專(zhuān)利名稱(chēng)：抗感染劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗感染劑組合物的用途，特別涉及免疫刺激微粒作為抗感染劑用于增 強(qiáng)對(duì)抗病原體的固有和/或特異免疫應(yīng)答的用途。本發(fā)明首先被開(kāi)發(fā)用作具有廣泛作用的抗感染劑，其能夠作用于免疫細(xì)胞以抵御 由病原體引起的疾病。下文將引入該申請(qǐng)來(lái)描述本明。然而，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于這個(gè)特 定的應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
說(shuō)明書(shū)中的任何對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的描述都絕不應(yīng)當(dāng)理解為承認(rèn)該現(xiàn)有技術(shù)廣為人們 所知或構(gòu)成了該領(lǐng)域的一般公知常識(shí)的部分。免疫系統(tǒng)包括2個(gè)主要分類(lèi)固有(非特異)免疫系統(tǒng)和適應(yīng)(特異)免疫系統(tǒng)。 兩個(gè)系統(tǒng)協(xié)調(diào)產(chǎn)生有效的應(yīng)答，然而它們?cè)诤芏喾矫娌煌?。適應(yīng)免疫系統(tǒng)需要時(shí)間來(lái)對(duì)病 原微生物作出反應(yīng)、抗原特異性和表現(xiàn)免疫記憶。相比之下，固有免疫系統(tǒng)提供對(duì)病原體更 快的應(yīng)答，非抗原特異性且不表現(xiàn)免疫記憶。適應(yīng)(特異)免疫系統(tǒng)有2個(gè)分支。它們包括體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)免疫。體液免 疫涉及對(duì)外來(lái)抗原產(chǎn)生抗體?？贵w由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。細(xì)胞介導(dǎo)免疫涉及激活T淋巴細(xì)胞， 其或作用于帶有外來(lái)抗原的感染細(xì)胞，或刺激其它細(xì)胞對(duì)感染細(xì)胞發(fā)生作用。哺乳動(dòng)物免 疫系統(tǒng)的兩個(gè)分支在防治疾病中均具有重要意義。體液免疫是防止細(xì)菌病原體和毒素的主 防線(xiàn)，然而，輔助性T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)似乎對(duì)于長(zhǎng)壽命的保護(hù)性免疫 非常關(guān)鍵。固有免疫是防止感染的第一道防線(xiàn)，利用對(duì)許多微生物來(lái)說(shuō)常見(jiàn)的病原分子模式 識(shí)別受體(PRRs)來(lái)迅速誘導(dǎo)前炎癥性及抗病毒細(xì)胞因子。這些途徑的特定活化劑對(duì)于健 康的和免疫能力受損的宿主的病毒感染均具有潛在的治療作用。對(duì)PRRs配體的辨別，伴隨 對(duì)它們的信號(hào)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的了解的增加，已致使開(kāi)發(fā)出選擇性PRR配體作為對(duì)給定的病原體 優(yōu)先免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)劑。對(duì)于使用非特異免疫刺激劑或佐劑作為增強(qiáng)/誘導(dǎo)非特異免疫的手段的興趣在 不斷增加。術(shù)語(yǔ)“佐劑”被廣泛用于描述在施加給個(gè)體或原位試驗(yàn)中時(shí)，通過(guò)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞 特異免疫活性的一般上調(diào)來(lái)發(fā)生作用的化合物。盡管很多材料已被表明具有佐劑活性，唯一被許可用于一般醫(yī)用的佐劑為50年 前被首次使用的明礬。僅次于明礬，含有礦物油和滅活的結(jié)核桿菌的弗氏完全佐劑(FCA)， 開(kāi)始時(shí)被廣泛使用并被視為“金牌標(biāo)準(zhǔn)”，但后來(lái)由于它形成肉芽腫而被停止使用。對(duì)胞壁酰二肽(MDP)-—種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性類(lèi)細(xì)菌的肽聚糖(Inohara， 2003 ；Kufer, 2006)常見(jiàn)的二肽的免疫刺激/調(diào)節(jié)性質(zhì)的確認(rèn)，引發(fā)了旨在將MDP作為化學(xué) 成分明確的、全面活性的免疫佐劑應(yīng)用于臨床的免疫功能研究。這些期望很快受挫，意識(shí)到 MDP自身不適于臨床使用，主要因?yàn)樗亩拘院筒畹乃巹?dòng)力學(xué)特征，也即從MDP身體中迅速 清除(Lidgate，1995 ;TraUb，2006)。反之，為減少或消除熱源性的嘗試導(dǎo)致衍生物的形成，其中的一些以可溶解的單體形式例如莫拉丁酯(Audibert，1984 ；Bahr, 1995 ；Vidal, 2001) 已經(jīng)被使用于臨床試驗(yàn)中。