專利名稱：一種抗sars病毒的基因疫苗及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因疫苗，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種含有S蛋白基因片段的抗SARS基因疫苗。
背景技術(shù)：
自1778年天花疫苗問(wèn)世以來(lái)，疫苗對(duì)人和家畜的疾病防與治方面顯示了巨大的作用，是其它手段不能與之相比的。人類對(duì)疾病的預(yù)防是靠非特異和特異免疫系統(tǒng)來(lái)完成的。隨著基因重組技術(shù)及基因載體傳遞系統(tǒng)的迅速發(fā)展，1992年美國(guó)有四個(gè)實(shí)驗(yàn)室(Robinson，Johoston，Li，David)同時(shí)開(kāi)發(fā)研究出了DNA疫苗(即基因疫苗)的雛形，并在1992年9月召開(kāi)的疫苗學(xué)新進(jìn)展大會(huì)上同時(shí)進(jìn)行了報(bào)告。從此DNA疫苗的新技術(shù)問(wèn)世引起世界各國(guó)的高度重視，被人們視為疫苗研究領(lǐng)域的一場(chǎng)革命。1994年美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)以國(guó)家生物戰(zhàn)略發(fā)展計(jì)劃的專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助開(kāi)展DNA疫苗治療HIV的研究工作。1994年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了在人體進(jìn)行DNA疫苗治療愛(ài)滋病的臨床試驗(yàn)。1995年5月，報(bào)導(dǎo)了世界第一例DNA疫苗的臨床試驗(yàn)，世界衛(wèi)生組織(WHO)撥款把DNA疫苗納入WHO全球免疫研制開(kāi)發(fā)計(jì)劃之中。1996年醫(yī)生首次將新基因(編碼HIV或流感蛋白質(zhì))注入健康人中，而不是注入患了某種疾病的人中。目前FDA已批準(zhǔn)五種DNA疫苗進(jìn)入臨床，這五種疫苗是愛(ài)滋病病毒疫苗、流感病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、單純皰疹病毒疫苗和瘧原蟲(chóng)病毒疫苗。
DNA疫苗是90年代新興的一種以重組DNA形式進(jìn)行免疫的一項(xiàng)新技術(shù)。技術(shù)的核心是將編碼抗原的DNA序列組裝到含有必要表達(dá)調(diào)控元件的真核表達(dá)載體中構(gòu)建DNA疫苗，然后采用不同的方式將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到動(dòng)物體內(nèi)，重組的DNA疫苗可以利用宿主體內(nèi)的酶系合成外源基因編碼的蛋白，從而誘發(fā)宿主對(duì)該外源蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答，表達(dá)產(chǎn)物既可激活體液免疫，又能激活細(xì)胞免疫，從而可以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的效果，不僅如此，這一新技術(shù)還避開(kāi)了蛋白疫苗在制備過(guò)程中復(fù)雜而昂貴的工藝，具有安全、長(zhǎng)效、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。因此疫苗DNA具有其它免疫方法難以比擬的潛在優(yōu)勢(shì)。近年美國(guó)NIH以國(guó)家生物戰(zhàn)略發(fā)展計(jì)劃的專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助開(kāi)展DNA疫苗治療重大疾病的研究。2002年歐盟第五框架、2003年歐盟第六框架生命科學(xué)部分均給予發(fā)展基因免疫技術(shù)治療腫瘤、愛(ài)滋病的課題以優(yōu)先資助。
許多動(dòng)物模型和人體實(shí)驗(yàn)都證明了DNA疫苗能激發(fā)有效的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答既可激活體液免疫，又能激活細(xì)胞免疫，表明DNA免疫技術(shù)，不僅能通過(guò)產(chǎn)生抗體預(yù)防病毒感染，更重要的是DNA疫苗可誘導(dǎo)極有效的專一性T殺傷細(xì)胞的能力，清除已經(jīng)被感染的機(jī)體細(xì)胞，達(dá)到治療的目的，而且沒(méi)有副作用反應(yīng)，這一點(diǎn)是該技術(shù)最誘人之處，也充分顯示出DNA疫苗的巨大潛力和應(yīng)用前景。
DNA疫苗與常用的疫苗相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，首先基因免疫所需的免疫量較小，20-100微克即可。其次基因免疫與病毒感染誘發(fā)的免疫反應(yīng)十分相似，但基因免疫能同時(shí)高效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，比其它免疫手段免疫效力強(qiáng)。第三基因免疫安全、長(zhǎng)效(免疫能力有長(zhǎng)時(shí)間的記憶)、穩(wěn)定、操作便捷。它既能通過(guò)B淋巴細(xì)胞免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，又能形成更為有效的T淋巴細(xì)胞免疫。
