專利名稱：gC1q受體,與其結合的HIV－1gp120區(qū)以及相關肽和靶向抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及(1)與HIV-1gp120結合并基于gC1q受體(gC1q-R)的肽，以及針對這些肽的抗體；(2)與gC1q-R結合的HIV-1gp120相關肽，以及針對這些肽的抗體。
背景技術：
C1q是補體經典途徑的C1復合物的一個組分(R.B.Sim and K.B.M.Reid，今日免疫學1991；12307-311)，C1q的生物學功能多種多樣，包括起始補體級聯系統進行調理和細胞溶解，以及根據表達C1q受體的細胞類型而介導幾種不同的功能。C1q在單核細胞/巨噬細胞中增強FcR和CR1介導的吞噬作用(D.A.Bobak等，歐洲免疫學雜志，1988；182001-2007；D.A.Bobak等，免疫學雜志1987；1381150-1156)，刺激B細胞產生免疫球蛋白(K.R.Young等，免疫學雜志1991；1463356-3364)，激活血小板以表達αIIb/β3整聯蛋白、P-選擇蛋白和前促凝劑(procoagulant)(E.I.B.Peerschke等，實驗醫(yī)學雜志1993；178579-587；E.I.B.Peerschke等，免疫學雜志1994；1525896-5901)，激活巨噬細胞的腫瘤毒性(R.W.Leu等，免疫學雜志1990；1442281-2286)，以及發(fā)揮對T細胞生長的抗增殖性作用(A.Chen等，免疫學雜志1994；1531430-1440)。
最近已鑒別、克隆并測序了一種稱為gC1q-R的33千道爾頓(kD)受體，其與C1q分子的球狀頭部結合(B.Ghebrehiwet等，實驗醫(yī)學雜志1994；1791809-1821；E.I.B.Peerschke等，免疫學雜志1994；1525896-5901；A.Chen等，免疫學雜志1994；1531430-1440)。另一種稱為cC1q-R的60kD受體與C1q的氨基端膠原樣(collagen-like)區(qū)域結合(B.Ghebrehiwet等，Behring Inst.Mitt.1989；84204-215；A.Chen等，免疫學雜志1994；1531430-1440)?；诮浘酆厦告湻磻?PCR)擴增檢測gC1q-R mRNA以及經免疫化學方法檢測gC1q-R蛋白的表達，發(fā)現這一受體在許多不同細胞類型中存在，例如，B細胞、T細胞、單核細胞/巨噬細胞、嗜中性白細胞、嗜伊紅性粒細胞、成纖維細胞、血小板、內皮細胞、肝細胞、神經細胞和平滑肌細胞。然而，尚不知gC1q-R結合HIV-1gp120并中和HIV-1的感染性。
已經公知主要在輔助/誘導T細胞表面表達的CD4抗原是HIV-1gp120的主要受體(P.J.Maddon等，細胞1986；47333-385；J.S.McDougal等，科學1986；231382-385)，除了CD4+T細胞，HIV-1還可以結合并感染其它一些細胞類型，如單核細胞/巨噬細胞、B細胞、結腸上皮細胞和神經膠質細胞，這些細胞表達檢測不到的或最低水平的細胞表面CD4。已經提示有幾種其它受體與HIV-1感染靶細胞相關，例如在人結腸上皮細胞、施旺細胞和少突膠質細胞表面的半乳糖神經酰胺(Gal-Cer)(N.Yahl等，病毒學1994；204550-557；J.M.Harouse等，科學1991；253320-323)，在B細胞上的IgM同種型的人免疫球蛋白VH3基因產物(分子量950kD)(L.Berberian等，科學1993；2611588-1591)，在活化的T和B細胞上的CD26(分子量110kD)(C.Callebaut等，科學1993；2622045-2050)，以及主要在巨噬細胞上的膜結合C型凝集素(分子量46kD)(B.M.Curtis等，美國國家科學進展1992；898356-8360)。
本發(fā)明是在意在發(fā)現非CD4表達細胞上的針對HIV-1gp120的細胞結合蛋白或受體的研究中完成。為此目的，將得自P.J.Nara(AIDS Res.Hum.Retroviruses1987；3283-302)的CEM-SS細胞(其是表達高水平細胞表面CD4的T細胞)的裂解物以及得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)的DAKIKI細胞(其是CD4陰性B細胞)的裂解物進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并將分開的蛋白質轉印到硝基纖維素膜上進行Western免疫印跡分析，發(fā)現重組gp120或HIV-1感染細胞衍生的gp120與CEM-SS和DAKIKI細胞裂解物中的一條32-33kD蛋白帶反應，該蛋白帶與和抗人CD4單克隆抗體反應的55kD蛋白帶截然分開。
為了純化這一新的gp120結合蛋白以用于N-末端氨基酸測序鑒定，制備大量DAKIKI細胞裂解物，用Prep Cell Model 491(Bio-Rad實驗室公司，Hercules，加利福尼亞)經制備電泳部分純化這一gp120結合蛋白。然后將樣品進行二維凝膠電泳并印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上進行Western免疫印跡分析以鑒別gp120反應性蛋白斑點并進行N-末端氨基酸測序。已證明gp120反應性蛋白的N-末端頭15個氨基酸的序列與以前已鑒定為p32的蛋白(分子量32kD)的N-末端頭15個氨基酸的序列相同，p32是由A.R.Krainer等(細胞1991；66383-394)和B.Honore等(基因1993；134282-287)報道與人前mRNA剪接因子共純化的。進一步的實驗揭示DAKIKI細胞可以被兔抗p32免疫球蛋白染色，表明p32存在于DAKIKI細胞的表面，兔抗p32免疫球蛋白是通過使用大腸桿菌表達的純p32而產生。DAKIKI細胞還顯示能結合重組HIV-1gp120，雖然該細胞在其表面不表達能用免疫熒光方法檢測到的CD4?？傊?，這些發(fā)現證明p32是另一種HIV-1gp120的細胞表面結合蛋白，隨后證明p32具有與gC1q-R(SEQ ID NO1)的相同的序列(B.B.Ghebrehiwet等，實驗醫(yī)學雜志1994；1791809-1821)。
gC1q-R的前體或前蛋白原含有282個氨基酸(a.a.)，功能性成熟蛋白含有209個氨基酸，這一成熟蛋白含有SEQ ID NO1的74位氨基酸(亮氨酸)至282位氨基酸(谷氨酰胺)的肽部分。成熟gC1q-R是高荷電的并是酸性的，其在114、136和223位氨基酸處具有3個潛在的N-糖基化位點，因此，在SDS-PAGE中gC1q-R的表觀分子量為32kD，而不是由氨基酸組成計算得到的24.3kD。由于成熟蛋白僅在186位具有一個半胱氨酸，因此蛋白內沒有鏈內二硫鍵。gC1q-R在許多細胞類型中發(fā)現，如B細胞、T細胞、單核細胞/巨噬細胞、嗜伊紅性粒細胞、嗜中性白細胞、血小板、內皮細胞、成纖維細胞和肝細胞。
由于gC1q-R與多種免疫學和生理學功能相關，所以gC1q-R和HIV-1gp120之間的相互作用可能導致HIV-1感染個體表現出的一些免疫學和生理學功能異常。其還可能導致已知的HIV-1的感染不同組織和器官中的各種非CD4表達人細胞的能力。對gC1q-R和HIV-1gp120之間的相互作用的人工干預代表了抵抗HIV-1疾病的新策略，基于這種人工干預的幾個發(fā)明將在下面討論。
發(fā)明概述本發(fā)明包括基于針對HIV-1gp120的gC1q-R的結合位點的免疫原和肽，以及基于針對gC1q-R的HIV-1gp120的結合位點的免疫原和肽。針對gp120的gC1q-R結合位點的序列如SEQ ID NO2所示，針對gC1q-R的HIV-1gp120結合位點的序列如SEQ ID NO3所示。本發(fā)明還包括針對所有這些免疫原和肽的抗體和結合分子以及誘導這種抗體的內源性產生。本發(fā)明的其它方面和實施方案進一步如下所述。