與上述提及的MDP劑形成對(duì)比，開(kāi)發(fā)出不具有MDP所具有的不期望的副作用且實(shí) 現(xiàn)了增強(qiáng)的免疫刺激性質(zhì)的MDP類(lèi)似物(澳大利亞專(zhuān)利號(hào)732809)。MDP的該非毒性形式 起先被開(kāi)發(fā)，大多數(shù)作為佐劑來(lái)增強(qiáng)對(duì)天然蛋白質(zhì)、重組蛋白質(zhì)、合成肽以及其它免疫物質(zhì) 的特異免疫應(yīng)答，也即將它與相關(guān)抗原聯(lián)合使用作為傳統(tǒng)的佐劑_抗原復(fù)合物。傳統(tǒng)的細(xì)菌佐劑本身不使用于刺激非特異免疫系統(tǒng)以防治感染的免疫治療。一部 分這是因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)的佐劑不能特異地激活相關(guān)免疫細(xì)胞類(lèi)型和因此激活相關(guān)免疫應(yīng)答。 現(xiàn)有技術(shù)佐劑通過(guò)不合適的細(xì)胞類(lèi)型誘導(dǎo)細(xì)胞因子，導(dǎo)致大量各種細(xì)胞因子的全身表達(dá)， 引起反過(guò)來(lái)阻止它們作為獨(dú)立的免疫治療法的嚴(yán)重和不期望的副作用。幾種固有免疫應(yīng)答被認(rèn)為有利于控制病毒感染。這些效應(yīng)機(jī)制是多面的，包括直 接抗病毒活性和在感染宿主的免疫細(xì)胞上有助于清除這些細(xì)胞的免疫調(diào)解效應(yīng)。直接抗 病毒活性可以包括可溶性因子，例如CD8抗病毒因子(CAF)和IFN-α，其能夠直接影響病 毒轉(zhuǎn)錄。由巨噬細(xì)胞和樹(shù)突固有免疫細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)/前炎癥細(xì)胞因子，例如TNF (與 IFN-Y相配合)能夠作用于對(duì)由TNF調(diào)節(jié)的細(xì)胞裂解表現(xiàn)增加的敏感性的病毒感染細(xì)胞。 此外，細(xì)胞機(jī)制例如自然殺傷細(xì)胞(NK)介導(dǎo)的對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺害包括固有抗病毒免 疫的另一重要方面。盡管各式各樣的其它固有細(xì)胞因子能夠介導(dǎo)控制抗病毒免疫性方面的生物功能， 高水平的IFN-α/β似乎在病毒感染中起主導(dǎo)作用并且控制其它固有應(yīng)答。IFN-α在治療 各種病毒紊亂例如慢性乙肝/丙肝以及廣泛的人類(lèi)癌癥中的臨床應(yīng)用，在于其能夠誘導(dǎo)抗 病毒基因的顯性陣列，其驅(qū)動(dòng)防止病毒復(fù)制的多效宿主防御途徑。目前臨床應(yīng)用的IFN-a 產(chǎn)品是重組蛋白或高度純化單一異構(gòu)體蛋白，其用作藥單治療或與其它抗病毒劑共同使 用。然而這些治療沒(méi)有良好的耐受性且應(yīng)答率低。這增加了對(duì)不僅能夠誘導(dǎo)生理相關(guān)水平 的自然發(fā)生的多重IFN-α異構(gòu)體，而且還能夠調(diào)動(dòng)很有可能與IFN-α發(fā)生協(xié)同作用的固 有抗病毒免疫的其它方面的新方法的需要。NK細(xì)胞是功能上不同的固有防御病毒感染的貢獻(xiàn)者。通過(guò)免疫刺激性化合物來(lái)加 強(qiáng)NK細(xì)胞的內(nèi)在活性是另外一種臨床上相關(guān)的抗病毒治療方法。此外，由于NK細(xì)胞能夠 通過(guò)與IFN-α不同的機(jī)制識(shí)別和破壞病毒感染細(xì)胞，它們能夠靶向那些對(duì)IFN-α的直接 效應(yīng)具有抗性的病毒。IFN-α在激活NK殺害中起中心作用，并進(jìn)一步與其它關(guān)鍵的固有 免疫細(xì)胞因子例如TNF- α和IL-12協(xié)同來(lái)向上調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能和提升適應(yīng)性細(xì)胞介導(dǎo)的 免疫性。因此，為了充分利用NK抗病毒機(jī)制，其它固有免疫細(xì)胞例如漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞 (PDC)和單核細(xì)胞的免疫刺激是期望的。對(duì)于細(xì)菌感染，其它固有免疫功能，特別是當(dāng)吞噬病原體遭受活性氧和氮種物種 或被溶酶體酶破壞時(shí)的吞噬細(xì)胞的功能很重要。巨噬細(xì)胞然后可以將退化抗原呈遞至T細(xì) 胞并誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。根據(jù)致病菌在巨噬細(xì)胞中的宿命可以將它們分為二類(lèi)，胞外菌 在被吞噬后立即被殺死，而除非吞噬細(xì)胞被免疫激活，兼性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌對(duì)細(xì)胞內(nèi)殺害具有 抗性。胞外菌引起化膿性感染，而兼性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌引起肉芽腫性感染。