專利名稱：中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療方法
本申請要求2002年12月30日提交的美國臨時申請序列號No.60/437,104的優(yōu)先權(quán)，該申請在本文中被整體引用作為參考。
背景中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，包括脊髓損傷，可能是最具破壞性和致殘性的損傷之一。根據(jù)損傷的嚴(yán)重程度，會導(dǎo)致不同程度的癱瘓。下肢癱瘓和四肢癱瘓通常是由脊髓嚴(yán)重?fù)p傷造成的。其對受害者(可以是人或者動物)產(chǎn)生的影響是嚴(yán)重的?；颊邥萦谝环N幾乎不能行動或者更糟的狀態(tài)。對于人類而言，由這種嚴(yán)重軀體殘疾引起的精神創(chuàng)傷會比軀體殘疾本身更具破壞性。
在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，神經(jīng)纖維在損傷或疾病后開始再生，但卻突然停止生長且無法形成功能性連接。這一形成神經(jīng)連接的故障阻止了神經(jīng)沖動傳導(dǎo)通過損傷區(qū)域，這是疾病或CNS損傷后災(zāi)難性的行為能力缺失的生物學(xué)基礎(chǔ)。克服這一障礙的一種方法在損傷區(qū)域提供一些能誘導(dǎo)顯著神經(jīng)再生的刺激。雖然這已經(jīng)通過植入外周神經(jīng)橋，導(dǎo)入神經(jīng)生長因子(NGF)或腦衍生神經(jīng)生長因子(BDNF)等化學(xué)生長因子，或者運用電刺激等方法在有限情況下的動物實驗中得以實現(xiàn)，但是這些方法中的任何一個都存在著限制或排斥其運用于人體的嚴(yán)重不足。例如，沒有證據(jù)表明外周神經(jīng)橋確實在動物中改善了行為能力的喪失。因為這項技術(shù)需要冒著額外損傷的危險進(jìn)行大量的脊髓手術(shù)或腦手術(shù)，外科醫(yī)生也不太可能采納外周神經(jīng)橋的使用。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NGF和BDNF等生長因子的導(dǎo)入具有顯著的副作用，會加重患者病情和/或刺激潛伏腫瘤的生長。
而且，盡管采用如振蕩場電刺激(OFS)的技術(shù)進(jìn)行電刺激已經(jīng)發(fā)展成為一種前景良好的脊髓損傷治療方法，外加電壓仍然存在問題。只有在損傷后最初的3個星期內(nèi)將OFS刺激器植入到狗和動物體內(nèi)，OFS方法才能發(fā)揮作用。很明顯，這一技術(shù)在慢性損傷的患者中不引起神經(jīng)再生。到目前為止，在超過100例慢性損傷(損傷后2個月以上)的實驗豚鼠中，OFS方法沒能引起神經(jīng)再生(Borgens等，(1993)RestorNeurol and Neurosci 5，173-179)。由于預(yù)計存在約250,000-350,000名長時間脊髓損傷的患者，無法成功治療慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提出了一個根本性挑戰(zhàn)。
因此，需要有能在CNS損傷(尤其是慢性CNS損傷)中促進(jìn)神經(jīng)再生的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種治療患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷(包括脊髓損傷)的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一種結(jié)合電刺激(如振蕩場電刺激(OFS))運用和嘌呤核苷或其類似物(如肌苷)給藥的二分療法能引起神經(jīng)再生，起到在CNS損傷的患者中至少部分恢復(fù)神經(jīng)機能和行為能力的效果。本發(fā)明的方法對于治療急性和慢性損傷都有效。同時使用嘌呤核苷或其類似物(如肌苷)，擴大了OFS治療慢性CNS損傷的療效。
一方面，本發(fā)明提供了一種治療脊髓損傷患者的方法，這一方法包括在損傷位置進(jìn)行電刺激和對患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類似物給藥，使得受損脊髓至少部分恢復(fù)，和/或使脊髓損傷位置的神經(jīng)再生被激活?？梢酝ㄟ^為患者植入一個裝置，來實現(xiàn)對損傷位置的電刺激。較佳地，這一裝置是振蕩場電刺激(OFS)裝置。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在能有效激活損傷位置神經(jīng)再生的情況下，和/或在能有效地至少部分恢復(fù)受損脊髓中的神經(jīng)功能的情況下，通過對患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類似物給藥，來治療脊髓損傷患者的方法。
脊髓損傷可以是脊髓的完全切斷，脊髓的部分切斷，或者脊髓的壓砸傷或壓迫傷。脊髓損傷可以發(fā)生在治療前3個月以上，治療前3個星期以上，或者治療前2星期以上。
神經(jīng)功能的恢復(fù)可以通過神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的恢復(fù)、傳導(dǎo)動作電位的可檢測升高、解剖學(xué)連續(xù)性檢測、一個以上脊髓根水平的恢復(fù)、反射行為的增加，或其組合來證明。
嘌呤核苷或其類似物可以是對患者進(jìn)行全身給藥，包括口服或皮下給藥。嘌呤核苷或其類似物可以是對脊髓損傷部位進(jìn)行局部給藥。嘌呤核苷或其類似物可以通過為患者植入一個嘌呤核苷或其類似物給藥裝置來給藥。嘌呤核苷或其類似物可以用藥學(xué)上可接受的載體來局部給藥。優(yōu)選的嘌呤核苷包括肌苷。
本發(fā)明還包括一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷的治療試劑盒，這一試劑盒包括第一成分，一種在損傷部位進(jìn)行電刺激的方法；和第二成分，一種嘌呤核苷或其類似物。在某些實施方案中，在損傷部位進(jìn)行電刺激的方法是振蕩場電刺激(OFS)裝置。在某些實施方案中，嘌呤核苷或其類似物包括肌苷。在某些實施方案中，這一試劑盒還包括一種用于皮下、靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)輸遞嘌呤核苷或其類似物的裝置。在某些實施方案中，這一試劑盒還包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療的書面說明。
定義如本文所用，術(shù)語“患者”包括易遭受中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的動物，優(yōu)選哺乳動物。在優(yōu)選的實施方案中，所述患者是人。患者的其他例子包括家養(yǎng)寵物(如狗和貓)或其它哺乳動物(如羊和牛)。
如本文所用，術(shù)語“中樞神經(jīng)系統(tǒng)”或“CNS”包括腦和脊髓的神經(jīng)組織。該術(shù)語不包括外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)。如本文所用，術(shù)語“脊髓”包括脊柱的所有神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。
除非另有說明，“一個”、“這一”和“至少一個”可以互換使用，指一個或一個以上。
附圖簡述

