專利名稱：抗原生動物的環(huán)取代的磷脂的制作方法
背景技術(shù)：
利什曼病(leishmaniasis)是一種原生動物寄生蟲病，該病流行于88個國家中，導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率。至少20種利什曼病能通過白蛉叮咬人、狗和各種野生脊椎動物宿主進(jìn)行傳播，起源于皮膚利什曼病，再擴(kuò)散到皮膚粘膜型利什曼病，更甚至成為內(nèi)臟利什曼病。估計，每年皮膚利什曼病發(fā)病例為100萬至150萬，內(nèi)臟利什曼病為500,000例。患病人數(shù)估計為3.5億人，流行人數(shù)為1200萬。日益增加的風(fēng)險因素促使利什曼病在全世界很多國家成為受關(guān)注的公眾健康問題。
治療利什曼病的最常用藥物是葡萄糖酸銻鈉(Pentostam)和甲葡胺銻酸鹽(Glucantime)。含銻的化療藥物需要胃腸外高劑量給藥，且療程長。對銻治療無效病例所使用的二線藥物包括兩性霉素B(AMB)、巴龍霉素(aminosidine)和噴他脒(pentamidine)。但是，所有這些藥物由于在有效劑量時具有無法接受的副作用而遠(yuǎn)不能達(dá)到滿意程度。最近開發(fā)的兩性霉素B的脂質(zhì)體劑型(AmBisomeTM)對于那些對銻治療無效的粘膜皮膚型利什曼病表現(xiàn)出很好的治療效率。但是，其給藥技術(shù)難度大，治療成本昂貴。
寄生蟲對含銻藥物替代品的普遍耐受性、在使用藥物的高毒性以及利什曼病/HIV聯(lián)合感染的新發(fā)疾病促使人們不斷尋找其它可選擇的治療物質(zhì)。由嬰兒利什曼原蟲(L.infantum)引起的內(nèi)臟利什曼病是一種與AIDS相關(guān)的機(jī)會感染，尤其是在歐洲南部地區(qū)。
近幾年，烷基溶解性磷脂類似物(ALPs)由于其具有抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)而引起人們極大的興趣。對各種ALPs的構(gòu)效關(guān)系的研究表明，長鏈烷基和磷酸膽堿部分是醚型脂類似物的抗腫瘤活性的必不可少的最小結(jié)構(gòu)。這一發(fā)現(xiàn)促使對烷基磷酸膽堿(APCs)的合成。在烷基鏈同族體中，十六烷基磷酸膽堿(HePC)具有抗腫瘤活性，于1992年在德國被批準(zhǔn)成藥，用于局部治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌。
體外和體內(nèi)的幾項研究表明包括HePC的烷基磷酸膽堿，以及諸如依地福新(edelfosine)、伊莫福新(ilmofosine)和SRI-62,834的烷基甘油磷酸膽堿都具有抗利什曼病的作用。據(jù)報道，十六烷基磷酸膽堿對治療感染了內(nèi)臟利什曼病的小鼠具有很好療效，口服米替福新(miltefosine)比皮下給予葡萄糖酸銻鈉的療效高600倍。在這些有前景的考察結(jié)果下，已完成了HePC(米替福新)口服治療印度人內(nèi)臟利什曼病的I期和II期臨床試驗，III期臨床試驗正在進(jìn)行中。用100-150mg/日的劑量，治療28天，治愈率達(dá)88％-100％。這樣的結(jié)果鼓舞了對米替福新在新世界治療皮膚利什曼病的療效研究，目前正處于II期臨床試驗中。在I期臨床試驗中，米替福新以100-150mg的劑量，治療3周，其治愈率達(dá)94％。各個階段的臨床試驗，米替福新表現(xiàn)的主要副作用是胃腸系統(tǒng)副作用，最常見為適度的嘔吐和腹瀉。在一些患者中還出現(xiàn)短暫的轉(zhuǎn)氨酶升高或脲/血肌氨酸酐升高的現(xiàn)象，隨著繼續(xù)治療，上述指標(biāo)都得以降低。盡管米替福新的毒性看起來比一些腸胃外給藥藥物小一些，但在嚴(yán)重患者身上，諸如營養(yǎng)不良或脫水患者身上，仍可能產(chǎn)生嚴(yán)重的胃腸道癥狀。另外，禁忌對孕婦進(jìn)行治療，這是因為米替福新有致畸作用。此外，米替福新的半衰期長，治療有效率低，一個療程的治療會使血液幾周內(nèi)都為亞治療水平。這些藥物的特性可能會引起耐藥性。在歐洲，米替福新對HIV聯(lián)合感染患者僅表現(xiàn)出暫時有效性。因此，需要尋找治療原生動物性疾病尤其是利什曼病的新型磷脂類藥物，而且這種藥物不會引起嚴(yán)重副作用。
美國專利文獻(xiàn)US 5,436,234公開了以下通式的化合物R-X-A-PO3-(CH2)2-N+R1R2R3其中，R為瓢兒菜基(erucyl)、巴西烯基(brassidyl)或二十四烯基(nervonyl)；R1，R2和R3獨自為包含至多4個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀飽和或不飽和烷基，其可含一個羥基，其中，兩個基團(tuán)可以相連形成一個環(huán)；A為化合鍵或下式之一的基團(tuán)
——CH2-CH2—CH2—O——(IV) 當(dāng)A優(yōu)選為化合鍵時，X為氧原子。通式為R-X-A-PO3-(CH2)2-N+R1R2R3的化合物及包含這些化合物的藥物組合物可被用于治療原生動物性疾病、真菌性疾病、自身免疫性疾病和骨髓損傷。
美國專利文獻(xiàn)US 6,254,879是申請?zhí)枮?8/469,779、目前美國專利號為5,980,915的部分繼續(xù)申請，其公開了口服或局部給藥用于治療原生動物性疾病尤其是利什曼病的一種新型藥劑，該藥劑含有的活性物質(zhì)是具下列通式結(jié)構(gòu)的一個或多個化合物R1-PO4-CH2CH2-N+R2R3R4其中，R1為含有12-20個碳原子的飽和烴基或具一個不飽和鍵或多個不飽和鍵的烴基。
美國專利文獻(xiàn)US 6,344,576涉及一種通式(I)的磷脂類化合物 其對水不溶或水難溶活性物質(zhì)具有助溶作用，并用于將活性物質(zhì)輸送至細(xì)胞內(nèi)來治療疾病，如癌癥和原生動物性疾病。
其中，A為
其中，R1和R2獨自為氫、飽和的或不飽和的酰基或烷基，其任選為支鏈的或/和被取代的，?；屯榛奶荚涌倲?shù)為16至44個碳原子。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個方案在于提供一種新型的含有磷脂物質(zhì)的環(huán)，及其用于治療原生動物性疾病，諸如利什曼病、錐蟲病、瘧疾、弓形體病、babeosis、阿米巴痢疾和蘭伯氏鞭毛蟲病(lambliasis)的應(yīng)用。本發(fā)明的化合物包括通式A-X-PO3-W的磷脂類物質(zhì)。
本發(fā)明的另一個方案涉及一種上述化合物的制備方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步方案涉及一種治療原生動物感染的方法，其包括以治療方式施用有效量的能抑制感染的本發(fā)明化合物。
通過以下詳細(xì)描述、詳細(xì)特征、特性、特點以及相關(guān)要素、制備步驟、在說明書和實施例中闡述的與其他各要素相關(guān)的內(nèi)容來進(jìn)一步理解本發(fā)明。


圖1顯示了在不同濃度的本發(fā)明化合物存在下，所存活的THP1細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
圖2為本發(fā)明的一些化合物。
圖3所選實施例的溶血活性與米替福新的比較。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種新型的通式為A-X-PO3-W的含有環(huán)的磷脂物質(zhì)，及其旋光異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體以及其生理可接受鹽，和包含上述物質(zhì)的藥物組合物。
通式為A-X-PO3-W的本發(fā)明磷脂化合物在殘基A中磷脂結(jié)構(gòu)處含有各種大小和形狀的環(huán)，這是現(xiàn)有技術(shù)中沒有公開過的?，F(xiàn)有技術(shù)的化合物的殘基A中僅含有直鏈或支鏈烷基取代基，除美國專利文獻(xiàn)5,436,234外，其殘基A中具有四氫呋喃取代基。本發(fā)明的化合物并沒有包含現(xiàn)有技術(shù)的化合物。
本發(fā)明的新型環(huán)取代的磷脂類物質(zhì)通過通式A-X-PO3-W表示。
A包括選自下式之一的基團(tuán)Y、YR1、R1Y、R1YR4、R1OY、YOR1、R1YOR2或R1OYOR2。A優(yōu)選為YR1、R1YOR2或R1OYOR2。
W包括選自下式之一的基團(tuán)R3Q或含有一個氮原子的C4-C7非芳香性雜環(huán)，其中所述的雜環(huán)包括至少一個雜原子，該雜原子獨自地選自氮、氧、硫及其混合，所述雜環(huán)可以被一個或多個取代基所取代。優(yōu)選地，取代基獨立地選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基或氨基。
Y包括碳環(huán)、含至少一個取代基的碳環(huán)、稠合雙環(huán)、含至少一個取代基的稠合雙環(huán)、橋雙環(huán)、含至少一個取代基的橋雙環(huán)、橋三環(huán)、含至少一個取代基的橋三環(huán)、雜環(huán)、含至少一個取代基的雜環(huán)、芳環(huán)體系或含至少一個取代基的芳環(huán)體系、雜芳環(huán)體系或含至少一個取代基的雜芳環(huán)體系。
X包括化合鍵、亞甲基(-CH2-)或選自氮、氧、硫的一個雜原子。優(yōu)選的雜原子為氧原子。