體液免疫機(jī)制(抗 體，補(bǔ)充物)主要處理胞外菌，而細(xì)胞免疫機(jī)制(T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)處理兼性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。仍然有很多細(xì)菌和病菌感染難以采用目前可獲得的治療方法來(lái)治療。例如，結(jié)核(TB)是一種最古老的人類(lèi)病原，是人由于單一細(xì)菌劑死亡的最主要的起因。據(jù)估計(jì)有將近 三分之一的人口感染結(jié)核桿菌(Mtb)-病原體。每年有接近800萬(wàn)新的TB病例和約200萬(wàn) 的死亡。多重抗藥性(MDR)和非常耐藥性(XDR)結(jié)核對(duì)死亡率和發(fā)病率的控制提出了嚴(yán)峻 的挑戰(zhàn)。結(jié)核能夠以不明顯的小數(shù)量存在，并且偶發(fā)性地重新激活產(chǎn)生甚至對(duì)于藥物敏感 株都難以治療的疾病。由于在藥物治療上的難題，用于限制MDR-Mtb的預(yù)防性和治療性疫 苗成為越來(lái)越可行的一套策略。從歷史上看，瘤型麻風(fēng)的細(xì)菌的重負(fù)載能夠通過(guò)BCG疫苗 來(lái)減少。迫切需要類(lèi)似的方法來(lái)減少或消除MDR-結(jié)核的細(xì)菌負(fù)載。對(duì)結(jié)核的有效控制似乎包括二個(gè)階段的治療對(duì)初步接觸(初種)后感染的建立 的預(yù)防和為預(yù)防疾病的重新激活對(duì)接種BCG的個(gè)體的免疫激活(免疫接種)。MDR-Mtb控制 中的一個(gè)主要缺口在于缺少能夠滿(mǎn)足這些免疫模式的有效疫苗。此外，藥物對(duì)治療MDR-Mtb 沒(méi)有效果，因此，需要治療性疫苗接種。來(lái)源于野生型結(jié)核分枝桿菌的減毒活疫苗和BCG疫 苗的保護(hù)性一樣好，但是受到安全問(wèn)題的限制。已鑒定出很多依賴(lài)增效劑、在較短的時(shí)間期 限內(nèi)提供保護(hù)的重組抗原和DNA疫苗。很遺憾地，BCG疫苗對(duì)兒童結(jié)核的成效不一，而對(duì)于成人結(jié)核或再感染無(wú)效。 MDR-結(jié)核通常是再感染的結(jié)果，因此，BCG疫苗對(duì)于控制這種藥物敏感或MDR-Mtb株無(wú)能為 力。而且，Mtb隱藏在巨噬細(xì)胞中，暗中破壞免疫識(shí)別。甚至減毒BCG疫苗隔離在減少免疫 識(shí)別的巨噬細(xì)胞(ΜΦ8)和樹(shù)突細(xì)胞(DCs)的特定隔離室內(nèi)。因此，BCG具有至少二個(gè)重要 的不足。第一，它不含所有潛在保護(hù)性抗原以及第二，它積極地暗中破壞免疫應(yīng)答。結(jié)核由強(qiáng)的Thl免疫性控制，Thl免疫性同時(shí)被抗體主導(dǎo)的Th2應(yīng)答和由Mtb衍 生產(chǎn)物誘導(dǎo)的抑制性T-調(diào)節(jié)細(xì)胞反調(diào)節(jié)。因此，對(duì)MDR結(jié)核的疫苗介導(dǎo)免疫控制要求以犧 牲其它T細(xì)胞應(yīng)答為代價(jià)，使用優(yōu)先誘導(dǎo)Thl免疫性的疫苗，突出了將能夠影響T細(xì)胞分化 的佐劑作為理性的疫苗設(shè)計(jì)的重要成分的作用。遺憾地，對(duì)以最少增效劑的劑量就能誘導(dǎo) 長(zhǎng)久持續(xù)的免疫性的佐劑的機(jī)制的理解還有很大的距離。流感感染導(dǎo)致了兒童和老年人群的主要發(fā)病率和死亡率。與流感感染相關(guān)的嚴(yán)重 并發(fā)癥包括肺炎，呼吸衰竭，非呼吸條件例如休克和腦病，以及潛在慢性疾病的加重。與流 感有關(guān)的死亡能夠直接與初始病毒感染相關(guān)或能夠由次級(jí)的并發(fā)癥導(dǎo)致。在某些例子中， 從疾病開(kāi)始到死亡的進(jìn)程能夠迅速發(fā)生。雖然接種疫苗可以提供一些保護(hù)，每年的遺傳漂 變的程度意味著疫苗與循環(huán)病毒株之間錯(cuò)配的可能性很高。一個(gè)優(yōu)選的疫苗劑型將是不要 求每年重新形成以適應(yīng)每年發(fā)生的快速流感株突變的疫苗。雖然疫苗是控制流感的必要工 具，當(dāng)疫苗失敗或流感在沒(méi)有接種疫苗的個(gè)體或沒(méi)有接種疫苗的人群(流行病)中突發(fā)時(shí)， 固有免疫治療方法可具有特別的優(yōu)勢(shì)。鼠疫由從假結(jié)核桿菌的腸道致病菌變體而來(lái)的鼠疫桿菌引起，其通常導(dǎo)致慢性和 相對(duì)輕微的疾病。鼠疫菌自然寄生在跳蚤上，但對(duì)于老鼠和人類(lèi)也高度毒性，導(dǎo)致系統(tǒng)性流 行病且常常為致命疾病。雖然鼠疫感染在西方世界相對(duì)稀少，在欠發(fā)達(dá)國(guó)家它仍然威脅到 公眾健康。它能夠以氣溶膠在人與人之間傳播，因此被列為A類(lèi)生物恐怖劑。鼠疫病能夠 導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病部分是由于它能夠內(nèi)在地減弱對(duì)感染的正常的、非傳染性免疫應(yīng)答。在沒(méi)有 目前預(yù)防性接種策略下，能夠刺激固有免疫應(yīng)答的治療方法可以防止肺鼠疫。同樣的，期望的具有廣泛作用的抗感染劑將是能夠?qū)Χ鄠€(gè)免疫細(xì)胞亞群有特異作
