專利名稱：通過序列分析監(jiān)測狀況的方法
通過序列分析監(jiān)測狀況的方法交叉參考本申請要求2008年11月7日提交的美國專利申請No. 61/112，693的優(yōu)先權(quán)，該美國專利申請在此引入作為參考。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)包括先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。先天性免疫系統(tǒng)包括利用一般方法識別外來病原體的細胞和機制。先天性免疫涉及的細胞包括中性白細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞和樹突細胞。這些細胞發(fā)揮吞噬作用以及釋放許多可殺死侵入病原體的化學物質(zhì)。另外，這些細胞參與先天性免疫防御機制，包括補體級聯(lián)和炎癥。最后，這些細胞中的一些參與在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中起作用的抗原呈遞過程。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)展為攻擊它們的靶標上的特定特征。發(fā)生對特定靶標的一種應(yīng)答給宿主提供了它的“記憶”，使其如果再一次出現(xiàn)則引發(fā)更強的應(yīng)答。通常，任何蛋白質(zhì)或多糖能夠作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答細胞的一些亞群或其產(chǎn)物的靶標，該產(chǎn)物識別靶標上的特異性表位。適應(yīng)性免疫應(yīng)答被分為兩類體液和細胞介導的免疫應(yīng)答，B細胞和T細胞分別在這些應(yīng)答中起特異性作用。由于自身免疫病涉及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一些成分對自身靶標的識別，已經(jīng)研究了適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的方面以幫助診斷和預(yù)后。已經(jīng)使用標準免疫學技術(shù)，通過尋找循環(huán)自身抗體研究了體液免疫系統(tǒng)。自身抗體如抗核、抗dsDNA和類風濕因子，已經(jīng)對幾種疾病進行了鑒別。這些抗體本身可能不是致病性的，它們在體內(nèi)識別的靶標也不必然與在體外檢測的相同；然而，這些水平的測定有助于診斷，并且在有些情況下具有一定的預(yù)后和治療意義。研究自身免疫病中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的另外一種方法是基于對適應(yīng)性免疫細胞的多樣性的分析。適應(yīng)性免疫細胞的激活導致它們的克隆擴增。這一克隆擴增的證據(jù)通常通過從血液RNA或DNA擴增編碼抗原識別區(qū)的核酸序列的部分來獲得。例如，擴增具有T 細胞受體β鏈(類似于抗體重鏈)的特異性V區(qū)段的序列的PCR引物用來擴增連接至特定V區(qū)段的J區(qū)段或J和D區(qū)段。當存在多樣的細胞群時，預(yù)期擴增片段，具有大小略微不同的擴增子的分布，但是克隆擴增導致特定大小被富集，因此在凝膠上顯示為更強的帶。在被稱為譜型分析(spectratyping)的技術(shù)中，每個V區(qū)段與J和D區(qū)段一起擴增，以評估這些擴增子中的任一種是否顯示克隆擴增。譜型分析方法的一個問題是許多不同的序列可能具有相同的長度，因此無法區(qū)分。因此，該技術(shù)只能分辨出顯著的克隆擴增。需要改進診斷和幫助自身免疫病預(yù)后和自身免疫疾病狀態(tài)以及免疫系統(tǒng)起中心作用的其它疾病的方法。盡管在對免疫系統(tǒng)進行譜型分析中另外的特異性在允許更好地預(yù)測它對人類健康的影響方面具有重要的應(yīng)用，如果開發(fā)了允許鑒別疾病過程涉及的特定τ和B細胞的方法，即使這些特定序列以前從未被觀察到，仍將具有更大的應(yīng)用。免疫系統(tǒng)的巨大多樣性提供了潛在有用的細胞的巨大儲備，而且對試圖使用該所有組成成分用于預(yù)測目的的研究人員提出了挑戰(zhàn)。針對抗原的任何單序列是可能涉及特定個體中的疾病過程和/或與之相關(guān)的大量序列之一。鑒別特定個體中的許多細胞中的哪些與疾病過程相關(guān)的方法對于人類健康是特別有價值的。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組(recombined)DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述細胞空間上分離基因組DNA的個體分子；對所述空間上分離的基因組DNA的個體分子進行測序，和確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。 在另一方面，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述細胞空間上分離基因組DNA的個體分子，擴增所述基因組DNA的個體分子，對所述擴增的DNA進行測序，以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在另一方面，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述細胞擴增基因組DNA，空間上分離所述擴增的DNA的個體分子，對所述空間上分離的擴增DNA的個體分子進行測序，以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在另一方面，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述細胞擴增基因組DNA，空間上分離所述擴增的DNA的個體分子，再擴增所述擴增的DNA分子，對所述再擴增的DNA分子進行測序，以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在另一方面，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，逆轉(zhuǎn)錄來自所述細胞的RNA以形成cDNA，空間上分離所述cDNA的個體分子，任選地再擴增所述空間上分離的個體cDNA的個體分子，對所述 cDNA和/或再擴增的cDNA進行測序；以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在另一方面，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品；空間上分離所述樣品中的個體細胞，對來自所述細胞的個體核酸分子進行測序；以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在一個實施方案中，所述擴增和/或再擴增包括PCR、多重PCR、TMA, NASBA或 LAMP。在另一實施方案中，所述空間上分離包括在用來轉(zhuǎn)化細菌的載體中亞克隆所述DNA 或cDNA，在固體支持體上兩維地分離所述DNA或cDNA，在含有微團的溶液中三維地分離所述DNA或cDNA，或利用微反應(yīng)室分離分子。在另一實施方案中，所述擴增和/或再擴增是通過攜帶亞克隆的DNA或cDNA的細菌的生長，DNA或cDNA在載玻片上的擴增，或DNA或cDNA 在珠上的擴增。在另一實施方案中，所述測序包括雙脫氧測序。在另一實施方案中，所述測序包括利用可逆終止的標記核苷酸進行合成測序。在另一實施方案中，所述測序包括檢測核苷酸摻入的焦磷酸釋放。在另一實施方案中，所述測序包括與標記寡核苷酸探針文庫的等位基因特異性雜交。在另一實施方案中，所述測序包括合成測序，該合成測序利用與標記寡核苷酸探針文庫的等位基因特異性雜交，隨后連接所述探針。在另一實施方案中，所述測序包括實時監(jiān)測聚合步驟過程中標記核苷酸的引入。在另一實施方案中，所述重組DNA序列包含T細胞受體基因和/或免疫球蛋白基因。在另一實施方案中，所述測序包括對免疫球蛋白和/或T細胞受體基因的全克隆序列的亞群進行測序。在另一實施方案中，所述全克隆序列的亞群包括免疫球蛋白或T細胞受體基因的 V-D連接、D-J連接、免疫球蛋白或T細胞受體基因的完整可變區(qū)、抗原識別區(qū)、或互補決定區(qū)3(CDR3)。在另一實施方案中，所述T細胞受體基因包含T細胞受體β基因。在另一實施方案中，所述免疫球蛋白基因包含免疫球蛋白重鏈基因。在另一實施方案中，所述擴增或再擴增包含多條互補于V區(qū)段的引物和一條互補于C區(qū)段的引物。在另一實施方案中，所述擴增或再擴增包含多條互補于V區(qū)段的引物和多條互補于C區(qū)段的引物。在另一實施方案中，所述多條互補于V區(qū)段的引物包含對于各V區(qū)段的至少三條不同的引物，所述多條互補于C區(qū)段的引物包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6條引物。在另一實施方案中，所述T或B細胞是總T和B細胞的亞群。在另一實施方案中， 所述T細胞的亞群是⑶4+，⑶8+細胞或⑶27 s細胞。在另一實施方案中，所述樣品包含至少100，000個、至少500，000個、至少750，000個或至少1，000, 000個T細胞。在另一實施方案中，所述測序包括至少1000閱讀/運行、至少10，000閱讀/運行、 至少100，000閱讀/運行或至少1，000, 000閱讀/運行。在另一實施方案中，所述測序包括每閱讀產(chǎn)生約30bp、約40bp、約50bp、約60bp、約70bp、約80bp、約90bp、約IOObp、約110 或約120bp。在另一實施方案中，當受試者處于自身免疫病的發(fā)作狀態(tài)(flare state)時采集所述樣品。在另一實施方案中，從患有或懷疑患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的受試者采集所述樣品。在另一方面，提供了一種確定受試者的一個或多個相關(guān)克隆型的方法，包括通過對來自受試者的至少一個樣品的個體、空間上分離的分子進行核酸測序產(chǎn)生一個或多個克隆型譜，其中所述至少一個樣品與疾病的第一狀態(tài)有關(guān)，以及基于所述一個或多個克隆型譜確定受試者中的一個或多個相關(guān)克隆型。在一個實施方案中，所述至少一個樣品來自受疾病影響的組織。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型的確定包括比較來自至少兩個樣品的克隆型譜。在另一實施方案中，疾病的第一狀態(tài)是疾病的高峰狀態(tài)。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型存在于疾病的高峰狀態(tài)。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)不存在。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時高。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時低。在另一實施方案中，所述樣品包含T細胞和/或B細胞。在另一實施方案中，所述 T細胞和/或B細胞包含T細胞和/或B細胞的亞群。在另一實施方案中，所述T細胞和/ 或B細胞的亞群通過與標志物相互作用而富集。在另一實施方案中，所述標志物是T細胞和/或B細胞的亞群上的細胞表面標志物。在另一實施方案中，所述T細胞和/或B細胞的亞群與特異性存在于疾病中的抗原相互作用。在另一實施方案中，所述疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡或多發(fā)性硬化。
在另一方面，提供了一種開發(fā)算法的方法，該算法能夠預(yù)測來自患病受試者的任何樣品中的一個或多個相關(guān)克隆型，該方法包括a)從一組樣品產(chǎn)生多個克隆型譜，其中該樣品與所述疾病有關(guān)，b)從這組樣品鑒別一個或多個相關(guān)克隆型，c)利用來自b)中鑒別的一個或多個相關(guān)克隆型的序列參數(shù)和/或功能數(shù)據(jù)來開發(fā)能夠預(yù)測來自患病受試者的任何樣品中的相關(guān)克隆型的算法。在一個實施方案中，這組樣品獲自一個或多個受疾病影響的組織。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型的鑒別包括比較來自至少兩個樣品的克隆型譜。在另一實施方案中，所述功能數(shù)據(jù)包括T細胞和/或B細胞表面上的標志物的結(jié)合能力或T細胞或B細胞與抗原的相互作用。在另一實施方案中，所述序列參數(shù)包括核酸序列和預(yù)測的氨基酸序列。在另一實施方案中，樣品來自一個或多個處于疾病高峰期的個體。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時存在。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)處于高水平。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)處于低水平。在另一實施方案中，一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時不存在。在另一實施方案中，所述疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡或多發(fā)性硬化。在另一實施方案中，提供了一種發(fā)現(xiàn)個體的一個或多個相關(guān)克隆型的方法，該方法包括將來自個體樣品的克隆型譜輸入一種算法，并利用該算法確定個體的一個或多個相關(guān)克隆型。在一個實施方案中，所述算法是能夠預(yù)測來自患病受試者的任何樣品中的一個或多個相關(guān)克隆型的算法，包括通過以下方式開發(fā)所述算法a)從一組樣品產(chǎn)生多個克隆型譜，其中該樣品與所述疾病有關(guān)，b)從這組樣品鑒別一個或多個相關(guān)克隆型，c)利用 b)中鑒別的一個或多個相關(guān)克隆型的序列參數(shù)和/或功能數(shù)據(jù)來開發(fā)能夠預(yù)測患病受試者的任何樣品中的相關(guān)克隆型的算法。在一個實施方案中，所述樣品在疾病的高峰狀態(tài)時獲得。在另一實施方案中，樣品取自受疾病影響的組織。在另一方面，提供了產(chǎn)生計算疾病活動性得分的算法的方法，包括開發(fā)使用一組因素將相關(guān)克隆型水平組合為疾病活動性得分的算法，比較該疾病活動性得分與關(guān)于疾病狀態(tài)的臨床數(shù)據(jù)，以及優(yōu)化該因素，以最大化臨床數(shù)據(jù)與疾病活動性得分之間的相關(guān)性。在一個實施方案中，提供了監(jiān)測個體疾病狀態(tài)的方法，包括a)從來自個體的樣品確定克隆型譜，b)將來自a)的克隆型譜信息輸入到計算疾病活動性得分的算法中，其中，該算法是如下產(chǎn)生的開發(fā)使用一組因子將相關(guān)克隆型水平組合為疾病活動性得分的算法，比較疾病活動性得分與關(guān)于疾病狀態(tài)的臨床數(shù)據(jù)，以及優(yōu)化所述因子以最大化臨床數(shù)據(jù)與疾病活動性得分之間的相關(guān)性，和c)使用計算疾病活動性得分的算法產(chǎn)生預(yù)示個體疾病狀態(tài)的得分。在另一實施方案中，監(jiān)測個體疾病狀態(tài)的方法還包括確定個體中的一個或多個相關(guān)克隆型，并將一個或多個相關(guān)克隆型信息輸入到一種算法中。在另一實施方案中，所述確定個體中的一個或多個相關(guān)克隆型包括a)通過對來自受試者的至少一個樣品的空間上分離的個體分子進行核酸測序，產(chǎn)生一個或多個克隆型譜，其中所述至少一個樣品與疾病的第一狀態(tài)相關(guān)，和b)基于一個或多個克隆型譜確定受試者中的一個或多個相關(guān)克隆型。在另一實施方案中，所述確定個體中的一個或多個相關(guān)克隆型包括a)將來自個體樣品的克隆型譜輸入到能夠預(yù)測一個或多個相關(guān)克隆型的算法中，其中所述能夠預(yù)測一個或多個相關(guān)克隆型的算法是通過以下方式開發(fā)的i)從一組樣品產(chǎn)生多個克隆型譜，其中該樣品與所述疾病有關(guān)，ii)從這組樣品鑒別一個或多個相關(guān)克隆型，iii)利用ii)中鑒別的一個或多個相關(guān)克隆型的序列參數(shù)和/或功能數(shù)據(jù)來開發(fā)能夠預(yù)測患病受試者的任何樣品中的相關(guān)克隆型的算法，和c)利用能夠預(yù)測一個或多個相關(guān)克隆型的算法來確定該個體的一個或多個相關(guān)克隆型。在另一實施方案中，所述疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡或多發(fā)性硬化。參考引用本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請都在此引入作為參考，如同每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埦唧w且分別地引入作為參考。


本發(fā)明的新特征在所附權(quán)利要求書中詳細闡明。通過參考以下說明應(yīng)用本發(fā)明原理的示例性實施方案的詳述和附圖，可以更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點，在附圖中圖1是本發(fā)明用于確定克隆型譜的方法的一個實施方案的流程圖。圖2顯示用于擴增TCRii基因的PCR方案。圖3顯示使用圖2中的方案擴增的待測序的PCR產(chǎn)物。圖4A和4B說明用于擴增同種型序列的PCR方案。圖5說明多重擴增的可重復(fù)性。圖6說明多重擴增具有最小的擴增偏性。圖7說明IgH序列的多重擴增的瓊脂糖凝膠電泳。圖8A顯示使用Accuprime和作為輸入模板的對應(yīng)于500ng RNA的cDNA，兩個重復(fù)樣品中每個克隆型的頻率的lc^1(l。圖8B顯示使用作為輸入模板的對應(yīng)于500ng RNA的cDNA和Accuprime (X軸)或高保真Taq (Y軸)，每個克隆型的頻率的logl。。圖8C顯示使用作為輸入模板的對應(yīng)于50ng RNA的cDNA和Accuprime (X軸)或高保真Taq (Y軸)，每個克隆型的頻率的logl。。說明通過發(fā)現(xiàn)研究確定算法的流程圖。圖9說明在擴增反應(yīng)中連接兩個序列以形成一個擴增子的方案的一個實施方案。 關(guān)于同一樣品(例如細胞)中存在這兩個序列的信息然后可以保留，即使它們與來自其它樣品的一組序列混合。圖10說明連接兩個序列的擴增方案的另一實施方案。圖11說明連接兩個序列的擴增方案的另一實施方案。圖12A和12B說明使通過PCR連接兩個序列的反應(yīng)多重化的方案。圖13A-13D說明將三個序列連接在一起的方案。圖14說明使用校準試驗發(fā)現(xiàn)相關(guān)克隆型的流程圖。圖15說明使用群體研究發(fā)現(xiàn)相關(guān)克隆型的流程圖。