圖1顯示作為脊髓損傷的行為能力指標(biāo)的皮膚肌干(CTM)反射。如圖1A所示，在豚鼠左側(cè)標(biāo)出了皮膚肌干(CTM)反射的傳入路徑和傳出路徑。在豚鼠脊髓的右側(cè)的脊髓損傷(為了便于說明，用一個大缺口標(biāo)出)只中斷了這一側(cè)上行性CTM束。在背部皮膚上產(chǎn)生了一個不再對觸覺刺激產(chǎn)生反應(yīng)的區(qū)域(反射消失區(qū))。圖1B顯示完整的CTM感受域的概圖。這一區(qū)域內(nèi)的觸覺探測會引起背部皮膚的抽搐，而在這個區(qū)域外，刺激不會引起CTM皮膚收縮。從上方，將一系列對鎮(zhèn)靜動物的皮膚輕微觸覺刺激情況進(jìn)行錄像，并用計算機重新構(gòu)圖。圖1C顯示了全寬脊髓壓迫損傷的結(jié)果。在CTM感受域的下半部分標(biāo)出的區(qū)域是反射消失區(qū)。正是這CTM感受域的下半部分不再對觸覺刺激作出應(yīng)答。圖1D標(biāo)出了CTM恢復(fù)的區(qū)域。在這一區(qū)域內(nèi)，CTM應(yīng)答性已經(jīng)恢復(fù)。圖1E是一個顯示畫在動物去毛背部上的點狀坐標(biāo)的錄像重構(gòu)圖。
圖2顯示用內(nèi)置標(biāo)記裝置進(jìn)行的橫切面組織學(xué)檢測。在所有的脊髓顯微照片中，脊髓都是按照長軸由照片的頂部到底部的方向?！绊敳俊笔穷^端(頭側(cè))，而尾側(cè)(尾端)在底部。在圖2A的照片中可以看到脊髓的兩側(cè)邊緣。但在圖2B中只能看到右側(cè)的邊緣。陰影線代表由標(biāo)記物確定的橫切面。在圖2A中，盡管標(biāo)記物從插入的中線位置移到了靠近脊髓右側(cè)邊緣的位置，移除標(biāo)記物后留下的洞還清晰可見。由于可以根據(jù)疤痕和洞的殘余部分缺少軸突來清楚地確定橫切面的左側(cè)邊緣，即使在這些脊髓中還是可以很方便地確定橫切面。如圖2B所示，在另一個組織切片中標(biāo)記物移向了右側(cè)。圈出的區(qū)域是一個充滿了巨噬細(xì)胞的囊泡，在圖2D中進(jìn)一步放大顯示。圖2C中顯示了一個位于脊髓中心的標(biāo)記物洞(邊緣在視野之外)。要注意的是，在標(biāo)記物洞的殘余部分中(圖2E)，長軸突在相鄰的疤痕組織中雜亂排列，在右側(cè)半切斷手術(shù)的殘余部分的未受損實質(zhì)中有序排列。橫切面延伸到脊髓的右側(cè)邊緣，在視野之外。
圖3顯示了實驗性治療后的上行(區(qū)域1到4，從左向右移動)和下行(區(qū)域1到4，從右向左移動)軸突投射。本圖中，脊髓的頭(吻)端畫在右側(cè)，末(尾)端畫在左側(cè)。在圖的中部，用從中線到圖右側(cè)邊緣的粗黑線標(biāo)出了右側(cè)半切斷(只切斷脊髓的右側(cè))的位置。用淺灰色和黑色(分別代表從尾側(cè)和頭側(cè)標(biāo)記)標(biāo)出的纖維投射穿過了橫切面(根據(jù)標(biāo)記物洞的位置確定)。在脊髓的右側(cè)，圖示的纖維可終止在距橫切面較遠(yuǎn)的位置上(小于250μm；區(qū)域1)或投射到橫切面250μm以內(nèi)或更近的位置(區(qū)域2)。也發(fā)現(xiàn)有纖維終止于橫切面上，有時沿著平面邊緣運動一小段距離(區(qū)域3)，或者繞過或經(jīng)過橫切面投射進(jìn)入相鄰的椎節(jié)(區(qū)域4)。
示例性實施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明主要涉及治療哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷(包括但不限于脊髓損傷)，使之至少部分恢復(fù)神經(jīng)功能的方法。本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)了一種結(jié)合對受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行電刺激和嘌呤核苷或其類似物給藥的二分療法，在急性和慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中都能引起神經(jīng)再生和修復(fù)神經(jīng)功能。在優(yōu)選的實施方案中，用振蕩場電刺激(OFS)和嘌呤核苷肌苷的聯(lián)合療法來進(jìn)行脊髓損傷的治療，用于在急性和慢性脊髓損傷中引起脊髓神經(jīng)再生以及神經(jīng)機能和行為能力的恢復(fù)。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種損傷都可以用本發(fā)明的方法來治療。如本文所用，術(shù)語“損傷”一般指神經(jīng)細(xì)胞膜的破裂，以致于神經(jīng)細(xì)胞膜喪失了分隔神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部鹽溶液(細(xì)胞質(zhì))和包圍神經(jīng)細(xì)胞的鹽溶液(細(xì)胞外液)的能力。這兩種液艙中的鹽種類差異很大，由損傷引起的離子和水分交換，導(dǎo)致神經(jīng)無法產(chǎn)生和傳遞神經(jīng)沖動，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。損傷包括直接或間接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常機能的損傷。損傷可以是結(jié)構(gòu)性的、物理性的或機械性的損傷，也可以是由物理碰撞造成的，如神經(jīng)纖維的壓砸、擠壓或拉伸。疾病、內(nèi)分泌不平衡、或者生理功能障礙等原因也會造成細(xì)胞膜破壞或降解，如缺氧(例如中風(fēng))、動脈瘤、或再灌注損傷。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷包括，例如但不限于，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，外傷性腦損傷，中風(fēng)導(dǎo)致的損傷，腦動脈瘤導(dǎo)致的損傷，包括單癱、雙癱、下肢癱瘓、偏癱和四肢癱瘓在內(nèi)的脊髓損傷，神經(jīng)增殖失調(diào)，或神經(jīng)病變性疼痛綜合征。
哺乳動物的脊髓損傷后，脊髓中的神經(jīng)間的連接被破壞。因為損傷影響了神經(jīng)束，這種損傷阻斷了神經(jīng)沖動流，導(dǎo)致了感覺功能和運動功能減退。脊髓損傷可以是由脊髓擠壓或其它挫傷，或脊髓壓砸或切斷造成的。脊髓切斷，這里也稱“橫斷”，可以是脊髓的完全切斷或部分切斷。
本發(fā)明的方法可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性和慢性損傷，包括但不限于急性和慢性的脊髓損傷。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法被用于治療脊髓的慢性損傷。如本文所用，術(shù)語“急性損傷”包括發(fā)生不久的損傷。例如，急性損傷可以是剛剛發(fā)生的，可以是1小時以內(nèi)發(fā)生的，可以是1天以內(nèi)發(fā)生的，可以是1個星期以內(nèi)發(fā)生的，可以是2個星期以內(nèi)發(fā)生的。如本文所用，術(shù)語“慢性損傷”是指持續(xù)了一段時間的損傷。例如，慢性損傷可以是2個星期前發(fā)生的，可以是3個星期以前發(fā)生的，可以是2個月以前發(fā)生的，也可以是3個月以前發(fā)生的。
本發(fā)明的治療CNS損傷的二分療法(two-part therapy)的一個部分是對CNS損傷部位進(jìn)行電刺激。二十年前，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)電刺激可以在損傷后增強哺乳動物脊髓軸突的再生和減少軸突退行性變性。各種將電刺激傳遞到CNS損傷部位的已知方法都可以使用。這一方法包括使用電流通過損傷部位，和/或在損傷部位加上電勢差或電位差。電流可以是交流電或直流電。電流和/或電勢差可以是恒定的或變化的。對CNS損傷的電刺激可以通過植入生物電刺激器來實現(xiàn)。
對損傷部位進(jìn)行電刺激的優(yōu)選方法是使用電場極性周期性倒轉(zhuǎn)的振蕩場電刺激(OFS)。振蕩場電刺激(OFS)，在治療狗的急性、嚴(yán)重、自然發(fā)生的下肢癱瘓中取得了積極有益的效果(美國專利No.4,919,140)，目前正在進(jìn)行人急性脊髓損傷治療的臨床試驗。然而，到目前為止的所有電刺激的成功應(yīng)用都只限于急性損傷的治療。哺乳動物CNS中受損神經(jīng)的再生，只在損傷發(fā)生后非常短的一段時間內(nèi)立即發(fā)生。在這段很短的時間之后，沒有發(fā)現(xiàn)神經(jīng)再生。因此，能有效治療慢性損傷的結(jié)果是激動人心和出乎意料的。