SARS病毒是一種新型的冠狀病毒(即RNA病毒)，感染人體后，目前還沒(méi)有治療SARS的有效藥物?，F(xiàn)今，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家都在對(duì)SARS進(jìn)行研究，以期早日找到預(yù)防SARS病毒的抗SARS疫苗方法。正在研究中的滅活疫苗和減毒疫苗，其中解決滅活疫苗免疫病理方面的問(wèn)題十分困難，通常有些滅活病毒進(jìn)入人體會(huì)在病毒入侵時(shí)加重病情；而減毒疫苗則要費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間使病毒繁殖許多代，然后逐漸減除病毒的大部分活性，也不能滿足需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)還沒(méi)有將基因疫苗應(yīng)用于預(yù)防和治療SARS病毒的空白，從而提供一種可以預(yù)防和治療SARS病毒的基因疫苗，該疫苗由編碼纖突蛋白的基因片段、RNA聚合酶基因cDNA片段與哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pVAX1組成，所述的編碼纖突蛋白的基因片段為SARS病毒S蛋白表面抗原決定簇分子，所述的真核質(zhì)粒表達(dá)載體pVAX1為可用于人的真核表達(dá)載體，是經(jīng)美國(guó)FDA認(rèn)可的。
本發(fā)明的另一目的是提供該基因疫苗的構(gòu)建。
本發(fā)明的再一目的是提供該基因疫苗的用途。
本發(fā)明的目的是由如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種抗SARS病毒的基因疫苗，該疫苗由基因文庫(kù)中登錄號(hào)為AY278487的21492-22472片段(圖1中所示的序列1)編碼的SARS病毒S蛋白和2486-2935片段(圖2中所示的序列2)編碼的RNA聚合酶基因cDNA與哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pVAX1組成，所述登錄號(hào)為AY278487的基因是SARS病毒S蛋白表面抗原決定簇分子，由北京華大基因研究中心提供。
本發(fā)明提供一種所述抗SARS病毒的基因疫苗的構(gòu)建，包括如下步驟1)將含有SARS病毒S蛋白及2486-2935片段編碼的RNA聚合酶基因cDNA和pGEM-tEasy vector載體的質(zhì)粒引入DH5a菌株，按常規(guī)方法分別挑含有SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段克隆載體的單菌落、搖菌，提含有SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的克隆載體；所述的SARS病毒S蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段分別由基因文庫(kù)中登錄號(hào)為AY278487的21492-22472和2486-2935基因所編碼；2)設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的引物序列分別為S蛋白上游引物5′-CGCGGATCCACC ATGTTTATTT TCTTATTATT TCTTACTCTC ACTAGTG-3′下游引物5′-CGCGGATCC CTCCCATGCT TAGACAGAAG GGAATTTAGT AGC-3′RNA聚合酶上游引物5′-CCGTATTCATGGGTGATTCACATGACA-3′下游引物5′-ATAACAAACTGGTTGTAAAGTCTTC-3′3)用聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，從步驟1)得到的質(zhì)?？寺》謩e得到SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段；4)將步驟3)擴(kuò)增的S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化；5)將步驟4)純化的SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段重組到哺乳動(dòng)物特殊表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建成抗SARS病毒的基因疫苗-pVAX1-SARS-S疫苗。