R1包括選自含有約3至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、含有約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、含有約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、含有約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)或至少一個環(huán)原子上具有一個取代基的上述任意基團(tuán)、含有約3至約20個碳原子的飽和的或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴、含有約3至約20個碳原子的飽和的或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴，其含有一個或多個獨立選擇的雜原子、含有約3至約20個碳原子的飽和的或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴，其含有至少一個獨自選立于約4至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)、或在至少一個環(huán)原子上具有一個取代基的上述任意環(huán)、或上述任意約3至約20個碳原子的烴鏈，其含至少一個獨立選擇的取代基。優(yōu)選地，約3至約20個碳原子烴鏈的取代基獨立選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基或氨基。
R2包括任意一種環(huán)，其選自含約3至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、含約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、含約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、含約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)、至少一個環(huán)原子上具有一個取代基的上述任意基團(tuán)、含約2至約5個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴鏈、含約2至約5個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴鏈，其具有一個或多個獨立選擇的雜原子、含約2至約5個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴鏈，其包含至少一個獨立選自于含約4至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)；在至少一個環(huán)原子上具有一個取代基的上述任意基團(tuán)、或上述任意含約2至約5個碳原子的烴鏈，其含有至少一個獨立選擇的取代基。
優(yōu)選地，R2包括C2飽和或不飽和烷基或烯基、可被一個或多個選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基和氨基的取代基所取代的C2飽和或不飽和烷基或烯基。
R3包括任意選自含約3至約9個環(huán)原子的碳環(huán)、含約4至約9個環(huán)原子的雜環(huán)、含約5至約9個環(huán)原子的芳環(huán)、含約5至約9個環(huán)原子的雜芳環(huán)、在至少一個環(huán)原子上有取代基的上述任意基團(tuán)、約C2至約C5的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪烴鏈、約C2至約C5的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪烴鏈，其包含一個或多個分別選擇的雜原子、約C2至約C5的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪烴鏈，其至少包含一個分別選自于含約4至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)；或在至少一個環(huán)原子上有取代基的上述任意環(huán)、或上述任意約C2至約C5烴鏈，其含有至少一個獨立選擇的取代基。
優(yōu)選地，R3包括C2飽和或不飽和烷基或烯基、可被一個或多個選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基和氨基的取代基所取代的C2飽和或不飽和烷基或烯基，或C1位與氧相連、C2位與Q相連的C3-C8的環(huán)烷基。
R4包括獨立選自R1或R2的任意基團(tuán)。
Q包括銨基，該銨基可一次或多次被C1-C6烷基取代、或包括C3-C7雜環(huán)，其含有一個與R3相連的氮原子，其中所述雜環(huán)可以含有一個或多個分別選自氮、氧、硫及其組合的雜原子，該雜環(huán)還可被一個或多個取代基所取代、雜雙環(huán)，其含有與R3相連的一個氮原子，其中所述雜雙環(huán)可以含有一個或多個分別選自氮、氧、硫及其組合的雜原子，該雜雙環(huán)可被一個或多個取代基所取代、雜三環(huán)，其含有與R3相連的一個氮原子，其中所述雜三環(huán)可以含有一個或多個分別選自氮、氧、硫及其組合的雜原子，該雜三環(huán)可被一個或多個取代基所取代。優(yōu)選地，取代基獨自選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基和氨基。
優(yōu)選的R1殘基的實例包括C5-C18亞烷基或C5-C18烷基，最優(yōu)選的是亞戊基、亞十一烷基、亞十二烷基、亞十四烷基、亞十六烷基、或戊基、十一烷基、十二烷基、十四烷基和十六烷基。
優(yōu)選的Y殘基的實例包括C3-C6碳環(huán)、取代的碳環(huán)、橋三環(huán)體系或取代的橋三環(huán)體系、芳環(huán)，最優(yōu)選的是環(huán)己基、金剛烷基或苯基。
R2和R3最優(yōu)選的是C2飽和烷基。X最優(yōu)選的是氧。Q最優(yōu)選的是三甲基銨或N-甲基嗎啉代(morpholinio)或N-甲基哌啶子基(piperidinio)。
本發(fā)明的化合物包括任何所有異構(gòu)體和旋光體，以及其加成鹽，尤其是藥學(xué)可接受加成鹽。通常，本發(fā)明的組合物可以選擇性的制成包括本發(fā)明公開的適宜化合物，或由本發(fā)明的化合物所組成，或基本上由本發(fā)明的化合物組成的制劑。本發(fā)明的組合物還可以或可選擇性地制成不含有或基本上不含有現(xiàn)有技術(shù)組合物中使用的組分、材料、組成、賦形劑等物質(zhì)，或者對于實現(xiàn)本發(fā)明功能和/或目的沒有必要的物質(zhì)。
除非特別定義，“?；钡耐ㄊ綖?C(O)烷基。
除非特別定義，“酰氧基”的通式為-O-?；?。
除非特別定義，“醇”的通式為烷基-OH，包括一級、二級和三級醇形式。
除非特別定義，“烷基”或“低級烷基”是指含1至約16個碳原子的直鏈、支鏈、或環(huán)狀的烷基，其包括如甲基、乙基、丙基、丁基、己基、辛基、異丙基、異丁基、叔丁基、環(huán)丙基、環(huán)己基、環(huán)辛基、乙烯基和烯丙基。烷基可以是飽和的或不飽和的。除非另有特別限定，烷基可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。除非另有特定限定，環(huán)烷基包括單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)和多環(huán)，如降冰片基、金剛烷基和相關(guān)的萜類。
除非另有特別限定，“烷氧基”的通式為-O-烷基。
除非另有特別限定，“烷基巰基”的通式為-S-烷基。
除非另有特別限定，“烷基氨基”的通式為-NH-烷基。
除非另有特別限定，“二烷基氨基”的通式為-N-(烷基)2。除非另有特別限定，二烷基氨基包括環(huán)胺化合物，如哌啶和嗎啉。
除非另有特別限定，芳環(huán)是含有約5個至約7個環(huán)原子的不飽和環(huán)結(jié)構(gòu)，其中的環(huán)原子僅為碳原子。芳環(huán)結(jié)構(gòu)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。
除非另有特別限定，“芳基”是指環(huán)原子僅為碳原子的芳環(huán)體系，如苯基、聯(lián)苯基或萘基。芳基可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。
除非另有特別限定，“芳酰基”的通式為-C(＝O)-芳基。
除非另有特別限定，雙環(huán)結(jié)構(gòu)包括兩個稠合環(huán)或橋環(huán)，其環(huán)原子僅為碳原子。雙環(huán)結(jié)構(gòu)可以是飽和的或不飽和的。雙環(huán)結(jié)構(gòu)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。各單環(huán)可以相同也可不同。雙環(huán)結(jié)構(gòu)的實例包括二甲基-雙環(huán)[3，1，1]庚烷、雙環(huán)[2，2，1]庚二烯、十氫萘和二環(huán)辛烷。
除非另有特別限定，碳環(huán)是指具有約3至約8個僅為碳的環(huán)原子的飽和的或不飽和的非芳環(huán)結(jié)構(gòu)，如，環(huán)己二烯或環(huán)己烷。該碳環(huán)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。
除非另有特別限定，“鹵素”是指選自于氟、氯、溴和碘的原子。
除非另有特別限定，雜芳環(huán)是指具有約5至約8個環(huán)原子的不飽和環(huán)結(jié)構(gòu)，所述環(huán)原子包含碳原子和一個或多個包括氧、氮和/或硫的雜原子，如吡啶、呋喃、喹啉及它們的衍生物。雜芳環(huán)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。