在損傷部位植入裝置(如生物電植入器)和用OFS進(jìn)行損傷部位電刺激的方法是本領(lǐng)域所熟知的。形成電流，以產(chǎn)生穿越損傷部位的電勢差或電位差。優(yōu)選的生物電植入器在損傷周圍產(chǎn)生幾百μV/mm(例如100μV/mm-500μV/mm)的恒定直流電(DC)電場。例如在小狗中，可以通過在損傷兩側(cè)的2個電極間約200μA的電流，產(chǎn)生這樣的電場。如下所述，在人體上最好使用多對電極。刺激裝置很小，可以方便地通過外科手術(shù)植入到背部皮膚下。產(chǎn)生弱電場所需的電流量，根據(jù)損傷部位的橫截面積和電極之間的距離而變化。優(yōu)選使用2對或2對以上電極來傳遞所需電流，這樣可以降低通過介入組織的電流量。隨著橫截面積的增加，用于產(chǎn)生電場的電極對數(shù)量也最好相應(yīng)增加。例如，橫截面積增加3倍，為了將通過任一組織截面的電流量都保持在安全水平，就需要電極數(shù)也增加3倍。例如，在一個實施方案中，6個電極(3對)被連接到脊柱上，并固定在損傷部位的上方和下方。導(dǎo)線(電極)在脊柱外，并不接觸脊髓本身，但是他們產(chǎn)生的電場通過了脊髓。在植入大約14個星期后，手術(shù)拆除整個裝置。通過脊髓損傷患者的一期人體臨床試驗，已經(jīng)證明這種植入/移出是完全安全的。參見，美國專利No.4,919,140，Borgens等，(1986)J Comp Neurol 250，168-180；Borgens等，(1987)Science 238，366-369；Borgens等，(1999)J CompNeurol 296，634-653；Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322；Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，173-179；Borgens和Bohnert(1997)Exp Neurol 145，376-89；Borgens等，(1999)J Neurtrauma 16，639-57；Borgens(1999)Neuroscience 91，251-64；以及Borgens(2003)Restoring Function to the InjuredHuman Spinal Cord，(Springer-Verlag，Heidelberg)。典型生物電刺激器的全部核心電路和電路圖都已經(jīng)在如Borgens等，(1999)J Neurtrauma 16，639-57等資料中說明。本發(fā)明的二分療法中，電刺激(通過“生物植入物”實施)和保健食品添加劑肌苷或其它嘌呤核苷或其類似物(口服或經(jīng)皮下給藥)可以在損傷之后的任何時間實施，較佳地，二者同時實施。
進(jìn)行受損部位電刺激(如OFS)的時間長度可以不同。電刺激可以進(jìn)行幾天，例如，1天、2天、3天、4天、5天、或者其間任何時間段。電刺激可以進(jìn)行幾個星期，例如，1個星期、2個星期、3個星期、4個星期、或者其間任何時間段。電刺激可以進(jìn)行幾個月，例如，1個月、3個月、4個月、5個月、6個月、或者其間任何時間段。對于急性損傷的治療，對損傷部位的電刺激可以在損傷發(fā)生以后馬上開始進(jìn)行，或者對損傷部位的電刺激可以在損傷發(fā)生后幾個小時或者幾天開始進(jìn)行。例如，治療可以在損傷后8-12小時、損傷后幾天、或者損傷后14-21天開始進(jìn)行。對于慢性損傷的治療，電刺激可以在任何時間點開始進(jìn)行。例如，在損傷后2個星期、損傷后3個星期或1個月、或損傷后幾個月或幾年開始進(jìn)行。
本發(fā)明的治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的二分療法的第二部分是嘌呤核苷或其類似物的給藥。如本文所用，“嘌呤核苷”包括任何連接了糖基的嘌呤堿基或其類似物。例如，嘌呤核苷包括鳥苷、肌苷或腺苷，其類似物包括6-硫代鳥嘌呤(6-TG)和其他相似物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述嘌呤核苷是肌苷。
最近研究表明，嘌呤核苷(肌苷和鳥苷)能作為神經(jīng)營養(yǎng)劑，在體外施用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞時能刺激軸突發(fā)生(參見美國專利No.6,440,455和Benowitz等，(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96，13486-90)。肌苷是一種沒有已知副作用的天然代謝產(chǎn)物。而且正如本發(fā)明所述，在體內(nèi)給藥時，肌苷作為一個“溫和”的神經(jīng)生長因子，不會產(chǎn)生更熟知的神經(jīng)生長因子(如NGF)給藥時所產(chǎn)生的嚴(yán)重副作用。本發(fā)明中所用的嘌呤核苷及其類似物都是容易得到的。例如，肌苷可以從化學(xué)藥品供應(yīng)公司(包括如Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)或銷售保健品的保健商店購得。
必須了解，嘌呤核苷或其類似物，既能根據(jù)本發(fā)明作為二分療法的一個部分；也能不結(jié)合損傷部位的電刺激單獨進(jìn)行治療。在后者中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷優(yōu)選為脊髓損傷，可以是急性損傷也可以是慢性損傷。
嘌呤核苷或其類似物(如肌苷)給藥的時間周期的長度可以不同。嘌呤核苷或其類似物可以給藥幾個小時，例如，1個小時、2個小時、4個小時、6個小時、8個小時、12個小時或者其間任何時間段。嘌呤核苷或其類似物可以給藥幾天，例如，1天、2天、3天、4天、5天或者其間任何時間段。嘌呤核苷或其類似物可以給藥幾個星期，例如，1個星期、2個星期、3個星期、4個星期或者其間任何時間段。嘌呤核苷或其類似物可以給藥幾個月，例如，1個月、3個月、4個月、5個月、6個月或者其間任何時間段。對于急性損傷的治療，嘌呤核苷或其類似物的給藥可以在損傷發(fā)生后立即開始。嘌呤核苷或其類似物的給藥也可以在損傷發(fā)生后幾個小時或幾天開始。例如，治療可以在損傷發(fā)生后1-2個小時、損傷發(fā)生后4-6個小時、損傷發(fā)生后2-6天、或損傷發(fā)生后14-21天開始。對于慢性損傷的治療，嘌呤核苷或其類似物給藥可以在任何時間點開始。例如，給藥可以在損傷后2個星期開始，可以在損傷后3個星期或1個月開始，或者可以在損傷后幾個月或幾年開始。
在本發(fā)明的方法中，嘌呤核苷或其類似物可以通過藥學(xué)上可接受的載體給藥。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”包括所有溶劑、分散媒劑、包被劑、抗菌劑和抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑，和類似的生理協(xié)調(diào)劑。這類載體包括水(優(yōu)選無菌水，包括去離子水)和其他任何本領(lǐng)域熟知的、不會對治療產(chǎn)生反效果的藥學(xué)上可接受的載體。在某些實施方案中，肌苷的優(yōu)選載體是無菌的乳酸林格爾液。
本發(fā)明的另一方面，嘌呤核苷或其類似物可以用藥學(xué)上可接受的制劑給藥。這種藥學(xué)上可接受的制劑可以是分散體系，例如脂基制劑、脂質(zhì)體制劑、多泡脂質(zhì)體制劑、納米膠囊、微球體、微珠、或是包括水包油乳劑、微團、混合微團、合成膜囊和重新包封的紅細(xì)胞在內(nèi)的脂基制劑。藥學(xué)上可接受的制劑也包括選自合成多聚體(包括聚酯(PLA，PLGA)、聚乙二醇、波洛沙姆(poloxomer)、聚酐和聚醚等)，或選自天然多聚體(包括白蛋白、藻酸鹽、纖維素衍生物、膠原、纖維蛋白、明膠和多糖等)的多聚基質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個方面，藥學(xué)上可以接受的制劑，能夠在其給藥后至少1個星期、2個星期、3個星期或4個星期，使嘌呤核苷在患者中的持續(xù)釋放或“緩慢釋放”。本發(fā)明中制劑的持續(xù)釋放，可以通過使用如緩釋膠囊或輸液泵的方法來實現(xiàn)。