所述步驟3)的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法為在95℃反應(yīng)5分鐘；在94℃持續(xù)1分鐘，在56℃持續(xù)1分鐘，在72℃持續(xù)1分鐘，反復(fù)加溫冷卻共40個(gè)循環(huán)；最后在71℃延伸10分鐘。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述抗SARS病毒的基因疫苗在制備用于預(yù)防SARS的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了所述抗SARS病毒的基因疫苗在制備用于治療SARS的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的抗SARS的基因疫苗優(yōu)益之處在于本發(fā)明是經(jīng)克隆、篩選得到目標(biāo)基因-S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段，并以此首次制備了可以用于抗SARS的基因疫苗，該疫苗具有病毒易識(shí)別、有高度特異性、其他生物機(jī)體所沒(méi)有的、且又能引起機(jī)體產(chǎn)生高效免疫應(yīng)答的特性；該疫苗不僅能通過(guò)B淋巴細(xì)胞免疫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，而且可以誘導(dǎo)極有效的專一性T殺傷細(xì)胞的能力，這種抗SARS新疫苗通過(guò)調(diào)動(dòng)患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)殺滅SARS病毒，達(dá)到治療SARS的目的，從而達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的；與當(dāng)前常用的疫苗相比，該基因疫苗達(dá)到相同免疫效果所需的量小，20-100微克即可；該基因疫苗能同時(shí)高效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，比常用免疫手段免疫效果更強(qiáng)；使用本基因疫苗免疫安全、長(zhǎng)效、穩(wěn)定、操作便捷。


圖1為序列1——基因文庫(kù)中登錄號(hào)為AY278487的21492-22472片段；圖2為序列2——基因文庫(kù)中登錄號(hào)為AY278487的2486-2935片段。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.本發(fā)明的抗SARS病毒的基因疫苗-pVAX1-SARS-S疫苗的構(gòu)建本發(fā)明提供的pVAX1-SARS-S基因疫苗的構(gòu)建步驟如下1)將含有SARS病毒S蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段和pGEM-tEasy vector載體的質(zhì)粒引入DH5a菌株，按常規(guī)方法分別挑含有SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段克隆載體的單菌落、搖菌，提含有SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的克隆載體；所述的SARS病毒S蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段分別由基因文庫(kù)中登錄號(hào)為AY278487的21492-22472(圖1所示的序列1)和2486-2935(圖2所示的序列2)的基因編碼，均由北京華大基因研究中心提供；2)設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的引物序列分別為
S蛋白上游引物5′-CGCGGATCCACC ATGTTTATTT TCTTATTATT TCTTACTCTC ACTAGTG-3′下游引物5′-CGCGGATCC CTCCCATGCT TAGACAGAAG GGAATTTAGT AGC-3′RNA聚合酶上游引物5’--CC GTA TTC ATG GGT GAT TCA CAT GAC A-3’下游引物5’---ATA ACA AAC TGG TTG TAA AGT CTT C-3’3)用聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，從步驟1)得到的質(zhì)?？寺》謩e得到SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段；PCR程序95℃ 5min↓94℃ 1min 56℃ 1min 72℃ 1min共40個(gè)循環(huán)↓71℃ 10min4)將步驟3)擴(kuò)增的S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化；5)將步驟4)純化的SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段重組到哺乳動(dòng)物特殊表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建成抗SARS病毒的基因疫苗-pVAX1-SARS-S疫苗；將rmCGβ全長(zhǎng)氨基酸編碼序列的cDNA片段重組到pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒中用連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Top10F’，取80ul轉(zhuǎn)化的菌液涂布LB(含氨芐青霉素)平板，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取菌落搖菌過(guò)夜，用堿裂法提取質(zhì)粒DNA，即本實(shí)施例的pVAX1-SARS-SRna，進(jìn)行酶切鑒定并對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序；將有正向插入了SARS-SRna擴(kuò)增產(chǎn)物外源DNA片斷的重組克隆質(zhì)粒經(jīng)純化后利用克隆質(zhì)粒測(cè)序引物M13反向引物(reverse