除非另有特別限定，雜雙環(huán)結(jié)構(gòu)包括兩個稠合環(huán)或橋環(huán)，其環(huán)原子包括碳原子和一個或多個包括氧、氮和/或硫的雜原子。雜雙環(huán)結(jié)構(gòu)可以是飽和的或不飽和的。雜雙環(huán)結(jié)構(gòu)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。各單環(huán)可以相同也可不同。雜雙環(huán)結(jié)構(gòu)的實例包括莨菪烷、奎寧環(huán)和四氫苯并呋喃。
除非另有特別限定，雜環(huán)是指具有約3至約8個環(huán)原子的飽和或不飽和環(huán)結(jié)構(gòu)，所述環(huán)原子包含碳原子和一個或多個包括氧、氮和/或硫的雜原子，如哌啶、嗎啉、哌嗪、吡咯烷、硫代嗎啉、四氫吡啶及它們的衍生物。所述雜環(huán)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。
除非另有特別限定，雜三環(huán)結(jié)構(gòu)包括三個環(huán)，其可以是稠合環(huán)、橋環(huán)或既包括稠合環(huán)又包括橋環(huán)的三環(huán)，其環(huán)原子包括碳原子和一個或多個包括氧、氮和/或硫的雜原子。雜三環(huán)結(jié)構(gòu)可以是飽和的或不飽和的。雜三環(huán)結(jié)構(gòu)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。各單環(huán)可以相同也可不同。雜三環(huán)結(jié)構(gòu)的實例包括2，4，10-三氧雜金剛烷、四十氫鄰二氮雜菲。
除非另有特別限定，雜多環(huán)結(jié)構(gòu)包括三個以上的環(huán)，其可以是稠合環(huán)、橋環(huán)或既包括稠合環(huán)又包括橋環(huán)的雜多環(huán)，其環(huán)原子包括碳原子和一個或多個包括氧、氮和/或硫的雜原子。雜多環(huán)結(jié)構(gòu)可以是飽和的或不飽和的。雜多環(huán)結(jié)構(gòu)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。各單環(huán)可以相同也可不同。雜多環(huán)結(jié)構(gòu)的實例包括氮雜金剛石、5-降冰片烯-2，3-二羧甲酰亞胺。
除非另有特別限定，術(shù)語“苯?；钡耐ㄊ綖?苯基-酰基。
除非另有特別限定，多環(huán)結(jié)構(gòu)包括三個以上的環(huán)，其可以是稠合環(huán)、橋環(huán)或既包括稠合環(huán)又包括橋環(huán)的雜多環(huán)，其環(huán)原子僅為碳原子。多環(huán)結(jié)構(gòu)可以是飽和的或不飽和的。多環(huán)結(jié)構(gòu)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。各單環(huán)可以相同也可不同。多環(huán)結(jié)構(gòu)的實例包括金剛石、二環(huán)辛烷、降莰烷和雙環(huán)壬烷。
除非另有特別限定，螺環(huán)是指兩個環(huán)僅有一個共用環(huán)原子的環(huán)體系。螺環(huán)可以包括具有約3個至約8個環(huán)原子的飽和碳環(huán)、具有約3個至約8個環(huán)原子的雜環(huán)，其中約3個環(huán)原子可以是N、S或O或其組合。
除非另有特別限定，三環(huán)結(jié)構(gòu)包括僅為碳環(huán)原子三個環(huán)，其可以是稠合環(huán)、橋環(huán)或既包括稠合環(huán)又包括橋環(huán)的三環(huán)。三環(huán)結(jié)構(gòu)可以是飽和的或不飽和的。三環(huán)結(jié)構(gòu)可以是未被取代的、在任意位置上的單取代或可能情況下的多取代。各單環(huán)可以相同也可不同。三環(huán)結(jié)構(gòu)的實例包括芴和蒽。
除非另有特別限定，術(shù)語“取代”是指被如下取代基在任意位置上的取代。上述所述的本發(fā)明所采用的取代基是不明顯降低本發(fā)明化合物生物活性的基團(tuán)。不明顯降低本發(fā)明化合物生物活性的取代基包括，如H、鹵素、N3、NCS、CN、NO2、NX1X2、OX3、OAc、O-?；?-芳?；?、O烷基OH、O烷基NX1X2、NH-?；H-芳?；?、NHCO烷基、CHO、CF3、COOX3、SO3H、PO3X1X2、OPO3X1X2、SO2NX1X2、CONX1X2、烷基、醇、烷氧基、烷基巰基、烷基氨基、二烷基氨基、磺酰氨基、硫代烷氧基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、或當(dāng)被取代結(jié)構(gòu)有兩個相鄰碳原子時，取代基可以為亞甲基二氧基，其中X1和X2獨立地包括H或烷基，或X1和X2共同包括含有約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)的一部分，且任選還含有選自O(shè)、N或S的一個雜原子，或X1和X2共同包括含有約5至約6個環(huán)原子的酰亞胺環(huán)的一部分，X3包括H、烷基、羥基低級烷基、或烷基-NX1X2。除非另有特別限定，取代基團(tuán)可以在任意位置取代。
本發(fā)明還涉及原生動物性疾病如利什曼病、錐蟲病、瘧疾、弓形體病、babeosis、阿米巴痢疾和蘭伯氏鞭毛蟲病(lambliasis)的治療方法。該方法包括以治療方式給予抑制感染有效量的一種本發(fā)明化合物。在一個實施方式中，有效劑量包括足量的一種旋光體或旋光體的混合物，其所述化合物的所有旋光體都具有抗原生動物的性質(zhì)。在另一個實施方式中，化合物只有一種旋光體具有顯著的抗原生動物性質(zhì)，其有效劑量包括足量的純的抗原生動物的旋光體。
本發(fā)明的化合物可以局部給藥、腸道給藥、腸胃外給藥，藥物可以是液體或固體形式。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種制備所述化合物的方法。通式為A-X-PO3-W的本發(fā)明的化合物通過下述方法進(jìn)行合成i)在有機(jī)溶劑如四氫呋喃中用三氯氧化磷處理適宜的醇A-OH，其中A的定義如上。溶劑中含有有機(jī)堿，如三乙胺，其能夠在水解后提供相應(yīng)的磷酸衍生物。
ii)在諸如吡啶的有機(jī)堿中，用1-(1，3，5-三甲基苯(mesitylen)-2-磺?；?-3-硝基-1H 1，2，4-三唑或2，4，6-三異丙基苯磺酰氯處理上述磷酸，隨后加入適宜醇W-OH，其中W的定義如上，然后加熱混合物，水解后得到磷脂A-X-PO3-W。
通過以下非限定性實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步舉例說明。
實施例合成方法總方法所有反應(yīng)在嚴(yán)格干燥條件下進(jìn)行。所有新化合物的NMR圖譜由BrukerAC 300光譜儀記錄，在300MHz下測定1H，在75.43MHz下測定13C，在121.44MHz下測定31P。在7.24ppm下的CHCl3共振以單位δ表示1H NMR光譜，作為化學(xué)位移共振。13C NMR的位移采用77.00ppm下相對于CDCl3的單位來表示，31PNMR光譜采用相對于85％H3PO4的單位δ表示，作為外標(biāo)。薄層色譜使用的硅膠板為MerckF254。用硅膠(200-400目)進(jìn)行色譜純化。
制備醚型磷脂的總方法在含有三氯氧化磷(0.09mL，1mmol)和三乙胺(0.25mL，1.8mmol)的干燥THF(5mL)中，0℃下，逐滴加入干燥THF(7mL)中的相應(yīng)醇(1mmol)。室溫攪拌混合物2個小時，然后加水(3mL)進(jìn)行水解。室溫攪拌1小時后，用水稀釋反應(yīng)混合物，然后用乙酸乙酯和二氯甲烷提取水相。用鹽水洗滌混合有機(jī)提取物，然后用無水Na2SO4干燥，真空下蒸除溶劑，得到相應(yīng)的磷酸衍生物，加入7mL無水吡啶并在40℃下攪拌2個小時，使磷酸衍生物轉(zhuǎn)化為吡啶鹽。冷卻后，真空下蒸除溶劑，在殘余物中加入吡啶(5mL)。邊冷卻所得溶液邊逐滴加入干燥吡啶(2mL)中的1-(1，3，5-三甲基苯-2-磺?；?-3-硝基-1H-1，2，4-三唑(MSNT)(0.593g，2mmol)或2，4，6-三異丙基苯磺酰氯(TIPS-C1)(0.606g，2mmol)溶液，之后加入膽堿鹽酸鹽(0.210g，1.5mmol)或N(2-羥乙基)-N-甲基哌啶溴化物(0.448g，1.5mmol)或N-(2-羥乙基)-N-甲基嗎啉溴化物(0.452g，1.5mmol)。在40℃下攪拌反應(yīng)混合物達(dá)48-56個小時。冷卻后，加入水(2mL)和2-丙醇(7mL)，室溫攪拌1個小時，使反應(yīng)混合物水解。真空下蒸除溶劑，用色譜柱純化所得粗產(chǎn)物，先用CH2Cl2/MeOH/25％NH4OH(60/50/5)洗脫，然后用MeOH/25％NH4OH(95/5)洗脫，真空下蒸除溶劑。用CHCl3稀釋殘余物，孔膜(0.5M，F(xiàn)H Millipore)過濾。蒸除溶劑，得到目標(biāo)產(chǎn)物。
實施例11-{2-{[(4-亞十二烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，采用2-(4-亞十二烷基環(huán)己氧基)乙醇、TIPS-C1和鹽酸膽堿，得到上述命名的化合物(0.327g，69％)。1H NMRδ5.06(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.24(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.89(broad s，2H)，3.76(broad s，2H)，3.57(broad s，2H)，3.40-3.35(m，1H，CHO)，3.30(s，9H，N+(CH3)3)，2.40-1.72(m，8H)，1.42-1.33(m，2H)，1.24(broad s，18H，(CH2)9)，0.84(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMRδ-2.16。