附圖的簡要描述

圖1是用于在大腸桿菌中表達全長成熟型gC1q-R(1-209a.a.)及其3個截短形式的載體pT7-7的限制圖譜，gC1q-R(δ1-57)代表gC1q-R(58-209a.a.)，gC1q-R(C)代表gC1q-R(95-209a.a.)，gC1q-R(N)代表(1-94a.a.)。
圖2示出由ELISA測定的HIV-1gp120對gC1q-R的結合，Y軸代表以450nm處OD表示的HIV-1gp120與gC1q-R的反應性，X軸是溶液中HIV-1gp120的濃度。
圖3A示出在CEM-SS細胞中gC1q-R對HIV-1IIIB的感染性的中和作用；其中Vn是在雙份測試孔中的合胞體的平均數，Vo是在雙份對照孔中的合胞體的平均數。
圖3B示出在CEM-SS細胞中gC1q-R對HIV-1MN的感染性的中和作用；其中Vn是在雙份測試孔中的合胞體的平均數，Vo是在雙份對照孔中的合胞體的平均數。
圖3C示出在CEM-SS細胞中gC1q-R對HIV-1RF的感染性的中和作用；其中Vn是在雙份測試孔中的合胞體的平均數，Vo是在雙份對照孔中的合胞體的平均數。
圖4示出gC1q-R對HIV-1IIIB感染的H9細胞與CD4+-Hela細胞的融合的抑制作用。
圖5示出由流式細胞術測定的大腸桿菌表達的純化的gC1q-R與HIV-1IIIB感染的H9細胞的結合。
圖6示出在ELISA中C1q對HIV-1gp120與gC1q-R結合的作用，用實心圓繪制的線代表C1q，用實心方塊繪制的線代表gC1q-R，Y軸代表以450nm處OD表示的gp120與gC1q-R的反應性，X軸是溶液中C1q和gC1q-R的濃度。
圖7示出HIV-1gp120作為ELISA中的固相抗原與各種形式的大腸桿菌表達的gC1q-R的反應性，用實心方塊繪制的線代表gC1q-R的全長成熟形式(1-209a.a.)；用實心圓繪制的線代表截短的gC1q-R(58-209a.a.)，即缺失N-末端57個氨基酸的gC1q-R；用實心三角形繪制的線代表N-末端構建物，gC1q-R(1-94a.a.)；用實心倒三角形繪制的線代表C-末端構建物，gC1q-R(95-209a.a.)。Y軸代表以450nm處OD表示的HIV-1gp120與各種形式的gC1q-R的反應性，X軸是溶液中gp120的濃度。
圖8示出抗體99-12-1對gC1q-R肽LM12DN的結合，用實心方塊繪制的線代表肽LM12DN，用實心圓繪制的線代表肽TD18EE，Y軸代表以450nm處OD表示的99-12-1與肽的反應性，X軸代表溶液中99-12-1的濃度。
圖9示出抗gC1q-R單克隆抗體99-12-1對gC1q-R結合HIV-1gp120的競爭。
圖10示出抗HIV-1gp120抗體G3-299和6205對HIV-1gp120結合gC1q-R的競爭。用實心圓繪制的線代表抗HIV-1gp120 C4區(qū)G3-299；用實心方塊繪制的線代表多克隆綿羊抗體6205，其特異性抗HIV-1gp120 C5區(qū)肽(HXB2R的氨基酸殘基數497-511，SEQ ID NO10)；用實心三角形繪制的線代表重組可溶性CD4(rsCD4)。
圖11示出gC1q-R與HIV-1gp120 C4區(qū)肽RC12LT，TG12NN和RC16GG的反應性。用實心三角形繪制的線代表RC16GG；用實心圓繪制的線代表TG12NN；用實心方塊繪制的線代表RC12LT。Y軸代表以450nm處OD表示的gC1q-R與肽的反應性，X軸代表溶液中gC1q-R的濃度。
完成和使用本發(fā)明A.gC1q-R肽gC1q-R的完整核苷酸序列和推導的氨基酸序列示于SEQ ID NO1，在大腸桿菌中表達并用于免疫和下述其它實施例的重組gC1q-R是起自SEQ ID NO1中74位氨基酸殘基亮氨酸的完整C-末端區(qū)段，這一區(qū)段代表已鑒定的gC1q-R的可溶性成熟蛋白。N-末端區(qū)段可能代表前蛋白原中的疏水性膜錨。
包括SEQ ID NO1的氨基酸殘基239-250的肽區(qū)段被鑒別為結合gp120的活性結合位點，其是基于下述實施例10中討論的抗gC1q-R單克隆抗體99-12-1(其結合SEQ ID NO2的肽)對gp120結合gC1q-R的競爭抑制而得出的結論。
gC1q-R結合gp120的活性結合位點可以表達為獨立的肽(以下稱為“gp120結合位點”)，或者表達為包括gp120結合位點的任何較長的肽(如代表完整gC1q-R序列的肽)(見下述實施例1)，或者gp120結合位點或這種較長的肽可以與另一種載體蛋白如匙孔嘁血藍蛋白(KLH)或另一種增強其免疫原性的載體分子連接，或者gp120結合位點可以與能產生免疫原性構型的肽或分子結合以增強其免疫原性，或者一種與gp120結合位點結構上或免疫學上等價的肽也可用于同樣目的(所有這種肽以下均稱為“gp120結合位點肽”)。
gp120結合位點肽可用在診斷分析中以檢測或定量HIV-1gp120，HIV-1病毒顆?；蛘逪IV-1感染的細胞，這種診斷分析可以使用標準的分析程序，如酶聯免疫吸附測定(ELISA)。在ELISA中，gp120結合位點肽可以固定于惰性固相基質或磁珠上，這種固定可以直接進行或通過交聯劑或特異結合試劑間接固定。然后將生物學體液試樣與包被的基質溫育，與gp120結合位點肽反應的游離的HIV-1gp120分子或攜帶gp120分子的HIV-1病毒顆粒將結合到基質上，隨后可用單克隆或多克隆抗HIV-1抗體檢測結合的HIV-1gp120分子或HIV-1病毒顆粒，然后該單克隆或多克隆抗HIV-1抗體可與酶聯二級檢測抗體反應以用于基于顏色反應定量?；蛘撸东@的gp120或病毒顆?？梢杂闷渌侄卫鐭晒狻⒒瘜W發(fā)光、放射性計數或PCR檢測。
gp120結合位點肽還可用于通過直接或間接免疫化學程序檢測和定量患者血樣或其它樣品中的HIV-1感染的細胞。例如，在一種這樣的檢測中，將感染細胞與gp120結合位點肽接觸，然后用與其結合的抗體標記，這些檢測抗體可以直接或間接與一熒光探針綴合，然后通過在熒光顯微鏡下觀察細胞或通過流式細胞計量方法檢測免疫熒光?；蛘撸琯p120結合位點肽可直接用酶、放射性核素、熒光探針或生物素標記，與細胞結合的標記肽可隨后用相應的熟知方法檢測。
gp120結合位點肽或任何衍生產物如與毒素(例如，蓖麻毒蛋白A、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素A、商陸抗病毒蛋白)，高能放射核素(例如碘-131、銦-111和釔-90)，細胞毒藥物(如阿霉素)，細胞膜活性分子(例如磷脂酶、補體和皂苷)的綴合物，或者作為微載體(如脂質體)均可用于治療HIV-1疾病或防止HIV-1感染。已證明對應于gC1q-R成熟蛋白的完整序列的肽可中和HIV-1幾種趨異進化毒株的體外感染性并抑制CD4陽性細胞和被HIV-1IIIB感染的細胞之間形成合胞體。見下述實施例5和6。給予gp120結合位點肽預計能結合gp120并中和HIV-1，以及能防止HIV-1通過細胞-細胞融合(合胞體形成)感染其它細胞。這種給藥可以作為HIV-1疾病的治療方法或者可以在接觸HIV-1之前或接觸之后立即預防性給藥以防止或抑制HIV-1感染。在預防應用中，其可以作為預防措施給予高危人群，如靜脈藥物使用者以及護理工人?；蛘?，其可在針刺損傷后使用以防止感染，或者在即將出生前或出生后立即應用以防止母嬰HIV-1傳播。