5用、誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的協(xié)調(diào)釋放的抗感染劑。所需要的是該種作用模式將對(duì)于預(yù)防和/ 或治療病毒和/或細(xì)菌感染(特別是那些難以治療的)。本發(fā)明的目的之一是克服或減輕現(xiàn)有技術(shù)的不足的至少一個(gè)或提供一種有益的替代。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一部分基于出于意料的發(fā)現(xiàn)即交聯(lián)到微粒上的胞壁酰二肽含有免疫刺激 性的核酸序，其可以解釋為什么還發(fā)現(xiàn)，如本文所描述的，MDP微粒能夠激活對(duì)很多固有抗 細(xì)菌和抗病毒免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)關(guān)鍵的幾種不同的免疫細(xì)胞亞群。下文中，包括核酸序的MDP 微粒將被稱(chēng)為“MDP/DNA微?！薄＿M(jìn)一步地，MDP/DNA微粒可以被一個(gè)或更多個(gè)能夠增強(qiáng)固有抗感染免疫應(yīng)答的附 加配體和/或細(xì)菌或病毒抗原功能化，以進(jìn)一步刺激/集中免疫應(yīng)答。根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供一種由病毒和/或細(xì)菌引起的感染的預(yù)防或治療方 法，其包括向需要它們的對(duì)象施加有效量的MDP/DNA微粒。優(yōu)選地，MDP/DNA微粒激活固有免疫應(yīng)答。更優(yōu)選地，固有免疫應(yīng)答包括NK細(xì)胞，漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pDC)或單核細(xì)胞的 固有免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，MDP/DNA微粒進(jìn)一步誘導(dǎo)和/或刺激至少一種細(xì)胞因子的釋放。細(xì)胞因子優(yōu)選為免疫/前炎性和/或調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子。優(yōu)選地，免疫/前炎性和/或調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子為干擾素-α (IFN-α)、干擾 素-Y (IFN- γ )、白細(xì)胞介素10 (IL-10)、白細(xì)胞介素6 (IL-6)、白細(xì)胞介素1 β (IL-1 β )、腫 瘤壞死因子α (TNF-α)、白細(xì)胞介素12(IL_12)以及⑶8抗病毒因子等。優(yōu)選地，MDP/DNA微粒調(diào)動(dòng)固有抗病毒和/或抗細(xì)菌免疫性的其它方面。更優(yōu)選地，上述固有抗病毒和/或抗細(xì)菌免疫性的其它方面能夠與IFN- α協(xié)同作 用。為了增強(qiáng)固有抗病毒和/或抗細(xì)菌免疫應(yīng)答的功效，可以將MDP/DNA微粒與至少 一種結(jié)合在微粒上或內(nèi)、能夠刺激在病毒和/或細(xì)菌細(xì)胞損傷和/或銷(xiāo)毀中有效的特異免 疫細(xì)胞亞群的免疫刺激配體組合。優(yōu)選地，配體選自TLR1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，N0D-1, N0D-2等或它們的任意組合。能夠?qū)DP/DNA微粒設(shè)計(jì)為支持優(yōu)先誘導(dǎo)Thl或Th2型免疫性。此外，吸收除了 進(jìn)一步佐劑配體之外的一系列免疫原的能力允許建立能夠優(yōu)選同時(shí)輸送抗原和佐劑至接 種疫苗的靶向細(xì)胞的單劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，MDP/DNA微粒包括至少一種病毒和/或細(xì)菌抗原。合適的抗原 的例子包括但不限于結(jié)核桿菌抗原例如抗原-85A，抗原-85B，ESAT和CFP-10。也可以使用 這些抗原的任意組合。優(yōu)選的流感抗原來(lái)源于循環(huán)株的紅血球凝集素和神經(jīng)氨酸酶基因。 鼠疫抗原可從毒素成分Fl，V或二者的組合-所謂的Fl-V融合抗原中獲得。其它可以與本 發(fā)明的組分一起使用的病毒和細(xì)菌抗原對(duì)于本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。優(yōu)選地，MDP/DNA微粒的直徑為約0. 05至3. 0微米。更優(yōu)選直徑為0. 2至2. 0微 米。最優(yōu)選地，直徑為0. 2至1. 0微米或者直徑為0. 5to 1. 0微米。