實施例21-{2-{[(4-亞十二烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，利用2-(4-亞十二烷基環(huán)己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2-羥基乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.350g，68％)。1HNMRδ5.16(t，J＝6.70Hz，1H，C＝CH)，4.24(bs，2H，POCH2CH2N)，3.82-3.55(m，10H)，3.30(broad s，1H，CHO)，3.25(s，3H，N+CH3)，1.92-1.43(m，14H)，1.41-1.32(m，2H，CH2CH＝)，1.19(broad s，18H，(CH2)9)，0.83(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31PNMRδ-2.1。
實施例31-{2-{[(4-亞十二烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，利用2-(4-亞十二烷基環(huán)己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2-羥基乙基)-N-甲基嗎啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.330g，64％)。1HNMRδ5.11(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.13(s，2H，POCH2CH2N)，3.82-3.32(m，15H)，3.16(s，3H，N+CH3)，1.92-1.47(m，8H)，1.42-1.34(m，2H，CH2CH＝)，1.27(broad s，18H，(CH2)9)，0.83(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMRδ-2.04。
實施例4
1-{2-{[(4-亞十四烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，采用2-(4-亞十四烷基環(huán)己氧基)乙醇、TIPS-C1和鹽酸膽堿，得到上述命名的化合物(0.166g，33％)。1H NMRδ5.05(t，J＝6.7Hz，1H，CH＝C)，4.23(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.88(broad s，2H)，3.75(broad s，2H)，3.55(broad s，2H，CH2N)，3.40-3.35(m，1H，CHO)，3.32(s，9H，N+(CH3)3)，2.41-2.37(m，1H)，2.17-2.13(m，1H)，1.89-1.74(m，8H)，1.21(broad s，22H，(CH2)11)，0.89(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMRδ-2.26；13C NMRδ136.9，122.7，74.3，67.7，64.7，54.2，33.4，32.5，31.9，30.1，29.6，29.3，27.4，24.9，22.6，14.0。
實施例51-{2-{[(4-亞十四烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，利用2-(4-亞十四烷基環(huán)己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2-羥基乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.201g，37％)。1HNMRδ5.21(t，J＝6.7Hz，1H，CH＝C)，4.31(bs，2H，POCH2CH2N)，3.93-3.80(m，4H)，3.60-3.43(m，6H，CH2N(CH2)2)，3.30(broad s，4H，NCH3，CHO)，2.40-1.40(m，16H)，1.23(broad s，22H，(CH2)11)，0.88(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31PNMRδ-2.4。
實施例61-{2-{[(4-亞十四烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，利用2-(4-亞十四烷基環(huán)己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2-羥基乙基)-N-甲基嗎啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.218g，40％)。1HNMRδ5.06(t，J＝6.7Hz，1H，CH＝C)，4.07(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.49-3.17(m，5H)，3.11(s，3H，N+CH3)，1.99-1.34(m，10H)，1.08(broad s，22H，(CH2)11)，0.78(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMRδ-1.9。
實施例71-{2-{[(4-亞十六烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，采用2-(4-亞十六烷基環(huán)己氧基)乙醇、TIPS-C1和鹽酸膽堿，得到上述命名的化合物(0.196g，37％)。1H NMRδ5.08(t，J＝6.7Hz，1H，CH＝C)，4.09(broad s，2H，OP(O)CH2CH2N)，3.82(broad s，2H，OCH2CH2OP)，3.71(broad s，2H，OCH2CH2OP)，3.51-3.43(m，2H，CH2N)，3.04(s，10H，CHO，N+(CH3)3)，2.45-2.40(m，1H)，2.25-2.20(m，1H)，2.02-1.85(m，6H)，1.51-1.42(m，2H，CH2CH＝)，1.09(broad s，26H，(CH2)13)，0.71(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMRδ-2.04。
實施例81-{2-{[(4-亞十六烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，利用2-(4-亞十六烷基環(huán)己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2-羥基乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.211g，37％)。1HNMRδ5.13(t，J＝6.7Hz，1H，CH＝C)，4.35(broad s，2H，POCH2)，3.87(broads，2H)，3.78(broad s，2H)，3.62-3.45(m，6H)，3.26(broad s，4H)，2.27-1.63(m，8H)，1.52-1.41(m，2H，CH2CH＝)，1.24(broad s，26H，(CH2)13)，0.89(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMRδ-2.0；13C NMRδ138.0，117.4，75.1，67.8，67.7，64.8，63.3，61.8，58.7，48.8，37.2，31.8，30.1，29.7，29.6，29.4，29.3，28.4，27.7，27.2，22.5，20.9，20.1，14.0。
實施例91-{2-{[(4-亞十六烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，利用2-(4-亞十六烷基環(huán)己氧基)乙醇、TIPS-C1和N-(2-羥基乙基)-N-甲基嗎啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.206g，36％)。1HNMRδ5.06(t，J＝6.70Hz，1H，CH＝C)，4.41(bs，2H，POCH2)，3.99-3.39(m，15H)，3.35(s，3H，N+CH3)，2.45-2.40(m，1H，CHCHOCH2)，2.25-2.20(m，1H，CH2CHOCH)，2.13-1.85(m，6H)，1.22(broad s，28H，(CH2)14)，0.89(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMRδ-2.17；13C NMRδ136.8，122.8，65.3，60.7，33.4，33.3，32.4，31.8，30.1，29.6，29.4，29.3，27.4，24.9，22.6，14.0。
實施例101-{2-{[(5-亞環(huán)己基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，采用5-亞環(huán)己基戊醇、MSNT和鹽酸膽堿，得到上述命名的化合物(0.219g，66％)；1H NMRδ4.99(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.21(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.74(broad s，4H，CH2OPOCH2CH2N)，3.34(s，9H，N+(CH3)3)，2.09-1.84(m，6H)，1.55-1.28(m，10H)；31P NMRδ-2.16；13CNMRδ139.8，120.8，66.1，65.4，59.1，54.2，37.1，30.6，28.6，27.8，26.9，26.4，25.6；ESI-MS m/z3 56.2(M++Na+)，334.2(M+)。