gp120結合位點肽可以與固相基質綴合，這一修飾的基質可以體外(extracorporeally)應用以除去游離HIV-1病毒顆粒或者從HIV-1感染個體除去HIV-1感染細胞以降低病毒負載(load)。B.針對gC1q-R肽的抗體可以使用下述實施例2中描述的公知技術容易地制備抗gC1q-R的單克隆或多克隆抗體，這種單克隆抗體可以使用單價或多價gC1q-R或gp120結合位點肽作為免疫原產生。gC1q-R肽(gp120結合位點肽)還可用于在免疫接種和融合后篩選雜交瘤。另一種方法是使用gp120結合位點肽或能結合gp120 C4區(qū)的相關部分的等價肽與一或多種蛋白載體結合制備免疫原，優(yōu)選的蛋白載體是KLH、破傷風類毒素或卡介苗(BCG)，也可使用重組蛋白抗原如來自痘苗病毒、乙型肝炎病毒、腺病毒或流感病毒的那些。這些載體可以與gp120結合位點肽化學綴合，或者完整的載體-肽可以由重組宿主細胞表達。多克隆抗體可以用gp120結合位點肽或等價肽作為免疫原從動物(例如嚙齒類動物、綿羊、山羊、豚鼠、兔和非人靈長類動物)中產生(見下述實施例3)。
特異于gC1q-R的gp120結合位點的單克隆或多克隆抗體還可以用DNA免疫原如編碼gp120結合位點肽的脫氧寡核苷酸免疫動物而產生(J.J.Donnelly等，免疫學方法雜志1994；176145-152)。編碼gC1q-R的特異寡核苷酸可以與其它表達載體(例如痘苗病毒、乙型肝炎病毒、細胞肥大病毒、反轉錄病毒或腺病毒)構建在一起以用于增強表達和基因尋靶(targeting)?；蛘?，可以采用直接肌肉內注射、機械程序如包被有DNA的高速金微粒轉染表皮或者通過化學(例如磷酸鈣)或電學方法來自體內(ex vivo)轉染以將寡核苷酸插入宿主細胞用于表達抗原誘導特異抗體應答。
這種單克隆抗體或多克隆抗體有許多用途，通過使用上述免疫熒光測定或其它方法，它們可以用來檢測表達gC1q-R受體的細胞，如B細胞、T細胞、單核細胞/巨噬細胞、嗜中性白細胞、嗜伊紅性粒細胞、成纖維細胞、血小板以及內皮和平滑肌細胞。已證明與gC1q-R反應的單克隆抗體99-12-1與gp120競爭結合gC1q-R(見下述實施例11描述的實驗)，因此，它們還可用作HIV-1疾病的療法，或者如果在接觸HIV-1之前或之后立即預防給藥的話，可以防止或抑制HIV-1感染。
如果用于治療HIV-1疾病或防止人類感染，它們優(yōu)選以嵌合抗體、人源化抗體或人抗體形式應用。嵌合抗體采用本領域公知的重組方法生產，其具有動物可變區(qū)和人恒定區(qū)。人源化抗體比嵌合抗體具有更高程度的人肽序列，在人源化抗體中，只有負責抗原結合和特異性的互補決定區(qū)(CDR)來源于動物并具有相應于動物抗體的氨基酸序列，抗體分子的幾乎所有其余部分均來源于人并對應于人抗體的氨基酸序列，見L.Riechmann等，自然1988；332323-327；G.Winter，美國專利5,225,539；C.Queen等，國際專利WO90/07861。
人抗體可通過幾種不同途徑制備，包括使用人免疫球蛋白表達文庫(StratagenCorp.，La Jolla，California)生產人抗體的片段(VH、VL、FV、Fd、Fab、或F(ab’)2)，并使用類似于生產嵌合抗體的技術將這些片段構建成完整人抗體。人抗體還可以在攜帶人免疫球蛋白基因組的轉基因小鼠中生產，該轉基因小鼠由GenPharm Internatioanal(Mountain View，California)生產。將動物用gp120結合位點肽免疫接種，可以在接受該免疫原的免疫接種者體內發(fā)現抗gp120結合位點肽的人抗體?？梢詮墓w的B細胞開發(fā)雜交瘤或EBV轉化的B細胞系。人抗體還可通過聯合文庫(combinatorial library)方法(T.A.Collet等，美國國家科學進展1992；8910026-10030)使用編碼抗gp120結合位點肽抗體的重鏈和輕鏈的mRNA產生。
或者，還可制備一種單肽鏈結合分子，該分子中重鏈和輕鏈Fv區(qū)連接在一起(J.S.Huston等，美國國家科學進展1983；855879-5883)。所有的完整或部分人抗體的免疫原性均比完整鼠單克隆抗體的免疫原性低，片段或單鏈抗體也是低免疫原性的，因此，所有這些類型的抗體不容易激發(fā)免疫或過敏應答。所以，它們比完整動物抗體更適合在人類中體內給藥，特別是當需要重復或長期給藥時。
抗gp120結合位點肽的抗體可以注射進動物(例如小鼠)以產生抗獨特型單克隆抗體，這些抗獨特型抗體可以模擬原始抗原并因此可用作免疫原以產生針對gp120結合位點肽的抗體，或者作為gC1q-R阻斷HIV-1感染。C.HIV-1gp120肽與gC1q-R結合通過下述實施例13的方法證明了一種具有HXB2R株的HIV-1gp120氨基酸殘基444-459的序列(SEQ ID NO3所示)的重組肽能結合gC1q-R，這一肽區(qū)段位于gp120中稱為C4的區(qū)域內(C.K.Leonard等，生物化學雜志1990；26510373-10382)，這一肽以下稱為“gC1q-R結合位點肽”。這種肽或者含有這種肽的較長肽或具有結合gC1q-R能力的等價肽可以用作免疫原以產生靶向這一gp120區(qū)域的單克隆或多克隆抗體。
如上所述，具有SEQ ID NO3所示序列的重組肽或者含有這種肽的較長肽或具有結合gC1q-R能力的等價肽，或者其它基于這種肽的其它免疫原(例如，通過將這些肽與優(yōu)選的載體蛋白如KLH、破傷風類毒素或BCG綴合制備的免疫原，或者將這些肽作為免疫原結構如缺陷型或減毒型乙型肝炎病毒、腺病毒或流感病毒的一部分而制備的免疫原)可以用作抗HIV-1的疫苗。這些載體可以與gp120結合位點肽化學綴合，或者完整的載體-肽可以從重組宿主細胞表達。當用作疫苗時，它們將內源產生抗體，產生的抗體將結合gp120的gC1q-R結合位點并中和HIV-1，或者它們將與HIV-1感染的細胞結合以抑制通過細胞-細胞融合而進行的病毒傳播或者通過依賴于抗體的細胞毒性(ADCC)或補體介導的細胞溶解(CMC)殺死感染的細胞。
特異于gp120結合gC1q-R的結合位點的單克隆或多克隆抗體還可通過用編碼gC1q-R結合位點肽的脫氧寡核苷酸作為DNA免疫原免疫動物而產生(J.J.Donnelly等，免疫學方法雜志1994；176145-152)。編碼gp120這一部分的特異性寡核苷酸可以與其它表達載體(如痘苗病毒、乙型肝炎病毒、細胞肥大病毒、反轉錄病毒或腺病毒)構建在一起以增強表達和基因尋靶。或者，可以采用直接肌肉內注射、機械程序如包被有DNA的高速金微粒轉染表皮或者通過化學(例如磷酸鈣)或電學方法來自體內(ex vivo)轉染以將寡核苷酸插入宿主細胞用于表達抗原誘導特異抗體應答。D.HIV-1gp120肽的抗體SEQ ID NO3代表的gC1q-R結合位點肽的單克隆抗體可以用常規(guī)技術產生，方法是用gp120或這種肽或上述免疫原免疫動物(如嚙齒類或非人靈長類)。也可以如上所述用公知的技術產生多克隆抗體。
gC1q-R結合位點肽(在gp120的C4區(qū))的單克隆抗體或多克隆抗體也可以如上所述用編碼這一區(qū)或較長區(qū)域的寡核苷酸作為DNA免疫原或疫苗在動物或人中產生。
這些單克隆抗體或多克隆抗體可以用于在一診斷分析中檢測或定量HIV-1gp120、HIV-1病毒顆?；騂IV-1感染的細胞，這種診斷分析可以采用標準的分析如ELISA。ELISA如上述用于gp120結合位點肽的類似方式進行，只是將抗HIV-1gp120抗體而不是這些肽固定在惰性固相基質或磁珠上。然后將生物學體液樣品與這些包被的基質一起溫育，與抗體反應的HIV-1gp120或攜帶gp120分子的HIV-1病毒顆粒將結合到基質上。隨后用其它的單克隆或多克隆抗HIV-1抗體檢測結合的病毒顆?；騡p120，而所用的抗體隨后可與酶聯二級檢測抗體反應以基于顏色反應定量。或者，捕獲的gp120或HIV-1病毒顆?？梢杂闷渌椒z測，如熒光法、化學發(fā)光法或PCR。
這些抗體還可用于通過直接或間接免疫熒光程序檢測和定量或者血樣中的HIV-1感染的細胞，如上述用于檢測gp120結合位點肽的程序。這些抗體還可直接用酶、放射核素、熒光探針或生物素標記，隨后可用已知方法檢測與細胞結合的標記抗體。
