)存在的情況下使受體與測試試劑接觸并且第二次測量結(jié)合。配體結(jié)合程度的降低是表示測試試劑對結(jié)合的抑制。使用表達(dá)adipocyspin受體的整個(gè)細(xì)胞，或來自表達(dá)adipocyspin受體的細(xì)胞的膜部分進(jìn)行結(jié)合抑制測定。
某些篩選方法包括對上調(diào)(或抑制或下調(diào))adipocyspin的表達(dá)或活性的化合物進(jìn)行篩選。這樣的方法通常包括進(jìn)行基于細(xì)胞測定(其中使測試化合物與一種或多種表達(dá)adipocyspin的細(xì)胞接觸)，然后檢測adipocyspin表達(dá)(轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物)的變化(如升高或降低)或活性。與表達(dá)內(nèi)源adipocyspin(如脂肪細(xì)胞或NIH 3T3 L1細(xì)胞)的細(xì)胞一起進(jìn)行一些測定?？梢耘c表達(dá)由適當(dāng)表達(dá)載體編碼的adipocyspin的重組細(xì)胞一起進(jìn)行其它的表達(dá)測定。在任一情況中，可以通過如此處所述的許多不同方法檢測adipocyspin表達(dá)。例如，通過用與編碼adipocyspin的轉(zhuǎn)錄本(或衍生自其的互補(bǔ)核酸)特異性雜交的探針對表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)的mRNA探測來確定細(xì)胞內(nèi)adipocyspin的表達(dá)水平。通過裂解細(xì)胞并進(jìn)行RNA印跡或使用原位雜交技術(shù)(如上述)無需裂解細(xì)胞，來進(jìn)行探測?；蛘呤褂妹庖邔W(xué)方法檢測adipocyspin蛋白，其中用特異性結(jié)合adipocyspin的抗體探測細(xì)胞裂解產(chǎn)物。類似地，通過確定細(xì)胞脂肪前體到細(xì)胞脂肪(如預(yù)NIH 3T3 L1細(xì)胞到NIH 3T3 L1脂肪細(xì)胞)的轉(zhuǎn)化率來測定adipocyspin活性。藥物篩選的一個(gè)方法是使用穩(wěn)定的表達(dá)adipocyspin的重組DNA分子的真核細(xì)胞或原核宿主細(xì)胞，其中重組DNA分子如具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2序列的蛋白。這樣的細(xì)胞(以變化的或固定的形式)可以用于篩選?？梢詼y定測試化合物用于結(jié)合或用于與另一結(jié)合用配體的競爭。
在適當(dāng)測定的一個(gè)例子中，使用adipocyspin蛋白(分離的或重組的)，該蛋白具有人adipocyspin蛋白的至少一個(gè)性質(zhì)、活性或功能特征。性質(zhì)可以是對前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以在適于結(jié)合的條件下保持含有adipocyspin蛋白或其變體的組合物。Adipocyspin受體與要測試的推定試劑(或含有至少一個(gè)推定試劑的第二組合物)接觸，檢測或測量結(jié)合。
將表達(dá)或活性的水平與基線值比較。還可以確定不表達(dá)adipocyspin的細(xì)胞的表達(dá)水平作為負(fù)對照。這樣的細(xì)胞通常從基因上基本上與測試細(xì)胞相同。
還可以使用炎癥模型來評估此處所提供的測試細(xì)胞、adipocyspin活性調(diào)節(jié)劑或推定調(diào)節(jié)劑和其它化合物來測定化合物在體內(nèi)施用效果的能力。適當(dāng)?shù)哪Ｐ桶ǎ缫韵陆鼛啄陙戆l(fā)展的幾個(gè)主動測定的方法，來在短時(shí)間中進(jìn)行成千上萬化合物的篩選。見，如Fodor等人，1991，Science 251767-73和其它化學(xué)多樣性庫的描述，其描述了大量化合物的測試結(jié)合親和力的方法。本發(fā)明提供的大量純的adipocyspin和/或表達(dá)重組adipocyspin的細(xì)胞極大地有助于開發(fā)合適的測定方法。
當(dāng)用于描述如基因的核酸的表達(dá)時(shí)，術(shù)語“上調(diào)”或“活化”表示任何導(dǎo)致基因產(chǎn)物的產(chǎn)率增加的方法?；虍a(chǎn)物是RNA(包括，但不限于mRNA)或蛋白。因此基因上調(diào)或活化包括提高基因的轉(zhuǎn)錄和/或mRNA的翻譯的方法。
提高轉(zhuǎn)錄的基因上調(diào)或活化的方法例子包括，但不限于有助于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成的那些、提高轉(zhuǎn)錄起始率的那些、提高轉(zhuǎn)錄延長率的那些、提高轉(zhuǎn)錄處理率的那些和減緩轉(zhuǎn)錄阻遏的那些(通過阻斷轉(zhuǎn)錄阻遏物的結(jié)合)。基因上調(diào)或活化可以組成性的阻遏和現(xiàn)有水平以上的表達(dá)的激活。提高翻譯的基因上調(diào)或活化的方法例子包括提高翻譯起始的那些、提高翻譯延伸的那些、提高翻譯終止的那些、提高核糖體循環(huán)的那些和提高mRNA穩(wěn)定性的那些?？梢允褂靡延械募夹g(shù)量化包括基因活化或上調(diào)的水平的基因表達(dá)水平，現(xiàn)有的技術(shù)包括，但不限于RNA印跡、核糖核酸酶保護(hù)分析(RPA)、核酸探針分析、定量PCR(如也叫作TaqMan分析)、斑點(diǎn)印跡分析和原位雜交。通常，基因上調(diào)或活化包括基因產(chǎn)物的生產(chǎn)中任何可檢測到的提高，優(yōu)選基因產(chǎn)物的生產(chǎn)中至少50-100％的提高。在其它情況中為約2到約5倍或任何其中的整數(shù)倍，在一些情況下為約5到約10倍或任何其中的整數(shù)倍，有時(shí)為約10到約20倍或任何其中的整數(shù)倍，一些情況中為約20到約50倍或任何其中的整數(shù)倍，其它情況中為約50到約100倍或任何其中的整數(shù)倍，且在一些情況中為100倍或更高。術(shù)語上調(diào)和基因活化可以表示為相對于基線水平的可觀察到的活性從統(tǒng)計(jì)學(xué)上是明顯不同的(如升高)。