primer)和T7啟動(dòng)子引物(promoter primer)對(duì)pVAX1-SARS-S Rna擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序；6)構(gòu)建的抗SARS的pVAX1-SARS-SRna基因疫苗，免疫小鼠和轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后檢測(cè)體內(nèi)外mRNA表達(dá)，RT-PCR程序?yàn)?5℃ 56min↓
93℃ 5min↓92℃ 1min 55℃ 1min 67℃ 1min共40個(gè)循環(huán)↓64℃ 10min所述步驟6)的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在45℃反應(yīng)56分鐘，接著在93℃滅活5分鐘，并啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法擴(kuò)增反應(yīng)在第一個(gè)變性步驟時(shí)加入聚合酶，變性溫度為92℃，持續(xù)1分鐘，退火溫度從55℃開(kāi)始，持續(xù)1分鐘，然后以每?jī)蓚€(gè)循環(huán)下降1℃的速度降至55℃，持續(xù)1分鐘，延伸溫度為67℃，持續(xù)40秒；最后在以退火溫度58℃分鐘繼續(xù)擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；最后在64℃延伸10分鐘。
實(shí)施例2.pVAX1-SARS-SRna疫苗SR在mRNA水平體外表達(dá)和表達(dá)含量的鑒定建立Hela細(xì)胞、CHO細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，將實(shí)施例1中構(gòu)建的pVAX1-SARS-S真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，分別于24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)收集培養(yǎng)液，采用RT-PCR、激光共聚焦間接免疫熒光檢測(cè)等方法鑒定重組真核表達(dá)載體pVAX1-SARS-S疫苗體外瞬時(shí)表達(dá)及含量，可知pVAX1-SARS-S真核表達(dá)質(zhì)粒在Hela細(xì)胞、CHO細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中在mRNA水平上能高效表達(dá)，mRNA水平的表達(dá)量比對(duì)照組(空質(zhì)粒)高出164％。
實(shí)施例3.pVAX1-SARS-SRna疫苗的外源基因SR在體外蛋白水平表達(dá)的鑒定建立Hela細(xì)胞、CHO細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，將實(shí)施例1中構(gòu)建的pVAX1-SARS-S真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，分別于24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)加入，pVAX1-SARS-S免疫后的BALB/C小鼠血清，采用激光共聚焦間接免疫熒光檢測(cè)等方法鑒定重組真核表達(dá)載體pVAX1-SARS-S疫苗體外瞬時(shí)表達(dá)及含量，可知pVAX1-SARS-S真核表達(dá)質(zhì)粒在Hela細(xì)胞、CHO細(xì)胞體外瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中在蛋白水平上能高效表達(dá)，蛋白水平的表達(dá)量比對(duì)照組(空質(zhì)粒)高159％。
實(shí)施例4.pVAX1-SARS-S在體內(nèi)SR的mRNA表達(dá)的檢測(cè)提取pVAX1-SARS-S免疫小鼠肌肉細(xì)胞后第6周時(shí)收集的肌肉組織總RNA，利用擴(kuò)增S蛋白cDNA片段時(shí)采用的引物及RT-PCR方法，擴(kuò)增cDNA條帶，由檢測(cè)結(jié)果可知，pVAX1-SARS-S基因疫苗免疫后，肌肉細(xì)胞中S在mRNA水平上表達(dá)，mRNA水平的表達(dá)量比對(duì)照組(空質(zhì)粒)高出216％。
實(shí)施例5.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blotting)與激光共聚焦間接免疫熒光檢測(cè)小鼠免疫后的體液免疫應(yīng)答用1∶50倍稀釋的正常血清作為對(duì)照，收集pVAX1-SARS-S免疫小鼠的血清按1∶100和1∶1000的比例稀釋，采用激光共聚焦間接免疫熒光檢測(cè)等方法鑒定重組真核表達(dá)載體pVAX1-SARS-S疫苗體內(nèi)抗體表達(dá)及含量，由檢測(cè)結(jié)果可知，pVAX1-SARS-SR基因疫苗免疫后機(jī)體能產(chǎn)生高滴度抗體(抗體滴度＞1∶3100)。