本發(fā)明的各個實施方案中使用嘌呤核苷或其類似物的精確量，可以根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的因素而改變，這些因素包括但不限于嘌呤核苷或其類似物的物理和化學(xué)性質(zhì)、藥學(xué)上可接受的載體的性質(zhì)、預(yù)期的劑量方案、患者損傷的情況和嘌呤核苷或其類似物的給藥方法。因此，提出一個在所有應(yīng)用中都有效的嘌呤核苷或其類似物的劑量是不現(xiàn)實的。然而，結(jié)合考慮上述因素，可以用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)決定適當(dāng)?shù)膭┝?。治療上有效的肌苷濃度的非限制性范圍?μM-100mM，更佳地是50μM-50mM。治療上有效的鳥苷濃度的非限制性范圍是1μM-100mM，更佳地是50μM-50mM。
在本發(fā)明中，嘌呤核苷或其類似物可以通過各種不同方式向患者給藥。嘌呤核苷或其類似物，可以向需要CNS損傷治療的患者進(jìn)行全身給藥。例如，嘌呤核苷或其類似物可以通過靜脈內(nèi)(經(jīng)由血液供應(yīng))、皮下、腹膜內(nèi)、穿透皮膚或口服給藥。對于皮下給藥，可以使用輸液泵或者微泵。同樣地，嘌呤核苷或其類似物也可以對CNS損傷部位進(jìn)行局部給藥。例如，嘌呤核苷或其類似物可以鞘內(nèi)給藥進(jìn)入脊柱髓鞘。輸液泵或微泵也可用于這種局部給藥。
對于CNS損傷治療，損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類似物給藥，可以在同一時間點開始。本發(fā)明的二分療法中的一部分也可以先于另一部分開始。也就是說，損傷部位的電刺激可以先于嘌呤核苷或其類似物給藥開始，或者嘌呤核苷或其類似物的給藥可以先于對損傷部位的電刺激開始。換句話說，損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類似物的給藥，可以在相同或不同的時間點開始和/或停止。
或者，本發(fā)明的二分療法中的一部分可以先于另一部分完成。也就是說，損傷部位的電刺激可以在嘌呤核苷或其類似物的給藥結(jié)束前停止，或者嘌呤核苷或其類似物的給藥可以在對損傷部位的電刺激結(jié)束前停止。
較佳地，在治療期間，有一段時間是損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類似物的給藥同時或協(xié)同實施的。然而，必須注意，本發(fā)明也包括損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類似物給藥的依次實施。在依次實施時，兩部分治療之間的間隔時間以短為佳，例如幾小時內(nèi)或幾天之內(nèi)。同樣地，本發(fā)明包括電刺激和嘌呤核苷或其類似物給藥的交替或間隔實施。換句話說，本發(fā)明不受兩種治療實施的前后順序或兩種治療是否嚴(yán)格同步實施的限制。既然電刺激和嘌呤核苷或其類似物的協(xié)同實施更好，至少可以預(yù)見兩種療法都是協(xié)同治療計劃的一部分。
本發(fā)明的方法能有效地在CNS損傷后至少部分恢復(fù)的神經(jīng)功能和/或神經(jīng)再生。本發(fā)明的治療功效可以通過各種方法確定。例如，本發(fā)明的治療功效可以通過檢測神經(jīng)功能恢復(fù)的方法來確定。通過受損部位的動作電位(如CAP)傳導(dǎo)的恢復(fù)或增加，可以作為神經(jīng)功能至少部分恢復(fù)的指標(biāo)。如果在治療后動作電位傳導(dǎo)增加，可以認(rèn)為神經(jīng)功能已經(jīng)至少部分恢復(fù)。較佳地，治療能使CAP傳導(dǎo)達(dá)到至少10％的增加。此外，如實施例中所述，解剖學(xué)連續(xù)性的恢復(fù)也可以通過高分辨率光學(xué)顯微鏡鏡檢和/或修復(fù)的神經(jīng)組織(如修復(fù)的軸突)胞內(nèi)熒光染料的分布，或?qū)π迯?fù)的軸突膜的直接觀測來檢測。另外，在人體應(yīng)用中，優(yōu)選治療的功效可以通過一個以上脊髓根節(jié)段的修復(fù)來確定，這種修復(fù)可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的美國脊髓損傷聯(lián)合會(ASIA)運動評分和/或國家動物脊髓損傷研究會(NASCIS)值來判斷，參見Wagih等，(1996)Spine21，614-619。此外，在動物應(yīng)用中，就像在實施例中有更全面描述的，對皮膚肌干(CTM)反射的行為能力分析，可用于確定治療的功效和神經(jīng)功能是否已經(jīng)至少部分恢復(fù)。使用這種分析，如果治療后出現(xiàn)反射行為的增加，則認(rèn)為神經(jīng)功能已經(jīng)至少部分恢復(fù)，但是較佳的，希望治療能夠使皮膚肌干(CTM)行為能力修復(fù)區(qū)域增加至少10％的反射行為。本發(fā)明治療方法的功效也可以通過上述方法的結(jié)合來確定。
本發(fā)明治療的功效可以用檢測神經(jīng)再生的方法來確定。例如，如實施例中所述，神經(jīng)再生可以通過高分辨率光學(xué)顯微鏡鏡檢和/或修復(fù)的神經(jīng)組織(如修復(fù)的軸突)胞內(nèi)熒光染料的分布、或?qū)π迯?fù)的軸突膜的直接觀測來檢測。
在某些實施方案中，與單獨進(jìn)行CNS損傷部位的電刺激或單獨進(jìn)行嘌呤核苷或其類似物給藥相比，對患者進(jìn)行CNS損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類似物給藥聯(lián)合治療所引起的神經(jīng)功能恢復(fù)增加更大。在某些實施方案中，對患者進(jìn)行CNS損傷部位的電刺激和嘌呤核苷或其類似物給藥，會引起神經(jīng)功能恢復(fù)的協(xié)同增加。也就是說，二分療法獲得的神經(jīng)功能的恢復(fù)，要大于單獨進(jìn)行CNS損傷部位的電刺激或單獨進(jìn)行嘌呤核苷或其類似物給藥所獲得的神經(jīng)功能恢復(fù)的總和。
在某些實施方案中，除了用電刺激和嘌呤核苷或其類似物給藥進(jìn)行損傷治療以外，本發(fā)明還包括用其他常規(guī)治療化合物和/或復(fù)合物來進(jìn)行損傷治療。例如，損傷也可以用聚亞烷基二醇或類固醇(如甲基氫化潑尼松)來治療。例如，如WO 02/092,107和美國專利申請No.09/438,206(1999年11月12日申請)所述，用聚亞烷基二醇進(jìn)行治療。
用嘌呤核苷或其類似物給藥、而不在損傷部位進(jìn)行電刺激的方法來進(jìn)行CNS損傷治療，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，脊髓損傷，包括但不限于慢性脊髓損傷，可以通過肌苷給藥、而不在損傷部位進(jìn)行電刺激的方法進(jìn)行治療。