如此處所用的“基線值”表示相對于進(jìn)行比較的試驗(yàn)或測定值(如對作為部分診斷或預(yù)測測試的病患樣品所測定的一個(gè))的值(或值的范圍)。因此在上調(diào)情況中，基線值是在不同時(shí)間點(diǎn)從相同個(gè)體中得到的樣品的活性或表達(dá)值。在一些情況中，基線值是對對照細(xì)胞或個(gè)體測定的值，或?yàn)閷φ占?xì)胞或個(gè)體群建立的統(tǒng)計(jì)值(如平均值)。在上調(diào)中，對照物是預(yù)計(jì)其水平不會上調(diào)的細(xì)胞、個(gè)體或其群體。因此，例如對照個(gè)體或?qū)φ杖后w可以包括健康的個(gè)體。作為對照的群體在大小上可以變化，其幾乎沒有單獨(dú)個(gè)體，但潛在地包括數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千、成千上萬或更多的個(gè)體。當(dāng)對照物是大群體時(shí)，基線值可以是由每個(gè)成員的個(gè)體值確定的統(tǒng)計(jì)值或是由作為聚集物的對照群體確定的值(如在孔中的細(xì)胞群體中測定的值)。
在另一方面，提供通過對具有這種疾病或病征的個(gè)體施用治療有效量的adipocyspin功能調(diào)節(jié)劑(如adipocyspin功能或基因表達(dá)的激動劑(刺激劑)和拮抗劑(抑制劑))來治療adipocyspin-介導(dǎo)的病征或疾病的方法。
與改變的adipocyspin表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥包括肥胖癥和與增加脂肪細(xì)胞質(zhì)量或脂肪質(zhì)量有關(guān)的情況?？梢杂胊dipocyspin功能的調(diào)節(jié)劑治療包括慢性疾病的疾病或病癥。疾病或病癥包括，如肥胖癥和與增加的肥胖質(zhì)量有關(guān)的情況，其均可以由adipocyspin和adipocyspin激動劑治療。這樣的調(diào)節(jié)劑包括adipocyspin功能或表達(dá)的小分子激動劑和拮抗劑、反義和核酶三聯(lián)多核苷酸、基因治療等。此處所述的方法和試劑可以用于動物、如哺乳動物(如人、非人靈長類、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、大鼠、小鼠等)或在動物中或體外的人類疾病(如細(xì)胞培養(yǎng)物)模型的治療。
進(jìn)一步提供治療組合物，包括激動劑、拮抗劑、或adipocyspin配體，和治療adipocyspin介導(dǎo)的生理或病理情況的方法(包括降低adipocyspin活性)。
可以在無菌或其它適合或理想的條件下對要治療的宿主直接施用Adipocyspin多肽、其片段、正義和反義多肽、抗adipocyspin的抗體或其結(jié)合片段和adipocyspin活性的拮抗劑或激動劑(如小分子調(diào)節(jié)劑)。但是，當(dāng)可能單獨(dú)施用有效成分時(shí)，通常優(yōu)選使其作為藥物制劑。典型地，制劑包括與一種或多種其可接受載體一起的至少一種活性成分。每個(gè)載體應(yīng)該是藥物上和生理上均可接受的，可與其它成分相容并且對病患無害或沒有不所需的毒性。例如，生物活性劑在施用之前可與如卵白蛋白或血清白蛋白的載體蛋白復(fù)合，來增加穩(wěn)定性或藥物性質(zhì)(如半衰期)。而且，治療制劑可以與其它化學(xué)治療的或化學(xué)阻止試劑結(jié)合或一起使用。
通過藥物領(lǐng)域已知的方法制得治療制劑。見，如Gilman等人(eds.)(1990)Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(8thed.)Pergamon Press；和Remington，The Science ofPractice and Pharmacy，20th Edition.(2001)Mack Publishing Co.，Easton，P.a.；Avis等人(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage FormsParenteralMedications Dekker，N.Y.；Liebennan等人(eds.)(1990)PharmaceuticalDosage FormsTablets Dekker，N.Y.；和Liebennan等人(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems Dekker N.Y.。
根據(jù)要處理的疾病和病人情況，可以通過口服、非腸道(如肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、ICV)、腦池內(nèi)注射或融合、皮下注射、植入)，通過吸入噴霧、鼻吸、陰道、直腸、舌下或局部的施用路徑施用此處所述的化合物，并且可以單獨(dú)或與適當(dāng)劑量單位的制劑一起進(jìn)行配制，該的制劑含有適于每一施用路徑的常規(guī)非毒性藥物上可接受的載體、佐劑和賦形劑。
治療的藥物組合物和方法可以進(jìn)一步包括其他治療性的活性化合物(如此處所述)，其經(jīng)?；蚩梢杂糜谏鲜霾±砬闆r的治療中。
在需要adipocyspin調(diào)整的治療或預(yù)防情況中，適當(dāng)?shù)膭┝克酵ǔ榧s0.001到約100毫克每千克病患體重每天，其可以以單次或多次劑量施用。優(yōu)選地，劑量水平通常為約0.01到約25毫克每千克每天；更優(yōu)選地，劑量水平通常為約0.05到約10毫克每千克每天。適當(dāng)?shù)膭┝克娇梢詾榧s0.01到約25毫克每千克每天，約0.05到約10毫克每千克每天或約0.1到約5毫克每千克每天。在這個(gè)范圍內(nèi)，劑量可以為約0.005到約0.05，0.05到約0.5或0.5到約5毫克每千克每天。對于口服施用，優(yōu)選以片劑形式提供組合物來對要治療的病患進(jìn)行一定劑量的癥狀調(diào)節(jié)，其含有約1到約1000或更高毫克有效成分，特別約1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、750、800、900或1000毫克有效成分?？梢砸约s1到約4次每天，優(yōu)選每天一次或兩次的形式施用化合物。