實施例111-{2-{[(5-亞環(huán)己基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用5-亞環(huán)己基戊醇、MSNT和N-(2-羥乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.153g，41％)；1H NMRδ5.02(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.28(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.82-3.42(m，8H，CH2OPOCH2CH2N(CH2)2)，3.31(s，3H，N+CH3)，2.08-1.48(m，16H)，1.23(broads，6H，(CH2)3)；31P NMRδ-2.04；ESI-MS m/z374.2(M+)。
實施例121-{2-{[(5-亞環(huán)己基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用5-亞環(huán)己基戊醇、MSNT和N-(2-羥乙基)-N-甲基嗎啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.153g，41％)。1H NMRδ5.01(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.29(broad s，2H，POCH2CH2N)，4.11-3.68(m，12H)，3.42(s，3H，N+CH3)，2.09-1.95(m，4H)，1.58-1.49(m，6H)，1.31(broad s，6H，(CH2)3)；31P NMRδ-2.23；ESI-MS m/z376.2(M+)。
實施例13
1-{2-{[(11-亞環(huán)己基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，采用11-亞環(huán)己基十一烷醇、MSNT和鹽酸膽堿，得到上述命名的化合物(0.220g，52％)。1H NMRδ5.05(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.20(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.75-3.68(m，4H，CH2OPOCH2CH2N)，3.26(s，9H，N+(CH3)3)，2.11-1.92(m，4H)，1.65-1.48(m，6H)，1.23(broad s，18H，(CH2)9)；31P NMRδ-2.45；13C NMRδ131.0，124.8，66.1，66.0，59.1，54.1，31.0，30.2，29.9，29.7，29.6，29.5，29.3，28.6，28.0，27.8，27.0，26.9，25.9，25.7；ESI-MS m/z440.2(M++Na+)，418.2(M+)。
實施例141-{2-{[(11-亞環(huán)己基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用11-亞環(huán)己基十一烷醇、MSNT和N-(2-羥乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.315g，69％)。1H NMRδ4.99(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.23(bs，2H，POCH2CH2N)，3.78-3.48(m，8H，CH2OPOCH2CH2N(CH2)2)，3.27(s，3H，N+CH3)，2.04-1.45(m，16H)，1.18(broads，18H，(CH2)9)；31P NMRδ-2.04；13C NMRδ130.9，124.7，65.3，63.2，58.4，48.5，37.0，31.0，30.9，30.1，29.8，29.6，29.5，29.4，29.2，28.6，27.9，27.7，26.8，25.8，25.6；ESI-MS m/z480.3(M++Na+)，458.3(M+)。
實施例151-{2-{[(11-亞環(huán)己基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用11-亞環(huán)己基十一烷醇、MSNT和N-(2-羥乙基)-N-甲基嗎啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.117g，25％)。1H NMRδ5.05(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.29(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.99-3.70(m，12H)，3.48(s，3H，N+CH3)，2.08-1.92(m，4H)，1.65-1.48(m，6H)，1.23(s，18H，(CH2)9)；31P NMRδ-2.13；13C NMRδ131.0，124.8，65.8，64.3，60.7，58.5，48.3，37.1，31.0，30.9，29.9，29.7，29.6，29.5，29.4，29.3，28.6，28.2，28.0，27.8，27.0，25.8，25.7，17.6。
實施例161-{2-[(5-亞金剛烷基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，采用5-亞金剛烷基戊醇、MSNT和鹽酸膽堿，得到上述命名的化合物(0.223g，58％)。1H NMRδ4.96(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.22(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.77-3.71(m，4H，CH2OPOCH2CH2N)，3.29(s，9H，N+(CH3)3)，2.75(s，1H，CHC＝)，2.27(s，1H，CHC＝)，1.95-1.53(m，16H)，1.34-1.29(m，2H)；31P NMRδ-2.42；13C NMRδ147.7，115.9，66.3，65.5，59.1，54.3，40.5，39.8，38.9，37.2，32.0，30.6，28.6，26.6，26.2；ESI-MS m/z408.1(M++Na+)，386.1(M+)。
實施例171-{2-[(5-亞金剛烷基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用5-亞金剛烷基戊醇、MSNT和N-(2-羥乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.272g，64％)。1H NMRδ4.93(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.25(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.79-3.60(m，8H，CH2OPOCH2CH2N(CH2)2)，3.32(s，3H，N+(CH3)3)，2.72(s，1H，CHC＝)，2.24(s，1H，CHC＝)，1.92-1.50(m，22H)，1.31-1.26(m，2H)；31P NMRδ-1.9；13C NMRδ147.6，115.9，65.4，65.3，63.5，58.6，58.5，48.6，40.5，39.8，38.9，37.2，32.0，30.7，30.6，28.6，26.6，26.2，20.9，20.2；ESI-MS m/z448.2(M++Na+)，426.2(M+)。
實施例181-{2-[(5-亞金剛烷基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用5-亞金剛烷基戊醇、MSNT和N-(2-羥乙基)-N-甲基嗎啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.239g，56％)。1H NMRδ4.94(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.27(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.99-3.69(m，12H)，3.43(s，3H，N+CH3)，2.73(s，1H，CHC＝)，2.25(s，1H，CHC＝)，1.96-1.32(m，16H)，1.29-1.18(m，2H)；31P NMRδ-2.16；13C NMRδ147.8，115.8，65.6，65.5，64.3，60.7，58.5，48.3，40.5，39.8，38.9，37.2，32.0，30.6，30.5，28.6，26.6，26.5；ESI-MS m/z450.2(M++Na+)，428.2(M+)。