圖16說明使用群體研究和校準試驗發(fā)現(xiàn)相關(guān)克隆型的流程圖。圖17說明能夠預(yù)測樣品中的相關(guān)克隆型的算法。圖18說明產(chǎn)生用于計算免疫負荷(Immune Load)的監(jiān)測算法的流程圖。圖19說明進行監(jiān)測試驗而不進行校準試驗的流程圖。圖20說明進行采用校準試驗的監(jiān)測試驗的流程圖。發(fā)明詳述鍵總體上，本發(fā)明包括將核酸測序技術(shù)應(yīng)用于監(jiān)測適應(yīng)性免疫細胞的所有組成成分 (repertoire)的任務(wù)以對免疫系統(tǒng)進行譜分析(profiling)的方法。產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)的譜 (profile)可用于診斷疾病和紊亂，以及用于診斷疾病和紊亂的狀態(tài)。本發(fā)明的免疫譜分析方法可以用于監(jiān)測疾病和紊亂和評價疾病和紊亂的治療。可以應(yīng)用本發(fā)明的方法的這些疾病和紊亂包括自身免疫病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化(MQ、類風濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)和強直性脊柱炎。本發(fā)明的方法可以用于診斷、監(jiān)視和治療移植排斥和免疫老化。此外，本發(fā)明的免疫譜型分析方法可以用于診斷、監(jiān)視和治療其它與免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病，包括癌癥和傳染病。對擴增的個體分子進行測序可以區(qū)分不同的序列，因此具有檢測克隆擴增的量變的靈敏性。總體上，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了確定T細胞和/或B細胞中的重組 DNA序列譜的方法。該方法可以包括以下步驟從受試者分離樣品，一輪或多輪核酸擴增， 空間上分離個體核酸，和對核酸進行測序。核酸可以是DNA或RNA。T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列可以被稱為克隆型(clonotype)。在一個方面，提供了確定受試者或個體中的一個或多個相關(guān)克隆型的方法。在另一方面，提供了開發(fā)能夠預(yù)測來自患病受試者的任何樣品中的一個或多個相關(guān)克隆型的算法的方法。在另一方面，提供了使用能夠預(yù)測來自受試者的任何樣品中的一個或多個相關(guān)克隆型的算法發(fā)現(xiàn)個體的一個或多個相關(guān)克隆型的方法。在另一方面，提供了產(chǎn)生計算疾病活動性得分的算法的方法。在另一方面，提供了監(jiān)測個體的疾病狀態(tài)的方法。I.確定克隆型譜的方法A.概述本發(fā)明的方法可以用來產(chǎn)生來自受試者的樣品中的重組DNA序列譜或克隆型。在一個實施方案中，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述細胞分離基因組DNA的個體分子，對分離的基因組DNA的個體分子進行測序，以及確定來自該樣品的不同序列的水平， 以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在另一實施方案中，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述細胞分離基因組DNA的個體分子，擴增所述基因組DNA的個體分子，對所述擴增的DNA進行測序，以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在另一實施方案中，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述細胞擴增基因組DNA，分離所述擴增的DNA的個體分子，對所述分離的擴增DNA的個體分子進行測序，以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在另一實施方案中，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述細胞擴增基因組DNA，分離所述擴增的DNA的個體分子，再擴增所述擴增的DNA分子，對所述再擴增的DNA分子進行測序，以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在另一實施方案中，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述樣品分離RNA，逆轉(zhuǎn)錄來自所述細胞的RNA以形成cDNA，分離所述cDNA的個體分子，任選地再擴增所述cDNA，對所述cDNA或再擴增的DNA的所述分離的個體分子進行測序，以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。在另一實施方案中，提供了一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品，從所述樣品分離RNA的個體分子，對RNA的個體分子進行測序，以及確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。B.警試者和樣品1.受試者本發(fā)明的方法可以使用來自受試者或個體(例如患者)的樣品。受試者可以是患者，例如，自身免疫病患者。受試者可以是傳染病或癌癥患者。受試者可以是哺乳動物，例如，人類。受試者可以是雄性或雌性。受試者可以是嬰兒、兒童或成人。2.樣品本發(fā)明的方法中使用的樣品可包括，例如，來自受試者的體液，包括圍繞胎兒的羊水、眼房水、膽汁、血液和血漿、耵聹(耳垢)、Cowper液或射精前液、乳糜、食糜、女性噴射液、間隙液、淋巴、月經(jīng)、乳汁、粘液(包括鼻涕和痰)、胸水、膿、唾液、皮脂(皮油)、精液、 血清、汗、淚、尿、陰道潤滑液、嘔吐物、水、糞便、內(nèi)體液，包括腦和脊髓周圍的腦脊液，骨關(guān)節(jié)周圍的滑液，細胞內(nèi)液是細胞內(nèi)的流體，和玻璃體液，即眼球內(nèi)的流體。在一個實施方案中，樣品是血液樣品。血液樣品可以是大約0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0、 1. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5或5. OmL。當受試者患有多發(fā)性硬化時，樣品可以是腦脊液 (CSF)，當受試者患有類風濕性關(guān)節(jié)炎時，樣品可以是滑液，當受試者患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡時，樣品可以是皮膚(或其它器官)活檢組織。在一個實施方案中，可以從可獲得的最可能反映病理學的體液/組織確定克隆型，隨后監(jiān)測構(gòu)成不同體液例如血液的克隆型的水平。樣品可以在疾病不活動時分析。樣品可以由衛(wèi)生人員獲得，例如，內(nèi)科醫(yī)生、醫(yī)生助理、護士、獸醫(yī)師、皮膚科醫(yī)生、 風濕科醫(yī)生、牙科醫(yī)生、急救醫(yī)士或外科醫(yī)生。樣品可以由研究技術(shù)員獲得?？梢垣@得一種以上的來自受試者的樣品。樣品可以是活檢組織，例如，皮膚活檢組織?；顧z組織可以來自，例如，腦、肝、肺、 心臟、結(jié)腸、腎或骨髓。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的任何活檢技術(shù)都可以用于從受試者分離樣品。例如，活檢可以是開放活檢，其中使用全身麻醉?；顧z可以是閉合活檢，其中形成比切開活檢更小的切口?；顧z可以是中心活檢或切開活檢，其中切除組織的一部分?；顧z可以是切除活檢，其中試圖切除整個病變(lesion)。活檢可以是細針抽吸活檢，其中用針頭移除組織或流體樣品。樣品可以包括免疫細胞。免疫細胞可以包括T細胞和/或B細胞。T細胞(T淋巴細胞)包括，例如，表達T細胞受體的細胞。T細胞包括輔助T細胞(效應(yīng)T細胞或Th細胞)、細胞毒性τ細胞(CTL)、記憶T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞。樣品在某些應(yīng)用(例如，定義相關(guān)T細胞的校準試驗)中可以包括單個細胞，或者更通常至少1，000個、至少10，000個、至少100，000個、至少250，000個、至少500，000個、至少750，000個或至少1，000, 000個T 細胞。B細胞包括，例如，血漿B細胞、記憶B細胞、Bl細胞、B2細胞、邊緣區(qū)B細胞和濾泡B細胞。B細胞能夠表達免疫球蛋白(抗體、B細胞受體)。樣品在某些應(yīng)用(例如，定義相關(guān)B細胞的校準試驗)中可以包括單個細胞，或者更通常至少1，000個、至少10，000 個、至少100，000個、至少250，000個、至少500，000個、至少750，000個或至少1，000, 000 個B細胞。樣品可以包括核酸，例如，DNA (例如，基因組DNA或線粒體DNA)或RNA (例如，信使RNA或微RNA)。核酸可以是不含細胞的DNA或RNA。在本發(fā)明的方法中，來自可以被分析的受試者的RNA或DNA的量包括，例如，在某些應(yīng)用(例如，校準試驗)中低至單個細胞， 以及多至1000萬個細胞或更多，轉(zhuǎn)化為6pg-60ug范圍的DNA，和大約Ipg-IOug的RNA。C.分離、擴增和再擴增核酸的方法1. TCR和BCR基因的特征由于鑒別的重組存在于每個個體適應(yīng)性免疫細胞的DNA以及它們的相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄物中，RNA或DNA可以用本發(fā)明的方法測序。來自T細胞或B細胞的重組序列也可以被稱為克隆型。DNA或RNA可能對應(yīng)于來自T細胞受體(TCR)基因或編碼抗體的免疫球蛋白(Ig) 基因的序列。例如，DNA和RNA可能對應(yīng)于編碼TCR的α、β、γ或δ鏈的序列。在大多數(shù)T細胞中，TCR是由α-鏈和β-鏈組成的異二聚體。TCRa鏈通過VJ重組產(chǎn)生，β鏈受體通過V(D)J重組產(chǎn)生。對于TCRii鏈，在人類中有48個V區(qū)段、2個D區(qū)段和13個J區(qū)段。幾個堿基可能缺失，另外一些可以在兩個連接的每一個處添加(稱為N和P核苷酸)。 在大多數(shù)T細胞中，TCR由γ和δ delta鏈組成。TCRy鏈通過VJ重組產(chǎn)生，TCR δ鏈通過 V(D)J重組產(chǎn)生(Kenneth Murphy,Paul TraversJPMark ffalport,Janeway's Immunology 7th edition, Garl 和 Science，2007，在此引入作為參考)。在本發(fā)明的方法中分析的DNA和RNA可對應(yīng)于編碼具有恒定區(qū)(α，δ，ε，Y或 μ)的重鏈免疫球蛋白(IgH)或具有恒定區(qū)λ或K的輕鏈免疫球蛋白(IgK或IgL)的序列。每個抗體具有兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈。每條鏈由恒定區(qū)(C)和可變區(qū)組成。對于重鏈，可變區(qū)由可變區(qū)段(V)、多樣性區(qū)段⑶和連接(J)區(qū)段組成?；蚪M中存在幾種不同的編碼這些區(qū)段的每個類型的序列。特定VDJ重組事件在B細胞發(fā)育過程中發(fā)生，標記該細胞，產(chǎn)生特異性重鏈。輕鏈中的多樣性以類似的方式產(chǎn)生，除了沒有D區(qū)因此只存在VJ重組以外。體細胞突變通常靠近重組位點發(fā)生，引起幾個核苷酸的添加或缺失， 進一步提高了 B細胞產(chǎn)生的重鏈和輕鏈的多樣性。B細胞產(chǎn)生的抗體的可能的多樣性因此是不同重鏈和輕鏈的產(chǎn)物。重鏈和輕鏈的可變區(qū)貢獻形成抗原識別(或結(jié)合)區(qū)或位點。 向該多樣性中增加體細胞超突變過程，該過程可能在發(fā)生針對某些表位的特異性應(yīng)答后發(fā)生。在該過程中，在能夠識別特定表位的那些B細胞中發(fā)生突變，導致在可能能夠更強地結(jié)合特定表位的抗體中具有較大的多樣性。所有這些因素都對B細胞產(chǎn)生的抗體的豐富多樣性具有貢獻。可能產(chǎn)生幾十億種，也許超過萬億種不同的抗體。產(chǎn)生T細胞多樣性的基本前提類似于B細胞產(chǎn)生抗體的前提。T細胞和B細胞活化的成分是它們與外來表位的結(jié)合。 特定細胞的活化導致產(chǎn)生更多相同類型的細胞，導致克隆擴增。互補決定區(qū)(CDR)或超可變區(qū)是能夠與抗原互補的抗原受體(例如，T細胞受體和免疫球蛋白)的可變域中的序列。每個抗原受體的鏈含有三個⑶R(⑶Rl、⑶R2和⑶R3)。 形成T細胞(α和β)和免疫球蛋白(IgH和IgK或IgL)的兩個多肽貢獻了三個CDR的形成。由TCRii編碼的⑶Rl和⑶R2的部分位于47個功能性V區(qū)段之一內(nèi)。⑶R的大部分多樣性在CDR3中發(fā)現(xiàn)，多樣性在T淋巴細胞發(fā)育過程中通過體細胞重組事件產(chǎn)生。在個體之間和個體之內(nèi)存在多種多樣的BCR。BCR由編碼抗體重鏈和輕鏈的兩個基因IgH和IgK (或IgL)組成。結(jié)合抗原和MHC分子的三個互補決定區(qū)(OTR)序列在IgH 和IgK(或IgL)中具有最高的多樣性。由IgH編碼的⑶Rl和⑶R2的部分位于44個功能性V區(qū)段之一內(nèi)。幼稚B細胞中的大部分多樣性通過B淋巴細胞發(fā)育過程中的體細胞重組事件在⑶R3產(chǎn)生中出現(xiàn)。重組可以產(chǎn)生具有V、D和J區(qū)段各一個的分子。在人類中，存在 44個V區(qū)段、27個D區(qū)段和6個J區(qū)段；因此，理論上存在超過7，000種組合的可能性。在小部分BCR(約5%)中，發(fā)現(xiàn)了兩個D區(qū)段。此外，幾個堿基可能缺失，其它幾個可能在兩個連接的每一個處添加(稱為N和P核苷酸)，產(chǎn)生高度的多樣性。在B細胞激活后，發(fā)生通過體細胞超突變的親和力成熟過程。在該過程中，激活的B細胞的后代細胞在整個基因中積累不同的體細胞突變，在CDR區(qū)具有較高的突變濃度，導致產(chǎn)生對抗原具有較高親和力的抗體。因此，多個引物可以用來在體細胞超突變后擴增序列。除了體細胞超突變以外， 激活的B細胞經(jīng)歷同種異型轉(zhuǎn)換過程。具有相同可變區(qū)段的抗體取決于恒定區(qū)段可能具有不同的形式(同種型)。所有幼稚B細胞表達IgM (或IgD)，而激活的B細胞主要表達IgG， 但也表達IgM.IgA和IgE0這種從IgM(和/或IgD)到IgG、IgA或IgE的表達轉(zhuǎn)換通過重組事件發(fā)生，導致一種細胞專門產(chǎn)生特定的同種型。IgM、IgD和IgE各有一個區(qū)段，IgA有兩個區(qū)段，IgG有四個區(qū)段。2.擴增反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)能夠用來從細胞集合擴增相關(guān)區(qū)域。轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA) 可以用來從靶核酸產(chǎn)生RNA擴增子。來自每個細胞的核酸可以分別分析，因為每個細胞攜帶其自身獨特的特征標志(signature)。TCR^或免疫球蛋白序列可以在使用至少一條與C區(qū)退火的引物和一條或多條與一個或多個V區(qū)段退火的引物的多重反應(yīng)中從核酸擴增(圖2和圖4)。在多重反應(yīng)中與V 區(qū)段退火的引物數(shù)可以是，例如，至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80。在多重反應(yīng)中與V區(qū)段退火的引物數(shù)可以是， 例如，10-60、20-50、30-50、40-50、20-40、30-40或35-40。引物可以與不同的V區(qū)段退火。 對于IgH基因，由于V區(qū)段中體細胞突變的可能性，可以使用多條與各V區(qū)段退火的引物； 例如，每個V區(qū)段1、2、3、4或5條引物。在多重反應(yīng)中與C區(qū)段退火的引物數(shù)可以包括，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在多重反應(yīng)中與C區(qū)段退火的引物數(shù)可以是1-10、2-9、3-8、4-7、3-8或3_6。TCR或免疫球蛋白基因的擴增可以如實施例3和/ 或?qū)嵤├?所述發(fā)生。將要擴增的區(qū)域可包括完全克隆序列或克隆序列的一部分，包括免疫球蛋白或T 細胞受體基因的V-D連接、D-J連接，免疫球蛋白或T細胞受體基因的完全可變區(qū)，抗原識別區(qū)，或⑶R，例如，互補決定區(qū)3 (⑶R3)。TCR或免疫球蛋白序列可以利用第一和第二擴增步驟擴增。不同擴增步驟各自可包括不同的引物。不同的引物可引入在免疫基因序列中原始不存在的序列。例如，擴增過程可以向擴增的TCR或免疫球蛋白序列的5’和/或3’末端添加一個或多個標簽(圖3)。 標簽可以是便于擴增DNA的后續(xù)測序的序列。標簽可以是促進擴增序列與固體支持體結(jié)合的序列。其它擴增方法可以不使用V區(qū)中的任何引物。而是可能使用來自C區(qū)段的特異性引物，另一端(5’ )可以使用通用引物。通用引物可以通過不同方法，包括充分描述的鏈轉(zhuǎn)換方法，在cDNA合成中附加。類似地，通用引物可以通過包括連接在內(nèi)的不同的方法附加在cDNA后。本發(fā)明方法中可以使用的其它核酸擴增手段包括，例如，反轉(zhuǎn)錄PCR、實時PCR、 定量實時PCR、數(shù)字PCR (dPCR)、數(shù)字乳液PCR (dePCR)、克隆PCR、擴增片段長度多態(tài)性 PCR(AFLP PCR)、等位基因特異性PCR、裝配PCR、不對稱PCR(其中為選擇的鏈使用極大過量的引物)、菌落PCR、解旋酶依賴的擴增(HDA)、熱啟動PCR、反轉(zhuǎn)PCR(IPCR)、原位PCR、長 PCR(大于大約5千堿基的DNA的延伸)、多重PCR、巢式PCR(使用一對以上的引物)、單細胞？0 、降落？0 、環(huán)介導的等溫？0 (1^^ 和基于核酸序列的擴增(NASBA)。其它擴增方案包括連接酶鏈反應(yīng)、Branch DNA擴增、滾環(huán)擴增、環(huán)到環(huán)(Circle to Circle)擴增、SPIA 擴增、通過捕獲和連接的靶標擴增(TACL)擴增和RACE擴增。樣品中的RNA信息可以通過利用逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)化為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中可以使用 PolyA引物、隨機引物和/或基因特異性引物。從基因組擴增DNA(或通過逆轉(zhuǎn)錄RNA擴增cDNA形式的核酸)后，各核酸分子可以被分離，任選地再擴增，然后分別測序?？梢栽诒景l(fā)明的方法中用于擴增的聚合酶包括，例如，Taq聚合酶、AccuPrime聚合酶或Pfu。使用的聚合酶的選擇可以基于是優(yōu)選保真度還是效率。在一個實施方案中，分離樣品中的個體細胞。來自每個分離的細胞的兩個或多個序列可以連接在一起。例如，來自個體細胞的TCRa和TCRii基因或IgH和IgK基因的序列可以例如通過擴增方案(圖9-13)或連接方案連接。對于分離的細胞，連接的TCRa和 TCR^或IgH和IgK序列可以任選地再擴增。連接的擴增產(chǎn)物可以任選地在擴增后再合并。3.分離個體核酸的方法從集合體分離核酸的方法包括將核酸亞克隆到DNA載體中，并轉(zhuǎn)化細菌(細菌克隆)，在固體物質(zhì)(例如，載玻片)上以兩維方式空間上分離該分子，在含微團的溶液中以三維方式空間上分離該分子(如可以使用油乳劑實現(xiàn)，在固體表面如珠上固定分子或不固定分子)，或者使用微反應(yīng)室，例如，在微流體或納米液體芯片中。可以利用稀釋確保在給定體積、空間區(qū)域、珠或反應(yīng)室中平均存在一個分子。