但是，可以理解的是對任何特定病患的特定劑量水平和使用頻率是可以變化的并且取決于各種因素，包括所用的特定化合物的活性、化合物代謝的穩(wěn)定性和作用的時(shí)間長短、年齡、體重、平時(shí)健康、性別、食物、施用的模式和時(shí)間、排泄率、藥物組合、特點(diǎn)情況的嚴(yán)重性和經(jīng)受治療的宿主。
專利中的化合物可以和其他具有用于防止和治療炎癥的和免疫控制的病癥和疾病(包括哮喘和過敏疾病和如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化和上述的那些病變的自身免疫病變)的其他化合物結(jié)合。
還提供檢測和量化生物樣品中的adipocyspin多肽和多核苷酸的方法。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，adipocyspin基因產(chǎn)物(如多肽或mRNA)的表達(dá)或過分表達(dá)與adipocyspin介導(dǎo)或與adipocyspin有關(guān)的疾病或病癥相關(guān)。
生物樣品包括，但不限于血液樣品、血清、細(xì)胞(包括整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞成份、細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系)、組織(包括得自活組織檢查的組織)、體液(如尿、唾液、羊水、滑液)或來自介質(zhì)(來自培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系)等。檢測或量化adipocyspin多核苷酸的方法包括，但不限于帶有信號基于擴(kuò)增信號擴(kuò)增的分析、基于雜交的分析和合并的擴(kuò)增-雜交分析。為了檢測和量化adipocyspin多肽，示例性方法是利用抗體或其他特異性結(jié)合adipocyspin多肽或表位的結(jié)合劑的免疫測定，例如ELISA或RIA測定。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其變體是示例性的基于擴(kuò)增的測定。體外擴(kuò)增方法技術(shù)的例子描述于PCR TECHNOLOGYPRINCIPLESAND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION，H.Erlich，Ed.Freeman Press，New York.NY(1992)；PCR PROTOCOLSA GUIDE TOMETHODS AND APPLICATIONS，eds.Innis，Gelfland，Snisky，和White，Acidemic Press，San Diego，CA(1990)。其他適合的靶向擴(kuò)增方法包括，如連接酶鏈反應(yīng)(LCR；如Wu和Wallace，1989，Genomics 4560)；鏈置換擴(kuò)增(SDA；如Walker等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89392-396)；基于核算序列的擴(kuò)增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario；如Compton，1991，Nature 35091)等。一種有用的PCR的變體是PCR ELISA(如Boehringer Mannhein Cat.No.1 636 111)，其中將地高辛標(biāo)記的dUTP加入到PCR產(chǎn)物中。PCR反應(yīng)混合物變性并且與用來與PCR產(chǎn)物的內(nèi)序列退火的生物素標(biāo)記的寡核苷酸雜交。雜交產(chǎn)物固定在鏈霉抗生物素包覆的板上并且使用抗地高辛配體的抗體進(jìn)行檢測。
使用多核苷酸雜交技術(shù)進(jìn)行特異性DNA和RNA測量的一些技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的(見Sambrook，supra)。基于雜交的測定通常涉及其中多核苷酸探針與靶向多核苷酸雜交的測定。那些所述的或此處涉及的多核苷酸雜交探針全部或基本上與adipocyspin核酸序列的連續(xù)序列相同。優(yōu)選地，多核苷酸探針的長度為至少約10堿基，普遍至少約20堿基，有時(shí)至少約200堿基或更多。選擇多核苷酸探針序列來用于多核苷酸雜交的方法描述于Sambrook，supra。
多核苷酸雜交的形式是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在一些形式中，至少一個(gè)目標(biāo)和探針是固定的。固定的多核苷酸可以是DNA、RNA或另一個(gè)寡或多核苷酸，并且可以包括天然或非天然的核苷酸、核苷酸類似物或主鏈。這樣的測定可以以幾個(gè)形式的任一個(gè)，包括DNA雜交，RNA雜交、斑點(diǎn)和狹線印跡、高密度多核苷酸或寡核苷酸陣列(如GeneChips TM Affymetrix)、測桿(dip stick)、釘、碎片或珠。所有這些技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并且是許多商用診斷試劑盒的基礎(chǔ)。雜交技術(shù)通常描述于Hames等人，ed.，NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，APRACTICAL APPROACH IRL Press，(1985)；Gall and Pardue Proc.Nat’l.Acad.Sci.