本發(fā)明提供了一種治療CNS損傷(包括但不限于脊髓損傷)的試劑盒。試劑盒主要包括在合適包裝材料中的第一成分和第二成分。第一成分是一種對損傷部位進(jìn)行電刺激的方法，例如振蕩場電刺激(OFS)裝置。第二成分是有效治療量的嘌呤核苷或其類似物。嘌呤核苷或其類似物可以是適于皮下、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、局部給藥或其他類似給藥方式的藥學(xué)制劑。嘌呤核苷或其類似物可以是肌苷。此外，試劑盒還可以包括實施本發(fā)明所需的其他試劑，如緩沖液和溶液。關(guān)于用進(jìn)行電刺激和/或嘌呤核苷或其類似物給藥來治療CNS損傷的說明書通常也包括在內(nèi)。試劑盒還包括嘌呤核苷或其類似物皮下、鞘內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥等所必需的輔助裝置和試劑。這些裝置或試劑包括微泵、注射器、針、局部麻醉劑和其他相類似的。如本文所用，術(shù)語“包裝材料”指一種或多種用于收藏試劑盒內(nèi)容的物理結(jié)構(gòu)。包裝材料是用眾所周知的方法構(gòu)設(shè)的，以提供一個無菌、無污染的環(huán)境為佳。包裝材料帶有一個說明第一成分和第二成分可被用于治療CNS損傷的標(biāo)簽。如本文所用，術(shù)語“包裝”指玻璃、塑料、紙張、金屬片和其他類似的固體基質(zhì)或材料。“使用說明”主要包括描述治療CNS損傷試劑盒的第一和/或第二成分的準(zhǔn)備和運用的真實表述。
結(jié)合下列實施例，具體闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，本文所述的特定實施方案、材料、劑量和方法只用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例實施例1同時運用兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子產(chǎn)生的行為學(xué)和解剖學(xué)協(xié)同作用運用胞外電壓梯度和肌苷在本實施例中，振蕩場電刺激(OFS)和肌苷注入的聯(lián)合治療被用于增強脊髓損傷(SCI)后的功能反應(yīng)。成年豚鼠的慢性皮膚肌干(CTM)功能缺失被選作研究脊髓損傷的行為學(xué)模型，有以下幾個原因首先，切斷相關(guān)的上行CTM白質(zhì)束引起了動物終身的CTM功能永久性缺失。而且，盡管在豚鼠和狗下肢癱瘓的臨床病例的損傷急性階段中，行為能力缺陷可以通過施加電場來部分逆轉(zhuǎn)(Borgens等，(1999)J CompNeurol 296，634-653；Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，173-179；Borgens(1999)Neuroscience 91，251-64)，對較久的、慢性損傷的治療并沒有發(fā)生改善功能的修復(fù)。尤其是，上百次的實驗中，在成年豚鼠2個月以上的皮膚肌干(CTM)損傷中都沒有發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后的CTM機能的自發(fā)性修復(fù)或電場施加所引起的修復(fù)(Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322)。
本實施方案第一次報道了這種慢性的CTM損傷可以通過單一肌苷治療或肌苷結(jié)合OFS治療獲得部分逆轉(zhuǎn)。此外，肌苷結(jié)合OFS治療取得了比單一OFS治療或單一肌苷治療更強的修復(fù)效果。
本研究包括兩個部分，第一部分研究和第二部分研究。主要研究(第一部分研究)是對在肌苷和OFS治療后成年豚鼠慢性SCI恢復(fù)情況進(jìn)行的解剖學(xué)和行為能力檢驗。第二部分研究僅檢測了對成年豚鼠SCI進(jìn)行短期肌苷和OFS治療后，被切斷的白質(zhì)作出的解剖學(xué)反應(yīng)。除非特別指明，下列方法可用于以上兩部分研究。
動物、麻醉和手術(shù)本研究使用約400克重的成年雌性豚鼠(Hartley Strain)。在手術(shù)前用常規(guī)方法(Borgens等，(2002)J.Exp.Biol.205，1-12)進(jìn)行氯胺酮/二甲苯嗪麻醉，手術(shù)后用熱燈來保溫，并且在觀測期間單獨飼養(yǎng)和隨意喂食。研究結(jié)束時用過量麻醉法處死動物，然后收集脊髓以待解剖學(xué)研究(參見Borgens等，(2002)J.Exp.Biol.205，1-12)。
用椎板切除法揭開所有動物的脊髓背面(T9到T11之間)。用特殊切割裝置進(jìn)行右側(cè)半切斷手術(shù)(圖1)，將尖銳的針劃過切開的組織來“完成”(也就是，不留下多余的實質(zhì))。這個手術(shù)切斷了從中線到脊髓右側(cè)最遠(yuǎn)端的整個右側(cè)脊髓，形成一個頭節(jié)和一個尾節(jié)。整個左側(cè)脊髓還保持完整。如Borgens等，(1986)J.Comp.Neurol.250，168-180以及Borgens和Bohnert.(1997)Exp.Neurol.145，376-389所述，切斷手術(shù)后，一個外科不銹鋼制成的標(biāo)記裝置被立即插入到傷口。這個裝置在研究過程中被留在原處，到組織學(xué)處理前被移除。這種方法在組織上留下一個洞，即使在數(shù)月的慢性損傷中也能準(zhǔn)確標(biāo)明正確的橫切面(圖1和圖2)。
如圖1A所示，CTM反射的傳入和傳出途徑在豚鼠的左側(cè)標(biāo)出。皮膚的痛覺受體通過背皮神經(jīng)(DCN)將感官傳入投射到脊髓中。DCN有部分是基本平行排列的，垂直于脊髓，作為背根的成分投射進(jìn)入脊髓。上行CTM傳入成束地投射到脊髓。在腹索中，CTM束正好位于脊髓丘腦束的左右兩個側(cè)面。投射到位于頸/胸交匯處運動神經(jīng)元群的上行束幾乎不轉(zhuǎn)接。這些上行束接著經(jīng)由臂叢的胸支，將傳出的運動纖維投射回到皮膚的皮膚肌干。盡管脊髓的上行CTM投射中有少量對側(cè)神經(jīng)支配，左側(cè)和右側(cè)神經(jīng)元群之間不存在神經(jīng)連接。脊髓損傷(為了便于說明，用大缺口標(biāo)出)只在豚鼠脊髓右側(cè)中斷了上行CTM束。這使得背部皮膚上的一個區(qū)域不再對觸覺刺激產(chǎn)生應(yīng)答(反射消失)。這一反射消失區(qū)域處于脊髓右側(cè)半切斷位置的同側(cè)下方。要注意的是，CTM反射的同側(cè)上方和對側(cè)都不受到損傷的影響。危及CTM束的全寬度損傷，將會降低動物在傷口下方兩側(cè)的皮膚應(yīng)答能力。損傷頭側(cè)的背部皮膚不會受到這種脊髓損傷的影響。這在圖1的錄像重構(gòu)圖中顯示出來。圖1B顯示了完整的CTM感受域的概圖。在這一區(qū)域內(nèi)的觸覺探測，會產(chǎn)生背部皮膚的抽搐，而在這個區(qū)域外的刺激不會產(chǎn)生CTM皮膚收縮。從上方，將一系列對鎮(zhèn)靜動物的皮膚輕微觸覺刺激情況進(jìn)行錄像，并用計算機重新構(gòu)圖。圖1C顯示了全寬脊髓壓迫傷的結(jié)果。在CTM感受域的下半部分標(biāo)出的區(qū)域是反射消失區(qū)。正是這CTM感受域的下半部分不再對觸覺刺激作出應(yīng)答。圖1D標(biāo)出了CTM恢復(fù)的區(qū)域。在這一區(qū)域內(nèi)，CTM應(yīng)答性已經(jīng)恢復(fù)。圖1E是一個顯示畫在動物去毛背部上的點狀坐標(biāo)的錄像重構(gòu)圖。結(jié)合在CTM測試中畫在動物背上的標(biāo)記，這些坐標(biāo)可用于進(jìn)一步量化CTM反射。
所有的實驗組都再進(jìn)行3個月的檢測后處死。
對第一部分研究，動物進(jìn)行了脊髓切斷，并在此后3個月內(nèi)不作任何處理。然后如下所述，對慢性損傷動物進(jìn)行實驗性治療。
在第二部分研究中，動物進(jìn)行了脊髓切斷，并在切斷后24小時內(nèi)就進(jìn)行實驗性治療。在切斷后30天向脊髓中注射胞內(nèi)軸突標(biāo)記物，18小時后對動物進(jìn)行安樂死并收集脊髓。對于第二部分研究中的動物只進(jìn)行解剖學(xué)檢測，而不進(jìn)行行為能力測試。
實驗組在第一部分研究中，有下列3個實驗組1)“單一肌苷”組。15只動物在頸部的背部皮膚下方皮下植入Alzet微滲泵(型號1002)。這個泵以0.25毫升(mL)/小時的速度釋放肌苷溶液(10毫摩(mM)，溶于無菌乳酸林格爾液中)。肌苷的連續(xù)注入持續(xù)14天后停止，直到約2個半月后處死都不再繼續(xù)。