實時PCR、picogreen染色、納米流體電泳(例如LabChip)或UV吸光度測量可以在開始的步驟中使用，以判斷可擴增材料的功能量。重新擴增核酸的方法包括分離的用核酸轉(zhuǎn)化的菌落的細菌生長，在載玻片上擴增 (例如，PCR群落(polonies))，和在珠上擴增?？梢岳孟嗤姆椒〝U增和重新擴增核酸， 或者可以利用不同的方法擴增和重新擴增核酸。在某些實施方案中，亞克隆步驟包括通過擴增或連接步驟將通用引物附著到DNA 或RNA上的步驟。然后利用該引物擴增所述克隆并作為引物雜交識別序列用于測序(圖 2)。在其它實施方案中，從細胞亞群分析核酸?？梢允褂梅蛛x細胞的方法，例如通過使用細胞表面標志物。例如，細胞可以通過細胞分選流式細胞術(shù)、流動分選、熒光激活細胞分選(FACS)、基于珠的分離如磁性細胞分選(MACS;例如，使用抗體包被的磁性顆粒)、基于大小的分離(例如，篩，障礙陣列，或過濾器)、在微流裝置中的分選、基于抗體的分離、 沉降、親和力吸附、親和提取或密度梯度離心來分離。細胞可以通過激光捕獲顯微切割純化。分選可以基于細胞大小、形態(tài)學或細胞內(nèi)或細胞外標志。分離或分選腫瘤細胞的方法例如記載在 Nagrath S.等人.Q007)Nature 450 :1235-1239 ；美國專利 Nos. 6008002， 7232653 和 7332288 ；PCT 公布 No. W02008157220A1 ；和美國專利申請 Nos. US20080138805A1 和 US20090186065 ；和 Rosenberg R.等人· (2002) Cytometry 49 150-158，每篇文獻均在此全文引入作為參考。細胞亞群可以是T細胞和/或B細胞亞群。T細胞亞群可以是⑶4+、⑶8+或⑶27
髙細胞。熒光激活細胞分選(FACQ利用光散射和熒光特征來分選細胞。例如利用核酸探針或偶聯(lián)至熒光染料的抗體可以將熒光性質(zhì)賦予細胞。細胞懸浮液可以形成流動液體流。 細胞流形成液滴，每滴含有大約一個細胞。在液流形成液滴前，測量每個細胞的熒光特征。 在熒光強度測量前將電荷置于電荷環(huán)上，相反的電荷由從液流破裂的液滴攜帶。帶電荷的液滴通過兩個高壓偏轉(zhuǎn)板，所述高壓偏轉(zhuǎn)板使液滴基于它們的電荷轉(zhuǎn)向到不同容器中。電荷可以直接施加到淮流上，破裂的滴保持與液流相同指標的電荷。該液流然后在液滴破裂后恢復(fù)中性。FACS中可以使用直接或間接免疫熒光。在直接免疫熒光中，抗體直接偶聯(lián)到熒光染料上。在間接免疫熒光中，第一抗體是未標記的，第二抗體偶聯(lián)到熒光染料上。在一個實施方案中，來自樣品的個體細胞可以被分離。來自細胞中兩個基因的序列信息可以連接在一起。例如，樣品可以來自自身免疫病患者，來自樣品的空間上分離細胞的TCRa和TCRii基因的序列信息可以通過例如擴增方案或連接方案物理連接在一起。連接的TCRa和TCRii序列可以任選地被擴增和/或與來自其它細胞的連接的序列合并。連接的序列可替代地可以用于IgH和IgK或用于IgH和IgL。C.測序技術(shù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何核酸測序技術(shù)可以在本發(fā)明的方法中使用。DNA測序技術(shù)包括使用標記的終止劑或引物和在板或毛細管中凝膠分離的經(jīng)典雙脫氧測序反應(yīng) (Sanger法)，使用可逆終止的標記核苷酸的合成測序，焦磷酸測序，454測序，與標記寡核苷酸探針文庫的等位基因特異性雜交，使用與標記克隆文庫的等位基因特異性雜交隨后進行連接的合成測序，在聚合步驟過程中摻入標記的核苷酸的實時監(jiān)測，聚合酶群落測序，和 SOLiD測序。分離的分子的測序最近已經(jīng)通過使用聚合酶或連接酶的連續(xù)或單延伸反應(yīng)以及通過與探針文庫的單或連續(xù)差異雜交得到證實。這些反應(yīng)已經(jīng)對許多克隆序列平行進行，包括在超過1億個平行序列的當前的商業(yè)應(yīng)用中得到證明。這些測序方法因此可以用來研究T細胞受體(TCR)和/或B細胞受體(BCR)的所有組成成分。本發(fā)明的方法中使用的測序技術(shù)每次運行可以產(chǎn)生至少1000個閱讀，每次運行至少10，000個閱讀，每次運行至少100，000個閱讀，每次運行至少500，000個閱讀，或每次運行至少1，000, 000個閱讀。本發(fā)明的方法中使用的測序技術(shù)每次閱讀可以產(chǎn)生大約30bp、約40bp、約50bp、 約 60bp、約 70bp、約 80bp、約 90bp、約 lOObp、約 110、約 120bp per read、約 150bp、約 200bp、 約 250bp、約 300bp、約 350bp、約 400bp、約 450bp、約 500bp、約 550bp 或約 600bp。本發(fā)明的方法中使用的測序技術(shù)每次閱讀可以產(chǎn)生至少30、40、50、60、70、80、90、 100、110、120、150、200、250、300、350、400、450、500、550 或600bp。1. True單分子測序可以在本發(fā)明的方法中使用的測序技術(shù)包括，例如，Helicos Ture單分子測序 (tSMS) (Harris Τ. D.等人.Q008)kience 320:106-109)。在 tSMS 技術(shù)中，DNA 樣品被裂解為大約100-200個核苷酸的鏈，向每個DNA鏈的3’端添加polyA序列。每條鏈通過添加熒光標記的腺苷核苷酸進行標記。DNA鏈然后與流動池表面雜交，流動池表面含有上百萬個固定在流動池表面上的寡聚-T捕獲位點。模板可以為大約1億模板/cm2的密度。流動池然后裝載在儀器例如HelKcope 測序儀中，激光照射流動池表面，顯示每個模板的位置。 CCD相機可以將流動池表面上的模板位置作圖。然后切割并洗掉模板熒光標記。通過引入 DNA聚合酶和熒光標記的核苷酸開始測序反應(yīng)。寡聚-T核酸作為引物。聚合酶以模板指導的方式向引物中摻入標記的核苷酸。除去聚合酶和未摻入的核苷酸。已經(jīng)指導熒光標記的核苷酸摻入的模板通過流動池表面成像檢測。成像后，切割步驟除去熒光標記，使用其它的熒光標記的核苷酸重復(fù)該過程，直到達到希望的閱讀長度。在每個核苷酸添加步驟收集序列信息。2. 454 測序本發(fā)明的方法中可以使用的DNA測序技術(shù)的另一個實例是妨4測序(Roche) (Margulies，M等人· 2005，Nature，437，376-380)。妨4測序包括兩個步驟。在第一步中， DNA被剪切為大約300-800個堿基對的片段，將這些片段平端化。然后將寡核苷酸銜接子連接到這些片段的末端。銜接子作為片段擴增和測序的引物。這些片段可以使用例如含有 5’_生物素標簽的銜接子B連接到DNA捕獲珠例如鏈霉親和素包被的珠上。在油-水乳液的小滴內(nèi)PCR擴增附著到珠上的片段。結(jié)果是在每個珠上克隆擴增的DNA片段的多個拷貝。 在第二步中，珠捕獲在孔中(皮升大小)。對每個DNA片段平行進行焦磷酸測序。添加一個或多個核苷酸產(chǎn)生光信號，光信號被測序儀中的CCD相機記錄。信號強度與摻入的核苷酸數(shù)成比例。焦磷酸測序利用在核苷酸添加后釋放的焦磷酸(PPi)。PPi在腺苷5’磷酸硫酸的存在下被ATP硫酸化酶轉(zhuǎn)化為ATP。螢光素酶利用ATP將螢光素轉(zhuǎn)化為氧螢光素，該反應(yīng)產(chǎn)生可被檢測和分析的光。
3. SOLiD 測序可以在本發(fā)明的方法中使用的DNA測序技術(shù)的另一個實例是SOLiD技術(shù)(Applied Biosystems)。在SOLiD測序中，基因組DNA被剪切為片段，銜接子連接到該片段的5，和3， 端，產(chǎn)生片段文庫?；蛘?，可以如下引入內(nèi)部銜接子將銜接子連接到片段的5’和3’端，環(huán)化該片段，消化環(huán)化的片段，以產(chǎn)生內(nèi)部銜接子，并將銜接子連接到得到的片段的5’和3’ 端，以產(chǎn)生配對的文庫。然后，在含有珠、引物、模板和PCR成分的微反應(yīng)器中制備克隆珠群體。PCR后，使模板變性，珠富集，以分離珠與延伸的模板。對選擇的珠上的模板進行3’修飾，該修飾允許結(jié)合到載玻片上。序列可以通過部分隨機寡核苷酸的連續(xù)雜交和連接來確定，該寡核苷酸具有通過特定熒光團識別的中心確定的堿基(或堿基對)。記錄顏色后，切割并除去連接的寡核苷酸，然后重復(fù)該過程。4. SOLEXA 測序能夠在本發(fā)明的方法中使用的測序技術(shù)的另一個實例是SOLEXA測序 (Illumina)。SOLEXA測序基于使用折回PCR和錨定引物在固體表面上擴增DNA?；蚪M DNA被片段化，向片段的5’和3’端添加銜接子。附著到流動池通道表面的DNA片段延伸并橋式擴增。片段變?yōu)殡p鏈，雙鏈分子變性。在多個固相擴增循環(huán)后進行變性可在流動池的每個通道中產(chǎn)生相同模板的大約1，000個拷貝的單鏈DNA分子的幾百萬個簇。使用引物、 DNA聚合酶和四種熒光團標記的、可逆終止的核苷酸進行連續(xù)測序。核苷酸摻入后，利用激光激發(fā)熒光團，并捕捉圖像，記錄第一個堿基的身份。除去3’終止子和來自每個摻入的堿基的熒光團，重復(fù)摻入、檢測和鑒別步驟。5. SMRT 測序可以在本發(fā)明方法中使用的測序技術(shù)的另一個實例包括I^acific Biosciences的單分子實時(SMRT )技術(shù)。在SMRT中，四個DNA堿基中的每一個連接到四種不同的熒光染料的一種上。這些染料是磷酸連接的(phosphol inked)。單個DNA聚合酶用模板單鏈DNA 單分子在零模式波導(ZMW)底部固定。ZMW是一種限制結(jié)構(gòu)，它使得能夠相對于快速擴散到 SMW之內(nèi)和之外(微秒)的熒光核苷酸背景觀察DNA聚合酶引起的單核苷酸摻入。核苷酸摻入正在延伸的鏈中需要幾毫秒的時間。在該時間中，激發(fā)熒光標記，產(chǎn)生熒光信號，并切去熒光標簽。染料的相應(yīng)熒光的檢測表明摻入了哪個堿基。重復(fù)該過程。6.納米孔(Nanopore)測序可以在本發(fā)明方法中使用的測序技術(shù)的另一個實例是納米孔測序(Soni GV和 Meller A. (2007)Clin Chem 53:1996-2001)。納米孔是直徑數(shù)量級為1納米的小孔。納米孔浸沒在導電流體中并在其上施加電勢導致由于離子通過納米孔傳導引起輕微的電流。電流量對納米孔的大小敏感。當DNA分子通過納米孔時，DNA分子上的每個核苷酸不同程度地阻塞了納米孔。因此，當DNA分子通過納米孔時通過納米孔的電流的變化代表了 DNA序列的讀取。7.化學敏感的場效應(yīng)晶體管陣列測序可以在本發(fā)明方法中使用的測序技術(shù)的另一個實例涉及對序列DNA使用化學敏感的場效應(yīng)晶體管(chemFET)陣列(例如，如美國專利申請公布No. 20090026082所述)。 在該技術(shù)的一個實例中，DNA分子可以置于反應(yīng)室內(nèi)，模板分子可以與結(jié)合到聚合酶的測序引物雜交。一個或多個三磷酸在測序引物3’端向新核酸鏈的摻入可以通過chemFET根據(jù)電流的變化來檢測。陣列可以具有多個chemFET傳感器。在另一個實例中，單核酸可以附著到珠上，核酸可以在珠上擴增，各個珠可以轉(zhuǎn)移到chemFET陣列上的各個反應(yīng)室，每個室具有chemFET傳感器，核酸可以被測序。8.使用電子顯微鏡測序可以在本發(fā)明方法中使用的測序技術(shù)的另一個實例涉及使用電子顯微鏡 (Moudrianakis E. N.和 Beer M. . Proc Natl Acad Sci USA. 1965 Mar ；53 :564-71)。在該技術(shù)的一個實例中，各個DNA分子用能夠用電子顯微鏡區(qū)別的金屬標簽標記。這些分子然后在扁平表面上拉伸，并使用電子顯微鏡成像以測量序列。此處所述的測序技術(shù)中的任一種都可以在本發(fā)明的方法中使用。P. TCR和BCR所有組成成分的測序方法可以讀取來源于單分子或來源于單分子擴增的序列?？梢栽诠腆w表面上或在水/ 油乳液的小區(qū)室中平行進行單分子的上百萬個獨立擴增。待測序的DNA樣品可以充分稀釋和/或分散，以在每個區(qū)室中獲得一個分子。這種稀釋后可以進行DNA擴增，以生成原DNA 序列的拷貝并產(chǎn)生都具有相同序列的分子“簇”。這些簇然后可以進行測序。一個運行中可以產(chǎn)生幾百萬個閱讀?？梢詮臄U增序列特定鏈的5’末端開始產(chǎn)生序列，和/或可以從互補序列的5’末端開始產(chǎn)生序列。在優(yōu)選實施方案中，產(chǎn)生來自鏈的序列，即，配對末端閱讀。原DNA序列中特定序列的普遍存在然后可以通過計數(shù)多少簇攜帶該序列來測量。 原樣品中更普遍存在的序列導致含有特定序列的更多區(qū)室和更多簇。擴增方案中可以使用一些方法來確保測量的DNA序列的頻率匹配原樣品中DNA序列的頻率。這些方法可包括確保PCR引物濃度足夠高，以驅(qū)動每個循環(huán)中的每個雜交反應(yīng)至飽和，調(diào)節(jié)各引物濃度以使不同序列的差異擴增最小化，等等?？梢允褂盟惴▉泶_定測序儀產(chǎn)生的哪些序列來源于DNA序列。單獨測定的序列 (閱讀)可以彼此補充，含有通過擴增和/或通過測序引入的錯誤。可以使用算法將閱讀組合在一起，以更精確地確定起始材料中DNA序列的頻率。從包含DNA或RNA的血液樣品原始擴增的IgH和/或TCRi^可以獲得百萬個或更多的測序閱讀。特定IgH或TCRii序列的閱讀數(shù)與血液樣品中特定克隆型的頻率有關(guān)。因此，可以確定每個克隆型的量。如果特定患者的致病克隆型已知，它們的水平可以通過這種測序方法精確地確定。在本發(fā)明的某些實施方案中，提取DNA分子集合，包括來自一個或多個受試者免疫細胞TCR和BCR區(qū)的基因組DNA或逆轉(zhuǎn)錄的RNA的代表，任選地以一種方式擴增，使得每個分子可以使用一個或多個上述測序技術(shù)測序，以能夠檢測受試者中序列的存在和頻率?？梢詫γ庖咔虻鞍谆騎細胞受體基因的不同區(qū)域進行測序。在一些實施方案中， 可以對可變區(qū)的完整序列進行測序，以鑒別和量化克隆型?？梢詫ν耆寺⌒蛄械莫毺貋喨簻y序。在一些實施方案中，對包含VD和DJ連接的核苷酸測序，以獨特地鑒別和量化克隆型。在其它實施方案中，可以被測序的片段是完整可變區(qū)。在另一實施方案中，對抗原識別區(qū)或互補決定區(qū)3(CDR3)測序?？梢詳U增含有完整⑶R3或完整可變區(qū)的片段，以允許對含有V、D和J區(qū)段的部分的⑶R3測序。擴增產(chǎn)物上的一個或多個標簽可以用于對免疫球蛋白或T細胞受體基因測序。一個或多個與標簽退火的引物可以用于測序反應(yīng)中。擴增的分子的不同部分可以在單獨的反應(yīng)中測序，測序結(jié)果可以拼湊在一起，以產(chǎn)生該分子的部分或完整序列。在一個實施方案中，只擴增和測序⑶R3。⑶R3的擴增和測序可以使用對于一個或多個V區(qū)段序列特異性的引物(以及C區(qū)段中擴增子的另一側(cè)上的一個或多個引物)完成。用于每個V區(qū)段的引物可以在一個或多個擴增反應(yīng)中使用，導致序列的所有組成成分擴增。序列的所有組成成分然后可以混合并在擴增或不擴增的情況下進行分離，并使用所述的任何測序技術(shù)測序。當在分開的管中使用各種V引物進行擴增時，由于PCR飽和，攜帶不同V區(qū)段的分子數(shù)可以被“標準化”。例如，如果一個特定V區(qū)段具有一次或幾次克隆擴增，導致其代表多于其它區(qū)段，該信息可以被刪除或減少，因為對于每個區(qū)段的PCR反應(yīng)可能趨向飽和或接近飽和。實時PCR可以用來量化各V區(qū)段存在多少?？梢詫θL⑶R3測序，或者可以對序列CDR3的一部分測序。在一個實施方案中，只分析克隆型的亞群。這可以通過使用對克隆型亞群特異性的引物例如V區(qū)段特異性引物擴增來完成。獨特的克隆型可以通過利用提供完全連接性的長連續(xù)閱讀測序來鑒別。在一些實施方案中，當存在幾個感興趣的序列時，僅在一個連接上的短閱讀長度長度能夠產(chǎn)生簡并標簽，它們對于特定克隆型是獨特的，但是在多個克隆型之間共有。例如跨過ν/J連接的測序可以將具有相同V/J的所有序列合計為一個克隆型， 而與D區(qū)段無關(guān)。關(guān)于所有區(qū)段的全部連接性的信息允許區(qū)別例如可能具有相同的V和J 區(qū)段但是連接到不同D區(qū)段上的序列。當只存在V和D(例如，抗體的輕鏈或TCR的α亞基)時可以進行相同的分析。 TCR和BCR的全部多樣性結(jié)合入這兩個亞基。然而，可以對兩個亞基的序列進行分析。當產(chǎn)生克隆型譜時可以考慮測序和/或擴增產(chǎn)生的錯誤。例如，參見實施例5。可以從DNA或RNA進行初始擴增(例如，在轉(zhuǎn)化為cDNA后)。II.石角定湘關(guān)克降型、疾病丨舌云M牛得分的方法禾Π用于石角定并一個或兩個的算法Α.相關(guān)與非相關(guān)克隆型T和B細胞受體序列的大量組成成分對于發(fā)現(xiàn)與特定人類健康結(jié)果相關(guān)的個體細胞發(fā)出了挑戰(zhàn)。