針對HIV-1gp120區(qū)的C4區(qū)的這一gC1q-R結合位點的抗體還可以潛在地用于治療HIV-1疾病或防止HIV-1感染。它們可以單獨應用或與其它抗HIV-1中和抗體、重組可溶性CD4、抗反轉錄病毒藥物或細胞因子聯合應用。這些抗體預計是中和性的，因為一旦與gp120結合后，它們將抑制gp120與gC1q-R結合從而防止對靶細胞的后續(xù)感染。當用于治療或防止HIV-1感染時，這些抗體可以是嵌合的、人源化的或人抗體形式，產生這些形式抗體的方法如上所述。另外，可以用gC1q-R結合位點肽免疫帶有人免疫球蛋白基因組的轉基因小鼠以生產人抗體，或者可以在HIV-1感染的個體或接種含gC1q-R結合位點肽的接種者體內發(fā)現抗gp120 C4區(qū)的人抗體。可以從這些供體的B細胞開發(fā)雜交瘤或EBV轉化的B細胞系。人抗體還可通過聯合文庫(combinatorial library)方法(T.A.Collet等，美國國家科學進展1992；8910026-10030)使用編碼抗C4抗體的重鏈和輕鏈的mRNA產生，這些mRNA可以從HIV-1感染的個體或如上所述的疫苗接種者的B細胞得到。
單克隆抗體或多克隆抗體可以以綴合物或微載體(如脂質體)的形式用于制導細胞毒性因子以殺死感染細胞，綴合的因子可以是例如毒素、細胞毒藥物、膜活化酶或化學品以及高能放射核素。
針對gp120上的gC1q-R結合位點的抗體可以與固相基質綴合，這些修飾后的基質可以體外應用除去游離HIV-1病毒顆?；驈腍IV-1感染個體中除去HIV-1感染細胞以降低病毒負載。
針對gp120上的gC1q-R結合位點的抗體可以通過與帶有不同特異性(例如針對細胞表面標記或HIV-1抗原)的另一種抗體結合而修飾，這種雙特異性抗體可以通過化學綴合(S.A.Kostelny等，免疫學雜志1992；1481547-1553；A.Mabondzo等，感染疾病雜志1992；16693-99)或兩個雜交瘤的融合(S.M.Chamow等，免疫學雜志1994；1534268-4280)而產生。
gC1q-R結合位點肽的抗體可以注射給動物(例如小鼠)以產生抗獨特型單克隆抗體，抗獨特型單克隆抗體可以模擬用于產生靶抗體的原始抗原，并因此可用作免疫原以產生針對gC1q-R結合位點的抗體。
以下描述本發(fā)明的實施例以及其應用性的例證。
實施例1 在大腸桿菌中表達gC1q-R蛋白A.分離RNA和制備cDNA根據廠商建議(Biotecx，Houston，Texas)通過RNA-ZOL抽提法從5×106個DAKIKI細胞中分離總RNA。在一含有50mMTris-HCl(pH8.3)和20單位RNASIN(Promega，Madison，Wisconsin)，0.5mM每種dATP，dTTP，dCTP，dGTP，10μM寡dT和2單位AMV反轉錄酶(Gibco BRL，Gaithersburg，Maryland)的反轉錄反應混合物中將10微克RNA用作模板制備cDNA的第一鏈。反應在42℃進行1小時。
B.PCR擴增編碼成熟全長gC1q-R蛋白(SEQ ID NO1的74位亮氨酸至282位谷氨酰胺)的gC1q-R cDNA用于PCR的兩個引物的序列來自gC1q-R cDNA基因(A.R.Krainer等，細胞1991；66383-394)，引物1加有一NdeI限制位點，引物2加有一PstI限制位點(引物1，SEQ ID NO4 TACATATGCTGCACACCGACGGAGAC；引物2，SEQ ID NO5 GCCCTGCAGCATCTGTCTGCTCTA)。在50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.01％明膠，0.2mM每種dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.5mM每種引物，2μl反轉錄反應混合物和1單位Taq DNA聚合酶(美國生物化學品公司，Cleveland，Ohio)中進行PCR，PCR在GeneAmp9600(Perkin Elmer，Norwalk，Connecticut)上于94℃(1分鐘)、55℃(2分鐘)和72℃(2分鐘)進行40個循環(huán)。
C.構建gC1q-R表達載體并在大腸桿菌中表達全長成熟重組蛋白通過NdeI和PstI雙酶切消化將gC1q-R cDNA片段克隆到pT7-7載體(美國生物化學品公司)中(圖1)，宿主大腸桿菌是BL21。克隆的基因在強T7啟動子的控制之下并由1mM IPTG誘導表達。
D.表達截短的gC1q-R重組蛋白如圖1所示產生帶有截短的N-末端部分的重組gC1q-R，稱為gC1q-R(C)。通過EcoRI和BstXI限制酶消化從pT7-7/gC1q-R表達載體除去編碼N-末端部分的基因片段。gC1q-R(C)含有SEQ ID NO1的168位苯丙氨酸至282位谷氨酰胺之間的肽片段。載體的末端用T4 DNA聚合酶補平并用T4 DNA連接酶重新連接。肽gC1q-R(C)在BL21細胞中以與全長gC1q-R相同的方式表達。
如圖1所示產生帶有截短的C-末端部分的重組gC1q-R，稱為gC1q-R(N。gC1q-R(N)含有SEQ ID NO1的74位亮氨酸至167位天冬氨酸之間的肽片段。通過BstXI和PstI限制酶消化從pT7-7/gC1q-R表達載體除去編碼C-末端部分的基因片段。載體的末端用T4 DNA聚合酶補平并用T4 DNA連接酶重新連接。肽gC1q-R(N)在BL21細胞中以與全長gC1q-R相同的方式表達。
如圖1所示產生帶有N-末端57個氨基酸被截短的重組gC1q-R，稱為gC1q-R(δ1-57)。gC1q-R(δ1-57)含有SEQ ID NO1的131位纈氨酸至282位谷氨酰胺之間的肽片段。該基因片段首先用PCR合成，在PCR中使用全長gC1q-R cDNA作模板，兩個引物為引物2，SEQ ID NO5和序列為AAGAATTCCGGTCACTTTCAACATT的引物3(SEQ ID NO6)，PCR的反應條件與上述相同，只是擴增循環(huán)減少至25個。將PCR擴增的DNA片段克隆到pT7-7載體的EcoRI和PstI位點。肽gC1q-R(δ1-57)在BL21細胞中以與全長gC1q-R相同的方式表達。
E.從大腸桿菌中生產和純化gC1q-R培養(yǎng)表達gC1q-R的大腸桿菌并收獲，在Tris緩沖液中超聲處理，離心裂解物并將上清對含20mM HEPES，0.1M KCl，0.5％甘油，0.2mM EDTA和1mM二硫蘇糖醇pH8.0的緩沖液透析。將透析的樣品上樣到預平衡的Fast Q離子交換柱(Pharmacia Biotechnology，Piscataway，New Jersey)。用含20mM HEPES和1MKCl pH8.0的緩沖液洗脫結合的蛋白。收集經SDS-PAGE和經測定與重組gp120的反應性的Western免疫印跡分析測試呈gC1q-R陽性的組分。合并的組分進一步在Sephracryl 200凝膠過濾柱(Pharmacia Biotechnology)上純化。最終物質的純度經SDS-PAGE測定，其與gp120的結合活性經ELISA測定(見下述實施例4)。實施例2 制備抗gC1q-R肽的單克隆抗體用在200μl PBS中的100μg在弗氏完全佐劑(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)中的大腸桿菌表達的純gC1q-R皮下注射12周齡的雄性BALB/cJ小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine)。一個月后，用100μg在弗氏不完全佐劑中的gC1q-R皮下注射小鼠。一個月后再次用100μg在弗氏不完全佐劑中的相同抗原皮下注射小鼠，三天后處死。對每一融合，從免疫小鼠的脾制備單細胞懸液并用于與Sp2/0骨髓瘤細胞融合。將5×108個Sp2/0細胞與5×108個脾細胞在含50％聚乙二醇(分子量1450)(Kodak，Rochester，New York)和5％二甲亞砜(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)的培養(yǎng)基中融合。