2)“肌苷和OFS”組。16只動物接受與上述相同的肌苷注射，此外還同時植入一個小型OFS裝置(Moriarty and Borgens.(1999)Restor Neuro Neurosci 14，53-64)。這一小型OFS裝置產(chǎn)生約45毫安(mA)總電流，以15分鐘為工作周期倒轉(zhuǎn)電極極性，持續(xù)4個星期(參見下述刺激器設(shè)計和植入)。
3)15只動物的“對照”組。這些動物植入了一個只釋放無菌乳酸林格爾液的Alzet微滲泵和一個無功能的假OFS刺激器。
在這部分研究結(jié)束時，第一部分研究中的所有動物都進(jìn)行了CTM行為能力測定和白質(zhì)的解剖學(xué)檢驗。
第一部分研究不包括本研究中的假OFS植入或單一植入有作用OFS的研究組。更準(zhǔn)確的說，由于在過去的實驗中，使用有作用的和假的OFS刺激器植入進(jìn)行了大量的慢性損傷豚鼠類似治療，這些數(shù)據(jù)已經(jīng)在別處報道了(Borgens等，(1999)RestorNeuro Neurosci 5，305-322)，這些過去的數(shù)據(jù)也在這里被引用。簡要地說，如Borgens.(1993)Restor Neuro & Neurosci 5，173-179中詳細(xì)報道的，26只在半切斷手術(shù)后3個月植入了假的刺激器的動物中，其中21只在半切斷手術(shù)后持續(xù)觀測12個月以上，1只觀測6個月，還有3只觀測少于6個月。在整個觀測過程中，所有動物的反射消失區(qū)都沒有發(fā)現(xiàn)有性質(zhì)、大小或側(cè)面的改變。所有的假治療動物中，都出現(xiàn)典型的反射消失區(qū)內(nèi)對于觸覺刺激應(yīng)答的CTM反射活力的完全缺失。在半切斷手術(shù)3個月后植入有作用的電刺激器的動物中，13只頭側(cè)加上負(fù)電場的動物沒有出現(xiàn)CTM反射的恢復(fù)，其中8只觀測了至少9個月，5只觀測了3個月；另外11只尾側(cè)加上負(fù)電場的動物中也沒有出現(xiàn)CTM反射的恢復(fù)，其中8只觀測了9個月，3只觀測了3個月。和假治療組一樣，在研究期間電刺激治療組的動物的反射消失區(qū)沒有發(fā)生形態(tài)和性質(zhì)的變化。
在第二部分研究中，“單一肌苷”組(14只動物)，“肌苷和OFS”組(15只動物)，和“對照”組(13只動物)在60天后只用解剖學(xué)方法進(jìn)行檢測。
脊髓損傷(SCI)后CTM反射的行為能力檢測CTM反射是一種檢測SCI后感覺運動機能的行為學(xué)模型(Blight等，(1990)J ofComp Neurol 296，614-633；Borgens.(2003)Restoring Function to the InjuredHuman Spinal Cord(Springer-Verlag，Heidelberg))。CTM反射，是指皮膚的肌肉收縮，和在對側(cè)面皮膚的局部觸覺刺激所產(chǎn)生的“起皺”反應(yīng)。脊髓損傷后的CTM反射及其神經(jīng)學(xué)回路都已經(jīng)在大鼠(Theriault和Diamond.(1988)J Neurophysiol60，446-462)和豚鼠(Blight等，(1990)J of Comp Neurol 296，614-33)中完全研究清楚，在本領(lǐng)域中是眾所周知的。因為即使在完全切斷以后還很可能出現(xiàn)脊髓(反射性的)行走和步進(jìn)，而且進(jìn)行自發(fā)性移動的神經(jīng)回路還無法有效確定，本研究沒有采用大鼠和豚鼠的SCI自發(fā)性“行走和步進(jìn)”模型。CTM反射模型的一個重要特征是，在切斷脊髓中的上行傳入束后，CTM的應(yīng)答能力完全徹底地消失，而且終身無法(在任何程度上)自發(fā)修復(fù)(Blight等，(1990)J of Comp Neurol296，614-633；Borgens.(2003)Restoring Function to the Injured Human Spinal Cord(Springer-Verlag，Heidelberg))。在這一研究中，未治療的動物中切斷部位同側(cè)(右側(cè))、和下方的背部皮膚肌肉收縮的都不應(yīng)再起作用。
在Borgens等，(2002)J.Exp.Biol.205，1-12中，已經(jīng)完整說明了描述、分析和量化CTM行為能力的方法。簡要地說，在豚鼠的去毛背部皮膚上標(biāo)記上點狀矩陣。當(dāng)皮膚收縮時(通常是向著局部刺激的方向)，記號點也發(fā)生移動。從上方錄像，記錄用單絲探測器進(jìn)行背部皮膚刺激引起CTM移動的全過程(圖1)。在SCI前，對未處理(未損傷)的動物進(jìn)行同樣的實驗，以確定每個動物各自的CTM移動模式。
技術(shù)人員用可干擦的記號筆在未處理的動物身上標(biāo)出應(yīng)答的和不應(yīng)答的皮膚的分界線，給出了動物背部皮膚上整個CTM感受域的完整圖。CTM反射缺失是指一個區(qū)域的皮膚不再對觸覺刺激產(chǎn)生應(yīng)答，而CTM反射的恢復(fù)是指這一區(qū)域?qū)p微的觸覺刺激產(chǎn)生應(yīng)答的皮膚收縮恢復(fù)。而刺激后CTM應(yīng)答的矢量、收縮速度和反應(yīng)時間，可以根據(jù)對錄像的行為進(jìn)行計算機定量測定而得出(Borgens等，(2002)J.Exp.Biol.205，1-12)，最重要的標(biāo)準(zhǔn)是相對于最初完整的感受域的CTM缺失面積百分比。例如，如果脊髓在胸部中間從左到右被完全切斷，將會破壞所有感受域的約50％。這是因為在橫切面上方的感受域完全不受影響，能正常行使機能。因此，在損傷“下方”(尾側(cè))的50％的CTM應(yīng)答能力喪失，而在損傷“上方”(頭側(cè))的50％的CTM應(yīng)答能力不受影響。
本實施方案中所用的切斷方法(右側(cè)單側(cè)半切斷法)中，脊髓只在中線的一側(cè)被完全切斷，因此在損傷平面“上方”和“對側(cè)”的CTM機能還是正常的。這通常引起整個感受域的25％的CTM應(yīng)答能力喪失。
脊髓白質(zhì)軸突的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記在大量過去的文獻(xiàn)中，都報道了將不同的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物注射到豚鼠的脊髓白質(zhì)中。參見Borgens等，(1986)J Comp Neurol 250，168-180和Borgens等，(1999)JNeurtrauma 16，639-57。簡要地說，在動物處死前約18小時，手術(shù)揭開脊髓，用Hamiliton注射器注入約20mL熒光標(biāo)記的右旋糖酐。標(biāo)記物(溶于去離子水中，濃度50％，10,000道爾頓)注射到橫切面(由于有內(nèi)置的標(biāo)記裝置，通常是可見的)頭側(cè)和尾側(cè)2個椎節(jié)的白質(zhì)實質(zhì)的深處。在橫切面的頭側(cè)注入連接了異硫氰酸熒光素(FITC)的右旋糖酐(“Flouro-emerald”)，在橫切面的尾側(cè)注入連接了若丹明的右旋糖酐(“Flouro-ruby”)。這樣，這種順行性雙標(biāo)記把從傷口下方朝傷口投射的上行纖維(多數(shù)是感覺傳入纖維)和從傷口上方朝傷口投射的下行軸突(主要是運動纖維)都標(biāo)記了?？v向水平切片提供了組織學(xué)樣本，其中單個軸突的投射的整個范圍可以是沒有達(dá)到、或延伸到、環(huán)繞、或穿過橫切面。
本方法有時可以提供單個軸突退化和再生的樣本。但是不能用于縱向水平切片上的獨立軸突計數(shù)。因為軸突經(jīng)常走曲折、彎曲的路線，在單個的組織學(xué)樣品中會被重復(fù)計數(shù)。此外，神經(jīng)的發(fā)芽和分支也會導(dǎo)致對于單個從殘余部分?jǐn)U大生長的被切斷纖維的錯誤計數(shù)。更確切地說，就是比較軸突停止在距橫切面(可以用內(nèi)置標(biāo)記物準(zhǔn)確確定)250μm以上、距橫切面250μm以內(nèi)、和穿過橫切面進(jìn)入相鄰的椎節(jié)的動物比例。檢測者得到這些數(shù)據(jù)時，并不知道這些動物的實驗治療情況。圖像來源于Olympus Van Ox顯微鏡觀測，用Optronics DEI-750彩色錄像機拍攝，用Adobe Twain32軟件進(jìn)行計算機分析。