優(yōu)選地，MDP/DNA微粒在包含一種或更多種制藥或獸醫(yī)輔料，載體或溶劑的組合物中。優(yōu)選地，由病毒和/或細(xì)菌引起的感染的預(yù)防或治療方法進(jìn)一步包括施加另外一 種有效預(yù)防或治療由病毒和/或細(xì)菌引起的感染的治療劑。優(yōu)選地，上述另外一種治療劑為同時(shí)或順序施加的疫苗和/或抗生素。對(duì)象優(yōu)選為哺乳動(dòng)物或更優(yōu)選地為人。優(yōu)選地，待治療的感染選自但不限于流感，鼠疫和結(jié)核。優(yōu)選地，MDP/DNA微粒能夠作為NK細(xì)胞的趨化劑。優(yōu)選地，MDP/DNA微粒能夠作為NK細(xì)胞毒素的趨化劑。MDP/DNA微粒還能夠作為抑制病毒和/或細(xì)菌復(fù)制的可溶性因子的趨化劑。根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供具有抗感染活性的藥物組合物，包括MDP/DNA微粒，其 中MDP/DNA微粒包括核酸和選擇性的藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)第三方面，本發(fā)明提供一種具有抗感染活性的藥物組合物，包括MDP/DNA微 粒，其中，MDP/DNA微粒包括核酸，組合一種或更多種能夠刺激有效損傷和/或破壞和/或 抑制細(xì)菌和/或病毒的免疫細(xì)胞亞群的配體，以及選擇性的藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)第四方面，本發(fā)明提供一種具有抗感染活性的藥物組合物，包括MDP/DNA微 粒，其中，MDP/DNA微粒包括核酸，組合一種或更多種細(xì)菌和/或病毒抗原，以及選擇性的藥 學(xué)上可接受的載體。合適的藥學(xué)上或獸醫(yī)載體和劑型對(duì)于本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員是已知的。MDP/DNA微粒的核酸成分優(yōu)選為DNA。更優(yōu)選的是細(xì)菌非甲基化富含CpG的DNA。根據(jù)第五方面，本發(fā)明提供包括MDP/DNA微粒的組合物，其中，MDP/DNA微粒包括 DNA。優(yōu)選地，MDP/DNA微粒誘導(dǎo)Thl-型免疫應(yīng)答。應(yīng)當(dāng)理解，可以將其它治療和/或抗感染劑與MDP/DNA微粒組合使用或結(jié)合到 MDP/DNA微粒上。能夠同時(shí)或順序施加MDP/DNA微粒和/或其它抗感染劑。順序施加可以 為任何合適的分鐘，小時(shí)，天或星期的時(shí)限所隔開(kāi)。因此，根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供包含有效量MDP/DNA微粒的疫苗組合物。還應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的MDP/DNA微粒組合物可以等同有效地使用于適于人類(lèi)給 藥的藥學(xué)劑型和適于獸類(lèi)應(yīng)用的劑型。優(yōu)選地，劑型供人類(lèi)使用。根據(jù)第七方面，本發(fā)明提供MDP/DNA微粒在制造用于細(xì)菌和/或病毒感染的預(yù)防 或治療處理藥物中的用途。除非上下文明確要求，說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，詞“包括”，“包含”等取與排他的或 詳盡的意義相對(duì)的包容性的意義，也即是說(shuō)，具有意義“包括但不限于”。在本發(fā)明的上下文中，“胞壁酰二肽微?！笨梢耘c“微?！?，“MA”，"MDP微粒”，MDP/ DNA微粒，“MIS-416”以及“MIS”可交換地使用。在圖中，術(shù)語(yǔ)“MIS”，“MIS416”和“MDP，，相 互交換使用，并描述本發(fā)明的MDP/DNA微粒。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗感染”旨在包括MDP/DNA微粒組合物的殺菌活性(即殺害 細(xì)菌和/或病毒)和抑菌活性(即抑制/防止細(xì)菌和/或病毒的生長(zhǎng)，繁殖和/或復(fù)制)
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圖1 被人外周血髓系樹(shù)突狀細(xì)胞(mDC)，漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)化的 熒光標(biāo)記的MDP/DNA微粒(MISAF488)。圖 2 用 10 μ g/ml MDP/DNA微粒(MIS416)培養(yǎng)后的 72h 的人PBMC分泌的 IFN- γ， IL-10, IL-6, IL-I β 和 TNF-α 細(xì)胞因子。圖3 :MDP/DNA微粒(MIS)刺激(通過(guò)內(nèi)涵體/溶酶體抑制劑終止刺激)后的pDC 分泌物。圖4 通過(guò)MDP/DNA微粒(MIS)對(duì)純化的人⑶56+⑶3-NK細(xì)胞的直接免疫刺激。圖5 在使用MDP-DNA微粒刺激后，單核細(xì)胞的TNF分泌的誘導(dǎo)。圖6 在使用MDP/DNA微粒(MIS)刺激后，人PBMC同步NK殺害活性的增強(qiáng)。圖7 對(duì)HIV-I分支A和BPBMC病毒生物負(fù)載的抑制，由從1，5或10 μ g/ml的MDP/ DNA微粒(MA)刺激后的PBMC培養(yǎng)菌中在48h小時(shí)收集的培養(yǎng)上清介導(dǎo)。圖8 :MDP/DNA微粒前處理提供抗鼠疫菌氣溶膠圖9 在感染前10天，用MDP/DNA微粒(MDP)對(duì)老鼠進(jìn)行抗鼠疫菌的前處理。