然后在補加10％胎牛血清、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.1mM次黃嘌呤、0.4μM氨基喋呤和16μM胸腺嘧啶的Iscove培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NewYork)中將細胞調整至每200μl懸液含1.5×105個脾細胞。將200微升細胞懸液加到約20個96孔微培養(yǎng)板的每個孔中。培養(yǎng)約10天后，取上清在每孔用50×103個DAKIKI細胞預包被的Immulon 1微測試板(Dynatech Laboratories，Alexandria，Virginia)上經ELISA篩選。DAKIKI細胞經測定在表面豐富表達gC1q-R。簡而言之，向用于DAKIKI細胞包被的微測試板的孔中加入200μl在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的5％BLOTTO(脫脂奶粉)以封閉非特異性位點。1小時后用緩沖液PBST(含0.05％Tween 20的PBS)洗孔。從每一融合孔中收集50微升培養(yǎng)物上清并與50μl BLOTTO混合然后加入到微測試板的各個孔中。溫育1小時后用PBST洗孔。然后通過與在BLOTTO中以1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，Pennsylvania)反應而檢測與細胞結合的鼠抗體。向孔中加入含1.1％3’，3’，5’，5’四甲基聯苯胺(Sigma)和0.0003％過氧化氫的過氧化物酶底物溶液以顯色。每孔加入50μl 2M H2SO4而終止反應。反應混合物在450nm的光密度(OD)用BioTek ELISA閱讀儀(BioTek Instruments，Winooski，Vermont)讀出。
在ELISA中還測試了那些陽性孔中的培養(yǎng)物上清與重組gC1q-R的反應性。簡而言之，向Immulon 2(Dynatech Laboratories)微測試板的孔中加入50μl濃度為1μg/ml的大腸桿菌表達的gC1q-R，室溫過夜。在輕彈板除去包被溶液后，向每孔中加入200μl BLOTTO保溫1時以封閉非特異性位點。然后用PBST洗孔，如上所述檢測結合的鼠抗體。通過有限稀釋克隆那些陽性孔中的細胞，并再次測試這些克隆在ELISA中與gC1q-R的反應性。選定的雜交瘤在旋動瓶中培養(yǎng)并收集培養(yǎng)物上清通過蛋白A親和層析純化抗體。測試一種如此產生的針對gC1q-R的單克隆抗體99-12-1以確定其是否與HIV-1gp120競爭結合gC1q-R(見下述實施例11)。實施例3 制備抗gC1q-R的多克隆抗體用100μg在弗氏完全佐劑中的大腸桿菌表達的純gC1q-R(DifcoLaboratories)皮下免疫接種約15周齡的兩只雄性新西蘭白兔。兩周后用同樣量的在弗氏不完全佐劑中的抗原對它們再次注射。兩周后再次重復同樣的免疫接種。從免疫動物收集血清并如上所述在ELISA中測試其與gC1q-R的反應性，只是使用在BLOTTO中以1∶2000稀釋的HRP綴合的驢抗兔IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，)檢測結合的抗體。使用有較高血清學應答的動物收集血清。通過使用gC1q-R偶聯的Affigel 102(BioRad Laboratories)的親和柱純化多克隆兔抗gC1q-R免疫球蛋白。實施例4 在ELISA中HIV-1IIIB gp120與大腸桿菌表達的gC1q-R的結合用100μl大腸桿菌表達的gC1q-R(5μg/ml于0.1M乙酸鈉緩沖液pH6中)包被Immulon 2板的孔并在室溫溫育過夜。在室溫用封閉緩沖液PBSTB(含2％牛血清白蛋白的PBST)處理孔1小時并用PBST洗后，以雙份向相應孔中加入100μl系列稀釋的桿狀病毒表達的HIV-1IIIB gp120(美國生物技術公司，坎布里奇，馬薩諸塞州)(從2μg/ml至0.016μg/ml)并于室溫反應1小時，然后如前所述洗孔。用以1∶2000稀釋的與HRP綴合的抗HIV-1gp120 V3功能域小鼠單克隆抗體BAT123檢測結合的gp120。經測試該抗體與SEQ ID NO7所示的gp120中的肽片段(HXB2R毒株的氨基酸殘基號308-322)反應，并且不干擾gC1q-R和gp120之間的結合。向每孔中加入100微升稀釋的綴合物并于室溫反應1小時，然后洗孔并向每孔中加入200μl過氧化物酶底物溶液以顯色30分鐘。通過加入50μl 2M H2SO4終止反應，并用BioTek ELISA閱讀儀在450nm測定OD。通過將加入gp120的測試孔的OD減去未加gp120的對照孔的OD得出特異性反應性。
結果示于圖2，其中可看出當gp120濃度增加時，gp120與恒定量的固定化重組gC1q-R的結合以S型方式增加，這顯示出gp120與gC1q-R的劑量依賴性結合。因為抗gp120 V3區(qū)抗體BAT123仍能和與gC1q-R結合的gp120反應，其證明gC1q-R與gp120的結合不涉及如SEQ ID NO7所示的gp120的V3區(qū)。實施例5 HIV-1中和分析為測試gC1q-R對HIV-1感染性的抑制活性，如P.L.Nara等所述(AIDS研究，人類反轉錄病毒1987；3283-302)用CEM-SS細胞作為靶細胞進行合胞體形成微量分析。簡而言之，將50μl稀釋的大腸桿菌表達的gC1q-R與50μl含有200個HIV-1IIIB、HIV-1MN或HIV-1RF合胞體形成單位(SFU)的病毒培養(yǎng)物上清混合，并在室溫溫育1小時。將混合物加入到含5×104個DEAE-葡聚糖處理的CEM-SS細胞的微培養(yǎng)孔中，將該細胞培養(yǎng)物在5％CO2中于37℃保持3-4天。在倒置顯微鏡下計數合胞體。中和活性以IC50表示，其定義是達到50％感染抑制時所需的濃度(即Vn/Vo＝50％)，其中Vn是在測試孔中的SFU，Vo是在不加測試抗體的對照孔中的SFU。
結果示于圖3A、3B和3C，可以看出gC1q-R中和HIV-1IIIB、MN和RF的IC50分別是4.3，13.5和1.65μg/ml。這些中和資料提示gC1q-R可以寬范圍地抑制各種不同HIV-1提取物的感染性。實施例6 分析對合胞體形成的抑制活性用HIV-1感染的H9細胞和表達CD4的HeLa細胞研究gC1q-R對通過細胞-細胞融合的HIV-1傳播的作用，這兩種細胞接觸后融合并在培養(yǎng)物中形成合胞體。HeLa是人癌細胞系，HeLa-CD4+在其基因組內含有由轉染而導入的CD4 DNA，它在其細胞表面表達CD4抗原。在本研究中使用的程序與P.J.Madden等，細胞1986；47333-348中所述的類似。簡要地說，將HeLa-CD4+細胞以1×105個細胞/孔在24孔微培養(yǎng)板上鋪板，溫育板36小時，此時單層上皮細胞幾乎鋪滿。當向亞鋪滿的HeLa-CD4+細胞中加入1×104個感染的H9細胞時，細胞形成接觸并融合，8小時后形成多核巨細胞(合胞體)。帶有多于5個核的那些合胞體很容易識別并計數，提供了合胞體形成的定量檢測。當研究大腸桿菌表達的純gC1q-R對合胞體形成的作用時，將不同濃度的gC1q-R與感染的H9細胞混合并加到HeLa-CD4+細胞中。每孔中的最終培養(yǎng)基體積為1ml。在37℃于5％CO2中溫育8小時后，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗孔，用甲醇固定，空氣干燥并用在甲醇中的0.1％亞甲藍染色。在100倍放大倍數下檢查細胞，以在4個隨機選擇的區(qū)域上的平均值確定合胞體(含有多于5個核)的數目。合胞體形成的抑制百分率以與對照相比在加入gC1q-R的孔中的合胞體數的減少而計算。