在許多情況下，有意義的克隆型的序列對于所研究的個體是獨特的。本發(fā)明的方法提供用于區(qū)別a)相關(guān)克隆型(可以是其水平與疾病相關(guān)的克隆型)和b)非相關(guān)克隆型(可以是其水平與疾病無關(guān)的克隆型)的手段。在一個實施方案中，相關(guān)克隆型可以顯示與疾病正相關(guān)或負相關(guān)。在另一實施方案中，在疾病的高峰狀態(tài)存在但是在疾病的非高峰狀態(tài)不存在的克隆型可以是相關(guān)克隆型(與疾病正相關(guān))。在另一實施方案中，在疾病的高峰狀態(tài)(或階段)比在疾病非高峰狀態(tài)更豐富的克隆型(即，以較高分子水平存在)可以是相關(guān)克隆型(與疾病正相關(guān))。在另一實施方案中，在疾病的高峰狀態(tài)不存在但是在疾病的非高峰狀態(tài)存在的克隆型可以是相關(guān)克隆型(與疾病負相關(guān))。在另一實施方案中，在疾病的高峰狀態(tài)比在疾病的非高峰狀態(tài)更少的克隆型可以是相關(guān)克隆型(與疾病負相關(guān))。在另一實施方案中，個體的相關(guān)克隆型通過算法確定。B.準i式驗不#用群體研窮.發(fā)現(xiàn)才目關(guān)禾Π非才目關(guān)克降型在本發(fā)明的該實施方案中，通過觀察某些樣品中存在的與疾病狀態(tài)相關(guān)的克隆型來鑒別相關(guān)克隆型(例如，參見圖14)。這種狀態(tài)可以是來自疾病高峰狀態(tài)時的樣品的血液(例如來自急性發(fā)作期的MS或狼瘡患者的血液樣品)，或是假定富含與個體疾病相關(guān)的T和B細胞的受影響的組織。這些組織的例子可以是具有腎臟炎癥的狼瘡患者的腎活檢組織、發(fā)作期MS患者的CSF、類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液、或癌癥患者的腫瘤樣品。在所有這些實例中，組織可能將含有與疾病有關(guān)的相關(guān)T和B細胞(雖然不一定是致病因素)。值得注意的是，如果利用該方法鑒別與疾病相關(guān)的克隆型，它們將只與檢測其樣品的個體相關(guān)。 結(jié)果，將需要特定校準試驗，以使用該方法鑒別任何患有疾病的特定個體中的相關(guān)克隆型。在一個實施方案中，提供了確定受試者中的一個或多個相關(guān)克隆型的方法。該方法可以包括以下步驟a)通過對來自受試者的至少一個樣品的空間上分離的個體分子進行核酸測序，產(chǎn)生一個或多個克隆型譜，其中所述至少一個樣品與疾病的第一狀態(tài)有關(guān)，和 b)基于所述一個或多個克隆型譜確定受試者中的一個或多個相關(guān)克隆型。在一個實施方案中，至少一個樣品來自于受疾病影響的組織。在另一實施方案中， 所述確定一個或多個相關(guān)克隆型包括比較來自至少兩個樣品的克隆型譜。在另一實施方案中，疾病的第一狀態(tài)是疾病的高峰狀態(tài)。在另一實施方案中，一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時存在。在另一實施方案中，一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時不存在。在另一實施方案中，一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時高。在另一實施方案中，一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時低。在另一實施方案中，樣品包含T細胞和 /或B細胞。在另一實施方案中，T細胞和/或B細胞包含T細胞和/或B細胞的亞群。在另一實施方案中，T細胞和/或B細胞的亞群通過與標志物相互作用來富集。在另一實施方案中，所述標志物是位于T細胞和/或B細胞亞群上的細胞表面標志物。在另一實施方案中，T細胞和/或B細胞亞群與疾病中特異性存在的抗原相互作用。在一個實施方案中，所述疾病是自身免疫病。在另一實施方案中，所述自身免疫病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、類風濕性關(guān)節(jié)炎或強直性脊柱炎。C. #用群體研窮.發(fā)現(xiàn)力目關(guān)禾Π非相關(guān)克降型在一個實施方案中，提供了一種使用群體研究鑒別相關(guān)克隆型的方法(例如，參見圖15)。群體研究的應(yīng)用在于允許歸納關(guān)于具有已知疾病狀態(tài)后果的個體中已經(jīng)確定的相關(guān)克隆型的具體信息，以允許在將來所有受試者中鑒別這些相關(guān)克隆型，而不需要校準試驗?？梢岳脤μ囟ㄒ唤M相關(guān)克隆型的了解來提取關(guān)于在將來的受試者中關(guān)聯(lián)的克隆型的相似屬性(參數(shù))的規(guī)則。在一個實施方案中，本發(fā)明包括以下方法，該方法包括在樣品的研究中對免疫細胞的所有組成成分進行測序來鑒別相關(guān)和非相關(guān)克隆型，所述樣品來自患病患者和任選的健康對照，來自不同時間，在疾病患者的情況下來自通過臨床數(shù)據(jù)表征的疾病過程的不同的(和已知的)狀態(tài)。所述疾病可以是，例如，自身免疫病。其水平與這些不同狀態(tài)的疾病的量度相關(guān)的克隆型可以用來開發(fā)一種算法，該算法能夠預(yù)測與疾病相關(guān)的一大組序列的身份，在所有個體中這些克隆型不同于與疾病無關(guān)的克隆型。不同于校準試驗的情況，相關(guān)序列不需要存在于發(fā)現(xiàn)研究中，而是可以基于這些序列預(yù)測。例如，相關(guān)序列可以是TCR基因DNA序列，其與在發(fā)現(xiàn)研究中鑒別的克隆型的DNA序列編碼相同的氨基酸序列。此外，可以預(yù)測一個或多個相關(guān)克隆型的算法可以用來鑒別來自任何個體的樣品中的克隆型，并且對于特定個體絕不是獨特的，從而允許在新的樣品中預(yù)測相關(guān)克隆型，而不需要事先知道該個體中存在的克隆型。在一個方面，提供一種開發(fā)預(yù)測患病受試者的任何樣品中一個或多個相關(guān)克隆型的算法的方法，包括a)從一組樣品產(chǎn)生多個克隆型譜，其中該樣品與疾病相關(guān)，b)從一組樣品鑒別一個或多個相關(guān)克隆型，C)利用b)中鑒別的一個或多個相關(guān)克隆型的序列參數(shù)和/或功能數(shù)據(jù)開發(fā)能夠預(yù)測來自患病受試者的任何樣品中的相關(guān)克隆型的算法。在一個實施方案中，這組樣品采自一個或多個受疾病影響的組織。在另一實施方案中，鑒別一個或多個相關(guān)克隆型包括比較來自至少兩個樣品的克隆型譜。在另一實施方案中，功能數(shù)據(jù)包括T細胞和/或B細胞中的標志物的結(jié)合能力或T 細胞或B細胞與抗原的相互作用。在另一實施方案中，所述序列參數(shù)包含核酸序列和預(yù)測的氨基酸序列。在另一實施方案中，樣品來自一個或多個處于疾病高峰階段的個體。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型存在于疾病的高峰狀態(tài)。在另一實施方案中，所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)處于高水平。在另一實施方案中，一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)處于低水平。在另一實施方案中，一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)不存在。在一個實施方案中，所述疾病是自身免疫病。在另一實施方案中，所述身免疫病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、類風濕性關(guān)節(jié)炎或強直性脊柱炎。在另一方面，提供了一種發(fā)現(xiàn)個體的一個或多個相關(guān)克隆型的方法，包括a)將來自個體樣品的克隆型譜輸入到一個算法中，和b)使用該算法確定個體的一個或多個相關(guān)克隆型。該算法可以是通過以下方法開發(fā)的算法a)從一組樣品產(chǎn)生多個克隆型譜，其中所述樣品與疾病相關(guān)，b)從這組樣品鑒別一個或多個相關(guān)克隆型，和C)利用b)中鑒別的一個或多個相關(guān)克隆型的序列參數(shù)和/或功能數(shù)據(jù)開發(fā)能夠預(yù)測來自患病受試者的任何樣品中的相關(guān)克隆型的算法。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用校準試驗結(jié)合群體研究鑒別相關(guān)克隆型(例如，參見圖17)。在該實施方案中，群體研究不產(chǎn)生允許預(yù)測任何樣品中的克隆型的算法，而是可以開發(fā)一種算法來預(yù)測來自其特定校準克隆型譜已經(jīng)產(chǎn)生的受試者的任何樣品中的相關(guān)克隆型(例如，參見圖16)。一個實例是開發(fā)一種算法，該算法將基于從任何疾病階段的血液樣品測定的克隆型譜預(yù)測狼瘡患者的相關(guān)克隆型，其首先在臨床發(fā)作期進行血液檢驗，用來校準該算法。在該實施方案中，本發(fā)明包括通過在樣品研究中對免疫細胞的所有組成成分進行測序來鑒別相關(guān)和非相關(guān)克隆型的方法，所述樣品來自患病患者和任選的健康對照，來自不同時間，在患病患者的情況下來自以臨床數(shù)據(jù)表征的疾病過程的不同的(和已知的)狀態(tài)。在第一狀態(tài)與第二狀態(tài)時以不同頻率(或水平)發(fā)現(xiàn)的克隆型然后用于開發(fā)一種算法，該算法預(yù)測在第一疾病狀態(tài)下每個個體的所有組成成分中發(fā)現(xiàn)的哪些序列與每個個體中的后一疾病狀態(tài)相關(guān)，它們不同于該個體中與疾病無關(guān)的序列。不同于單獨的校準試驗的情況，相關(guān)序列可以是發(fā)現(xiàn)在疾病狀態(tài)之間不同的所有序列的亞群。也可能相關(guān)克隆型在校準樣品中未發(fā)現(xiàn)，但是如果它們在未來的樣品中出現(xiàn)，則基于該算法預(yù)測其相關(guān)。作為一個例子，與校準樣品中發(fā)現(xiàn)的克隆型編碼相同的氨基酸序列的克隆型可以基于群體研究得到的算法預(yù)測是相關(guān)克隆型。不同于以前的實施方案，開發(fā)該算法是為了基于校準克隆型譜預(yù)測相關(guān)克隆型，該校準克隆型譜是個體中產(chǎn)生的克隆型譜，將對于該個體預(yù)測該相關(guān)克隆型中哪個處于疾病的特定狀態(tài)。在該實施方案中，該算法不能用于產(chǎn)生特定個體中的相關(guān)克隆型，直到已經(jīng)檢測特定校準克隆型譜。在特定受試者中檢測該校準譜之后，可以基于該個體中克隆型譜的檢測預(yù)測所有后續(xù)相關(guān)克隆型。在另一方面，提供了一種發(fā)現(xiàn)個體的一個或多個相關(guān)克隆型的方法，該方法包括 a)將個體樣品的克隆型譜輸入一個算法中，和b)利用該算法確定個體的一個或多個相關(guān)克隆型。該算法可以是通過以下方法開發(fā)的算法a)從一組樣品產(chǎn)生多個克隆型譜，其中所述樣品與疾病相關(guān)，b)從這組樣品鑒別一個或多個相關(guān)克隆型，和c)利用b)中鑒別的一個或多個相關(guān)克隆型的序列參數(shù)和/或功能數(shù)據(jù)開發(fā)能夠預(yù)測來自患病受試者的任何樣品中的相關(guān)克隆型的算法。在一個實施方案中，樣品在疾病的高峰狀態(tài)采集。在另一實施方案中，樣品采自受疾病影響的組織。E.可以用來予頁測丨相關(guān)克降型的序歹Il相關(guān)的參數(shù)為了進行群體研究，可以使用訓練組通過檢測能夠區(qū)分相關(guān)克隆型與不相關(guān)克隆型的各個參數(shù)理解相關(guān)克隆型的特征。這些參數(shù)包括使用的序列或特定V、D和J區(qū)段。在一個實施方案中，已知特定V區(qū)段更可能與某些疾病相關(guān)，如果特定疾病的克隆型可能識別相關(guān)表位并因此可能具有序列相似性通常是這樣。進一步的實施方案中包括的其它參數(shù)包括鑒別的體細胞超突變的程度和處于發(fā)作高峰時的克隆型水平及其在疾病相對不活動時的水平?？梢灶A(yù)測相關(guān)克隆型的其它參數(shù)包括但不限于1)包括V或J區(qū)、組合VJ、DJ 區(qū)中的短序列的序列基序；2)克隆型的序列長度；3)克隆型水平，包括絕對水平(每百萬個分子的克隆數(shù))或等級水平；4)與其它克隆型的氨基酸和核酸序列相似性其它高度相關(guān)克隆型的頻率，包括具有沉默變化的那些(編碼相同氨基酸的核苷酸差異)或具有保守氨基酸變化的那些；5)對于BCR，克隆型中的體細胞突變水平和/或由于體細胞突變而與一些種系克隆型不同的獨特克隆型的數(shù)目；6)其相關(guān)蛋白具有類似的三維結(jié)構(gòu)的克隆型。進一步的實施方案將利用功能數(shù)據(jù)來幫助鑒別相關(guān)克隆型。例如，含有某些在含有相關(guān)克隆型的細胞中富含的標志物的T細胞和/或B細胞可以通過如FACS或MACS的標準方法捕獲。在另一實施方案中，標志物是細胞表面標志物。在另一實施方案中，T細胞和 /或B細胞對與病理學或受影響組織有關(guān)的抗原的反應(yīng)性將是克隆型的病理相關(guān)性的良好的證據(jù)。在另一實施方案中，可以合成候選克隆型的序列，并置于完整TCR或BCR的背景中，評價相關(guān)反應(yīng)性。或者，不同序列的擴增的片段可以用作噬菌體、核糖體或RNA展示技術(shù)的輸入?？梢詾榫哂邢嚓P(guān)反應(yīng)性的序列選擇這些技術(shù)。選擇之前和之后的測序結(jié)果的比較可以鑒別那些具有反應(yīng)性、因此可能是病理性的克隆。在另一實施方案中，特定展示技術(shù) (例如噬菌體、核糖體或RNA展示)可以以陣列形式使用。攜帶來自TCR或BCR的個體序列(例如⑶R3序列)的個體分子(或這些個體分子的擴增)可以排列為噬菌體、核糖體或 RNA。然后可以研究特定抗原，以確定編碼結(jié)合它們的肽的序列。結(jié)合與疾病相關(guān)的抗原的肽可能是病理性的。G.產(chǎn)生免疫負荷算法可以利用算法計算免疫負荷(例如，參見圖18)。免疫負荷可以用來作出臨床決定。使用實驗獲得(例如，包含來自第一疾病狀態(tài)的受試者的樣品和來自第二疾病狀態(tài)的受試者的樣品的實驗)的數(shù)據(jù)，可以開發(fā)將關(guān)于相關(guān)和非相關(guān)克隆型水平的信息組合為一個得分(免疫負荷)的算法。然后可以調(diào)節(jié)該算法的參數(shù)，以將免疫負荷和臨床數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性最大化。例如，臨床數(shù)據(jù)可以是疾病嚴重程度的臨床量度(例如，多發(fā)性硬化患者的MRI的病變程度)。產(chǎn)生免疫負荷算法中使用的相關(guān)克隆型可以利用如上所述的校準試驗、群體研究或校準試驗和群體研究產(chǎn)生?？梢耘c相關(guān)克隆型結(jié)合考慮的一些因素有相關(guān)克隆型的數(shù)目、它們的水平、它們的變化率(速率)和速度的變化率(加速度)。將要評價的其它因素包括發(fā)作高峰和不活動的疾病狀態(tài)時的克隆型水平。在一個實施方案中，產(chǎn)生的免疫負荷與自身免疫病有關(guān)。這種負荷可以被稱為自身免疫負荷(Autolmm Load)。在一個方面，提供了一種產(chǎn)生計算疾病活動性得分的算法的方法，包括a)開發(fā)一種算法，該算法使用一組因素將相關(guān)克隆型水平組合為疾病活動性得分，b)比較疾病活動性得分與關(guān)于疾病狀態(tài)的臨床數(shù)據(jù)，和c)優(yōu)化這些因素，以將臨床數(shù)據(jù)與疾病活動性得分之間的相關(guān)性最大化。H.使用負荷算法監(jiān)測疾病1.不使用校準試驗監(jiān)測疾病在本發(fā)明的一個實施方案中，使用群體研究確定克隆型和免疫負荷算法(例如， 參見圖19)。免疫負荷可以直接使用，而不需首先校準個體患者。該試驗可以在患者處于任何疾病狀態(tài)時進行。該試驗可以用來基于以上開發(fā)的算法產(chǎn)生特定相關(guān)和非相關(guān)克隆型。 然后可以使用群體研究中產(chǎn)生的第二算法計算免疫負荷。該得分然后可以在臨床上使用。在另一方面，提供了一種監(jiān)測個體的疾病狀態(tài)的方法，包括a)從受試者的樣品確定克隆型譜，b)將a)獲得的克隆型譜信息輸入一種算法，和c)使用該算法產(chǎn)生可預(yù)測個體的疾病狀態(tài)的得分。該算法可以是通過以下方法產(chǎn)生的算法a)開發(fā)一種算法，該算法使用一組因素將相關(guān)克隆型水平組合為疾病活動性得分，b)比較疾病活動性得分與關(guān)于疾病狀態(tài)的臨床數(shù)據(jù)，和c)優(yōu)化這些因素，以使臨床數(shù)據(jù)與疾病活動性得分之間的相關(guān)性最大化。2.使用校準試驗監(jiān)測疾病在本發(fā)明的一個實施方案中，使用校準試驗或校準試驗和群體研究確定相關(guān)克隆型和免疫負荷算法(例如，參見圖20)。免疫負荷可以在診所使用，首先進行校準試驗。該試驗可以在患者處于類似于產(chǎn)生免疫負荷算法中使用的相關(guān)和非相關(guān)克隆型的研究中使用的第一狀態(tài)的狀態(tài)時進行。例如，該狀態(tài)可以是自身免疫病的發(fā)作狀態(tài)，如果這是免疫負荷算法如何產(chǎn)生的。該校準試驗然后可以用來產(chǎn)生將在后續(xù)疾病監(jiān)測試驗中使用的特定相關(guān)和非相關(guān)克隆型。在治療該患者的稍后時間點，對患者進行另一個試驗，并且可以使用發(fā)現(xiàn)研究中產(chǎn)生的算法和該患者的特定校準試驗中產(chǎn)生的克隆型水平的列表計算免疫負荷。 該免疫負荷得分然后可以在臨床上使用。在另一方面，提供了一種監(jiān)測個體的疾病狀態(tài)的方法，包括a)從受試者的樣品確定克隆型譜，b)將a)獲得的克隆型譜信息輸入一種算法，和c)使用該算法產(chǎn)生可預(yù)測個體的疾病狀態(tài)的得分。該算法可以是通過以下方法產(chǎn)生的算法a)開發(fā)一種算法，該算法使用一組因素將相關(guān)克隆型水平組合為疾病活動性得分，b)比較疾病活動性得分與關(guān)于疾病狀態(tài)的臨床數(shù)據(jù)，和C)優(yōu)化這些因素，以使臨床數(shù)據(jù)與疾病活動性得分之間的相關(guān)性最大化。在另一實施方案中，該方法還可包括通過本發(fā)明的任何方法確定個體中的一個或多個相關(guān)克隆型，和將一個或多個相關(guān)克隆型的信息輸入該算法中。