，USA.，63378-383(1969)；和John等人，Nature，223582-587(1969)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用原位雜交來檢測樣品中的adipocyspin序列。原位雜交測定是公知的且描述于Angerer等人，METHODS ENZYMOL，152649-660(1987)和Ausubel，supra。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用抗adipocyspin的抗體或結(jié)合分子檢測adipocyspin多核苷酸。許多已有的免疫結(jié)合測定適于測定和量化adipocyspin。見，如美國專利4,366,241；4,376,110；4,517,288和4,837,168，還參考METHODS IN CELL BIOLOGY VOLUME 37ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY，Asai，ed.Academic Press，Inc.NewYork(1993)；BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7thEdition，Stites& terr，eds.(1991)；Harlow，supra[如第四章]，和Ausubel，supra，[如第11章]，其每一個(gè)以全部加入本文作為參考并為所有目的。
檢測adipocyspin的免疫測定可以是競爭性或非競爭性的。使用可檢測到的標(biāo)記直接或間接檢測需要測定的adipocyspin基因產(chǎn)物。用于測定的特定標(biāo)記或可檢測到的基團(tuán)通常不是關(guān)鍵的一面，只要是沒有明顯干擾用于測定的抗體的特異性結(jié)合。標(biāo)記可以共價(jià)連接捕獲劑(如抗adipocyspin的抗體)，或可以與第三部分，如另一抗體(其特異性結(jié)合到不是捕獲劑識別的adipocyspin多肽的不同表位上)連接。
非競爭性免疫測定直接測量捕獲的分析物(此處，例如adipocyspin多肽)的量。一個(gè)該測定是，例如使用對捕獲的分析物上的兩個(gè)非干擾表位有反應(yīng)性的單克隆抗體的二個(gè)位點(diǎn)的基于單克隆免疫測定。見，例如用于背景信息的Maddox等人，1983，JExp.Med.，1581211。在這樣的測定中，直接測量樣品中的adipocyspin量。例如使用稱為“三明治”的測定，將捕獲劑(此處如抗adipocyspin的抗體)直接結(jié)合到其固定的固體基質(zhì)上。
固定的抗體捕獲存在于測試樣品中的多肽。固定的adipocyspin或其他目標(biāo)分子用標(biāo)記試劑(如含標(biāo)記的第二adipocyspin抗體)結(jié)合?；蛘?，例如第二adipocyspin抗體可以沒有標(biāo)記，但其可以用對衍生第二抗體的種類的抗體特異的標(biāo)記的第三抗體結(jié)合?？梢杂萌缟锼氐目蓹z測到的部分(第三標(biāo)記的分子可以與其特異性結(jié)合，如酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素)修飾第二部分。
在競爭性測定中，可以測量由樣品(如adipocyspin多肽)中存在的分析物從捕獲劑(如抗adipocyspin的抗體)中置換(或?qū)Ω偁?來的加入的(外源的)adipocyspin的量來間接測量樣品中存在的adipocyspin多肽的量。在一個(gè)競爭性測定中，例如向樣品中加入已知量的adipocyspin，然后使樣品與特異性結(jié)合到adipocyspin的捕獲劑(如抗adipocyspin的抗體)接觸。結(jié)合到抗體的adipocyspin的量與樣品中存在的adipocyspin的濃度成反比。
優(yōu)選的，將抗體固定在固體底物上。結(jié)合到抗體的adipocyspin的量可以通過測量存在于adipocyspin/抗體復(fù)合物中的adipocyspin的量，或測量剩下的未復(fù)合的adipocyspin的量進(jìn)行確定。通過提供標(biāo)記的adipocyspin分子來檢測adipocyspin的量。例如，使用半抗原抑制測定，將分析物(此處為adipocyspin)固定在固體底物上。將已知量的抗adipocyspin的抗體加入到樣品中，然后使樣品與固定的adipocyspin接觸。在這種情況中，結(jié)合到固定adipocyspin的抗adipocyspin的抗體的量與存在于樣品中adipocyspin的量成反比。再次通過檢測抗體的固定部分或保留在溶液中的抗體的片段檢測固定抗體的量。檢測可以是直接的(抗體是標(biāo)記的)或間接的(通過隨后加入特異性結(jié)合到上述抗體的標(biāo)記部分)。
除了競爭性和非競爭性adipocyspin多肽免疫測定以外，還可以提供其他用于檢測和量化adipocyspin多肽的其他測定。例如可以使用蛋白印跡(免疫印跡)分析來檢測和量化樣品中adipocyspin的存在。技術(shù)通常包括通過以分子量為基礎(chǔ)的凝膠色譜法分離樣品多肽，將分離的多肽轉(zhuǎn)移至適合的固體載體(如硝基纖維膜、尼龍膜或衍生的尼龍膜)，然后和特異性結(jié)合adipocyspin的抗體一起孵化樣品。抗adipocyspin的抗體特異性結(jié)合到固體載體上的adipocyspin。這些載體可以直接被標(biāo)記或者可以使用特異性結(jié)合到抗adipocyspin的標(biāo)記的抗體(如標(biāo)記的羊抗鼠抗體)隨后進(jìn)行檢測。
而且，如脂質(zhì)體免疫測定(LIA)的測定也可以包括在本專利中。LIA使用用于結(jié)合特異性的分子(如抗體)并且釋放被囊的試劑或標(biāo)記的脂類。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測釋放的化學(xué)物質(zhì)(見，Monroe等人，1986，Amer.Clin.Prod.Rev.534-41)。