圖4所示的結果證實重組gC1q-R抑制HIV-1IIIB感染的H9細胞和CD4+-HeLa細胞之間的融合，其IC50為21μg/ml。實施例7 由流式細胞計量術測量的gC1q-R與HIV-1IIIB感染的H9細胞的結合通過間接免疫熒光流式細胞計量術分析大腸桿菌表達的純gC1q-R與HIV-1IIIB感染的H9細胞表面表達的gp120之間的結合。將50微升感染的細胞(10×106個細胞/ml PBSB(含有1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水pH7.4))與系列濃度的大腸桿菌表達的純gC1q-R在冰上混合30分鐘。然后在相同緩沖液中洗細胞1次，300×g離心5分鐘，將細胞沉淀重懸于50μl相同緩沖液中并加入50μl濃度為5μg/ml的親和純化的兔抗gC1q-R在冰上反應30分鐘。然后如前所述洗細胞并加入50μl 1∶40稀釋的熒光素綴合的驢抗兔IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories)，并置于冰上30分鐘。隨后洗細胞，在1％低聚醛中固定并用Coulter EPIC細胞分析儀(Coulter Electronics，Hialeah，Florida)分析。在對照中，只使用兔抗gC1q-R和/或熒光素綴合的驢抗兔IgG。特異細胞染色的計算是將試驗的細胞結合百分率減去對照的細胞結合百分率，后者設定為10％。還測試了未感染的H9細胞作為結合研究的陰性對照。
結果顯示重組gC1q-R以劑量依賴形式與HIV-1IIIB感染的H9細胞結合(圖5)，但不與未感染的H9細胞結合。實施例8 C1q對ELISA中HIV-1gp120與gC1q-R結合的影響為測試天然配體C1q是否與gp120共有結合gC1q-R的結合位點，通過ELISA研究C1q對HIV-1gp120與gC1q-R結合的影響。用50μl在0.1M乙酸鈉緩沖液中的濃度為5μg/ml的大腸桿菌表達的純gC1q-R包被Immulon 2的孔并在室溫溫育過夜，然后用200μl封閉/稀釋緩沖液PBSTB在室溫封閉孔1小時。用PBST洗孔后，在用封閉/稀釋緩沖液系列稀釋的大腸桿菌表達的gC1q-R或從人血清純化的C1q(Quidel，San Diego，California)的存在和不存在下，向每孔中加入50μl濃度為0.2μg/ml的桿狀病毒表達的HIV-1IIIB gp120，在室溫溫育孔1小時后洗孔。向每孔中加入50μl在封閉/稀釋緩沖液中1∶2000稀釋的HRP綴合的單克隆抗體BAT123，并在室溫溫育1小時，然后洗板，如上所述加入過氧化物酶底物溶液顯色。通過將加gp120的測試孔的OD減去不加gp120的對照孔的OD得到特異反應性。
結果如圖6所示，其中實心圓劃線代表C1q，實心方塊劃線代表gC1q-R。C1q不與gp120競爭結合gC1q-R，而gC1q-R如所預期的競爭。結果顯示gp120在gC1q-R上的結合位點不同于C1q在gC1q-R上的結合位點，它們互不干擾。這是一個非常重要的發(fā)現，因為當將gC1q-R給予HIV-1感染的個體時或給予接觸過HIV-1的人時，在血中存在的大量的C1q不會干擾gC1q-R與病毒顆粒上或感染細胞上的HIV-1gp120的結合。另外，gC1q-R同時結合C1q和gp120的能力是顯著而有益的，因為gC1q-R可能可以介導激活補體經典途徑以裂解HIV-1病毒顆粒和HIV-1感染的細胞。實施例9 HIV-1gp120與gC1q-R的不同重組構建物的反應性為定位gC1q-R上供HIV-1gp120結合的位點，制備各種長度的gC1q-R重組構建物用于ELISA。用100μl在0.1M乙酸鈉緩沖液(pH6)中的濃度為5μg/ml的大腸桿菌表達的純全長gC1q-R(1-209a.a.)、gC1q-R(58-209a.a.)、gC1q-R(1-94a.a.)或gC1q-R(95-209a.a.)包被Immulon 2的孔并在室溫溫育過夜，用封閉/稀釋緩沖液PBSTB在室溫處理孔1小時并用PBST洗后，以雙份向相應的孔中加入100μl系列稀釋的桿狀病毒病毒的HIV-1IIIB gp120(美國生物技術公司)(從2μg/ml至0.016μg/ml)，在室溫反應1小時，然后如前所述洗孔。通過加入100μl 1∶2000稀釋的HRP綴合的單克隆抗體BAT123在室溫保溫1小時而檢測結合的gp120，然后洗孔，并向每孔中加入200μl過氧化物酶底物溶液顯色30分鐘。加入50μl 2M H2SO4終止反應，并用BioTek ELISA閱讀儀在450nm測量OD。通過將加gp120的測試孔的OD減去不加gp120的對照孔的OD得到特異反應性。
結果如圖7所示，其中實心方塊劃線代表全長gC1q-R(1-209a.a.)，實心圓劃線代表gC1q-R(58-209a.a.)，實心三角代表gC1q-R(1-94a.a.)，實心倒三角代表gC1q-R(95-209a.a.)。gp120與gC1q-R(1-209a.a.)、gC1q-R(58-209a.a.)和gC1q-R(95-209a.a.)結合，而不與gC1q-R(1-94a.a.)結合。因此，結果提示gC1q-R上與gp120結合的位點位于其C-末端部分，這一觀察與圖6所示的結果一致，即gp120結合位點與C1q結合位點截然分開，C1q結合位點位于gC1q-R的N-末端肽片段，如SEQ ID NO8所示(B.Ghebrehiwet等，實驗醫(yī)學雜志1994；1791809-1821)。這一肽片段等價于SEQ ID NO1的氨基酸殘基76-93。實施例10 肽作圖定位gC1q-R上用于結合99-12-1的功能域為定位gC1q-R上結合99-12-1的表位，使用多針肽合成(MultipinPeptide Synthesis)技術(H.M.Geysen等，科學1987；2351184-1190)。在一96孔微測試板矩陣的塑料針上以系列方式獨立合成41個12聚體肽，該41個肽包括了完整的gC1q-R序列(相鄰的肽以7個氨基酸互相重疊)。該套肽由Chiron Mimotopes PTY.LTD.，Clayton，Victoria，澳大利亞商業(yè)合成。
使用這一多針肽系統定位表位的程序類似于廠商說明書。簡而言之，首先用含有在PBS中的2％牛血清白蛋白和0.1％Tween 20的預包被緩沖液在室溫處理針1小時，然后將針插入含有在預包被緩沖液中的濃度為2μg/ml的抗體99-12-1的96孔微測試板的孔中，在室溫進行1小時溫育。在PBST中洗針(洗3次，每次10分鐘)，然后在含有1∶4000稀釋的100μl HRP綴合的山羊抗小鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)的96孔微測試板的孔中室溫溫育1小時。如前所述洗針后，將針放入含有2，2’-連氮-雙[3-乙基苯并噻唑啉-b-磺酸]二銨(ABTS)和H2O2的過氧化物酶底物溶液(Kirkegaard & PerryLaboratories Inc.，Gaithersburg，Maryland)的孔中室溫保溫30分鐘以顯色。通過BioTek ELISA讀板儀在405nm讀板，對比492nm波長處的背景吸收。顯色的孔指示在這些孔中gC1q-R衍生的肽與99-12-1的反應性。
表位定位的結果顯示99-12-1與SEQ ID NO2的肽結合。