實施例191-{2-[(11-亞金剛烷基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，采用11-亞金剛烷基十一烷醇、MSNT和鹽酸膽堿，得到上述命名的化合物(0.248g，53％)。1H NMRδ4.98(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.21(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.75(broad s，4H，CH2OPOCH2CH2N)，3.32(s，9H，N+(CH3)3)，2.77(s，1H，CHC＝)，2.28(s，1H，CHC＝)，1.91-1.53(m，16H)，1.23(broad s，14H)；31P NMRδ-2.16；13C NMRδ147.2，116.3，66.1，65.5，59.2，54.2，40.5，39.8，38.9，37.3，32.0，31.0，30.9，29.7，29.6，29.5，29.2，28.7，26.5，25.9；ESI-MS m/z492.2(M++Na+)，470.2(M+)。
實施例201-{2-[(11-亞金剛烷基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用11-亞金剛烷基十一烷醇、MSNT和N-(2-羥乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.168g，33％)。1H NMRδ4.98(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.27(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.84-3.52(m，8H，CH2OPOCH2CH2N(CH2)2)，3.32(s，3H，NCH3)，2.76(s，1H，CHC＝)，2.27(s，1H，CHC＝)，1.92-1.53(m，22H)，1.23(broad s，14H)；31P NMRδ-2.04；13C NMRδ147.2，116.3，65.1，62.1，57.3，47.4，40.5，39.9，38.9，37.5，32.0，30.3，29.6，29.5，29.4，29.2，28.7，26.4，25.8，20.9，20.2；ESI-MS m/z532.3(M++Na+)，510.3(M+)。
實施例211-{2-[(11-亞金剛烷基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用11-亞金剛烷基十一烷醇、MSNT和N-(2-羥乙基)-N-甲基嗎啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.235mg，46％)。1H NMRδ4.99(t，J＝6.7Hz，1H，C＝CH)，4.29(broad s，2H，POCH2CH2N)，4.00-3.67(m，12H)，3.42(s，3H，N+CH3)，2.77(s，1H，CHC＝)，2.28(s，1H，CHC＝)，1.91-1.54(m，14H)，1.23(s，16H)；31P NMRδ-2.29；13C NMRδ147.2，116.3，65.7，64.9，60.7，58.5，48.3，40.5，39.8，38.9，37.3，32.0，30.9，30.4，29.7，29.6，29.5，29.3，28.6，26.5，25.8；ESI-MS m/z534.2(M++Na+)，512.2(M+)。
實施例221-{2-{[(4-(十二烷氧基)環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用2-[4-(十二烷氧基)環(huán)己氧基]乙醇、TIPS-Cl和N-(2-羥乙基)-N-甲基哌啶溴化物，得到上述命名的化合物(0.241g，45％)。1H NMRδ4.26(bs，2H)，3.88-3.79(m，4H)，3.58-3.38(m，6H)，3.36-3.27(m，7H)，1.95-1.40(m，34H)，0.83(t，J＝7.0Hz，3H)；31P NMRδ-2.26。
實施例231-{2-{[(4-(十二烷氧基)環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用2-[4-(十二烷氧基)環(huán)己氧基]乙醇、TIPS-Cl和N-(2-羥乙基)-N-甲基嗎啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.213g，40％)。1H NMRδ4.32(broad s，2H)，4.04-3.19(m，21H)，1.99-1.50(m，28H)，0.86(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)；31P NMRδ-2.5。
實施例241-{2-{[(4-(十四烷氧基)環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用2-[4-(十四烷氧基)環(huán)己氧基]乙醇、TIPS-Cl和鹽酸膽堿，得到上述命名的化合物(0.214g，38％)。1H NMRδ4.31(bs，2H)，3.93-3.84(m，4H)，3.62-3.54(m，6H)，3.36-3.27(m，7H)，1.87-1.20(m，38H)，0.83(t，J＝7.0Hz，3H)；31P NMRδ-2.32。
實施例251-{2-{[(4-(十四烷氧基)環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽通過上述總方法，采用2-[4-(十四烷氧基)環(huán)己氧基]乙醇、TIPS-Cl和N-(2-羥乙基)-N-甲基嗎啉溴化物，得到上述命名的化合物(0.236g，42％)。1H NMRδ4.32(broad s，2H)，3.96-3.19(m，21H)，1.99-1.50(m，32H)，0.86(t，J＝7.0Hz，3H)；31P NMRδ-2.11。
不飽和醚型磷脂氫化的總方法在甲醇(10mL)中的所需醚型磷脂(1mmol)的溶液中加入10％的Pd/C(10％w/w)，使所得混合物在1個大氣壓下，氫化反應(yīng)10個小時。通過硅藻土過濾，真空濃縮濾液，得到純產(chǎn)物。
實施例261-{2-{[(4-(十二烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，使實施例1的化合物氫化得到上述命名的化合物(收率定量)。1H NMRδ4.31(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.93(broad s，2H，CH2OPOCH2CH2N)，3.82(broad s，2H)，3.59(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.37(broad s，10H，CHO，N+(CH3)3)，2.05-1.95(m，1H)，1.76-1.72(m，2H)，1.46-1.10(m，28H)，0.86(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)。
實施例271-{2-{[(4-(十四烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，使實施例4的化合物氫化得到上述命名的化合物(收率定量)。1H NMRδ4.31(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.93-3.82(m，4H)，3.59-3.15(m，12H)，1.96(broad s，1H)，1.76(broad s，2H)，1.42-1.09(m，32H)，0.87(t，J＝7.0Hz，3H，CH3)。
實施例281-{2-[(11-環(huán)己基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，使實施例13的化合物氫化得到上述命名的化合物(收率定量)。1H NMRδ4.20(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.75-3.68(m，4H，CH2OPOCH2CH2N)，3.26(s，9H，N+(CH3)3)，2.09-1.12(m，13H)，1.23(s，18H，(CH2)9)。
實施例291-{2-[(5-金剛烷基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，使實施例16的化合物氫化得到上述命名的化合物(收率定量)。1H NMRδ4.27(bs，2H，POCH2CH2N)，3.79-3.09(m，13H)，2.02-1.25(m，23H)。
實施例301-{2-[(11-金剛烷基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽通過上述總方法，使實施例19的化合物氫化得到上述命名的化合物(收率定量)。1H NMRδ4.27(broad s，2H，POCH2CH2N)，3.79-3.09(m，13H)，2.02-1.25(m，35H)。
在前鞭毛體培養(yǎng)物中測試體外抗利什曼的活性利用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物)酶標(biāo)分析法為細(xì)胞存活標(biāo)記，來評價本發(fā)明的磷脂類對朵氏利什曼原蟲(LeishmaniaDonovani)和嬰兒利什曼原蟲(Leishmania infantum)的前鞭毛體的抑制作用，并與醚型磷脂十六碳烷基磷酸膽堿(米替福新)的作用相比較。因而，將嬰兒利什曼原蟲MHOM/TN/80/IPT1/LEM 235和朵氏利什曼原蟲MHOM/IN/80/DD8/LEM703的前鞭毛體培養(yǎng)于26℃的RPMI1640中，其中還加有10％FCS、L谷氨酸和抗生素。將所有新型化合物溶解于DMSO中，所得最終濃度為9.625mM，在培養(yǎng)基中以線性稀釋方式進(jìn)行3倍稀釋。將25μl的前鞭毛體培養(yǎng)液以5×105個細(xì)胞/mL置于96孔平底板中(Costar3696)，然后于26℃下，與25μl各種濃度的藥物共同培養(yǎng)。72小時后，加入10μl PBS液中的5mg/mL MTT(SIGMA M2128)，然后繼續(xù)培養(yǎng)3個小時。加入50μl的50％異丙醇、10％SDS，輕微震蕩30分鐘使反應(yīng)停止。利用TRITURUS微板讀數(shù)儀在550nm下測定吸收度，以620nm處為對照。