用于治療和診斷(檢測)方法的試劑以試劑盒形式提供，包括含有多肽、抗體和多核苷酸的試劑盒形式。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，試劑盒形式包括一種或多種下列內(nèi)容物(1)一種或多種adipocyspin多核苷酸(如，對應(yīng)于adipocyspin cDNA序列并且能擴(kuò)增靶向多核苷酸的寡核苷酸引物或探針)；(2)一種或多種抗adipocyspin的抗體(或其他結(jié)合的分子)；(3)一種或多種adipocyspin多肽或片段，其任選包覆在固體表面上(如載物片、多孔板、或測試試管)；(4)一種或多種adipocyspin多核苷酸和/或多肽(如用作測定中的正對照)；(5)和試管。進(jìn)行適當(dāng)檢測方法和校準(zhǔn)曲線的方法也可以包括在其中。
在以下說明中，我們說明了新型的脂肪細(xì)胞分泌的產(chǎn)物的確定，該產(chǎn)物與半胱氨酸蛋白酶抑制劑的家族成員具有相同的序列。在3T3-L1細(xì)胞的脂肪轉(zhuǎn)化過程中明顯誘發(fā)了adipocyspin的表達(dá)。肥胖狀態(tài)下中大量mRNA也明顯增加。而且用重組adipocyspin處理3T3 L1細(xì)胞會明顯抑制脂肪的轉(zhuǎn)化，表明adipocyspin是脂肪形成的負(fù)調(diào)整劑。。
通過參考下列實(shí)驗(yàn)部分來加深進(jìn)一步的理解。下列實(shí)驗(yàn)是示例性的并且不會以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1設(shè)定用于分化3T3-L1細(xì)胞和隨后所得到的來自細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白濃度的實(shí)驗(yàn)程序。
維持DMEM中的未融合的3T3-L1細(xì)胞，其用DMEM中補(bǔ)充10％胎牛血清。對于要發(fā)生的分化，將細(xì)胞接種到150mm的板上，并且達(dá)到100％融合，且在融合一天后用含有0.25μM地塞米松、0.5mM IBMX和10μg/mL胰島素的上述介質(zhì)誘發(fā)2天。然后用10μg/mL胰島素孵育2天。在帶有10％胎牛血清的DMEM中保持細(xì)胞4天。
為了得到分泌自脂肪細(xì)胞的蛋白，用PBS清洗分化8天后的細(xì)胞3次，然后用不含血清的培養(yǎng)基再孵化4小時(shí)。對培養(yǎng)基進(jìn)行收集，以3,000×g離心10分鐘，通過0.20μm過濾器過濾，然后使用5000DaMWCO(Vivascience Ltd，Gloucestershire，UK)的濃縮器濃縮并去鹽。然后使用BCA試劑量化蛋白，并且在-80℃儲存直到使用。
使用Immobiline DryStrips，在pH值為6-11的范圍內(nèi)，用以上所述的二維凝膠電泳分離脂肪細(xì)胞或3T3 L1前脂肪細(xì)胞分泌的蛋白。用銀或考司馬亮藍(lán)R250(CBB)染分離的蛋白。用Melanine2軟件確定分化分泌的蛋白。
切割2-DE凝膠分離的感興趣的蛋白，且使凝膠片經(jīng)過上述的凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化作用。通過RP HPLC在Jupiter 5μC18柱(250×2.00mm，Phenomenex)上分餾提取的胰蛋白酶肽混合物。用0.1％三氟醋酸(v/v)清洗預(yù)熱柱(37℃)7分鐘，然后以每分鐘200uL的流速，在50min內(nèi)，乙腈從8％到36％進(jìn)行線性梯度洗脫。使用Edman降解方法，用Perkin-Elmer蛋白序列分析儀(Procise，Model 492)選擇分離好的片段進(jìn)行氨基酸的排序。
Adipocyspin的克隆和哺乳動物表達(dá)。使用TRIZOL試劑，根據(jù)制造者的方法，從小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞或人脂肪墊中純化總RNA。來自總RNA的寡-dT-引物的cDNA用作PCR克隆的模板。將小鼠(SEQID NO5)和人(SEQ ID NO6)adipocyspin的全長cDNA插入到pGEMT-easy載體(Promega)中進(jìn)行DNA序列驗(yàn)證。
使用5’GCCCGCGGATCCATGCTACTGTTGCAAGCTCT3’[SEQ IDNO3]作為正義引物，且5’GGCCGCGAATTCTCACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTTGGTATCATGGTAGAG3’[SEQ ID NO4]作為反義引物，通過cDNA擴(kuò)增來產(chǎn)生用于小鼠adipocyspin的哺乳動物表達(dá)的載體。用BamHI/EcoRI消化后，將片段插入到pcDNA3.1載體中以產(chǎn)生pcDNA-adipocyspin-F，其編碼C端由FLAG表位標(biāo)記的以全長adipocyspin。使用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑將這種哺乳動物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞中，并且使細(xì)胞分泌adipocyspin進(jìn)入非血清培養(yǎng)基48小時(shí)。然后得到培養(yǎng)基，并且通過3,000×g離心10分鐘，通過0.20μm過濾器過濾來去除細(xì)胞碎片。使用5000Da MWCO的濃縮器濃縮過濾的培養(yǎng)基，如上所述。根據(jù)制造者的方法，使用抗FLAG M2親和凝膠純化FLAG標(biāo)記的adipocyspin，然后用150μg/mL的FLAG肽洗脫。