為證實99-12-1的結合表位，在ELISA中測試SEQ ID NO2的肽LM12DN結合99-12-1的能力。使用以前確定的是結合C1q的位點的SEQ IDNO8的肽(肽TD18EE)作為陰性對照。使用廠商建議的9-芴甲氧羰基合成程序通過自動肽合成儀(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，California)合成肽LM12DN和TD18EE。在肽ELISA中，用50μl 1μg/ml的肽LM12DN或TD18EE包被Immulon 2微測試板的孔，于室溫過夜包被。通過輕振板除去包被溶液后，向每孔中加入200μl PBSTB以在室溫飽和非特異性位點1小時，然后用PBST洗孔。以雙份向孔中加入50微升在PBSTB中系列稀釋的99-12-1，室溫保溫1小時，之后再次洗板。向每孔中加入1∶2000稀釋的50μl HRP綴合的山羊抗小鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，室溫保溫1小時。之后洗孔，如上所述加入過氧化物酶底物顯色。用ELISA閱讀儀在450nm讀板，將加入99-12-1的測試孔的OD減去對照孔的OD得到特異反應性。
結果示于圖8，其中實心方塊劃線代表肽LM12DN，實心圓劃線代表肽TD18EE。99-12-1與肽LM12DN(SEQ ID NO2)以劑量依賴方式結合，但99-12-1不與肽TD18EE(SEQ ID NO8)結合。實施例11 在ELISA中抗gC1q-R單克隆抗體99-12-1對HIV-1gp120與gC1q-R結合的競爭用50μl在0.1M乙酸鈉緩沖液(pH6)中的5μg/ml大腸桿菌表達的純gC1q-R于室溫過夜包被Immulon 2微測試板的孔，然后用200μl封閉/稀釋緩沖液PBSTB在室溫封閉孔1小時，之后用PBST洗。在用封閉/稀釋緩沖液系列稀釋的99-12-1的存在和不存在下，向每孔中加入50μl濃度為0.2μg/ml的桿狀病毒表達的HIV-1IIIB gp120，在室溫溫育孔1小時后洗孔。向每孔中加入50μl在封閉/稀釋緩沖液中1∶2000稀釋的HRP綴合的單克隆抗體BAT123，并在室溫溫育1小時，然后洗板，如上所述加入過氧化物酶底物溶液顯色。通過以加gp120和不加gp120的孔的OD之差計算99-12-1對gp120與gC1q-R結合的抑制。
圖9顯示99-12-1以劑量依賴的方式抑制gp120與gC1q-R的結合，提示99-12-1結合到gC1q-R上與gp120相互作用關鍵的位點上。這一位點如實施例10所述定位于SEQ ID NO2。實施例12 在ELISA中抗體G3-299和6205對HIV-1gp120與gC1q-R結合的競爭為有助于鑒別HIV-1gp120上的gC1q-R結合位點，設計一競爭ELISA以檢查各種抗HIV-1gp120抗體和重組可溶性CD4(rsCD4)對gp120p120與gC1q-R結合的作用。
用50μl在0.1M乙酸鈉緩沖液(pH6)中的5μg/ml大腸桿菌表達的純gC1q-R于室溫過夜包被Immulon 2微測試板的孔，然后用200μl封閉/稀釋緩沖液PBSTB在室溫封閉孔1小時。在用封閉/稀釋緩沖液系列稀釋的抗HIV-1 gp120抗體和rsCD4(Biogen，Boston，Massachusetts)的存在和不存在下，向每孔中加入50μl濃度為0.2μg/ml的桿狀病毒表達的HIV-1IIIB gp120，在室溫溫育孔1小時。所測的抗HIV-1 gp120抗體包括小鼠單克隆抗體G3-299(結合C4區(qū)(HXB2R毒株的氨基酸殘基號423-437)，如SEQ ID NO9所示)，綿羊抗HIV-1gp120 C5區(qū)抗體，6205(結合HXB2R毒株的氨基酸殘基號497-511的序列，如SEQ ID NO10所示)，和BAT085(結合HXB2R毒株的氨基酸殘基號169-183的V2區(qū)，如SEQ ID NO11所示)。G3-299和BAT085的性質以前已有描述(N.C.Sun等，病毒學雜志1989；633579-3585；M.S.C.Fung等，病毒學雜志1992；66848-856)?？贵w6205購自International Enzymes，Fallbrook，California。洗板后，向每孔中加入50μl在封閉/稀釋緩沖液中1∶2000稀釋的HRP綴合的單克隆抗體BAT123，并在室溫溫育1小時，然后洗板，如上所述加入過氧化物酶底物溶液顯色。通過以加和不加競爭劑的孔的OD之差計算抗HIV-1gp120抗體或4sCD4對gp120與gC1q-R結合的抑制。
結果如圖10所示，其中實心圓劃線代表抗gp120 C4區(qū)G3-299，實心方塊劃線代表多克隆綿羊抗gp120 C5區(qū)，6205，實心三角劃線代表rsCD4?？梢钥闯鯣3-299非常有效地競爭gp120與gC1q-R的結合，6205中度競爭，而rsCD4不是這樣。抗V2區(qū)的抗體BAT085也不抑制結合。總之，實施例4和實施例12的結果提示gC1q-R結合位點位于C4和C5區(qū)的附近，其與CD4結合位點截然分開。這一重要的發(fā)現提示gC1q-R和rsCD4可以聯合應用治療HIV-1感染，這樣可以擴大防止CD4陽性靶細胞和CD4陰性靶細胞感染的有效性。實施例13 肽作圖定位HIV-1gp120上結合gC1q-R的功能域為確定HIV-1gp120上結合gC1q-R功能域的肽表位，再次使用如上所述的多針肽合成技術。通過Chiron Mimotopes肽系統在一96孔微測試板矩陣的塑料針上合成94個12聚體肽，該94個肽包括了完整的HIV-1MN gp120序列(相鄰的肽以7個氨基酸互相重疊)，HIV-1MN gp120的氨基酸序列基于LosAlamos國立實驗室數據庫(G.Myers等，人反轉錄病毒和AIDS，1992)。定位表位的程序類似于上述實施例10所述。
用5μg/ml大腸桿菌表達的純gC1q-R與塑料針上的肽反應。洗針后，通過在室溫與親和純化的兔抗gC1q-R免疫球蛋白反應1小時檢測結合的gC1q-R。如前所述洗針，并與HRP綴合的驢抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)反應。顯色反應程序如前所述。
用覆蓋結合區(qū)的重疊合成肽作為ELISA中的包被抗原證實HIV-1gp120上的gC1q-R結合表位。HIV-1 HXB2R gp120重疊肽RC16GG(氨基酸殘基號444-459，如SEQ ID NO3所示)，RC12LT(氨基酸殘基號444-455，如SEQ ID NO12所示)，以及TG12NN(氨基酸殘基號450-461，如SEQID NO13所示)購自美國生物技術公司。用100μl 2μg/ml的相應肽在室溫過夜包被Immulon 2微測試板的孔，然后用200μl封閉/稀釋緩沖液PBSTB在室溫處理孔1小時，之后用PBST洗孔。以雙份向孔中加入不同濃度的大腸桿菌表達的純gC1q-R，在室溫反應1小時，然后如前所述洗板。向每孔中加入100微升2μg/ml的親和純化的兔抗gC1q-R免疫球蛋白，在室溫反應1小時，然后洗板。加入100微升稀釋的HRP綴合的驢抗兔IgG，室溫反應1小時，洗板。如前所述加入過氧化物酶底物溶液進行顯色反應。
結果如圖11所示，其中實心方塊劃線代表RC12LT，實心圓劃線代表TG12NN，實心三角劃線代表RC16GG?？梢钥闯鲋挥蠷C16GG與gC1q-R反應，這一結果與下列事實一致，即gp120上的gC1q-R結合位點位于SEQ ID NO3所示的肽片段中，即位于gp120的C4區(qū)。如實施例12所示，抗體G3-299可以有效地競爭gp120與gC1q-R的結合，可能是因為G3-299的結合位點(SEQIN NO9)與gC1q-R的結合位點(SEQ IN NO3)緊密相鄰。
應理解的是本文所述的術語、表達法和實施例僅僅是舉例性而非限制性的，本發(fā)明的范圍僅由權利要求書限定并包括所有等價物。
序列表(1)一般信息(i)申請人邁克爾·S·C·馮，比爾·N·C·孫，塞西莉·R·Y·孫，金泳宇，余立明(ii)發(fā)明名稱gC1q受體，與其結合的HIV-1gp120區(qū)以及相關肽和靶向抗體(iii)序列數13(iv)通訊地址(A)收信人Tanox Biosystems，Inc.
(B)街道10301 Stella Link Rd.