圖10 多種劑量的MDP-DNA微粒(MDP)的抗鼠疫菌的比較。圖11 在感染建立后，通過(guò)MDP/DNA微粒(MIS416)治療對(duì)流感A的發(fā)病率和死亡 率的抑制。圖12 :MDP/DNA微粒(NT-MDP)預(yù)防法抗炭疽毒素。圖13 MDP/DNA微粒(MIS416)佐劑-OVA免疫原結(jié)合物在Thl接種疫苗模式中誘 導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞免疫。圖14 伴隨HLA-DR下調(diào)，MDP/DNA微粒(MIS416)上調(diào)免疫共刺激分子人CD83和 CD86的人PBMC mDC和pDC表達(dá)。圖15:通過(guò)與未治療的動(dòng)物相比減少的肺Mtb菌落數(shù)來(lái)衡量MDP/DNA微粒 (MIS416)增強(qiáng)Mtb ESTAT抗原的免疫原性。
具體實(shí)施例方式沒(méi)有安全和有效的病毒和/或細(xì)菌感染的預(yù)防或治療手段激發(fā)了本發(fā)明，本發(fā)明 部分以交聯(lián)到微粒上的胞壁酰二肽(MDP微粒)對(duì)刺激固有免疫系統(tǒng)的獨(dú)特和有益的性質(zhì) 為基礎(chǔ)。出乎意料地發(fā)現(xiàn)，MDP微粒含有可能具有細(xì)菌起源的DNA片段，這可以解釋它對(duì)幾 種不同的、對(duì)很多固有和適應(yīng)抗感染免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)關(guān)鍵的免疫細(xì)胞亞群的選擇性靶向和 激活能力。這種新型包含DNA片段的MDP微粒將在本文中稱(chēng)為“MDP/DNA微?！?。雖然本發(fā)明的MDP/DNA微粒組合物本身能有效靶向和激活有助于細(xì)菌和/或病毒 的破壞的免疫系統(tǒng)的相關(guān)成分，微粒組合物的功效能夠通過(guò)能夠被偶聯(lián)到MDP/DNA微粒表 面或之內(nèi)的配體和免疫原/抗原所增強(qiáng)。本發(fā)明的組合物能夠殺死細(xì)菌和病毒(即殺菌的)，但同時(shí)也能夠預(yù)防細(xì)菌和病 毒生長(zhǎng)/繁殖/復(fù)制(也即抑菌的)。二種活性類(lèi)型在細(xì)菌和/或病毒感染的預(yù)防或治療 中均是有利的。本文中描述的MDP/DNA微粒已被設(shè)計(jì)用于誘導(dǎo)高水平的IFN- α和與廣譜固有免 疫特別是抗毒免疫的誘導(dǎo)臨床相關(guān)的其它前炎性細(xì)胞因子。非常重要地，調(diào)解細(xì)胞因子例如IL-10的同時(shí)產(chǎn)生意味著微粒能夠誘導(dǎo)調(diào)解免疫應(yīng)答因而避免與基于免疫的單一治療 關(guān)聯(lián)的高免疫刺激。所有這些已通過(guò)利用能夠在微粒制劑中誘導(dǎo)期望的廣度和程度的免疫 應(yīng)答的特定病原識(shí)別受體(PRR)配體的免疫刺激性質(zhì)實(shí)現(xiàn)。這限制了關(guān)鍵固有免疫細(xì)胞亞 群的微粒吸收，因而避免了不相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型介導(dǎo)的臨床上不能接受的副作用。例如，對(duì)MDR-Mtb (耐多藥結(jié)核分枝桿菌)的免疫性取決于⑶4和⑶8依賴(lài)的強(qiáng) Thl免疫的誘導(dǎo)，涉及主要細(xì)胞因子IFNY、IL-12*TNFa。這些細(xì)胞因子通過(guò)循環(huán)機(jī)制激 活感染的ΜΦ8和DCs來(lái)借由氧化氮和超氧化物的合成準(zhǔn)備和消除細(xì)胞內(nèi)Mtb。有趣的是， 已知Toll樣受體(TLRs)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞上的細(xì)胞因子的合成進(jìn)行調(diào)節(jié)，因而影響保護(hù)性Thl 應(yīng)答的擴(kuò)增。新興的研究表明TLR信號(hào)也可以影響細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌的宿命。然而應(yīng)理解，類(lèi)似的免疫應(yīng)答對(duì)于防止其它細(xì)菌和病毒感染是有益的，因此本發(fā) 明的組合物既可以被用作固有或特異免疫刺激劑來(lái)對(duì)抗廣泛的細(xì)菌和病毒感染。本發(fā)明組 合物的抗感染活性可以殺菌活性形式(即殺死細(xì)菌和病毒)或抑菌活性形式(預(yù)防細(xì)菌和 病毒的生長(zhǎng)復(fù)制)出現(xiàn)，二種活性類(lèi)型均有助于對(duì)對(duì)象的細(xì)菌或病毒感染的治療或預(yù)防。為了增強(qiáng)固有抗病毒和/或抗細(xì)菌免疫應(yīng)答的功效，可以將MDP/DNA微粒與至少 一種結(jié)合在微粒上或內(nèi)、能夠刺激在病毒和/或細(xì)菌細(xì)胞損傷和/或銷(xiāo)毀中有效的特異免 疫細(xì)胞亞群的免疫刺激配體組合。合適的配體可以選自描述的病原體分子模式識(shí)別受體的 已知配體，包括TLRl，2，3，4，5，6，7，8，9，10，N0D-1，N0D-2等。還能夠使用這些配體的任意 組合。