RNA印跡和蛋白質(zhì)印跡分析。在1.2％甲醛-變性的瓊脂糖凝膠上分離10μg從3T3 L1細(xì)胞或小鼠脂肪組織中純化的總RNA，然后轉(zhuǎn)入尼龍薄膜。如上所述，使用32P標(biāo)記的全長adipocyspin、脂聯(lián)素、PPARγ、或GLUT4 cDNA作為探針來進(jìn)行雜交。目測并使用磷屏分析膜。如上所述進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。
實(shí)施例2下列實(shí)驗(yàn)說明adipocyspin的性質(zhì)。
用二維凝膠電泳分離來自3T3-L1前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)基的蛋白。分析顯示出具有16kDa的表觀MW和9.3pI值的蛋白主要存在于脂肪細(xì)胞中，而不存在于前脂肪細(xì)胞中(圖1)。為了確定這些蛋白的性質(zhì)，從多重預(yù)備凝膠中切出蛋白“點(diǎn)”(見圖1)，然后進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化作用。通過RP HPLC分餾胰蛋白酶肽混合物，并使分離好的片段進(jìn)行氨基酸的測序(圖2)。來自4個(gè)胰蛋白酶的肽的氨基酸序列不能被認(rèn)為是任何已知蛋白。在National Center forBiotechnology Information的核酸數(shù)據(jù)庫中tBLASTn搜索表明了與假定蛋白的匹配，其是從RIKEN全長的富含成鼠cDNA庫(基因接收號碼AK002298)中的表達(dá)序列標(biāo)記(EST)的序列中電子翻譯的RT PCR分析證明了在3T3L1細(xì)胞中該基因的表達(dá)。
這個(gè)cDNA的假定讀碼框編碼162氨基酸殘基的推定蛋白(圖3A)。預(yù)測的氨基酸序列在氨基酸位點(diǎn)62、72、83、86、101和116含有半胱氨酸殘基，如圖3A所示。將一個(gè)半胱氨酸殘基與另一個(gè)辦胱氨酸殘基連接形成分子內(nèi)雙硫鍵，以使adipocyspin和/或adipocyspin異構(gòu)體可以含有至多3個(gè)分子內(nèi)雙硫鍵。在Kyte-Doolittleplot分析之后預(yù)計(jì)的一個(gè)疏水性伸展位于頭17個(gè)氨基端的殘基中并且是信號序列的特征。同源搜尋顯示這種蛋白N端的一半和具有類似cystatin結(jié)構(gòu)域(如cystatin C)的蛋白族之間的一些相似性(圖3B)。Cystatin是半胱氨酸蛋白酶抑制劑的家族并且其中許多是分泌蛋白。Adipocyspin的COOH端的一半顯示出與與任何已知蛋白沒有同源性。Adipocyspin的預(yù)測的分子質(zhì)量和pI值(除了推定的分泌信號)是16548.23Da和9.36，其特別與在2DE分離中所觀察到的值相匹配(圖2)。
實(shí)施例3這個(gè)實(shí)驗(yàn)確定adipocyspin作為分泌蛋白。通過將FLAG表位標(biāo)記的adipocyspin構(gòu)建瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS 7細(xì)胞，并且通過免疫印跡在條件培養(yǎng)基中檢測蛋白。
分析顯示出adipocyspin在培養(yǎng)物培養(yǎng)基中易于檢測到(圖4)。在另一方面，很難檢測到β微管蛋白，其是一種細(xì)胞質(zhì)蛋白，并且得知細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中的adipocyspin并不是由于細(xì)胞溶解。
實(shí)施例4這個(gè)實(shí)施例用于評估通過RNA印跡分析得到的adipocyspinmRNA的依賴于分化的表達(dá)，其通過測定3T3 L1預(yù)細(xì)胞脂肪的脂肪轉(zhuǎn)化過程中的adipocyspin mRNA表達(dá)的時(shí)間譜。如圖5所示，adipocyspinmRNA表達(dá)與細(xì)胞分化，并且和細(xì)胞形態(tài)的變化有關(guān)(圓形和分子內(nèi)脂滴的出現(xiàn))。具有約800bp的adipocyspin mRNA在誘使脂肪轉(zhuǎn)化的第二天時(shí)開始顯示出來，并且在第8天達(dá)到最大值。Adipocyspin的表達(dá)動力學(xué)與aP2的那些相似，并且稍微領(lǐng)先于脂聯(lián)素，脂聯(lián)素是完全在脂肪細(xì)胞中表達(dá)的蛋白。
結(jié)果顯示出同時(shí)出現(xiàn)adipocyspin mRNA表達(dá)和脂肪細(xì)胞的顯型。
實(shí)施例5這個(gè)實(shí)施例評估肥胖癥中adipocyspin的改變的表達(dá)。肥胖中基因表達(dá)的調(diào)整提供用于新陳代謝疾病狀態(tài)中感興趣蛋白的功能關(guān)聯(lián)性的有用信息。
我們發(fā)現(xiàn)相對于肥胖(ob/ob)小鼠的共基因瘦肉對照，其中的adipocyspin mRNA持續(xù)增加3到4倍(圖6)。這個(gè)結(jié)果與ob/ob小鼠中的脂聯(lián)素基因中的降低表達(dá)是明顯相反的。肥胖中adipocyspin的改變的表達(dá)表明了這種病癥的一種或多種病理生理特征涉及該蛋白。通過對這種模型(如leptin)特異性的基因缺陷來控制adipocyspin mRNA的水平。
實(shí)施例6這個(gè)實(shí)施例評估脂肪細(xì)胞分化蛋白水解的adipocyspin抑制及其在脂肪轉(zhuǎn)化中的角色。測定在脂肪細(xì)胞分化中adipocyspin的涉及情況。
從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS 7細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化COOH端FLAG標(biāo)記的adipocyspin，然后加入到3T3 L1細(xì)胞中。在沒有adipocyspin的情況下，超過80％的3T3 L1細(xì)胞分化入負(fù)載脂類的脂肪細(xì)胞，如在油紅O染色中所示(見圖7的A)。在用20μg/ml adipocyspin處理的細(xì)胞中，觀察到僅偶爾出現(xiàn)的負(fù)載脂類的細(xì)胞(50中少于1的幾率)。類似地，當(dāng)細(xì)胞用adipocyspin處理后，脂肪細(xì)胞標(biāo)記、PPARγ和GLUT4的表達(dá)也降低超過70％(圖8)。這些結(jié)果顯示adipocyspin可以阻斷脂肪轉(zhuǎn)化。