在一個實施方案中，所述疾病是自身免疫病。在另一實施方案中，所述自身免疫病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、類風濕性關(guān)節(jié)炎或強直性脊柱炎。3.站斿儲艦捕白姐P賄對于不同的患者，相同的免疫負荷可能意味著不同的含義。舉例來說，需要考慮患者的全部臨床現(xiàn)象。從檢驗角度，在作出臨床決定時除免疫負荷水平以外還可以考慮速率 (免疫負荷隨時間的變化率)和加速度(速率隨時間的變化率)。例如，如果自身免疫負荷得分升高(高速率)，則可以預(yù)測自身免疫病的初期發(fā)作。可以集成到負荷得分例如自身免疫負荷得分中的其它檢驗包括，例如，紅細胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平、抗-ds DNA、其它自身抗體滴度、補體水平、尿蛋白水平、尿蛋白/肌酸酐比值、肌酸酐水平、血尿素氮(BUN)水平、血小板水平、WBC計數(shù)、血細胞比容(Hct)、Hb、尿分析結(jié)果?？梢约傻呐cSLE相關(guān)的其它檢驗包括，例如，CD27水平、 CD27++ 細胞水平、INF-反應(yīng)性基因(Baechler，EC 等人.Q003)Proc. Natl. Acad. Sci. 100 2610-2615)和趨化因子得分(Bauer JW 等人.Q009) Arthritis Rheum. 60 :3098-3107)。 與狼瘡無關(guān)的其它檢驗包括，例如，促甲狀腺激素(TSH)檢驗、三碘甲腺原氨酸CH)檢驗、 甲狀腺素(T4)檢驗、肝功能試驗(LFT)、其它自身抗體、鈣網(wǎng)蛋白檢驗、乳鐵蛋白檢驗和滑液分析。其它檢驗可以包括成像試驗，包括，例如，MRI, CT-掃描、X-射線和超聲。III.確定疾病狀態(tài)因為免疫系統(tǒng)是人類健康的中心，檢測免疫應(yīng)答的能力在醫(yī)學中具有廣泛應(yīng)用。 本發(fā)明教導了使用免疫系統(tǒng)理解當被免疫系統(tǒng)介導時的基礎(chǔ)疾病狀態(tài)的能力。這允許一組非常有效的診斷和預(yù)后應(yīng)用，這些應(yīng)用使用免疫譜提示多種臨床后果的風險，并且允許醫(yī)生更有效地干預(yù)。A.t^^m^^mmm本發(fā)明的方法可以用來診斷和治療受試者的自身免疫病。自身免疫病涉及逃脫提供自身免疫性的普通過程和攻擊身體組織某些靶標的適應(yīng)性免疫細胞。自身免疫病包括， 例如，急性播散性腦脊髓炎、阿狄森病、強直性脊柱炎、抗磷脂抗體綜合征、自身免疫溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳病、貝賽特病、大皰性類天皰瘡、乳糜瀉、美洲錐蟲病、慢性阻塞性肺疾病、皮肌炎、1型糖尿病、肺出血腎炎綜合征、格雷夫斯病、格-巴二氏綜合征、橋本甲狀腺炎、化膿性汗腺炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、間質(zhì)性膀胱炎，多發(fā)性硬化、重癥肌無力、神經(jīng)性肌強直、尋常型天皰瘡、惡性貧血、多肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、類風濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、舍格倫綜合征和脈管炎綜合征。這些自身免疫病的階段可以用本發(fā)明的方法診斷?？梢愿鶕?jù)自身免疫病的階段建議對受試者的治療。關(guān)于患有自身免疫病或懷疑患有自身免疫病的受試者的臨床信息可以用來確定疾病狀態(tài)(或自身免疫負荷)。臨床信息可以用來鑒別與疾病狀態(tài)相關(guān)的克隆型譜的模式。 臨床信息可以包括，例如，身高、體重、虹膜色、年齡、性別、種族、血壓、LDL膽固醇水平、HDL 膽固醇水平、家族史和分子標志物信息。臨床信息可以包括一個或多個自身免疫的癥狀。對于自身免疫性肝炎，癥狀可以包括疲勞、肝大、黃疸、瘙癢、皮疹、關(guān)節(jié)痛、腹部不適、蜘蛛痣、惡心、嘔吐、食欲減退、黑尿、 大便蒼白或灰色。對于皮肌炎(DM)，癥狀可以包括疹(面、頸、肩、胸上部、肘、膝、指關(guān)節(jié)和后背上的斑駁的、藍紫色的變色)伴隨的或以前的肌無力、吞咽困難、肌痛、疲勞、體重減輕和低熱。對于格雷夫斯病，癥狀可以包括能量消耗引起的體重減輕、食欲增加、心率和血壓和震顫、神經(jīng)質(zhì)和出汗。對于橋本甲狀腺炎，癥狀可以包括精神和身體上的遲緩、對冷的較高敏感性、體重增加、皮膚粗糙、甲狀腺腫。對于混合性結(jié)締組織病(MCTD)，癥狀可以包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、硬皮病和硬皮病的特征。對于大皰性類天皰瘡(BP)，癥狀可以包括輕度的搔癢性風團到嚴重水皰和感染、口或食道大皰。對于天皰瘡，癥狀可以包括皮膚和粘膜起皰。對于惡性貧血，癥狀可以包括呼吸短促、疲勞、蒼白、心動過速、食欲不振、腹瀉、手足發(fā)麻和麻木、口瘡和不穩(wěn)定步態(tài)。對于多肌炎(PM)，癥狀可以包括肌無力、吞咽困難和肌痛。對于原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)，癥狀可以包括疲勞和瘙癢。對于硬皮病(系統(tǒng)性硬化病)、癥狀可以包括手指和手腫脹和浮腫、皮膚增厚、手指上的皮膚潰瘍、手部關(guān)節(jié)強直、疼痛、咽喉痛和腹瀉。對于舍格倫綜合征，癥狀可以包括眼口干燥、血管性甲狀腺腫、吞咽或說話困難、不正常的味覺或嗅覺、口渴和舌潰瘍。對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE))，癥狀可以包括發(fā)熱、體重減輕、脫發(fā)、口鼻瘡、不適、疲勞、精神病發(fā)作和癥狀、類似于RA的關(guān)節(jié)炎癥、鼻和頰上的蝶形皮疹、手足對冷的極度敏感。對于脈管炎綜合征，例如，韋格納肉芽腫、特發(fā)性新月體性腎小球腎炎(ICGN)、顯微多動脈炎(MPA)、肺-腎綜合征(PRS)，癥狀可以包括疲勞、 虛弱、發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、腹痛、腎臟問題和神經(jīng)系統(tǒng)問題。臨床信息可以來自于一個或多個時間點的一個或多個受試者。臨床信息可以包括關(guān)于自身免疫病患者對該患者接受的一個或多個治療的應(yīng)答的信息。以下對具體自身免疫病討論了自身免疫負荷的臨床應(yīng)用。本發(fā)明的另一實施方案涉及免疫譜分析試驗與其它已經(jīng)用于檢測這些疾病的疾病活動性的標志物的組合，以使試驗具有更高的靈敏度和特異性。其它分子標識物或標志物可以用于計算負荷算法或用于確定疾病狀態(tài)。分子標識物可以包括核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)，核酸或蛋白質(zhì)的表達譜。分子標識物可以是人或非人來源的(例如，細菌)。標識物或標志物可以通過包括以下的技術(shù)確定，例如，比較基因組雜交(CGH)、染色體微陣列分析(CMA)、表達譜分析、 DNA微陣列、高密度寡核苷酸微陣列、全基因組RNA表達陣列、肽微陣列、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、基因組測序、拷貝數(shù)(CNV)分析、小核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、免疫組織化學、原位雜交、熒光原位雜交(FISH)、PCR、Western印跡分析、Southern印跡分析、SDS-PAGE、凝膠電泳和Northern印跡分析。對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡，標志物可以包括紅細胞沉降率(ESR)水平、C反應(yīng)蛋白 (CRP)水平、抗-ds DNA、其它自身抗體滴度、補體水平、尿蛋白水平、尿蛋白/肌酸酐比值、 肌酸酐水平、血尿素氮(BUN)水平、血小板水平、WBC計數(shù)、血細胞比容(Hct)、Hb和尿分析結(jié)果?？梢约傻睦缗cSLE有關(guān)的其它檢驗包括，例如，CD27水平、CD27++細胞水平、 INF-反應(yīng)性基因和趨化因子得分。1.系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)本發(fā)明的方法可以用來確定系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE或狼瘡)的狀態(tài)或階段。SLE是嚴重的自身免疫病，通常影響年輕成人(大多為女性)。其特征在于可能影響許多器官的炎性過程，包括皮膚、關(guān)節(jié)、腎、肺、心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致頻繁的失能和有時死亡。該疾病遵循非常不可預(yù)測的過程，其標志為發(fā)作期后的緩解靜止期。然而，被診斷為SLE的患者由風濕科醫(yī)生定期觀察，并用多種正式藥物治療。這些藥物包括膽固醇如潑尼松和其它免疫抑制劑，如Cellc印t (驍悉)(嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil))。這些藥物可以減輕器官損傷，但是它們具有明顯的副作用，包括感染和不育的風險。一些癥狀的不可靠性 (例如，疼痛和疲勞)和不可預(yù)測的疾病過程使得調(diào)整用藥劑量變得困難，導致一些患者的過度治療和另一些患者的治療不足。結(jié)果，SLE的治療對醫(yī)生提出了明顯的治療挑戰(zhàn)。有大量標準方法可供臨床醫(yī)生使用，以評價SLE的活動性。疾病狀態(tài)可以通過觀察疾病的臨床癥狀來測量。這些方法包括評價體征(例如，皮疹)和癥狀(例如，關(guān)節(jié)痛和疲勞)以及實驗室結(jié)果(例如，尿蛋白/肌酸酐比、抗-ds DNA抗體和血細胞計數(shù))。然而，這些臨床標志可能是疾病狀態(tài)的滯后的指標，這些患者可能只在治療數(shù)周或數(shù)月后應(yīng)答。此外，在一些情況中，癥狀可能難以精確評價(例如，疼痛和疲勞)。其它炎癥標志，例如抗-ds DNA抗體、補體水平(例如，C3)、C反應(yīng)蛋白(CRP)和紅細胞沉降率(ESR)通常缺乏特異性和/或靈敏性。侵入性方法如腎活檢對于常規(guī)使用來說不實用。結(jié)果臨床醫(yī)生對其患者進行非常頻繁的檢驗，不需對疾病狀態(tài)有完全的測量。臨床癥狀和實驗室評價集成在如系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動性指數(shù)(SLEDAI)和醫(yī)生總體評價(PGA)的測量中。這些測量在臨床實踐中不常規(guī)進行，在幾個臨床情況中通常不足。自身免疫負荷在對SLE進行治療性干預(yù)中的應(yīng)用的具體實例在實施例部分更詳細地討論，同時有確定自身免疫負荷的具體研究。2.多發(fā)件硬化(MS)本發(fā)明的方法也可以用來確定多發(fā)性硬化(MS)的狀態(tài)或階段。MS是影響腦和脊髓(中樞神經(jīng)系統(tǒng))的自身免疫病。其癥狀不同，因為每個攻擊的位置和嚴重程度可能不同。發(fā)作可能持續(xù)數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月。這些發(fā)作與癥狀減輕或無癥狀期(緩解)交替。該疾病通常復(fù)原(復(fù)發(fā))。但是，該疾病可能繼續(xù)惡化，而沒有緩解期。因為腦或脊髓任何部分中的神經(jīng)可能被損傷，多發(fā)性硬化患者可能在身體的許多部位具有癥狀。肌肉癥狀包括，例如，平衡缺失、麻木或許多區(qū)域的感覺異常、肌肉痙攣引起的疼痛、臂或腿的疼痛、運動臂或腿的問題、步行問題、協(xié)調(diào)和進行小移動的問題、言語急促不清或難以理解、一條或多條臂或腿的震顫、不受控制的肌肉群痙攣(肌痙攣狀態(tài))和一條或多條臂或腿的虛弱。眼癥狀包括，例如，復(fù)視、眼不適、不受控制的眼快速運動和視力喪失(在一個時間通常影響一只眼)。其它腦和神經(jīng)癥狀包括，例如，注意廣度縮小、判斷力下降、記憶減退、抑郁或沮喪感、頭暈和平衡問題、面部疼痛、聽覺喪失和疲勞。腸和膀胱癥狀包括，例如，便秘、排尿開始困難、尿頻、大便泄漏、強排尿沖動和尿泄漏(失禁)。現(xiàn)在還沒有已知的多發(fā)性硬化的治愈。但是，有一些療法可以延緩該疾病。治療的目的是控制癥狀和幫助患者維持正常的生活質(zhì)量。用來延緩多發(fā)性硬化進展的藥物包括，例如，幫助控制免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)劑，包括干擾素(Avonex，Betaseron或Rebif)、單克隆抗體(Tysabri)、格拉默醋酸鹽(glatiramer acetate) (Copaxone)、米托蒽醌(Novantrone)、米托蒽醌、硫唑嘌呤 (Imuran)、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)和那他珠單抗(Tysabri)。類固醇類可以用來降低攻擊的嚴
重程度?？刂瓢Y狀的藥物可包括，例如，減輕肌肉痙攣的藥物如力奧來素(Baclofen)、替扎尼定(Zanaflex)或苯二氮雜￥，減少泌尿問題的膽堿能藥物，用于心情和行為癥狀的抗抑郁藥，和用于疲勞的金剛烷胺。MS影響女性超過男性。該疾病最常在20到40歲之間開始，但是在任何年齡可見。 MS由髓鞘的損傷引起，髓鞘是圍繞神經(jīng)細胞的保護套。當該神經(jīng)套受損時，神經(jīng)沖動減慢或停止。MS是一種進行性疾病，意味著神經(jīng)損傷(神經(jīng)變性)隨時間變得惡化。MS多快惡化因人而異。神經(jīng)損傷由炎癥引起。炎癥在自身的免疫細胞攻擊神經(jīng)系統(tǒng)時發(fā)生。炎癥的反復(fù)發(fā)作可以沿腦和脊髓任何區(qū)域發(fā)生。研究人員沒有確定是什么引發(fā)了炎癥。最常見的理論指向病毒或遺傳缺陷，或者兩者的組合。MS在北歐、北美、南澳大利亞和新西蘭(New Zeal)比在其它地區(qū)更可能發(fā)生，地理學研究表明可能涉及環(huán)境因素。具有MS家族史的人和生活在較高發(fā)病率地理區(qū)域的人具有較高的患病風險。MS的癥狀可能模擬許多其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀。該疾病的診斷是通過排除其它疾病進行的。被稱為復(fù)發(fā)緩解型(relapsing-remitting)的MS形式的患者可能具有至少兩次攻擊的歷史，這兩次攻擊間為一段緩解或無癥狀期。如果中樞神經(jīng)系統(tǒng)的兩個不同部分的功能(如異常反射)在不同時間降低，醫(yī)療保健提供者可能懷疑MS。神經(jīng)學檢查可顯示在身體一個區(qū)域降低的或在身體許多部分擴散的神經(jīng)功能。診斷多發(fā)性硬化的試驗包括，例如，腦脊液檢驗，包括CSF寡克隆帶分析、頭部MRI 掃描、腰椎穿刺術(shù)(脊髓穿刺)、神經(jīng)功能研究(誘發(fā)電位試驗)和脊柱MRI。象其它自身免疫病一樣，MS遵循不可預(yù)測的病程，具有急性發(fā)作和緩解期。有越來越多的治療，每一個都具有從嚴重(體重增加和抑郁)到危及生命(全血細胞減少癥和 PML感染)的副作用、在不同患者中可變的有效性和高成本。同時，MS疾病活動性缺乏高度精確的和特異性的常規(guī)檢測使得有效施用治療的挑戰(zhàn)變得復(fù)雜。臨床發(fā)作可以由長時間期限(在早期疾病中最多數(shù)年)隔開，甚至沒有治療。另外，可以應(yīng)用的藥物治療降低了復(fù)發(fā)的可能性，但是沒有完全預(yù)防。因此，疾病活動性難以評價，因此沒有足夠的疾病活動性短期檢測用來通過測量復(fù)發(fā)的次數(shù)或嚴重程度檢測特定治療在特定患者中是否顯示效力。僅有的可用于監(jiān)測疾病活動性的其它試驗是借助造影增強劑和釓顯示的跟蹤病變狀態(tài)的腦 MRL·然而，這種成像只是提供了腦部損傷的綜合檢查，缺乏特異性和時間分辨率。試圖在短于一年的時間尺度上使用MRI成像追蹤病程是不實際的，這是由于成本、缺乏特異性和過度造影劑暴露的危險。結(jié)果，患者通常以高成本長時間治療，沒有任何有效的反饋能使醫(yī)生改變給藥和/或增加治療的轉(zhuǎn)換。3.類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)這些方法可以用來檢測類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的疾病狀態(tài)。類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)
是一種慢性的、全身性的炎性疾病，它可以影響許多組織和器官，但是主要攻擊關(guān)節(jié)，導致
炎性滑膜炎，炎性滑膜炎通常進展為關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)強直。類風濕性關(guān)節(jié)炎也可以產(chǎn)
生肺、心包、側(cè)甲和鞏膜的彌散性炎癥，也導致結(jié)節(jié)性病變，最常發(fā)生在皮膚下的皮下組織。
盡管類風濕性關(guān)節(jié)炎的原因未知，但是自身免疫在慢性和進展中起關(guān)鍵作用。