刺激器的設(shè)計和植入用與過去文獻(xiàn)報道相同的方法，將小型的OFS裝置植入到豚鼠中(Moriarty和Borgens.(1999)Restor Neurol Neurosci 14，53-64)。OFS裝置的裝配和電路原理是本領(lǐng)域中已知的(Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322；Borgens.(1999)Neuroscience 91，251-64)。簡要地說，各個裝置用醫(yī)用級的特氟綸包被，輸出總電流為30μA直流電，每15分鐘顛倒一下電極極性。特氟綸包被的刺激器前端，通過外科手術(shù)從刺激器植入位點(背部皮膚下)插入到脊柱，并被脊柱旁肌肉組織固定在這一位置。將鉑/銥醫(yī)用級電極的非絕緣末端分別放到脊髓傷口頭側(cè)和尾側(cè)2個椎節(jié)。預(yù)計該裝置能產(chǎn)生45μA/cm2的有效電流密度和約10mV/mm的電場強度。這種估計是根據(jù)對刺激中的電流密度和電場強度進(jìn)行四極檢測得出的(Borgens等，(1990)J Comp Neurol 296，634-653)。
統(tǒng)計學(xué)檢測。無母數(shù)評價和方法比較通常使用Mann-Whitney或Wilcoxian檢驗，而用費希爾(Fishers’)精確度檢驗、或更保守的X平方分布檢測進(jìn)行比例比較。所用的比較都采用Instat軟件。
本研究的一般方法在第一部分研究的慢性損傷動物中，在進(jìn)行了手術(shù)和植入兩個裝置(OFS裝置和滲透泵)后就要注意動物的長期存活和健康情況，要求動物在最初的脊髓手術(shù)后還能長期存活(6個月)。但是，在進(jìn)行第一部分研究的46只動物中，仍然有7只因為不同的原因被更換。2只動物在手術(shù)后約3個月、實驗性“治療”開始前被取出。它們是由于有證據(jù)表明損傷“失效”而被取出的，例如脊髓損傷沒有破壞CTM行為能力。1只動物在最初的手術(shù)后立即死去。3只動物因為出現(xiàn)自食而在治療開始前被取出。1只動物因為裝置植入部位的持續(xù)感染而在實驗性治療開始前被替換。感染發(fā)生在OFS植入的位置上，這只動物被人道地實施了安樂死，沒有進(jìn)行了行為能力或解剖學(xué)檢測。
在研究結(jié)束時，用面積法(planimitry)分析CTM缺失的范圍。每個動物完整的CTM感受域的單位面積(記為100％)用于比較半切斷手術(shù)后的缺失百分比。這樣就可以根據(jù)CTM缺失的單位面積來確定所有的實驗組是否接受了相似的標(biāo)準(zhǔn)化損傷。所有接受手術(shù)的實驗組都引起統(tǒng)計學(xué)上相似的CTM缺失。
CTM反射的行為能力恢復(fù)在15只植入了泵(只釋放無菌鹽水)和一個沒作用的OFS裝置的對照動物中，沒有一個動物修復(fù)了無功能的CTM感受域。在研究結(jié)束時，它們CTM應(yīng)答能力性質(zhì)與脊髓半切斷術(shù)所產(chǎn)生的CTM應(yīng)答能力性質(zhì)相同，即約25％的感受域沒有活性。在“單一肌苷”和“肌苷加OFS”實驗組中都出現(xiàn)了不同程度的CTM恢復(fù)。在肌苷治療組中一定程度恢復(fù)CTM行為能力的動物數(shù)量(11只動物)要多于聯(lián)合治療組(6只動物)；盡管這個差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＝0.16；費希爾精確度檢驗)。然而，與對照組相比，兩種治療都產(chǎn)生了具有統(tǒng)計學(xué)意義的CTM反射恢復(fù)(“對照”和“單一肌苷”的對比；P＜0.0001；“對照”和“肌苷加OFS”的對比；P＜0.01，費希爾精確度檢驗)。在聯(lián)合治療中，除了一只外，所有的恢復(fù)的動物都在實驗性治療后一個月出現(xiàn)了CTM。在聯(lián)合治療中，CTM的恢復(fù)要更晚(因為11只“肌苷加OFS”組的動物中只有3只在治療后的同一時間段恢復(fù))。盡管兩個實驗組中恢復(fù)的動物的總數(shù)較少，這一差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.04；費希爾精確度檢驗)。
在研究結(jié)束時，聯(lián)合治療產(chǎn)生的CTM感受域恢復(fù)百分率很不穩(wěn)定，但要大于單一肌苷治療所產(chǎn)生的恢復(fù)百分率(平均28.1±17.8對比23.5±3.6)，然而這一差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＝0.5；Mann Whitney)。
軸突再生的解剖學(xué)下方的表1分別列出了3個實驗組中注射胞內(nèi)標(biāo)記物的脊髓數(shù)(N)和沒有組織學(xué)意義的脊髓數(shù)(LTH)。被檢脊髓數(shù)量中有標(biāo)記纖維進(jìn)入四個區(qū)域的脊髓比例也列出了。實驗組兩兩之間的統(tǒng)計學(xué)比較列在了圖表的底部(費希爾精確度雙尾檢驗)。若丹明標(biāo)記的上行纖維和FITC標(biāo)記的下行投射的數(shù)據(jù)都列出了。要注意的是，任何兩組間的沒有組織學(xué)意義的脊髓數(shù)都沒有明顯差異。
表1上行
下行
表1總結(jié)了第一部分研究中所有慢性損傷動物的脊髓內(nèi)上行束和下行束的順行性標(biāo)記的結(jié)果。要注意的是，并不是所有的脊髓都有比較價值。沒有在這里被比較或討論的脊髓的最主要的問題是沒有很好地吸收標(biāo)記物。這些“失效的標(biāo)記”很容易被排除，因為可接受的脊髓在脊髓左側(cè)(未切斷側(cè))的傷口處的兩個脊椎截面有吸收了標(biāo)記物的纖維束。通常在半切斷手術(shù)后，它們通?？梢酝渡?厘米以上。因此，如果明顯跡象表明脊髓標(biāo)記物吸收不足或者在組織學(xué)處理中出現(xiàn)其他問題，則不對這些脊髓作檢定。換句話說，只有對那些在中線左側(cè)(也就是鄰近半切斷位置)出現(xiàn)完整的、標(biāo)記的軸突的脊髓才進(jìn)行解剖學(xué)檢測。確定相對于傷口的軸突投射范圍或距離時，只用了一種其他方法。非常清晰的情況下，軸突的末端是鈍的、或者有時是尖銳的。通常由于熒光有強度衰退，如果末端不明顯，就認(rèn)為纖維還沒有停止。用切片機切割纖維時會將殘余部分帶到下一個組織切片上，有時會產(chǎn)生軸突末端的假象(參見Borgens等，(1986) J Comp Neurol 250，168-180)。然而，在特定實驗組中這并不經(jīng)常發(fā)生，而且切片是在不了解它們實驗性治療的情況下進(jìn)行檢驗和評分的。
任何一個實驗組中都有30％到40％的脊髓沒有足夠吸收標(biāo)記物(和/或其他組織學(xué)處理的問題)。當(dāng)比較兩組之間沒有組織學(xué)意義的脊髓數(shù)時-包括比較頭側(cè)和尾側(cè)標(biāo)記的質(zhì)量(下行束和上行束分開進(jìn)行)，發(fā)現(xiàn)沒有顯著差異(表1)。最后，沒有發(fā)現(xiàn)在右旋糖酐注射點和傷口之間的背根吸收了標(biāo)記物，所以沒有據(jù)此進(jìn)行排除(參見Borgens和Bohnert(1997) Exp Neurol 145，376-89)。
所有的對照動物中，除了3只以外，順行性標(biāo)記的纖維都停止在距橫切面頭側(cè)或尾側(cè)250μm以上的位置處。在這3只(上行軸突)中只有1只，纖維是從標(biāo)記點(傷口的尾側(cè))向傷口平面投射的，但不穿過傷口平面。在同一動物中，來自頭側(cè)脊髓的纖維投射沒有到達(dá)傷口平面，但落在了距傷口平面約100μm以內(nèi)。在其他兩只動物中，順行性標(biāo)記的上行和下行纖維穿過了250μm平面，但是沒有投射到如前一個樣本距傷口這么近的位置。