用1∶50倍稀釋的正常血清作為對(duì)照，收集pVAX1-SARS-S免疫小鼠的血清按1∶100、1∶500、1∶1000的比例稀釋，采用激光共聚焦間接免疫熒光檢測(cè)等方法鑒定重組真核表達(dá)載體pVAX1-SARS-S疫苗體內(nèi)抗體表達(dá)及含量，由檢測(cè)結(jié)果可知，pVAX1-SARS-S DNA疫苗免疫接種BALB/C小鼠，20μg的劑量能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。從檢測(cè)的第2周開(kāi)始，免疫反應(yīng)的滴度持續(xù)升高，在第6周時(shí)上升接近頂峰，抗體滴度最高可達(dá)1∶2600，顯著高于對(duì)照組。
以完全滅活的SARS病毒作抗原，經(jīng)Western-Blotting及ELISA技術(shù)鑒定證明融合pVAX1-SARS-SRna DNA疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗SARS病毒的特異性抗體。結(jié)果顯示pVAX1-SARS-SRna DNA疫苗能有效激發(fā)小鼠產(chǎn)生抗原特異性的體液免疫應(yīng)答。
實(shí)施例6.細(xì)胞免疫檢測(cè)用pVAX1-SARS-SR DNA疫苗免疫接種BALB/C小鼠后8周T淋巴細(xì)胞檢測(cè)CTL的抗原特異性殺傷活性。在經(jīng)過(guò)滅活的SARS病毒致敏處理后的T淋巴細(xì)胞的CTL活性檢測(cè)結(jié)果T細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的抗原特異性殺傷活性在不同的E∶T比例中50∶1達(dá)到38％，25∶1時(shí)達(dá)到26％，與對(duì)照組相比差異顯著(p＜0.01)，結(jié)果說(shuō)明pVAX1-SARS-SRna DNA疫苗在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)亦表明DNA疫苗產(chǎn)生的特異性抗原可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。
實(shí)施例7.細(xì)胞因子檢測(cè)經(jīng)過(guò)用完全失活的SARS病毒致敏處理后，DNA疫苗pVAX1-SARS-S免疫小鼠中IL-2，IL-4、IFN-γ，TNF-α，TGF-β均有表達(dá)。
實(shí)施例8.疫苗體外SARS病毒實(shí)驗(yàn)(由CDC合作完成)我們送給中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病研究所(CDC)15份pVAX1-SARS-SRnaDNA疫苗免疫小鼠的血清，其中對(duì)照血清樣品7份。體外SARS活病毒中和實(shí)驗(yàn)證實(shí)融合pVAX1-SARS-SRna DNA疫苗免疫小鼠的血清能有效地中和SARS病毒。Western-Blotting及ELISA技術(shù)檢測(cè)證實(shí)融合pVAX1-SARS-SRna DNA疫苗免疫小鼠后能產(chǎn)生抗SARS病毒的特異性抗體。
實(shí)施例9.疫苗體外SARS病毒實(shí)驗(yàn)(由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所合作)1.恒河猴SARS動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)5只恒河猴分為兩組一組注射生理鹽水作為對(duì)照組(N＝1)，一組(N＝4)注射融合pVAX1-SARS-SRna DNA疫苗50μg每隔一周注射一次共三次。注射融合pVAX1-SARS-SRna DNA疫苗后40天，5只恒河猴分別注射同劑量的SARS活病毒，攻毒后第二天從5只猴取咽拭子分離SARS病毒，注射疫苗組與對(duì)照組均呈陽(yáng)性，15天、20天后注射疫苗組均呈陰性(即分離后未見(jiàn)SARS病毒)，而對(duì)照組均呈陽(yáng)性(即分離后有SARS病毒)；攻毒后第5天分別從5只猴取血漿分離SARS病毒，注射疫苗組與對(duì)照組均呈陽(yáng)性，15天、20天后注射疫苗組均呈陰性(即分離后未見(jiàn)SARS病毒)，而對(duì)照組均呈陽(yáng)性(即分離后有SARS病毒)；安樂(lè)處死(21天)的5只猴分別取肺、腎、脾、肝、淋巴結(jié)，注射疫苗組均呈陰性。血常規(guī)檢測(cè)，注射疫苗組均呈正常。
2.布氏田鼠SARS動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)十六只布氏田鼠為兩組一組注射生理鹽水(對(duì)照組，N＝6)，另一組(N＝10)注射融合pVAX1-SARS-SRna DNA疫苗20μg共三次。注射融合pVAX1-SARS-SRnaDNA疫苗后45天，將布氏田鼠送到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所，分別注射同劑量的SARS活病毒，5天后對(duì)照組死亡3只，動(dòng)物死亡前呈呼吸困難，口鼻出血等明顯的SARS癥狀，而注射疫苗組未見(jiàn)死亡，且一直存活15天后安樂(lè)死亦未見(jiàn)其它異常癥狀。