世界上大約的人口受到類風濕性關(guān)節(jié)炎的困擾，女性三倍于男性。發(fā)病在40 和50歲之間最常見，但是任何年齡的人都可能患病。它可能是失能性的和疼痛的疾病，可能導致機能和運動性大大受損。RA主要根據(jù)癥狀和體重診斷，但是也可以通過血液檢驗 (特別是被稱為類風濕因子的檢驗)和X射線診斷。診斷和長期控制一般由擅長于關(guān)節(jié)和結(jié)締組織疾病的風濕科醫(yī)生進行。可以使用各種治療。非藥物治療包括物理治療、矯形器和職業(yè)療法。鎮(zhèn)痛(止痛藥)和消炎藥，包括類固醇類，可以用來抑制癥狀，而疾病改善抗風濕藥(DMARD)可以用來抑制或中止免疫過程和預(yù)防長期損傷。最近，新的生物制品組增加了治療選項。當臨床上懷疑RA時，可以進行免疫學研究，如檢測類風濕因子(RF，一種特異性抗體)的存在。陰性RF不排除RA;而關(guān)節(jié)炎被稱為血清陰性的。在大約15%的患者中是這樣。在疾病的第一年，類風濕因子更可能是陰性的，某些個體隨時間轉(zhuǎn)變?yōu)檠尻栃缘摹F 也見于其它疾病，例如舍格倫綜合征，并且見于健康人口的大約10 %中，因此該試驗不是非常特異的。由于這種低特異性，已知開發(fā)了新的血清學檢驗，其檢測所謂的抗瓜氨酸蛋白抗體(ACPA)的存在。象RF—樣，這些試驗只在所有RA病例中的一部分(67%)中是陽性的， 但是如果不存在RA則極少陽性，其特異性大約為95%。對于RF，在許多病例中存在ACPA 的證據(jù)，甚至在臨床疾病開始之前。最常見的ACPA試驗是抗-CCP (環(huán)瓜氨酸肽)檢測和抗MCV試驗(抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體)。最近，已經(jīng)發(fā)展了用于早期檢測RA的血清學重點照護檢驗(POCT)。該試驗結(jié)合了類風濕因子的檢測和用于診斷類風濕性關(guān)節(jié)炎的抗MCV，顯示72%的靈敏性99. 7% 的特異性。也可以進行幾種其它血液檢驗來考慮關(guān)節(jié)炎的其它原因，如全身性紅斑狼瘡。紅細胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白、全血計數(shù)、腎功能、肝酶和其它免疫學試驗(例如，抗核抗體 /ANA)全都在此階段進行。升高的鐵蛋白水平可以揭示血色沉著病、模擬RA，或者是斯蒂爾病的體征，該病是一種血清陰性的、通常為青少年的、類風濕的變型。術(shù)語疾病改善抗風濕藥(DMARD)最初的意思是一種影響生物學指標如ESR和血紅蛋白和自身抗體水平的藥物，但是現(xiàn)在通常用來指降低骨和軟骨損傷率的藥物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn) DMARD產(chǎn)生持久的有癥狀的緩解，并且延遲或中止進展。這是有意義的，因為這樣的損傷通常是不可逆的。消炎藥和鎮(zhèn)痛藥改善疼痛和強直，但是不會阻止關(guān)節(jié)損傷或減緩疾病進展。在風濕科醫(yī)生之間越來越認為在疾病的極早期階段發(fā)生關(guān)節(jié)的永久性損傷。過去，經(jīng)常只使用消炎藥開始治療，并在臨床上和使用X射線評價進展。如果有開始發(fā)生關(guān)節(jié)損傷的證據(jù)，則開出更強的DMARD。超聲和MRI是更靈敏的關(guān)節(jié)成像方法，并且已經(jīng)證明關(guān)節(jié)損傷比以前所認為的更早地在更多患者中發(fā)生。X射線檢查正常者通常具有通過超聲檢查能夠檢測到、X射線檢查無法證明的病變。現(xiàn)在的目的是在發(fā)生損傷前治療。關(guān)于早期開始DMARD為什么有益于防止結(jié)構(gòu)關(guān)節(jié)損傷可能有其它原因。從疾病的最早階段，關(guān)節(jié)被免疫系統(tǒng)細胞浸潤，免疫系統(tǒng)細胞彼此發(fā)出信號，這種方式可能涉及多種正反饋回路(長期以來觀察到單皮質(zhì)類固醇注射可能長期消除特定關(guān)節(jié)的滑膜炎)。用有效的DMARD (如氨甲喋呤)盡可能早地中斷該過程在以后數(shù)年似乎改善了 RA的后果。癥狀發(fā)生后延遲治療短至數(shù)個月可能導致長期的較差的后果。因此，當患者對治療響應(yīng)最強并且收益最大時，在建立早期關(guān)節(jié)炎的最有效的治療方面特別有意義。用來治療關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)小分子藥物包括，例如，化學合成的DMARD 硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素(環(huán)孢菌素A)、D-青霉胺、金鹽、羥氯喹、來氟米特、氨甲喋呤(MTX)、米諾環(huán)素和柳氮磺吡啶(SSZ)。細胞毒性藥物包括環(huán)磷酰胺。最常見的不良反應(yīng)涉及肝臟和骨髓毒性(MTX、SSZ、來氟米特、硫唑嘌呤、金化合物、D-青霉胺)、腎毒性(環(huán)孢菌素A、腸胃外金鹽、D-青霉胺)、肺炎(MTX)、變應(yīng)性皮膚反應(yīng)(金化合物，SSZ)、自身免疫性(D-青霉胺、SSZ、米諾環(huán)素)和感染(硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素 A)。羥氯喹可能導致眼毒性，盡管極為少見，并且因為羥氯喹不影響骨髓或肝臟，它通常被認為是毒性最小的DMARD。遺憾的是，羥氯喹不是非常有效，并且其本身通常不足以控制癥狀。生物制劑(biologies)可以通過遺傳工程生產(chǎn)，包括，例如，腫瘤壞死因子 α (TNF α )阻斷劑一依那西普(Enbrel)、英利昔單抗(Remicade)、阿達木單抗(Humira)、白介素1 (IL-I)阻斷劑一阿那白滯素(Kineret)、B細胞單克隆抗體一利妥昔單抗(Rituxan)、 T細胞共刺激阻斷劑一阿巴西普(Orencia)、白介素6 (IL-6)阻斷劑一托珠單抗(一種抗-IL-6 受體抗體)(RoActemra, Actemra)?？寡讋┌?，例如，糖皮質(zhì)激素類，非留體抗炎藥(NSAID，大多數(shù)也用作鎮(zhèn)痛藥)。 鎮(zhèn)痛藥包括，例如，局部應(yīng)用對乙酰氨基酚(在美國和加拿大為醋氨酚)、阿片類、地普喹酮和利多卡因。治療RA的挑戰(zhàn)在于以下事實該疾病是長期慢性疾病，可導致攻擊性的失能，對此現(xiàn)有大量治療，其中每一種都具有明顯的缺點。許多DMARD使患者具有明顯的副作用，包括嚴重感染、癌癥或甚至自身免疫病的風險升高。此外，生物學來源的藥物非常昂貴，并且患者遭受頻繁的感染。對患者開始治療的醫(yī)生面臨許多可能的選擇。一旦患者開始治療就希望得到快速的反饋，以理解患者是否響應(yīng)在臨床表現(xiàn)出現(xiàn)以前選擇的該治療。成像不靈敏，并且昂貴， 許多血液標志物如CRP缺乏足夠的靈敏度。使醫(yī)生能夠快速確定疾病狀態(tài)的檢驗將使他或她能夠?qū)⒅委熆焖僬{(diào)整至更有效的治療，使患者避免另外的關(guān)節(jié)損傷，并更有效地使用可以采用的昂貴的治療。沒有經(jīng)歷任何急性發(fā)作的患者從開始治療起實際上可能仍然經(jīng)歷進行性的關(guān)節(jié)炎性損傷，在臨床上沒有表現(xiàn)出來。使醫(yī)生能夠區(qū)別該狀態(tài)與背景的試驗將允許調(diào)整治療以嘗試使患者更接近沒有經(jīng)歷進行性關(guān)節(jié)損傷的狀態(tài)。在控制MS患者中如何使用自身免疫負荷的具體實例在本文實施例部分進一步詳細描述。4.強肓性脊柱炎所述方法可以用來檢測強直性脊柱炎的疾病活動性。強直性脊柱炎(AS，來自希臘語ankylos，彎曲；spondylos，脊柱)，以前被稱為別赫捷列夫病和Marie Strumpell病，是脊椎關(guān)節(jié)炎的一種形式，是一種慢性的、炎性的關(guān)節(jié)炎和自身免疫病。它主要影響脊柱的關(guān)節(jié)和骨盆中的骶髂(sacroilium)，引起脊柱的最終融合。它是具有強遺傳傾向的脊椎關(guān)節(jié)病的成員。完全融合導致脊柱完全強直，這種情況被稱為竹節(jié)樣脊柱。典型的患者是年輕男性，年齡為18-30，此時疾病的癥狀首先出現(xiàn)，脊柱下部、有時整個脊柱具有慢性疼痛和僵硬，通常疼痛涉及骶髂關(guān)節(jié)的臀部一側(cè)或另一側(cè)或大腿背側(cè)。 受影響的男性多于女性，比例大約為3 1，疾病在男性中比在女性中通常有更疼痛的過程。在病例的40%中，強直性脊柱炎與眼部炎癥有關(guān)(虹膜睫狀體炎和葡萄膜炎)，引起變紅、眼痛、視力損失、飛蚊癥和畏光。另外一種常見的癥狀是全身疲勞，有時惡心。可能發(fā)生較少見的主動脈炎、頂端肺纖維化和骶神經(jīng)根鞘的膨脹。對于所有血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病，可能發(fā)生指甲的翹起(甲松離)。沒有直接的試驗?zāi)軌蛟\斷AS。脊柱的臨床檢查和X射線研究，顯示特征性的脊柱變化和骶髂關(guān)節(jié)炎，是主要的診斷工具。X-射線診斷的缺點是在平片X射線發(fā)現(xiàn)X射線明顯變化之前AS的體征和癥狀通常已經(jīng)出現(xiàn)了長達8-10年，這意味著在可以引入充分的治療之前已經(jīng)有長達10年的延遲。早期診斷的選擇是骶髂關(guān)節(jié)的X線斷層照相術(shù)和磁共振成像，但是這些檢查的可靠性仍不清楚。Schober檢查是在檢查過程中進行的一種有用的腰椎彎曲的臨床測量。在急性炎癥期間，AS患者有時顯示血液C反應(yīng)蛋白(CRP)濃度升高和紅細胞沉降率(ESR)升高，但是有許多AS患者的CRP和ESR率不升高，因此正常的CRP和ESR結(jié)果不總是對應(yīng)于一個人實際存在的炎癥程度。有時AS患者具有正常水平結(jié)果，然而在其體內(nèi)存在明顯的炎癥。強直性脊柱炎(AS，來自希臘語ankylos，彎曲，彎曲；spondylos，脊柱)，以前被稱為別赫捷列夫病、別赫捷列夫綜合征和Marie Strumpell病，是脊椎關(guān)節(jié)炎的一種形式，是一種慢性的、炎性的關(guān)節(jié)炎和自身免疫病。它主要影響脊柱的關(guān)節(jié)和骨盆中的骶髂，引起脊柱的最終融合。它是具有強遺傳傾向的脊椎關(guān)節(jié)病的成員。完全融合導致脊柱完全強直，這種情況被稱為竹節(jié)樣脊柱。有三種主要類型的藥物用于治療強直性脊柱炎1)消炎藥，包括NSAID如布洛芬、 保泰松、吲哚美辛、萘普生和C0X-2抑制劑，它們減輕炎癥和疼痛。臨床證據(jù)也已證明阿片類鎮(zhèn)痛藥在減輕AS患者經(jīng)常經(jīng)歷的慢性疼痛類型中非常有效，特別是隨時間釋放的制齊IJ。 2)DMARD如環(huán)孢菌素、氨甲喋呤、柳氮磺吡啶和皮質(zhì)類固醇，用來通過免疫抑制減輕免疫系統(tǒng)應(yīng)答；3) TNF α阻斷劑(拮抗劑)如依那西普、英利昔單抗和阿達木單抗(也被稱為生物制劑)，用于治療AS并且是AS中的有效的免疫抑制劑，如其它自身免疫病中一樣。已經(jīng)證明TNF α阻斷劑是最有前途的治療藥物，延緩大多數(shù)臨床病例的AS進展， 幫助許多患者獲得炎癥和疼痛的顯著的減輕，盡管不是根除。也證明它們不僅在治療關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎而且在治療與AS有關(guān)的脊柱關(guān)節(jié)炎中非常有效。它的缺點除了通常費用較高以外， 還包括提高了感染的風險。由于這個原因，用于任何TNF-α阻斷劑的方案包括在開始治療前檢查結(jié)核病(如Mantoux或Heaf)。在復(fù)發(fā)性感染，甚至復(fù)發(fā)性喉嚨痛的情況中，由于涉及免疫抑制，可能對治療產(chǎn)生懷疑。建議施用TNF藥物的患者限制他們接觸攜帶或可能攜帶病毒(如感冒或流感病毒)或可能具有細胞或真菌感染的他人。AS產(chǎn)生在健康人群中非常常見的癥狀。例如，主訴嚴重背痛的患者不一定經(jīng)歷AS 發(fā)作，而是可能僅具有普通的背痛。醫(yī)生被迫在沒有非常準確地判斷疾病狀態(tài)的情況下作出是否用具有潛在嚴重副作用的昂貴的藥物治療這些癥狀的決定。CRP和ESR無法非常準確地判斷疾病狀態(tài)。同時，未治療的疾病的過程可能導致使人虛弱的長期脊柱損傷。這種狀態(tài)導致困難的臨床挑戰(zhàn)和使用明顯的過度治療。反映疾病活動性的客觀測量的可用性可能對AS患者的控制具有很大幫助。B.免疫譜分析在癌癥檢測中的應(yīng)用這些方法可以用來檢測癌癥風險。癌癥已經(jīng)成為工業(yè)化國家中首要的死亡原因。 因此，癌癥的治療方法有非常大的需求。正在嘗試許多癌癥治療方法，包括開發(fā)新的小分子藥物以及針對腫瘤的抗體。已經(jīng)提出的一組方法是免疫療法。腫瘤監(jiān)視是免疫系統(tǒng)細胞的功能之一。有幾種類型的腫瘤抗原能被免疫系統(tǒng)識別。第一類包括通過腫瘤中的體細胞突變(點突變或易位)新產(chǎn)生的抗原。另一類包括來自只在不表達MHC分子的雄性生殖細胞中表達的蛋白質(zhì)的抗原。許多腫瘤中基因表達的失調(diào)可能使這些抗原中的某一些被表達。第三類包括來自只在特定組織中表達的蛋白質(zhì)的抗原。第四類包括在腫瘤組織中顯著過度表達的抗原。最后，第五類包括由異常翻譯后修飾產(chǎn)生的抗原。腫瘤的一種性質(zhì)是它們逃脫免疫系統(tǒng)的有效清除的能力。據(jù)認為腫瘤中獲得的新的突變使其從平衡期(其中腫瘤未完全消除，但是其生長被抑制)轉(zhuǎn)至逃脫期，此時腫瘤生長而不受免疫系統(tǒng)的有效控制。腫瘤利用許多機制來逃脫免疫系統(tǒng)。這些機制包括缺乏特異性抗原性肽，或者能夠激活T細胞的共刺激分子。其它機制包括腫瘤分泌抑制T細胞的因子和通過產(chǎn)生分隔腫瘤與淋巴細胞的物理屏障產(chǎn)生腫瘤誘導的特殊部位。正在研究并以多種方式測試誘導免疫系統(tǒng)以更好地對抗腫瘤作為治療癌癥的策略。一種方法是過繼性T 細胞治療。該方法集中在通過分離浸潤腫瘤和/或與特定腫瘤抗原反應(yīng)的細胞鑒別靶向腫瘤抗原的T細胞。這些T細胞可以在增強其有效性的條件下在體外生長，例如使用IL-2和 /或抗原呈遞細胞。擴增的細胞然后回輸?shù)交颊哐褐?。另外一種方法是使用含有腫瘤特異性TCR的逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒可能輸注到患者的特定細胞中，這些細胞后來分泌逆轉(zhuǎn)錄病毒，使其感染T細胞，然后T細胞開始表達腫瘤特異性TCR。最后，一種常用的方法是采用疫苗接種。該治療方法的前提是用一種或多種腫瘤抗原免疫患者，該腫瘤抗原將刺激免疫系統(tǒng)對抗腫瘤的能力。免疫通常使用如卡介苗(BCG)等佐劑進行。該方法已經(jīng)成功用于預(yù)防病毒誘導的癌癥，如通過預(yù)防由HPV-16和HPV-18誘導的宮頸癌的能力所顯現(xiàn)的。但是，很少成功用于治療其它腫瘤。癌癥死亡率已經(jīng)發(fā)生了較大的改善，這是由于可以獲得更好的早期檢測方法，例如導致乳腺癌和宮頸癌的死亡率降低。腫瘤的可突變性使得它們的早期治療比晚期檢測時更加有效。傳統(tǒng)上，尋找癌癥檢測生物標志物通常包括尋找在癌癥中高度表達并且在正常組織中低水平表達或不存在的標志物。這導致鑒定了幾種腫瘤標志物，如PSA。癌癥早期檢測的一個問題是當生物標志物的檢測最困難時，即，腫瘤非常小時，發(fā)生癌癥檢測的最大價值。因此，為了有能夠區(qū)別具有小腫瘤的患者與沒有腫瘤的受試者的有效癌癥檢測生物標志物，需要腫瘤和正常組織之間的表達有巨大差異，這是由于腫瘤和正常組織之間的大小有大的差異。另外，標志物需要有效地“溢出”至血液或其它體液，以允許使用非創(chuàng)傷性技術(shù)進行檢測。本發(fā)明教導了一種新的利用免疫細胞應(yīng)答的癌癥檢測機制。在這點上，通過檢測腫瘤本身產(chǎn)生的標志物無法實現(xiàn)癌癥的檢測，但是通過對腫瘤的免疫系統(tǒng)應(yīng)答可以檢測到。特別是，TCR和/或BCR譜可以提供關(guān)于身體是否對腫瘤具有應(yīng)答的了解。這可以改善使用現(xiàn)有的生物標志物的一些問題。首先，免疫應(yīng)答是一種擴增信號，它可以被較早地檢測到。其次，淋巴細胞經(jīng)常地通過血液，因此相關(guān)生物標志物可能比傳統(tǒng)腫瘤生物標志物更容易地存在于外周血中并可被檢測到。最后，正常組織產(chǎn)生的“背景”生物標志物的問題大大減少。T和/或B細胞的高度多樣性提供了一種高靈敏度和特異性的檢測相關(guān)生物標志物的方法，特別是最近可獲得高通量DNA測序方法。利用對癌癥的免疫系統(tǒng)應(yīng)答的檢測方法通過免疫治療的保證調(diào)節(jié)了歸于該領(lǐng)域的基礎(chǔ)。但是，兩種應(yīng)用的風險可能非常不同。利用對癌癥的免疫應(yīng)答進行檢測不需要特異性克隆型在治療腫瘤中有效，而是需要與對腫瘤的免疫應(yīng)答相關(guān)。本發(fā)明的另一實施方案涉及免疫譜分析試驗與其它已經(jīng)用于檢測癌癥的標志物的組合，以使試驗具有更高的靈敏度和特異性。其它分子標識物或標志物可以用于計算負荷算法或用于確定疾病狀態(tài)。分子標識物可以包括核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)，核酸或蛋白質(zhì)的表達譜。分子標識物可以是人或非人來源的(例如，細菌)。標識物或標志物可以通過包括以下的技術(shù)確定，例如，比較基因組雜交(CGH)、染色體微陣列分析(CMA)、表達概況分析、DNA微陣列、高密度寡核苷酸微陣列、全基因組RNA表達陣列、肽微陣列、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、基因組測序、拷貝數(shù)(CNV)分析、小核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、免疫組織化學、原位雜交、熒光原位雜交(FISH)、PCR、Western印跡分析、Southern印跡分析、 SDS-PAGE、凝膠電泳和Northern印跡分析。C.免疫譜分析在移棺醫(yī)學中的應(yīng)用這些方法可以用來檢測移植器官的免疫排斥。器官移植已經(jīng)成為美國每年進行的超過25，000例實體器官(腎、肝、心臟、胰和肺)移植和超過15，000例骨髓移植的醫(yī)療的不可或缺的部分。這些通常是在三級護理中心進行的復(fù)雜的手術(shù)。為了最小化移植排斥的風險，患者通常被長期置于免疫抑制下，使得他們具有癌癥和感染的危險。此外，許多移植物被急性排斥或在移植數(shù)年后排斥。盡管存在這些問題，器官移植仍然是重要的治療方式， 因為器官衰竭患者幾乎沒有其它選擇。實體器官移植排斥的發(fā)生主要是由于適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對移植的器官的應(yīng)答。這是由于移植物中存在被宿主免疫系統(tǒng)識別的同種異體抗原。排斥可以在三個不同的階段發(fā)生。第一個是在移植幾分鐘內(nèi)的超急性期，其中預(yù)先形成的抗體引起對移植物的應(yīng)答。第二個是在移植后前幾周或前幾個月發(fā)生的急性排斥。最后一個是可以在移植后數(shù)年發(fā)生的慢性排斥?？紤]到這些危險，已經(jīng)小心使供體和接受體之間的免疫原性差異最小化。例如， 當供體和接受體的ABO亞型匹配以及檢測交叉匹配(確定接受者是否具有與供體的白細胞反應(yīng)的抗體)時，超急性反應(yīng)的危險大大降低。類似地，進行主要組織相容性(MHC)的仔細匹配以減少急性排斥。但是，由于MHC分子具有非常高的多態(tài)性，非常難以發(fā)現(xiàn)確定完美的匹配。單卵雙胎具有完美的MHC匹配。類似地，1/4同胞預(yù)期具有完美的MHC匹配。根據(jù)臨床試驗具有可檢測到的相同的等位基因的無關(guān)個體通常由于在常規(guī)臨床實踐中檢測不到的其它多態(tài)性位點具有差異。但是，甚至來自同胞的完美的MHC匹配，仍然存在明顯的排斥風險，這是因為存在次要組織相容性抗原，實際上超過一半的移植物非常常見地發(fā)生急性排斥。