其它有用的受體在本領(lǐng)域中是已知的，能夠?yàn)樗鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員容易辨別。能夠被連接到和保留在MDP/DNA微粒骨架上的功能基團(tuán)的可獲得性允許高密度 耦合其它佐劑/免疫刺激配體，其能夠以基于它們已知的生物活性的原理方式吸收。例如， N0D-1和N0D-2配體已經(jīng)被表明與合成磷脂A(TLR4配體)，聚(I C)，(TLR3配體)以及CpG 0DN(TLR-9配體)協(xié)同，用于誘導(dǎo)人樹(shù)突細(xì)胞IL-12p70的產(chǎn)生和T細(xì)胞關(guān)聯(lián)的IFN-γ的 產(chǎn)生。以類(lèi)似的方式，能夠建立MDP/DNA微粒來(lái)支持對(duì)Thl或Th2型免疫的優(yōu)先誘導(dǎo)。此 外，吸收除了進(jìn)一步佐劑配體之外的一系列免疫原的能力允許建立能夠優(yōu)選同時(shí)輸送抗原 和佐劑至接種疫苗的靶向細(xì)胞的單劑?？煽焖偾宄蛟谔囟l件例如細(xì)胞內(nèi)體/溶酶體pH降低的條件下可逆的連接劑， 對(duì)于開(kāi)發(fā)很多生物活性化合物的輸送載體有用。MDP/DNA微粒在現(xiàn)有的型式下被生產(chǎn)用于 向抗原加工/表現(xiàn)細(xì)胞提供免疫原的靶向輸送，帶有NOD配體和抗核酸TLR9配體共價(jià)結(jié)合 入微粒中的。MDP/DNA微粒含有其它功能基團(tuán)包括氨基和可氧化碳水化合物基團(tuán)，用于連接 免疫原和TLR配體。能夠采用這些功能基團(tuán)將期望的免疫原和/或配體連接，使用雙功能 交聯(lián)反應(yīng)劑例如琥珀酰亞胺、馬來(lái)酰亞胺和醛連接劑。此外，存在可氧化碳水化合物基團(tuán)， 其提供直接連接初級(jí)和次級(jí)氨基基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)，初級(jí)和次級(jí)氨基基團(tuán)可被免疫原和TLR 配體均吸收。在藥物載體的構(gòu)建中以及連接藥物和載體中，乙縮醛鍵被廣泛用作輸送藥物 的酸不穩(wěn)定鍵。醛可以作為酸不穩(wěn)定構(gòu)件模塊來(lái)交聯(lián)生物活性化合物至MDP/DNA微粒.上 的自由氨基基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方式中，MDP/DNA微粒包括至少一種病毒和/或細(xì)菌抗原。合適的抗 原離子包括但不限于結(jié)合桿菌抗原例如抗原-85A、抗原-85AB，ESAT以及CFP-10。也可以 使用這些抗原的任意組合。流感抗原通常來(lái)源于紅血球凝集素和神經(jīng)氨酸酶基因，與目前 循環(huán)株一致。鼠疫抗原可以來(lái)源于有毒成分Fl，V或二者的組合即所謂的Fl-V融合抗原。
MDP/DNA微粒優(yōu)選為耐降解。優(yōu)選地，MDP/DNA微粒劑型耐胃蛋白酶、極限pH和變 性狀態(tài)下的處理。特別是，MDP/DNA微粒劑型耐a)在pH3. 5下用胃蛋白酶處理，b)pH，其中 PH小于1 (ImM HCl)或大于11 (ImM NaOH)以及c)變性狀態(tài)，例如6M尿素或6M鹽酸胍。MDP/DNA微粒的DNA組分優(yōu)選耐核酸例如例子DNAse IMDP/DNA微粒組合物可以通過(guò)合適的手段給藥。根據(jù)本發(fā)明，使對(duì)象具有對(duì)某種 疾病免疫或治療有病的對(duì)象的方法可以采用很多方法將將疫苗組合物形成的液體溶液施 加。示例性的給藥方法是肌肉注射、皮下注射、靜脈注射、腹腔內(nèi)注射、滴眼液、通過(guò)飲水、噴 霧，或鼻腔噴霧。到施加給動(dòng)物時(shí)，任何合適的獸藥劑型可以使用。除了上面描述的那些， 劑型還可以是粉或膏形式，可以通常的方式加入到飼料或口服給藥。合適的劑型和賦形劑 能夠在標(biāo)準(zhǔn)文本中找到，例如Remington 科學(xué)和藥學(xué)實(shí)踐，19版本，1995 (Mack Publishing Co. Pennsylvania，美國(guó))，英國(guó)藥典，2000 等。雖然不希望收到任何關(guān)于本發(fā)明如何工作的理論的限制，MDP/DNA微粒劑型的處 理廣譜感染劑的能力起源于對(duì)固有殺死細(xì)胞(NK)和其它固有免疫細(xì)胞例如漿細(xì)胞樣樹(shù)突 狀細(xì)胞(PDC)和單核細(xì)胞的激活，以及由MDP/DNA微粒組分中的核酸對(duì)多重細(xì)胞因子的釋 放的誘導(dǎo)/刺激。僅是通過(guò)舉例的方式，參考附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。盡管通過(guò)舉例的方 式描述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，可以在不背離本發(fā)明范圍的情況下作出變形。此外，當(dāng)特定特征 存在已知的等同特征時(shí)，這些等同特征作為在本發(fā)明中特別提及的引入。實(shí)施例例1-MDP/DNA微粒的制備從丙酸桿菌腺胞分離出來(lái)的胞壁酰二肽(MDP)的多個(gè)重復(fù)形成了本例中MDP/DNA 微粒載體復(fù)合物的核結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的單體亞基的化學(xué)組分顯示如下