表1本發(fā)明的磷脂類抑制朵氏利什曼原蟲和嬰兒利什曼原蟲的前鞭毛體的體外抗利什曼活性*


*結(jié)果是以平均值±SEM表示的，n＝3-4(每個實驗重復(fù)兩次)
值得注意的是本發(fā)明活性化合物的烷基鏈長度，對于烷基磷酸膽堿類，其烷基可含5-11個碳原子，對于烷氧乙基磷酸膽堿類，其烷基可含12-14個碳原子。這將有利于這些新化合物的溶解性和/或毒性，并有利于其代謝清除。因此，我們進(jìn)一步在人體單核細(xì)胞系THP1中評價4個本發(fā)明化合物以及米替福新的細(xì)胞毒性。
在THP1單核細(xì)胞中評價細(xì)胞毒性用SYBR-14和PI(Molecular Probes，The Netherlands)雙染色，流式細(xì)胞計數(shù)后，定量測定經(jīng)各種濃度藥物培養(yǎng)后的細(xì)胞受損數(shù)。
用SYBR-14和PI進(jìn)行染色1×106個細(xì)胞/ml的THP1細(xì)胞與濃度范圍為50-1.56μM的各種濃度化合物孵育。培養(yǎng)72小時后，將約4×106個細(xì)胞懸浮于標(biāo)注的緩沖液中(10mMHEPES，150mM NaCI，10％BSA，pH7.4)，并加入10μg/ml PI和0.1mg/ml的SYBR-14。流式細(xì)胞分析之前將培養(yǎng)液于37℃下放置30分鐘。
流式細(xì)胞分析用Epics Elite型流式細(xì)胞儀(Coulter，Miami，F(xiàn)lorida)分析細(xì)胞樣本。在488nm激發(fā)SYBR-14的綠色熒光和PI的紅色熒光。每個樣本至少分析10,000個細(xì)胞，每個染色試驗重復(fù)兩次。依據(jù)熒光強度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不包括細(xì)胞的自身熒光和細(xì)胞碎片。
用合適種類的利什曼原蟲感染THP1單核細(xì)胞，通過對細(xì)胞內(nèi)寄生蟲無鞭毛體時期的抑制來評價化合物抑制利什曼原蟲的活性。如圖1所示，對感染朵氏利什曼原蟲和嬰兒利什曼原蟲的THP1單核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性評價，米替福新在50μM的低濃度下顯示了對THP1極強的細(xì)胞毒作用，而這樣的細(xì)胞毒作用并沒有在本發(fā)明活性最好的兩個類似物(化合物13和19)中看到。
權(quán)利要求
1.一種通式所示的化合物、及其生理可接受鹽以及其異構(gòu)體和旋光體A-X-PO3-W其中，A包括選自下式之一的基團(tuán)Y、YR1、R1Y、R1YR4、R1OY、YOR1、R1YOR2或R1OYOR2；W包括選自下式之一的基團(tuán)R3Q，或含有一個氮原子的C4-C7非芳香性雜環(huán)，其中所述的雜環(huán)包括至少一個雜原子，該雜原子獨立地選自氮、氧、硫及其混合，所述雜環(huán)可以被一個或多個取代基所取代；Y包括碳環(huán)、含至少一個取代基的碳環(huán)、稠合雙環(huán)、含至少一個取代基的稠合雙環(huán)、橋雙環(huán)、含至少一個取代基的橋雙環(huán)、橋三環(huán)、含至少一個取代基的橋三環(huán)、雜環(huán)、含至少一個取代基的雜環(huán)、芳環(huán)體系或含至少一個取代基的芳環(huán)體系、雜芳環(huán)體系或含至少一個取代基的雜芳環(huán)體系；X包括化合鍵、亞甲基(-CH2-)或選自氮、氧、硫的一個雜原子；R1包括選自含有約3至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、含有約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、含有約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、含有約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)；或在至少一個環(huán)原子上具有一個取代基的上述任意基團(tuán)、含有約3至約20個碳原子的飽和的或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴、含有約3至約20個碳原子的飽和的或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴，其含有一個或多個獨立選擇的雜原子、含有約3至約20個碳原子的飽和的或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴，其含有至少一個獨立選自于約4至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)；或至少在一個環(huán)原子上具有一個取代基的上述任意環(huán)、或上述任意約3至約20個碳原子的烴鏈，其含至少一個獨立選擇的取代基；R2包括選自含約3至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、含約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、含約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、含約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)；在至少一個環(huán)原子上具有一個取代基的上述任意基團(tuán)、含約2至約5個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴鏈、含約2至約5個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴鏈，其具有一個或多個獨立選擇的雜原子、含約2至約5個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪烴鏈，其包含至少一個獨立選自于含約4至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)、或至少在一個環(huán)原子上具有一個取代基的上述任意環(huán)、或上述任意含約2至約5個碳原子的烴鏈，其含有至少一個獨立選擇的取代基；R3包括任意選自含約3至約9個環(huán)原子的碳環(huán)、含約4至約9個環(huán)原子的雜環(huán)、含約5至約9個環(huán)原子的芳環(huán)、含約5至約9個環(huán)原子的雜芳環(huán)；在至少一個環(huán)原子上有取代基的上述任意基團(tuán)、約C2至約C5的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪烴鏈、約C2至約C5的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪烴鏈，其包含一個或多個獨立選擇的雜原子、約C2至約C5的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪烴鏈，其包含至少一個獨立選自于含約4至約7個環(huán)原子的碳環(huán)、約4至約7個環(huán)原子的雜環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的芳環(huán)、約5至約7個環(huán)原子的雜芳環(huán)；或在至少一個環(huán)原子上有取代基的上述任意環(huán)、或上述任意約C2至約C5烴鏈，其含有至少一個獨立選擇的取代基；R4包括任意獨自選自R1或R2的基團(tuán)。Q包括銨基，該銨基可一次或多次被C1-C6烷基取代、或包括C3-C7雜環(huán)，其含有一個與R3相連的氮原子，其中所述雜環(huán)可以含有一個或多個獨立選自氮、氧、硫及其組合的雜原子，該雜環(huán)還可被一個或多個取代基所取代、雜雙環(huán)，其含有與R3相連的一個氮原子，其中所述雜雙環(huán)可以含有一個或多個獨立選自氮、氧、硫及其組合的雜原子，該雜雙環(huán)可被一個或多個取代基所取代、雜三環(huán)，其含有與R3相連的一個氮原子，其中所述雜雙環(huán)可以含有一個或多個獨立選自氮、氧、硫及其組合的雜原子，該雜三環(huán)可被一個或多個取代基所取代。優(yōu)選地，取代基獨立選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基和氨基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中，A包括YR1、R1YOR2或R1OYOR2。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中，W包括含有一個氮原子的C4-C7非芳香性雜環(huán)，所述雜環(huán)包括至少一個選自氮、氧、硫及其組合的雜原子，所述雜環(huán)能被一個或多個取代基所取代，該取代基獨立選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基或氨基。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中，X包括氧原子。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中，R1包括含約3至約20個碳原子的飽和或不飽和的直鏈或者支鏈脂肪烴鏈，該脂肪烴鏈至少在一個環(huán)原子上具有取代基，該取代基獨立選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基或氨基。