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根據(jù)法律來解釋權(quán)利要求。但是且雖然，所謂的或輕松認(rèn)識到或困難的解釋任何權(quán)利要求或其部分，不可能在執(zhí)行本發(fā)明或本申請過程中對權(quán)利要求或其任何部分的調(diào)整或修改會使本專利以喪失對任何和全部沒有形成已有技術(shù)的一部分的同等部分的權(quán)利進(jìn)行解釋。
本說明書中公開的所有特征以任何合并方式進(jìn)行結(jié)合。因此，除非另有說明，公開的每個(gè)特征僅是同等或相似基因系列的例子。
知道當(dāng)將本發(fā)明與其詳細(xì)描述結(jié)合描述時(shí)，前述描述試圖說明而非限制本發(fā)明的范圍，該范圍是由所屬權(quán)力要求的范圍定義的。因此，從上述表明，即使特定具體實(shí)施方案描述于此出來作為說明目的，但是可以在不違背本發(fā)明的精神和范圍的情況下使用各種變體。另一方面，除了由所屬權(quán)利要求限定以外，權(quán)利要求和本發(fā)明的范圍內(nèi)的優(yōu)點(diǎn)和變體是不受限制的。
描述于此的特定方法和組合物是優(yōu)選具體實(shí)施方案的代表，并且作為示例且不會限制本發(fā)明的范圍。在本說明書的考慮下對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說其他的目的、方面和具體實(shí)施方案是會發(fā)生的并且包括在由權(quán)利要求的范圍定義的本發(fā)明的精神以內(nèi)。對本發(fā)明的技術(shù)人員來說在不違背本發(fā)明的范圍和精神下對此處所公開的本發(fā)明所作的取代和改變是明顯的?？梢栽跊]有任何元素或限定(并非此處作為必要公開的)下實(shí)施此處所述的本發(fā)明。因此，例如，在每種情況和本發(fā)明的具體實(shí)施方案或?qū)嵤├拿枋鱿?，術(shù)語“包括”，“含有”，“包含”等可以擴(kuò)張性理解并且沒有限制?？梢砸苑植讲襟E此處所述的方法和過程，并且他們對此處所說明的或權(quán)利要求中的步驟是并非嚴(yán)格要求的。
所用的術(shù)語和表達(dá)用作描述的術(shù)語且無限制，并且不試圖使用這樣的術(shù)語和表達(dá)來排除任何等同的所示特定和描述或其部分，但是可以認(rèn)為在所要求的本發(fā)明的范圍內(nèi)各種變化是可能的。因此，已知盡管本發(fā)明可以通過各種具體實(shí)施方案和/或優(yōu)選具體實(shí)施方案和任選特征來進(jìn)行公開，但是任何或所有本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的概念的改變或變化都認(rèn)為是在由所屬權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此處廣泛并一般地描述本發(fā)明。落入一般公開的每個(gè)較窄物類和分支類群類也屬于本發(fā)明。無論所述材料或條件是否在此處有所描述，這包括條件或負(fù)面限定為從物類中去除任何目標(biāo)物質(zhì)的本發(fā)明的類別描述。
還知道用于此處和所述權(quán)利要求中的單數(shù)形式“a”，“an”和“the”包括復(fù)數(shù)，除非有明確說明，而字母“s”在名詞后面來表示名詞的單復(fù)數(shù)。術(shù)語“或”當(dāng)用于此處作為聯(lián)合意思“和/或”，除非明確說明。術(shù)語“包括”或相關(guān)術(shù)語是非限定的并且除了特別說明而包括元素的存在。此外，特征或方面是根據(jù)Markush類群進(jìn)行描述，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到本發(fā)明還可以根據(jù)Markush類群的任何單獨(dú)成員或子群來進(jìn)行描述。
其它具體實(shí)施方案也在權(quán)利要求中。在任何情況下專利都不能解釋為對此處特別和/或明確公開的特定實(shí)施例或具體實(shí)施方案或方法進(jìn)行限制。在任何情況下本發(fā)明都不能解釋為是通過任何審查員或任何其他專利和商標(biāo)的官方或雇員所作的任何陳述進(jìn)行限定，除非這樣的陳述是特定的并且并未在申請人的回復(fù)中明確限定或保留權(quán)益。
權(quán)利要求
1.一種重組的表達(dá)載體，包括選自以下的多核苷酸(a)編碼SEQ ID NO1的多肽的多核苷酸；(b)編碼SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸；(c)在嚴(yán)緊條件下與(a)和/或(b)的多核苷酸或其互補(bǔ)雜交的多核苷酸；或(d)由于遺傳碼降解成(a)、(b)或(c)定義的序列的多核苷酸序列。
2.一種由權(quán)利要求1所述的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞，其是真核細(xì)胞或哺乳類細(xì)胞。
4.一種制備adipocyspin蛋白、肽或融合蛋白的方法，包括培養(yǎng)已經(jīng)被遺傳制造來產(chǎn)生增量的adipocyspin蛋白、肽或融合蛋白的重組細(xì)胞。
5.一種分離的或重組的多肽，包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或其任一的生物活性或免疫原的片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的adipocyspin多肽，其抑制前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽或片段，其中多肽具有至少90％與SEQID NOS1或2相同的30個(gè)氨基酸序列。