權(quán)利要求
一種由病毒和/或細(xì)菌引起的感染的預(yù)防或治療方法，包括將有效量的MDP/DNA微粒施加給需要它們的對(duì)象。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中MDP/DNA微粒激活固有免疫應(yīng)答。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述固有免疫應(yīng)答包括NK細(xì)胞，漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀 細(xì)胞(PDC)和/或單核細(xì)胞的激活。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述MDP/DNA微粒進(jìn)一步誘導(dǎo)和/或 刺激至少一種細(xì)胞因子的釋放。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自干擾素-α(IFN-α)、 干擾素-Y (IFN- γ),白細(xì)胞介素-10 (IL-10)，白細(xì)胞介素_6 (IL-6)，白細(xì)胞介 素-1 β (IL-1 β )，白細(xì)胞介素1 β (IL-1 β)，腫瘤壞死因子- α (TNF- α )，白細(xì)胞介 素-12 (IL-12)和/或⑶8抗病毒因子。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述MDP/DNA微粒包括至少一種免 疫刺激性配體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述配體選自TLR1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，N0D-1 和 / 或 N0D-2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述MDP/DNA微粒包括至少一種病 毒和/或細(xì)菌抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述至少一種病毒和/或細(xì)菌抗原選自分支桿菌 抗原-85A、抗原-85B，ESAT, CFP-10，流感血凝素抗原和/或神經(jīng)氨酸酶，鼠疫抗原Fl，V, Fl-V融合抗原或它們的組合。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括施加另一種對(duì)防止和/或 治療由病毒和/或細(xì)菌引起的感染有效的治療劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述另一種治療劑為疫苗和/或抗生素，同時(shí)或 依次施加。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對(duì)象為哺乳動(dòng)物。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的方法，其中待治療的感染選自流感，鼠疫或結(jié)核。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述MDP/DNA微粒包括Thl-型免疫應(yīng)答。
15.一種組合物，包含MDP/DNA微粒和選擇性的藥物或獸藥賦形劑、載體或溶劑。
16.包含MDP/DNA微粒和至少一種其它抗感染藥物的組合物，。
17.包含有MDP/DNA微粒和至少一種免疫刺激性配體的組合物。
18.包含有MDPP/DNA微粒和至少一種病毒和/或細(xì)菌抗原的組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物為殺菌的。
20.根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物為抑菌的。
21.一種包含權(quán)利要求15至20中任一項(xiàng)所述的MDP/DNA微粒組合物的疫苗，其用于治 療或預(yù)防細(xì)菌或病毒感染。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的疫苗，其中所述細(xì)菌或病毒感染選自鼠疫，流感和結(jié)核。
23.MDP/DNA微粒在制造預(yù)防或治療細(xì)菌和/或病毒感染的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型免疫刺激微粒組合物以及它們作為細(xì)菌和病毒感染治療中的抗感染劑的用途。
文檔編號(hào)A61K39/145GK101983063SQ200980112374
公開(kāi)日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2009年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日
發(fā)明者吉利安·愛(ài)力森·韋伯斯特, 弗朗克·B·戈?duì)柕?申請(qǐng)人:伊耐特醫(yī)療技術(shù)有限公司