實(shí)施例10.安全性檢測(cè)通過(guò)長(zhǎng)期觀察，注射疫苗的小鼠沒(méi)有明顯飲食、行為、毛等變化；病理切片表明心、肝、脾、肺、腎、腦等器官無(wú)明顯病理變化。
異種核酸疫苗在理論上整合到染色體上的可能性比同種核酸疫苗小的多，這就一定程度上有效的解決了長(zhǎng)期困擾核酸疫苗的整合安全問(wèn)題。
F1代小鼠未檢測(cè)到質(zhì)粒DNA。
FPI04034-sequence list.txtSEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所北京華大基因研究中心<120>一種抗SARS病毒的基因疫苗及其制備方法和用途<130>FPI04034<160>2<170>Patent In version 3.1<210>1<211>980<212>DNA<213>coronavirus<400>1catgtttatt ttcttattat ttcttactct cactagtggt agtgaccttg accggtgcac60cacttttgat gatgttcaag ctcctaatta cactcaacat acttcatcta tgaggggggt120ttactatcct gatgaaattt ttagatccga cactctttat ttaactcagg atttatttct180tccattttat tctaatgtta cagggtttca tactattaat catacgtttg acaaccctgt240catacctttt aaggatggta tttattttgc tgccacagag aaatcaaatg ttgtccgtgg300ttgggttttt ggttctacca tgaacaacaa gtcacagtcg gtgattatta ttaacaattc360tactaatgtt gttatacgag catgtaactt tgaattgtgt gacaaccctt tctttgctgt420ttctaaaccc atgggtacac agacacatac tatgatattc gataatgcat ttaattgcac480tttcgagtac atatctgatg ccttttcgct tgatgtttca gaaaagtcag gtaattttaa540acacttacga gagtttgtgt ttaaaaataa agatgggttt ctctatgttt ataagggcta600tcaacctata gatgtagttc gtgatctacc ttctggtttt aacactttga aacctatttt660taagttgcct cttggtatta acattacaaa ttttagagcc attcttacag ccttttcacc720tgctcaagac acttggggca cgtcagctgc agcctatttt gttggctatt taaagccaac780tacatttatg ctcaagtatg atgaaaatgg tacaatcaca gatgctgttg attgttctca840aaatccactt gctgaactca aatgctctgt taagagcttt gagattgaca aaggaattta900ccagacctct aatttcaggg ttgttccctc aagagatgtt gtgagattcc ctaatattac960aaacttgtgt ccttttggag980<210>2<211>460<212>DNA<213>coronavirus<400>2gaagtaacct ttcttgaagg tgattcacat gacacagtac ttacctctga ggaggttgtt60ctcaagaacg gtgaactcga agcactcgag acgcccgttg atagcttcac aaatggagct120atcgttggca caccagtctg tgtaaatggc ctcatgctct tagagattaa ggacaaagaa180caatactgcg cattgtctcc tggtttactg gctacaaaca atgtctttcg cttaaaaggg240ggtgcaccaa ttaaaggtgt aacctttgga gaagatactg tttgggaagt tcaaggttac300aagaatgtga gaatcacatt tgagcttgat gaacgtgttg acaaagtgct taatgaaaag360tgctctgtct acactgttga atccggtacc gaagttactg agtttgcatg tgttgtagca420gaggctgttg tgaagacttt acaaccagtt tctgatctcc 460
權(quán)利要求
1.一種抗SARS病毒的基因疫苗，該疫苗由圖1中所示的序列1編碼的SARS病毒S蛋白和圖2中所示的序列2編碼的RNA聚合酶基因cDNA與表達(dá)載體pVAX1組成。
2.如權(quán)利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗，其特征在于，所述的序列1為基因文庫(kù)中登錄號(hào)為AY278487的21492-22472片段。
3.如權(quán)利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗，其特征在于，所述的序列1為基因文庫(kù)中登錄號(hào)為AY278487的2486-2935片段。