(C)城市休斯敦(D)州德克薩斯州(E)國家美國(F)郵碼77025(v)計算機可讀形式(A)媒介類型3.5英寸軟盤(B)計算機IBM PS/2(C)操作系統DOS 3.30(D)軟件Wordperfect 5.1(vi)當前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/410,360(B)申請日24/03/1995(viii)律師/代理人信息(A)姓名Mirabel，Eric P.
(B)注冊號31,211(C)案號/文檔號TNX95-1-PCT(ix)電訊信息(A)電話(713)664-2288(B)傳真(713)664-8914(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征；(A)長度1138個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO1CCGGCGGCGC CTCAGGTCGC GGGGCGCCTA GGCCTGGGTT 40GTCCTTTGCA TCTGCACGTG TTCGCAGTCG TTTCCGCG78ATG CTG CCT CTG CTG CGC TGC GTG CCC CGT GTG CTG GGC TCC TCC 123Met Leu Pro Leu Leu Arg Cys Val Pro Arg Val Leu Gly Ser Ser5 10 15GTC GCC GGC CTC CGC GCT GCC GCG CCC GCC TCG CCT TTC CGG CAG 168Val Ala Gly Leu Arg Ala Ala Ala Pro Ala Ser Pro Phe Arg Gln20 25 30CTC CTG CAG CCG GCA CCC CGG CTG TGC ACC CGG CCC TTC GGG CTG 213Leu Leu Gln Pro Ala Pro Arg Leu Cys Thr Arg Pro Phe Gly Leu35 40 45CTC AGC GTG CGC GCA GGT TCC GAG CGG CGG CCG GGC CTC CTG CGG 258Leu Ser Val Arg Ala Gly Ser Glu Arg Arg Pro Gly Leu Leu Arg50 55 60CCT CGC GGA CCC TGC GCC TGT GGC TGT GGC TGC GGC TCG CTG CAC 303Pro Arg Gly Pro Cys Ala Cys Gly Cys Gly Cys Gly Ser Leu His65 70 75ACC GAC GGA GAC AAA GCT TTT GTT GAT TTC CTG AGT GAT GAA ATT 348Thr Asp Gly Asp Lys Ala Phe Val Asp Phe Leu Ser Asp Glu Ile80 85 90AAG GAG GAA AGA AAA ATT CAG AAG CAT AAA ACC CTC CCT AAG ATG 393Lys Glu Glu Arg Lys Ile Gln Lys His Lys Thr Leu Pro Lys Met95 100 105TCT GGA GGT TGG GAG CTG GAA CTG AAT GGG ACA GAA GCG AAA TTA 438Ser Gly Gly Trp Glu Leu Glu Leu Asn Gly Thr Glu Ala Lys Leu110 115 120GTG CGG AAA GTT GCC GGG GAA AAA ATC ACG GTC ACT TTC AAC ATT 483Val Arg Lys Val Ala Gly Glu Lys Ile Thr Val Thr Phe Asn Ile125 130 135AAC AAC AGC ATC CCA CCA ACA TTT GAT GGT GAG GAG GAA CCC TCG 528Asn Asn Ser Ile Pro Pro Thr Phe Asp Gly Glu Glu Glu Pro Ser140 145 150CAA GGG CAG AAG GTT GAA GAA CAG GAG CCT GAA CTG ACA TCA ACT 573Gln Gly Gln Lys Val Glu Glu Gln Glu Pro Glu Leu Thr Ser Thr155 160 165CCC AAT TTC GTG GTT GAA GTT ATA AAG AAT GAT GAT GGC AAG AAG 618Pro Asn Phe Val Val Glu Val Ile Lys Asn Asp Asp Gly Lys Lys170 175 180GCC CTT GTG TTG GAC TGT CAT TAT CCA GAG GAT GAG GTT GGA CAA 663Ala Leu Val Leu Asp Cys His Tyr Pro Glu Asp Glu Val Gly Gln185 190 195GAA GAC GAG GCT GAG AGT GAC ATC TTC TCT ATC AGG GAA GTT AGC 708Glu Asp Glu Ala Glu Ser Asp Ile Phe Ser Ile Arg Glu Val Ser200 205 210TTT CAG TCC ACT GGC GAG TCT GAA TGG AAG GAT ACT AAT TAT ACA 753Phe Gln Ser Thr Gly Glu Ser Glu Trp Lys Asp Thr Asn Tyr Thr215 220 225CTC AAC ACA GAT TCC TTG GAC TGG GCC TTA TAT GAC CAC CTA ATG 798Leu Asn Thr Asp Ser Leu Asp Trp Ala Leu Tyr Asp His Leu Met230 235 240GAT TTC CTT GCC GAC CGA GGG GTG GAC AAC ACT TTT GCA GAT GAG 843Asp Phe Leu Ala Asp Arg Gly Val Asp Asn Thr Phe Ala Asp Glu245 250 255CTG GTG GAG CTC AGC ACA GCC CTG GAG CAC CAG GAG TAC ATT ACT 888Leu Val Glu Leu Ser Thr Ala Leu Glu His Gln Glu Tyr Ile Thr260 265 270TTT CTT GAA GAC CTC AAG AGT TTT GTC AAG AGC CAG 924Phe Leu Glu Asp Leu Lys Ser Phe Val Lys Ser Gln275 280TAGAGCAGAC AGATGCTGAA AGCCATAGTT TCATGGCAGG 964CTTTGGCCAG TGAACAAATC CTACTCTGAA GCTAGACATG 1004TGCTTTGAAA TGATTATCAT CCTAATATCA TGGGGGAAAA 1044AATACCAAAT TTAAATTATA TGTTTTGTGT TCTCATTTAT 1084TATCATTTTT TTCTGTACAA TCTATTATTT CTAGATTTTT 1124GTATAACATG ATAG 1138(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征；(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO2Leu Met Asp Phe Leu Ala Asp Arg Gly Val Asp Asn5 10(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征；(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO3Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly5 10 15(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征；(A)長度26個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO4TACATATGCT GCACACCGAC GGAGAC 26(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征；(A)長度24個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO5GCCCTGCAGC ATCTGTCTGC TCTA 24(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征；(A)長度25個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性
(ix)序列描述SEQ ID NO6AAGAATTCCG GTCACTTTCA ACATT 25(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征；(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO7Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys5 10 15(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征；(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO8Thr Asp Gly Asp Lys Ala Phe Val Asp Phe Leu Ser Asp Glu Ile LysGlu Glu5 10 15(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征；(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO9Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro5 10 15(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征；(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO10Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg5 10 15(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征；
(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO11Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe Tyr Lys Leu Asp Ile Ile Pro5 10 15(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征；(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO12Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr5 10(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征；(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ix)序列描述SEQ ID NO13Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Asn5 10
權利要求
1.一種具有SEQ ID NO2的序列的肽。
2.權利要求1的肽，其與增強其免疫原性的一種載體綴合。
3.權利要求2的肽，其中所述的載體是KLH。
4.編碼SEQ ID NO2的肽的寡核苷酸。
5.權利要求4的寡核苷酸，其是脫氧寡核苷酸。
6.靶向權利要求1的肽的結合分子或抗體。
7.權利要求6所述的結合分子或抗體，其是單克隆抗體。
8.單克隆抗體99-12-1。
9.生產單克隆抗體99-12-1的細胞系。
10.一種具有SEQ ID NO3的序列的肽。
11.權利要求10的肽，其與增強其免疫原性的一種載體綴合。
12.權利要求10的肽，其中所述的載體是KLH。
13.編碼SEQ ID NO3的肽的寡核苷酸。
14.權利要求13的寡核苷酸，其是脫氧寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于gC1q－R上結合HIV－1gp120的結合位點的免疫原和肽,以及基于HIV－1gp120上結合gC1q－R的結合位點的免疫原和肽。gC1q－R上的結合gp120的結合位點的序列如SEQIDNO:2所示,HIV－1gp120上結合gC1q－R的結合位點的序列如SEQIDNO:3所示。還公開了針對所有這些免疫原和肽的抗體和結合分子,以及誘導這種抗體的內源生產。
文檔編號C12R1/19GK1179163SQ9619278
公開日1998年4月15日 申請日期1996年3月22日 優(yōu)先權日1995年3月24日
發(fā)明者邁克爾·S·C·馮, 比爾·N·C·孫, 塞西莉·R·Y·孫, 金永瑀, 於利敏 申請人:泰諾克斯生物系統公司