人們可以想象更具攻擊性的MHC基因座檢測以及鑒定和匹配次要組織相容性抗原將顯著改善移植排斥和可能的存活率。可以獲得的供體器官數(shù)量有限的事實使得該任務(wù)不切實際，因為更具攻擊性的測試可能顯著延遲用于每名患者的適當移植物的鑒定。因此，在移植領(lǐng)域發(fā)生的許多進展為使用免疫抑制劑預(yù)防和治療排斥。當前有許多藥物用于該目的，包括硫唑嘌呤、皮質(zhì)類固醇類、環(huán)孢菌素、他克莫司、麥考酚酸、西羅莫司、莫羅單抗-CD3、單克隆抗CD25抗體、單克隆抗CD20抗體和鈣神經(jīng)素抑制劑。骨髓移植最常用于白血病和淋巴瘤的治療。一般而言，接受者經(jīng)歷攻擊性的放射和/或化學治療方案，以在移植之前降低腫瘤的負荷。來自供體的成熟T細胞可以在被稱為移植物抗宿主病(GVHD)的相反排斥中攻擊一些宿主組織。這通常表現(xiàn)為疹、腹瀉和肝病。 MHC的仔細匹配可以改善但不能消除該問題。一種方案是在體外排除供體骨髓中最終引起 GVHD的成熟T細胞。一個問題是引起GVHD的相同的現(xiàn)象可能通過移植物抗白血病效應(yīng)引起骨髓移植的一些治療效果，其中供體T細胞攻擊剩余的癌細胞。另外，供體T細胞的排除可以使患者暴露于免疫缺陷的風險。因此，當考慮這些方法時，需要平衡風險和利益。因此通常用免疫抑制劑治療患者以預(yù)防以及治療GVHD?，F(xiàn)有的骨髓控制，對于實體器官移植更是如此，嚴重依賴于使用強免疫抑制劑的治療。然而，由于這些藥物具有明顯的危險，它們以平衡風險和利益的方式使用。但是，由于特定患者在特定時間的危險沒有很好地理解，用對平均患者平衡了風險和收益的劑量治療患者?？梢灶A(yù)測未來排斥事件的試驗可能潛在地非常有助于在它們需要的適當時間調(diào)整對患者的治療。這可導致免疫抑制劑量的減少，或者某些患者同時改善了排斥率和有希望的移植物存活。本發(fā)明的另一實施方案涉及免疫譜分析試驗與其它已經(jīng)用于檢測移植排斥的標志物的組合，以使試驗具有更高的靈敏度和特異性。其它分子標識物或標志物可以用于計算負荷算法或用于確定疾病狀態(tài)。分子標識物可以包括核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)， 核酸或蛋白質(zhì)的表達譜。分子標識物可以是人或非人來源的(例如，細菌)。標識物或標志物可以通過包括以下的技術(shù)確定，例如，比較基因組雜交(CGH)、染色體微陣列分析(CMA)、 表達概況分析、DNA微陣列、高密度寡核苷酸微陣列、全基因組RNA表達陣列、肽微陣列、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、基因組測序、拷貝數(shù)(CNV)分析、小核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、免疫組織化學、原位雜交、熒光原位雜交(FISH)、PCR、WeStern印跡分析、Southern印跡分析、 SDS-PAGE、凝膠電泳和Northern印跡分析。P.免疫譜分析在治療感染中的應(yīng)用這些方法已經(jīng)用于指導感染的治療，特別是在這些感染可能以活動和潛伏狀態(tài)存在時。過去一個世紀用于治療傳染病的抗生素的出現(xiàn)對預(yù)期壽命產(chǎn)生了極大的影響。在過去十年中，分子診斷學技術(shù)已經(jīng)在傳染病的診斷和控制中發(fā)揮了快速提高的作用。核酸擴增提供的出色的靈敏性和特異性使得能夠?qū)⑦@些技術(shù)應(yīng)用到越來越多的應(yīng)用中。許多應(yīng)用用于診斷評價傳染原的存在或不存在。例如，性傳播疾病的檢測通常由采用核酸擴增技術(shù)的分子檢測進行。另一組應(yīng)用涉及評價已經(jīng)診斷的傳染原感染患者的“載量”。一個例子是評估已經(jīng)診斷為AIDS的患者中的HIV病毒載量。該檢查幫助醫(yī)生確定患者的疾病狀態(tài)，因此可以對使用的治療方案的有效性提供指導。有時不僅有助于考慮傳染原的水平，而且有助于考慮對傳染原的免疫應(yīng)答。在臨床實踐中常規(guī)使用對感染的免疫應(yīng)答的一個例子是乙型肝炎。乙型肝炎檢測的一個方面依賴于通過檢測乙型肝炎抗原或者通過核酸擴增試驗檢測傳染原。另外，常規(guī)臨床實踐中通常檢測針對乙型肝炎病毒的不同抗體的存在?？?HBc IgM的存在通常在急性感染條件下發(fā)生，抗-HBc IgG的出現(xiàn)表明感染是慢性的。類似地，抗-HBs抗體的出現(xiàn)表示清除了感染。在本發(fā)明的一個實施方案中，評價對感染的免疫應(yīng)答的價值同時具有分子檢測的靈敏性和特異性。這特別可用于其中傳染原在體內(nèi)保持潛伏的慢性傳染病。TCR和/或BCR 譜可以用來評價對感染的免疫應(yīng)答。測序可以用來獲得TCR和/或BCR譜，以允許高靈敏性和特異性地檢測特定克隆型。為了確定與疾病相關(guān)的特異性的克隆型，設(shè)想了幾種方法。本發(fā)明的另一實施方案涉及免疫譜分析試驗與其它已經(jīng)用于檢測傳染物的標志物的組合，以使試驗具有更高的靈敏度和特異性。其它分子標識物或標志物可以用于計算負荷算法或用于確定疾病狀態(tài)。分子標識物可以包括核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)，核酸或蛋白質(zhì)的表達譜。分子標識物可以是人或非人來源的(例如，細菌)。標識物或標志物可以通過包括以下的技術(shù)確定，例如，比較基因組雜交(CGH)、染色體微陣列分析(CMA)、 表達概況分析、DNA微陣列、高密度寡核苷酸微陣列、全基因組RNA表達陣列、肽微陣列、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、基因組測序、拷貝數(shù)(CNV)分析、小核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、免疫組織化學、原位雜交、熒光原位雜交(FISH)、PCR、WeStern印跡分析、Southern印跡分析、 SDS-PAGE、凝膠電泳和Northern印跡分析。E.免漸細刷臺赫龍患糾白摘ffl這些方法已經(jīng)用于監(jiān)測老年人的免疫系統(tǒng)的狀態(tài)。老年人的免疫系統(tǒng)減弱，被稱為免疫衰老，這影響他們對感染應(yīng)答和對疫苗產(chǎn)生有效應(yīng)答的能力(Weinberger等人.， 2008)。從老年人中肺炎引起的高死亡率(Office for National Statistics, 2005)和他們對醫(yī)源性感染如艱難梭菌(Clostridium difficile)和甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌的易感性(Health Protection Agency, 2008)可以清楚地看出這一點。此外，免疫系統(tǒng)能力的下降被認為解釋了老年人中升高的癌癥比例。另外，免疫衰老可能導致具有顯著炎性過程成分的老年人的其它主要疾病，如阿爾茨海默病和心臟病。預(yù)測哪些個體最可能處于這些致死性后果的危險中的能力在老年科醫(yī)生做出關(guān)于接種、攻擊性感染治療和住院的臨床決定時是有用的。先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的許多方面在免疫衰老中改變。T細胞喪失反應(yīng)性，巨噬細胞具有降低的抗原呈遞能力和改變的細胞因子分泌，自然殺傷細胞具有降低的毒性，濾泡樹突細胞不能有效地呈遞抗原，中性白細胞失去吞噬細胞能力。較小的幼稚T和B細胞集合和記憶和效應(yīng)細胞集合導致T和B細胞所有組成成分的多樣性降低，導致適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對新抗原應(yīng)答的能力降低。特別是，與巨細胞病毒(CMV)有關(guān)的T細胞所有組成成分大大增加，并且總T細胞所有組成成分中的多達45%可能與它有關(guān)。已經(jīng)注意到這些擴增在百歲以上老人中較不明顯。研究提示免疫標志物可能預(yù)測老年人中的存活率。已經(jīng)證明B細胞所有組成成分的多樣性程度預(yù)測至少一個群體中的老年人的存活率。即使TCR和BCR多樣性的這些總體差異表明預(yù)測臨床結(jié)果，但是這些標志物缺乏特異性。所有組成成分數(shù)據(jù)的更深入的分析可以提供顯著更高的預(yù)測精確性。例如，對CMV具有反應(yīng)性的擴增可能具有與其它擴增不同的顯著性。在本發(fā)明的一個實施方案中，來自在外周血中發(fā)現(xiàn)的T和B細胞的RNA可以從其病歷已隨訪數(shù)年的衰老患者的縱向組群中采集?？梢詫@些組群中的每一個在他們的病歷中的幾個時間點擴增TCR和TCR基因和IgH、IgK和IgL基因。長期存活患者的譜與短期存在的患者進行比較。首先，可以獲得多樣性的全面測量。這不僅包括鑒別的不同的克隆型的數(shù)目，而且包括它們的多樣性。例如，V、D、J區(qū)段的使用在兩組中是相同還是一組在其使用方面更有限制？例如，兩個樣品可以具有相同的獨立克隆型數(shù)目，但是兩個樣品之一的克隆型不覆蓋許多V區(qū)段。邏輯上預(yù)測與其克隆型分布在所有V區(qū)段之間的其它樣品相比，該樣品在響應(yīng)新抗原方面多能性更差。除了整體多樣性以外，將確定是否可以根據(jù)一些序列參數(shù)與短期存活患者的克隆型比較來區(qū)別長期存活患者中擴增的克隆型。通過觀察響應(yīng)于特定抗原的克隆型可以補充該方法。例如，由于可以獲得的證據(jù)，CMV響應(yīng)性克隆型的鑒別可能具有預(yù)測能力。在發(fā)現(xiàn)研究中捕獲CMV反應(yīng)性T細胞克隆型可以從一組老年健康患者進行?？梢匝芯窟@些克隆型的序列以鑒別能夠區(qū)別它們與其它克隆型的參數(shù)。使用上述縱向群組通過使用CMV克隆型的該預(yù)測算法，可以評價添加該信息是否能夠提高從非長期存活患者中預(yù)測長期存活患者的能力。本發(fā)明的另一實施方案涉及免疫譜分析試驗與其它已經(jīng)用于檢測老年人群健康的標志物的組合，以使試驗具有更高的靈敏度和特異性。其它分子標識物或標志物可以用于計算負荷算法或用于確定疾病狀態(tài)。分子標識物可以包括核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)，核酸或蛋白質(zhì)的表達譜。分子標識物可以是人或非人來源的(例如，細菌)。標識物或標志物可以通過包括以下的技術(shù)確定，例如，比較基因組雜交(CGH)、染色體微陣列分析 (CMA)、表達概況分析、DNA微陣列、高密度寡核苷酸微陣列、全基因組RNA表達陣列、肽微陣列、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、基因組測序、拷貝數(shù)(CNV)分析、小核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、免疫組織化學、原位雜交、熒光原位雜交(FISH)、PCR、WeStern印跡分析、Southern印跡分析、SDS-PAGE、凝膠電泳和Northern印跡分析。F.免疫譜分析在給予疫苗中的應(yīng)用這些方法已經(jīng)用于給予疫苗。疫苗接種的應(yīng)用導致多種生物的感染率極大降低。 一種具有顯著的健康影響，在美國每年導致超過30，000例死亡的傳染病是流感。流感疫苗接種每年都要進行，因為毒株快速突變。該疾病的大多數(shù)嚴重后遺癥發(fā)生在老年人中。遺憾的是，老年人通常經(jīng)歷免疫衰老，這使得他們對疫苗接種的反應(yīng)性不足。為了區(qū)別對疫苗接種具有反應(yīng)性的患者與對疫苗接種沒有反應(yīng)性的患者，需要進行發(fā)現(xiàn)研究。在該人群中，可以從一組具有已知流感后果的流感疫苗接種患者(即，他們是否后來被預(yù)防感染)中獲得接種前和接種后(在一組或多組時間)血液樣品。TCR和/或 BCR序列可以從這些樣品中獲得。確定在每名患者中疫苗接種后富集的克隆型。在對疫苗接種有反應(yīng)的患者中富含的克隆型然后與一組對照克隆型(例如，同一組患者中的其余克隆型)進行比較，以區(qū)別相關(guān)克隆型與其它克隆型。然后利用預(yù)測這些克隆型的算法來預(yù)測對疫苗接種沒有應(yīng)答的患者之間的相關(guān)克隆型。沒有應(yīng)答的患者可能與有應(yīng)答的患者產(chǎn)生類型相同但水平較低的克隆型。或者，可能無應(yīng)答者產(chǎn)生不同類別的克隆型。在無應(yīng)答者中鑒別的相關(guān)克隆型的數(shù)目可以區(qū)別這兩個可能性。使用鑒別的相關(guān)克隆型，然后建立一種算法，以產(chǎn)生用于預(yù)測免疫可能性的得分。 來自疫苗應(yīng)答者和無應(yīng)答者的譜的數(shù)據(jù)用來產(chǎn)生該算法。該算法然后可以用來利用從免疫后獲得的樣品預(yù)測的相關(guān)克隆型預(yù)測下一患者中免疫的可能性。通過應(yīng)用也是在發(fā)現(xiàn)研究中產(chǎn)生的另一算法進行預(yù)測。它可以任選地由來自預(yù)先校準的數(shù)據(jù)進行輔助(或代替)，以將對相關(guān)克隆型的搜索限制為免疫后富集的那些。本發(fā)明的另一實施方案涉及免疫譜分析試驗與其它已經(jīng)用于檢測對疫苗接種的應(yīng)答的標志物的組合，以使試驗具有更高的靈敏度和特異性。其它分子標識物或標志物可以用于計算負荷算法或用于確定疾病狀態(tài)。分子標識物可以包括核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)，核酸或蛋白質(zhì)的表達譜。分子標識物可以是人或非人來源的(例如，細菌)。標識物或標志物可以通過包括以下的技術(shù)確定，例如，比較基因組雜交(CGH)、染色體微陣列分析(CMA)、表達概況分析、DNA微陣列、高密度寡核苷酸微陣列、全基因組RNA表達陣列、肽微陣列、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、基因組測序、拷貝數(shù)(CNV)分析、小核苷酸多態(tài)性(SNP) 分析、免疫組織化學、原位雜交、熒光原位雜交(FISH)、PCR、WeStern印跡分析、Southern印跡分析、SDS-PAGE、凝膠電泳和Northern印跡分析。G.躺丨免■細(械艦)Φ白摘ffl適應(yīng)性免疫系統(tǒng)已經(jīng)進展為響應(yīng)與病原體有關(guān)的抗原。如同自身免疫病中一樣， 免疫系統(tǒng)有時可能具有錯誤的靶標。在自身免疫病中，免疫系統(tǒng)針對自身抗原，而在超敏反應(yīng)中，它產(chǎn)生對有害的刺激物如藥物、粉塵和食物的應(yīng)答。超敏反應(yīng)非常常見，多達50%的美國人口對環(huán)境刺激物具有變態(tài)反應(yīng)，并且它是由藥物引起的。超敏反應(yīng)分為4類。I型超敏反應(yīng)是速發(fā)型超敏反應(yīng)，由IgE介導。II型超敏反應(yīng)通常是由于IgG抗體與細胞表面結(jié)合的抗原結(jié)合引起的。例如，與細胞表面結(jié)合的無害的藥物可以使細胞成為碰巧具有這些抗體的患者中的抗藥物IgG的靶標。III型超敏反應(yīng)是由抗原-抗體復(fù)合物在組織上的沉積引起的。這發(fā)生在例如抗原量大導致小免疫復(fù)合物不能被有效清除、而是沉積在血管壁上時。IV型超敏反應(yīng)是由T細胞介導的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。I型和IV型超敏反應(yīng)對人類健康具有最大的影響。在I型超敏反應(yīng)中，患者通過產(chǎn)生抗無害抗原(變應(yīng)原)的IgE抗體而對該抗原致敏。后來暴露于變應(yīng)原誘導IgE-結(jié)合細胞如肥大細胞和嗜堿性粒細胞的活化。一旦被活化，這些細胞就通過分泌儲存的化學物質(zhì)和合成細胞因子、白三烯和前列腺素誘導炎性過程而引起變應(yīng)性反應(yīng)。變應(yīng)原的劑量和進入途徑?jīng)Q定了變態(tài)反應(yīng)的程度，其程度可能從變應(yīng)性鼻炎的癥狀到過敏反應(yīng)中的危害生命的循環(huán)衰竭。通常急性I型反應(yīng)之后為另一個晚期階段，該晚期階段在產(chǎn)生的許多病理性過程中起作用。T輔助細胞和其它炎性細胞的募集的晚期基本上是IV型超敏反應(yīng)。一些I型變態(tài)反應(yīng)包括季節(jié)性鼻炎結(jié)膜炎(花粉癥)、 食物變態(tài)反應(yīng)、藥物誘導的過敏反應(yīng)、特應(yīng)性皮炎(濕疹)和哮喘。這些是具有流行性升高的非常常見的病癥，引起高成本以及發(fā)病率和死亡率。例如，哮喘是一種慢性疾病，它影響到美國人口的大約7%，每年導致約4，000例死亡。這些疾病中的一些具有一些相關(guān)的方面。例如，特應(yīng)性皮炎患者具有顯著提高的患哮喘的危險。食物變態(tài)反應(yīng)可以引起嘔吐和腹瀉，但是也可以在相當數(shù)目的患者-30，000名一中導致過敏反應(yīng)，在美國每年導致約200 例死亡。激活鼻中粘膜下肥大細胞引起變應(yīng)性鼻炎癥狀的的某些相同變應(yīng)原也可以激活下呼吸道中的肥大細胞，引起支氣管緊縮，這是哮喘的一種典型的癥狀。一些IV型超敏反應(yīng)是接觸性皮炎(例如，毒葛)、慢性鼻炎、慢性哮喘和乳糜瀉。乳糜瀉是一種由非IgE介導的食物變態(tài)反應(yīng)引起的慢性病。它是由針對谷蛋白的變應(yīng)性應(yīng)答引起的小腸疾病，谷蛋白是小麥和其它食物中存在的一種成分。超過95%的乳糜瀉患者具有特定的MHC II類等位基因，HLA-DQ2。超敏反應(yīng)的治療不同，但是它們通常具有兩個方面急性治療和慢性控制或預(yù)防。 這些病癥中的一些可能是危害生命的(過敏反應(yīng)和急性哮喘)并且引起直接醫(yī)學關(guān)注。慢性控制通常包括試圖避免特定變應(yīng)原。當變應(yīng)原能夠清楚地鑒別時(例如，對堅果過敏)， 這可能是有效的，但是當變應(yīng)原廣泛存在于環(huán)境中時，如花粉或粉塵，這可能是困難的。因此，藥物慢性治療通常用于這些疾病中的一些疾病(例如，哮喘和變應(yīng)性鼻炎)。當患者重新暴露于變應(yīng)原時，最終測試治療控制的有效性水平。因此一些患者可能過度治療或治療不足。理想地，可以采用評價疾病活動性和患者傾向于發(fā)生超敏反應(yīng)的程度的試驗。這種試驗將允許根據(jù)個體患者需要調(diào)整治療。