4.一種權(quán)利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗的構(gòu)建，包括如下步驟1)將含有SARS病毒S蛋白及2486-2935片段編碼的RNA聚合酶基因cDNA和pGEM-tEasy vector載體的質(zhì)粒引入DH5a菌株，按常規(guī)方法分別挑含有SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段克隆載體的單菌落、搖菌，提含有SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的克隆載體；所述的SARS病毒S蛋白及SARS RNA聚合酶cDNA片段分別由基因文庫(kù)中登錄號(hào)為AY278487的21492-22472和2486-2935基因所編碼；2)設(shè)計(jì)的用于擴(kuò)增SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的引物序列分別為S蛋白上游引物5′-CGCGGATCCACC ATGTTTATTT TCTTATTATT TCTTACTCTC ACTAGTG-3′下游引物5′-CGCGGATCC CTCCCATGCT TAGACAGAAG GGAATTTAGT AGC-3′RNA聚合酶上游引物5′-CCGTATTCATGGGTGATTCACATGACA-3′下游引物5′-ATAACAAACTGGTTGTAAAGTCTTC-3′3)用聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，從步驟1)得到的質(zhì)粒克隆分別得到SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段；4)將步驟3)擴(kuò)增的S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段，利用WizardPCR Preps.DNA純化體系試劑盒回收純化；5)將步驟4)純化的SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段重組到哺乳動(dòng)物特殊表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建成抗SARS病毒的基因疫苗-pVAX1-SARS-S疫苗。
5.如權(quán)利要求2所述的抗SARS病毒的基因疫苗的構(gòu)建，其特征在于所述步驟3)的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法為在95℃反應(yīng)5分鐘；在94℃持續(xù)1分鐘，在56℃持續(xù)1分鐘，在72℃持續(xù)1分鐘，反復(fù)加溫冷卻共40個(gè)循環(huán)；最后在71℃延伸10分鐘。
6.一種權(quán)利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗在制備用于預(yù)防SARS的藥物中的應(yīng)用。
7.一種權(quán)利要求1所述的抗SARS病毒的基因疫苗在制備用于治療SARS的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗SARS病毒的基因疫苗，該疫苗由基因文庫(kù)中登錄號(hào)為AY278487的21492－22472片段編碼的SARS病毒S蛋白和2486－2935片段編碼的RNA聚合酶基因cDNA與哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pVAX1組成。該疫苗的構(gòu)建包括挑單菌落、搖菌、提含有SARS病毒S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段的克隆載體質(zhì)粒；設(shè)計(jì)引物，用聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增方法，克隆S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段；將純化后的S蛋白和RNA聚合酶基因cDNA片段重組到哺乳動(dòng)物特殊表達(dá)載體pVAX1中，構(gòu)建成抗SARS病毒的基因疫苗－pVAX1－SARS－S疫苗。與當(dāng)前常用的疫苗相比，本疫苗達(dá)到相同免疫效果時(shí)所需的量小，并且能同時(shí)、高效激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更強(qiáng)，而且安全、長(zhǎng)效、穩(wěn)定、操作便捷，本疫苗可以用于制備預(yù)防和治療SARS的藥物。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1572328SQ200410039458
公開(kāi)日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2004年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月16日
發(fā)明者彭景楩, 孫泉紅, 常建軍, 石樹(shù)群, 徐麗, 楊穎 , 王金玲, 夏紅飛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所, 北京華大基因研究中心