8.一種融合蛋白，包括權(quán)利要求5所述的多肽。
9.一種多核苷酸引物、探針、反義寡核苷酸或核酶，包括至少15個(gè)與編碼SEQ ID NO1或SEQ ID NO2互補(bǔ)的鄰近的堿基。
10.一種抗體或其結(jié)合片段，其中抗體或抗體片段與權(quán)利要求5所述的多肽特異性結(jié)合。
11.一種分泌權(quán)利要求10所述的抗體的分離的細(xì)胞。
12.一種在樣品中檢測adipocyspin基因產(chǎn)物的方法，包括(a)使樣品與結(jié)合基因產(chǎn)物的探針接觸，其中探針與基因產(chǎn)物形成復(fù)合物，并且檢測復(fù)合物的形成；或(b)在生物樣品中特別擴(kuò)增基因產(chǎn)物，其中所述基因產(chǎn)物是多核苷酸，并且檢測擴(kuò)增的產(chǎn)物；其中復(fù)合物的形成或擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與生物樣品中脂聯(lián)素基因產(chǎn)物的存在有關(guān)聯(lián)。
13.一種確定adipocyspin活性調(diào)制子的方法，包括在adipocyspin存在的情況下使細(xì)胞與測試化合物接觸并且測定在測試化合物存在而非沒有的情況下發(fā)生的生物效應(yīng)，其中誘發(fā)生物效應(yīng)的測試化合物確定為adipocyspin活性的調(diào)制劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述生物效應(yīng)是前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的抑制。
15.一種治療哺乳動物中adipocyspin介導(dǎo)的病癥的方法，包括對哺乳動物體內(nèi)的細(xì)胞或組織中施用調(diào)節(jié)adipocyspin的活性或表達(dá)的試劑。
16.一種藥物組合物，包括如權(quán)利要求5所述的adipocyspin多肽和一種或多種選自藥物上可接受的賦形劑、載體、助活性劑或稀釋劑的材料。
17.一種組合物，包括adipocyspin多肽，其中adipocyspin多肽是重組的、分離的、純化的或合成的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其能誘發(fā)1μg/mL至20μg/mL的血漿adipocyspin多肽濃度。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其能誘發(fā)1.9μg/mL至17μg/mL的血漿adipocyspin多肽濃度。
20.一種診斷個(gè)體中疾病狀態(tài)的存在或疾病的發(fā)展傾向的方法，包括確定個(gè)體中adipocyspin多肽的水平，并且將該水平與未處于疾病狀態(tài)的個(gè)體的水平特征比較，其中水平的差別顯示為疾病的存在或向疾病發(fā)展的傾向。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中疾病狀態(tài)選自高血糖、胰島素抗性、2型糖尿病、肥胖癥、高血壓、動脈硬化、冠性心臟病、缺血性心臟病、多囊性卵巢癥候群、或與胰島素抗性有關(guān)的代謝癥候群。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中評估方法使用電泳、HLPC或質(zhì)譜分析。
23.一種治療與adipocyspin失調(diào)有關(guān)的疾病狀態(tài)的方法，包括施用有效量的含有adipocyspin多肽的藥物上可接受的組合物。
24.帶有或未帶有藥物上可接受的賦形劑、助活性劑、稀釋劑和包封容器的adipocyspin多肽在制備用于哺乳動物病患中的藥物組合物或藥物或藥劑的應(yīng)用i)在治療與adipocyspin多肽調(diào)節(jié)有關(guān)的疾病狀態(tài)中；或ii)來增強(qiáng)胰島素的作用；或iii)抑制與增加的脂肪質(zhì)量有關(guān)的肥胖癥或病癥。
25.一種當(dāng)施用或單獨(dú)施用與人類或其它哺乳動物時(shí)能夠傳輸有效量adipocyspin多肽來有效降低脂肪組織的量或體重的制劑或藥劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的制劑或藥劑，其中adipocyspin多肽是人類adipocyspin。
27.一種治療哺乳動物來防止和/或逆轉(zhuǎn)肥胖或增加的脂肪組織質(zhì)量和/或任何肥胖或增加的脂肪組織質(zhì)量的特征的方法，其包括或包含對病患施用adipocyspin和/或其激動劑。
28.一種制品，包括或包含含有adipocyspin多肽和/或adipocyspin激動劑的容器；和使用其來治療、防止或逆轉(zhuǎn)肥胖或增加的脂肪組織質(zhì)量和/或任何肥胖或增加的脂肪組織質(zhì)量的特征的指導(dǎo)方法。
29.一種測定哺乳動物體內(nèi)adipocyspin的方法，其包括或包含測定血液或組織中adipocyspin的濃度。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述濃度通過如放射免疫測定法(RIA)和/或ELISA的免疫學(xué)方法確定。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型肽及其使用，包括多肽及相關(guān)分子在例如減肥和治療肥胖方面以及與例如增加細(xì)胞脂肪質(zhì)量相應(yīng)疾病的應(yīng)用。
文檔編號A61P3/10GK1898260SQ200480038005
公開日2007年1月17日 申請日期2004年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月28日
發(fā)明者G·J·S·庫珀, Y·王, A·許 申請人:普羅特米克斯發(fā)現(xiàn)有限公司