實施例實施例1m^^^^mm^nm dna 的序歹U血液樣品采自自身免疫病患者。⑶4+和⑶8+細胞使用抗體包被的磁珠從血液樣品中分離。PCR用來擴增T細胞受體β基因的完整可變區(qū)。將擴增的片段亞克隆到載體中，并轉(zhuǎn)化細菌，以分離DNA片段。培養(yǎng)細菌，以擴增DNA，利用雙脫氧測序?qū)細胞受體β 基因的可變區(qū)測序，以鑒別克隆型。測序信息用來產(chǎn)生患者的克隆型譜。一種類似的方法顯示在圖1中。實施例2確定自身免疫病的狀杰腦脊液(CSF)和血液樣品采自多發(fā)性硬化發(fā)作高峰的患者。⑶4+細胞從CSF和血液中分離，T細胞受體β基因的CDR3通過PCR擴增。將擴增的片段亞克隆到載體中，并轉(zhuǎn)化細菌，以分離DNA片段。培養(yǎng)細菌，以擴增DNA，利用雙脫氧測序?qū)細胞受體β基因的可變區(qū)進行測序，以鑒別克隆型。測序信息用來產(chǎn)生患者的克隆型譜。另一份血液樣品在患者處于多發(fā)性硬化的相對不活動狀態(tài)時采集。重復(fù)如上所述的相同程序以產(chǎn)生克隆型譜。病理性克隆型被確定為在高峰發(fā)作時高而在不活動狀態(tài)時明顯下降的克隆型。另一份血液樣品采自處于稍后狀態(tài)的患者。在此時，只有一部分T細胞受體β基因CDR3區(qū)被擴增，然后測序。該亞群含有病理性克隆型。確定各種克隆型的水平以評估患者的疾病狀態(tài)。實施例3TCRg所有組成成分分析擴增和測序策略為了研究TCR所有組成成分的擴增，分析TCRii鏈。該分析包括擴增、測序和分析 TCR^序列。一個引物為六606六01^^^^^^^^六0六，互補于(3 1和CP 2中的共同序列，有34 個V引物(表1)能夠擴增全部48個V區(qū)段。Ci31或Ci32在自J/C連接的位置10和14 彼此不同。用于C β 1和C β 2的引物將在位置16bp終止，并且對于C β 1或C β 2應(yīng)當沒有偏性。34個V引物從BI0MED-2小組發(fā)表的一組原始引物修飾而來，以擴增全部48個 V區(qū)段和他們發(fā)表的國際ImMimoGeneTics信息系統(tǒng)定義的全部等位基因(http//imgt. cines. fr/) 0
BI0MED-2引物已經(jīng)多重使用以鑒別淋巴細胞增生性疾病中的克隆形成能力。表1.互補于不同V家族的引物序列
權(quán)利要求
1.一種確定τ細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括a.從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品；b.從所述細胞空間上分離基因組DNA的個體分子；c.對所述空間上分離的基因組DNA的個體分子進行測序；d.確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。
2.一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括a.從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品；b.從所述細胞空間上分離基因組DNA的個體分子；c.擴增所述基因組DNA的個體分子；d.對所述擴增的DNA進行測序；和e.確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列。
3.一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括a.從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品；b.從所述細胞擴增基因組DNA;c.空間上分離所述擴增的DNA的個體分子；d.對所述空間上分離的擴增DNA的個體分子進行測序；和e.確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。
4.一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括a.從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品；b.從所述細胞擴增基因組DNA;c.空間上分離所述擴增的DNA的個體分子；d.再擴增所述擴增的DNA分子；e.對所述再擴增的DNA分子進行測序；和f.確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。
5.一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括a.從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品；b.逆轉(zhuǎn)錄所述細胞的RNA以形成cDNA；c.空間上分離所述cDNA的個體分子；d.任選地再擴增所述空間上分離的個體cDNA分子；e.對所述cDNA和/或再擴增的cDNA進行測序；和f.確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。
6.一種確定T細胞和/或B細胞中的重組DNA序列譜的方法，包括a.從受試者獲得包含T細胞和/或B細胞的樣品；b.空間上分離所述樣品中的個體細胞；c.對來自所述細胞的個體核酸分子進行測序；和d.確定來自所述樣品的不同序列的水平，以產(chǎn)生所述重組DNA序列譜。
7.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述擴增和/或再擴增包括PCR、多重PCR、TMA、 NASBA 或 LAMP。
8.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述空間上分離包括將所述DNA或cDNA亞克隆到用來轉(zhuǎn)化細菌的載體中，在固體支持體上二維分離所述DNA或cDNA，在含微團的溶液中三維分離所述DNA或cDNA，或使用微反應(yīng)室分離分子。
9.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述擴增和/或再擴增是通過攜帶亞克隆的 DNA或cDNA的細菌的生長，DNA或cDNA在載玻片上的擴增，或DNA或cDNA在珠上的擴增。
10.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測序包括雙脫氧測序。
11.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測序包括使用可逆終止的標記核苷酸合成測序。
12.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測序包括檢測核苷酸摻入的焦磷酸釋放。
13.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測序包括與標記的寡核苷酸探針文庫的等位基因特異性雜交。
14.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測序包括合成測序，該合成測序是利用與標記寡核苷酸探針文庫的等位基因特異性雜交，隨后連接所述探針。
15.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測序包括實時監(jiān)測聚合步驟過程中標記核苷酸的引入。
16.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述重組DNA序列包含T細胞受體基因和/或免疫球蛋白基因。
17.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測序包括對免疫球蛋白和/或T細胞受體基因的全克隆序列的亞群進行測序。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述全克隆序列的亞群包括免疫球蛋白或T細胞受體基因的V-D連接、D-J連接、免疫球蛋白或T細胞受體基因的完整可變區(qū)、抗原識別區(qū)、或互補決定區(qū)3(CDR3)。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述T細胞受體基因包含T細胞受體β基因。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述免疫球蛋白基因包含免疫球蛋白重鏈基因。
21.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述擴增或再擴增包含多個互補于V區(qū)段的引物和一個互補于C區(qū)段的引物。
22.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述擴增或再擴增包含多個互補于V區(qū)段的引物和多個互補于C區(qū)段的引物。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述多個互補于V區(qū)段的引物包含至少三個不同的用于每個V區(qū)段的引物，多個互補于C區(qū)段的引物包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、 至少5個或至少6個引物。
24.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述T細胞和/或B細胞是總T細胞和/或B 細胞的亞群。
25.權(quán)利要求M的方法，其中所述T細胞的亞群是⑶4+，⑶8+細胞或⑶27s細胞。
26.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述樣品包含至少100，000個、至少500，000 個、至少750，000個或至少1，000，000個T細胞。
27.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測序包括至少1000閱讀/運行、至少 10，000閱讀/運行、至少100，000閱讀/運行或至少1，000, 000閱讀/運行。
28.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測序包括每個閱讀產(chǎn)生約30bp、約40bp、 約 50bp、約 60bp、約 70bp、約 80bp、約 90bp、約 IOObp、約 110 或約 120bp。
29.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述樣品當受試者處于自身免疫病的發(fā)作狀態(tài)時采集。
30.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述樣品從患有或懷疑患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的受試者采集。
31.一種確定受試者的一個或多個相關(guān)克隆型的方法，包括a.通過對來自受試者的至少一個樣品的空間上分離的個體分子進行核酸測序，產(chǎn)生一個或多個克隆型譜，其中所述至少一個樣品與疾病的第一狀態(tài)有關(guān)，和b.基于所述一個或多個克隆型譜確定受試者中的一個或多個相關(guān)克隆型。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述至少一個樣品來自受疾病影響的組織。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述確定一個或多個相關(guān)克隆型包括比較來自至少兩個樣品的克隆型譜。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述疾病的第一狀態(tài)是疾病的高峰狀態(tài)。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述一個或多個相關(guān)克隆型存在于疾病的高峰狀態(tài)。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)不存在。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時高。
38.權(quán)利要求34的方法，其中所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時低。
39.權(quán)利要求31的方法，其中所述樣品包含T細胞和/或B細胞。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述T細胞和/或B細胞包含T細胞和/或B細胞的亞群。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述T細胞和/或B細胞的亞群通過與標志物相互作用而富集。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述標志物是T細胞和/或B細胞的亞群上的細胞表面標志物。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述T細胞和/或B細胞的亞群與特異性存在于疾病中的抗原相互作用。
44.權(quán)利要求31的方法，其中所述疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡或多發(fā)性硬化。
45.一種開發(fā)算法的方法，該算法能夠預(yù)測患病患者的任何樣品中的一個或多個相關(guān)克隆型，該方法包括a.從一組樣品產(chǎn)生多個克隆型譜，其中該樣品與所述疾病有關(guān)，b.從這組樣品鑒別一個或多個相關(guān)克隆型，c.利用來自b)中鑒別的一個或多個相關(guān)克隆型的序列參數(shù)和/或功能數(shù)據(jù)來開發(fā)能夠預(yù)測患病患者的任何樣品中的相關(guān)克隆型的算法。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述一組樣品獲自一個或多個受疾病影響的組織。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述一個或多個相關(guān)克隆型的鑒別包括比較來自至少兩個樣品的克隆型譜。
48.權(quán)利要求45的方法，其中所述功能數(shù)據(jù)包括T細胞和/或B細胞表面上的標志物的結(jié)合能力或T細胞或B細胞與抗原的相互作用。
49.權(quán)利要求45的方法，其中所述序列參數(shù)包括核酸序列和預(yù)測的氨基酸序列。
50.權(quán)利要求45的方法，其中所述樣品來自一個或多個處于疾病高峰期的個體。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時存在。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時處于高水平。
53.權(quán)利要求50的方法，其中所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時處于低水平。
54.權(quán)利要求50的方法，其中所述一個或多個相關(guān)克隆型在疾病的高峰狀態(tài)時不存在。
55.權(quán)利要求45的方法，其中所述疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡或多發(fā)性硬化。
56.一種發(fā)現(xiàn)個體的一個或多個相關(guān)克隆型的方法，該方法包括a.將來自個體的樣品的克隆型譜輸入權(quán)利要求45的算法中，和b.利用該算法確定對于該個體的一個或多個相關(guān)克隆型。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述樣品在疾病的高峰狀態(tài)時采集。
58.權(quán)利要求56的方法，其中所述樣品采自受疾病影響的組織。
59.一種產(chǎn)生計算疾病活動性得分的算法的方法，包括a.開發(fā)一種算法，該算法使用一組因素將相關(guān)克隆型的水平組合為疾病活動性得分，b.比較所述疾病活動性得分與關(guān)于疾病狀態(tài)的臨床數(shù)據(jù)，和c.優(yōu)化這些因素，以將臨床數(shù)據(jù)與疾病活動性得分之間的相關(guān)性最大化。
60.監(jiān)測個體的疾病狀態(tài)的方法，包括a.從來自個體的樣品確定克隆型譜，b.將來自a)的克隆型譜信息輸入到算法中，該算法計算權(quán)利要求59中產(chǎn)生的疾病活動性得分，和c.使用計算疾病活動性得分的算法產(chǎn)生預(yù)示個體疾病狀態(tài)的得分。
61.權(quán)利要求60的方法，還包括確定個體中的一個或多個相關(guān)克隆型，并將一個或多個相關(guān)克隆型的信息輸入到算法中。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述確定個體中的一個或多個相關(guān)克隆型包括a.通過對來自受試者的至少一個樣品的各個空間上分離的分子進行核酸測序，產(chǎn)生一個或多個克隆型譜，其中所述至少一個樣品與疾病的第一狀態(tài)相關(guān)，和b.基于所述一個或多個克隆型譜確定受試者中的一個或多個相關(guān)克隆型。
63.權(quán)利要求61的方法，其中所述確定個體中的一個或多個相關(guān)克隆型包括a.將來自個體的樣品的克隆型譜輸入到能夠預(yù)測一個或多個相關(guān)克隆型的算法中，其中所述能夠預(yù)測一個或多個相關(guān)克隆型的算法是通過以下方式開發(fā)的i.從一組樣品產(chǎn)生多個克隆型譜，其中該樣品與疾病有關(guān)， .從這組樣品鑒別一個或多個相關(guān)克隆型，iii.利用來自ii)中鑒別的一個或多個相關(guān)克隆型的序列參數(shù)和/或功能數(shù)據(jù)來開發(fā)能夠預(yù)測患病患者的任何樣品中的相關(guān)克隆型的算法，和b.利用能夠預(yù)測一個或多個相關(guān)克隆型的算法確定對于該個體的一個或多個相關(guān)克隆型。
64.權(quán)利要求61的方法，其中所述疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡或多發(fā)性硬化。
全文摘要
需要用于確定患病(包括自身免疫病和癌癥)患者的診斷和預(yù)后的改進的方法。本發(fā)明提供利用DNA測序鑒別自身免疫病和其它疾病患者的個體化生物標志物的方法。鑒別的生物標志物可以用來確定患有自身免疫病或其它疾病的受試者的疾病狀態(tài)。
文檔編號C12Q1/68GK102272327SQ200980153756
公開日2011年12月7日 申請日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日
發(fā)明者M·法哈姆, T·威利斯 申請人:賽昆塔公司