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中，R2包括C2飽和或不飽和烷基或烯基、能被一個或多個選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基和氨基的取代基所取代的C2飽和或不飽和烷基或烯基。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中，R3包括C2飽和或不飽和烷基或烯基、能被一個或多個取代基所取代的C2飽和或不飽和烷基或烯基，所述取代基選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基和氨基或者C1位與氧、C2位與Q相連的3-8個碳原子的環(huán)烷基。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中，Q包括C3-C7雜環(huán)，其含有一個與R3相連的氮原子，其中所述雜環(huán)可以含有一個或多個獨立選自氮、氧、硫及其組合的雜原子，該雜環(huán)還能被一個或多個取代基所取代，所述取代基獨自選自羥基、鹵素、烷基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、烷氧羰基、烷硫基或氨基。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中，R1包括C5-C18亞烷基或C5-C18烷基。
9.權(quán)利要求1的化合物，其中，R1包括亞戊基、亞十一烷基、亞十二烷基、亞十四烷基、亞十六烷基、戊基、十一烷基、十二烷基、十四烷基或十六烷基。
10.權(quán)利要求1的化合物，其中，Y包括C3-C6碳環(huán)、取代的碳環(huán)、橋三環(huán)體系、取代的橋三環(huán)體系或芳香環(huán)。
11.權(quán)利要求1的化合物，其中，Y包括環(huán)己基、金剛烷基或苯基。
12.權(quán)利要求1的化合物，其中，R2包括C2飽和烷基。
13.權(quán)利要求1的化合物，其中，Q包括三甲基銨、N-甲基嗎啉代基或N-甲基哌啶子基。
14.權(quán)利要求1的化合物，其中A包括R1YOR2；W包括R3Q；X包括氧；Y殘基包括碳環(huán)、取代的碳環(huán)、橋三環(huán)體系或取代的橋三環(huán)體系；R1包括C12-C18亞烷基或C12-C18烷基；R2包括C2飽和烷基；R3包括C2飽和烷基；以及Q包括銨基，該銨基可一次或多次被C1-C6烷基取代、或包括具有與R3相連的氮原子的C3-C7雜環(huán)，其中所述雜環(huán)可以含有一個或多個選自氮、氧、硫的雜原子，所述雜環(huán)可被一個或多個獨立選擇的取代基所取代。
15.權(quán)利要求1的化合物，其中包括至少下述之一的化合物1-{2-{[(4-亞十二烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-亞十二烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-亞十二烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-亞十四烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-亞十四烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-乙基哌啶鎓內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-亞十四烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-亞十六烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-亞十六烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-亞十六烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-十二烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-十四烷基環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基}乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽。
16.權(quán)利要求1的化合物，其中A包括YR1；W包括R3Q；X包括氧；Y殘基包括碳環(huán)、取代的碳環(huán)、橋三環(huán)體系、取代的橋三環(huán)體系或芳香環(huán)體系；R1包括C5-C18亞烷基或C5-C18烷基；R3包括C2飽和烷基；以及Q包括銨基，該銨基可一次或多次被C1-C6烷基取代、或包括具有與R3相連的氮原子的C3-C7雜環(huán)，其中所述雜環(huán)可以含有一個或多個獨立選自氮、氧、硫的雜原子，所述雜環(huán)可被一個或多個獨立選擇的取代基所取代。
17.權(quán)利要求16的化合物，其包括1-{2-[(5-亞環(huán)己基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；1-{2-[(5-亞環(huán)己基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽；1-{2-[(5-亞環(huán)己基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽；1-{2-[(11-亞環(huán)己基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；1-{2-[(11-亞環(huán)己基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽；1-{2-[(11-亞環(huán)己基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽；1-{2-[(5-亞金剛烷基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；1-{2-[(5-亞金剛烷基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽；1-{2-[(5-亞金剛烷基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽；1-{2-[(11-亞金剛烷基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；1-{2-[(11-亞金剛烷基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽；1-{2-[(11-亞金剛烷基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽；1-{2-[(11-(環(huán)己基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；1-{2-[(5-金剛烷基戊氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽；或1-{2-[(11-金剛烷基十一烷氧基)羥基膦氧基]乙基}-N，N，N-三甲銨內(nèi)鹽。
18.權(quán)利要求1的化合物，其中A包括R1OYOR2；W包括R3Q；X包括氧；Y殘基包括碳環(huán)、取代的碳環(huán)、橋三環(huán)體系、取代的橋三環(huán)體系或芳香體系；R1包括C12-C18烷基；R2包括C2飽和烷基；R3包括C2飽和烷基；以及Q包括銨基，該銨基可一次或多次被C1-C6烷基取代、或包括具有與R3相連的氮原子的C3-C7雜環(huán)，其中所述雜環(huán)可以含有一個或多個獨立選自氮、氧、硫的雜原子，所述雜環(huán)可被一個或多個獨立選擇的取代基所取代。
19.權(quán)利要求18的化合物，其包括1-{2-{[(4-(十二烷氧基)環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-(十二烷氧基)環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽；1-{2-{[(4-(十四烷氧基)環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-1-甲基哌啶鎓內(nèi)鹽；或1-{2-{[(4-(十四烷氧基)環(huán)己氧基)乙氧基]羥基膦氧基]乙基}-1-甲基嗎啉鎓內(nèi)鹽。
20.一種包括權(quán)利要求1-19任一所述的化合物及藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
21.一種治療原生動物性疾病的方法，其包括施用有效劑量的一種權(quán)利要求1所述的化合物。
22.一種治療原生動物性疾病的方法，其包括施用有效劑量的權(quán)利要求20的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)構(gòu)通式以A－X－PO
文檔編號A61P33/02GK1742017SQ200380107828
公開日2006年3月1日 申請日期2003年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月30日
發(fā)明者西奧多拉·卡洛伊羅普盧, 瑪麗亞·庫法基, 尼古勞斯·阿夫洛尼蒂斯, 亞歷山德羅斯·馬克里揚尼斯 申請人:Mak科學(xué)公司