為了簡化對于解剖學(xué)數(shù)據(jù)的討論，對于標(biāo)記的上行束和下行束的討論分別進(jìn)行說明。表1列出了對于動物比例的詳細(xì)比較和它們之間的統(tǒng)計學(xué)比較。盡管上行束的比較中可用于研究的脊髓數(shù)較少，對照組與兩個治療組之間的差異都十分顯著。尤其是，肌苷/OFS聯(lián)合治療能明顯增加了有上行性纖維停在距傷口250μm ms內(nèi)、和停在傷口平面上的脊髓數(shù)量。9個對照脊髓中只有2個有纖維在距傷口250μms內(nèi)，其中只有1個朝向半切斷平面。約90％的肌苷/OFS治療的脊髓中都在這些位置的纖維，這些脊髓軸突中45％進(jìn)入頭節(jié)。對照組與聯(lián)合治療組之間，所有3種比較(即靠近、位于、或越過橫切面)都具有統(tǒng)計學(xué)意義。肌苷注入治療組中，帶有位于橫切面250μm ms以內(nèi)的軸突的脊髓的增加具有統(tǒng)計學(xué)意義；而對帶有到達(dá)橫切面、或在橫切面周圍和/或穿過橫切面的軸突的脊髓的比較，沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)。
盡管對照組、單一肌苷組和肌苷加OFS聯(lián)合治療組之間沒有組織學(xué)意義的脊髓數(shù)的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，用FITC-標(biāo)記的右旋糖酐對下行束中的軸突進(jìn)行順行性標(biāo)記，明顯要比用若丹明-標(biāo)記的右旋糖酐吸收更好、整合更好。只有對照組和聯(lián)合治療組之間，帶有進(jìn)入尾節(jié)(繞過或穿過傷口)的纖維的脊髓數(shù)的比較才有統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)對帶有在橫切面上或250μm ms以內(nèi)的纖維的脊髓進(jìn)行比較時，只有肌苷治療組與對照組相比有顯著差異。
綜上所述，盡管檢測所用的脊髓數(shù)量較少，與下行纖維束相比，上行束中由實驗性治療引起的損傷后軸突退行性變性減少和軸突再生都更明顯。而且，聯(lián)合治療要比單一肌苷治療更有效的產(chǎn)生這樣的結(jié)果。
實施例2OFS和肌苷聯(lián)合治療在狗下肢癱瘓臨床治療中的效果在由椎間盤突出引起自然發(fā)生的脊髓損傷的狗中，進(jìn)行OFS結(jié)合肌苷聯(lián)合治療的臨床試驗。選擇標(biāo)準(zhǔn)與以前在Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322中所述一樣。簡要地說，選擇標(biāo)準(zhǔn)可以包括下述的一條或多條經(jīng)神經(jīng)學(xué)檢驗和電生理學(xué)測試確定的下肢完全癱瘓；未受影響的節(jié)段反射；因椎間盤突出和局灶性病變而引起脊髓壓迫的放射學(xué)和脊髓攝影證據(jù)；壞死沒有明顯地向頭尾傳播；體重在16公斤以下。對急性和慢性損傷都可以研究。急性損傷的特征是癱瘓在治療前一個月以內(nèi)發(fā)生。慢性損傷的特征是癱瘓在治療前一個月以上發(fā)生。OFS裝置的手術(shù)植入與以前在Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322中所述一樣。用如實施例1所述的一般方法進(jìn)行肌苷治療。研究組包括用OFS加肌苷治療的動物和只用肌苷治療的動物。此外，本研究中的對照組包括任何下述動物用假OFS和假肌苷治療的動物，用假OFS治療的動物，用假肌苷治療的動物，和沒有接受治療的動物。用與以前在Borgens等，(1993)Restor Neurol Neurosci 5，305-322中所述相同的方法，對動物進(jìn)行神經(jīng)學(xué)和電生理學(xué)檢測。
實施例3OFS和肌苷治療的人類臨床試驗如本文所述，招募脊髓損傷的患者參加OFS和肌苷聯(lián)合治療的一期、二期和三期臨床試驗。從相應(yīng)的研究機構(gòu)審查委員會獲得批準(zhǔn)。從符合FDA的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)的供應(yīng)商處購買肌苷。在治療后一年的時間內(nèi)，追蹤觀測患者情況。
在本發(fā)明提及的所有專利、專利申請、出版物和電子版資料(包括在GenBank和RefSeq遞交的核酸序列，在SwissProt、PIR、PRF、PDB遞交的氨基酸序列，以及對GenBank和RefSeq中注明的編碼序列的變換)都在本申請中引用作為參考。進(jìn)一步的詳細(xì)說明和實施例，只是為了便于清楚理解，并不由此產(chǎn)生任何不必要的限制。本發(fā)明不限于已經(jīng)描述和給出的詳細(xì)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員據(jù)此作出的各種改動也包括在本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。
所有的標(biāo)題是為了方便讀者，除非特別指出，否則不應(yīng)被用于限制標(biāo)題后正文的意義。
權(quán)利要求
1.一種治療脊髓損傷患者的方法，所述方法包括對脊髓損傷部位進(jìn)行電刺激；和對患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類似物給藥；其中，所述受損脊髓中的神經(jīng)功能至少部分恢復(fù)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括給患者植入一個在脊髓損傷部位進(jìn)行電刺激的裝置。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述裝置是振蕩場刺激裝置。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嘌呤核苷包括肌苷。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嘌呤核苷或其類似物是向患者全身性給藥的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嘌呤核苷或其類似物是口服或皮下給藥的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嘌呤核苷或其類似物是在脊髓損傷部位局部給藥的。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，還包括給患者植入一個進(jìn)行嘌呤核苷或其類似物局部給藥的裝置。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述脊髓損傷發(fā)生在治療前3個月以上。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述患者是人。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述患者是家養(yǎng)寵物。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述神經(jīng)功能的恢復(fù)可以通過神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的恢復(fù)、傳導(dǎo)動作電位的可檢測升高、解剖學(xué)連續(xù)性的檢測、一個以上脊髓根水平的恢復(fù)、反射行為的增加、或其組合來證明。
13.一種治療脊髓損傷患者的方法，所述方法包括對脊髓損傷部位進(jìn)行電刺激；和對患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類似物給藥；其中，脊髓損傷部位的神經(jīng)再生被激發(fā)。
14.一種治療脊髓損傷患者的方法，所述方法包括在有效恢復(fù)所述受損脊髓的神經(jīng)功能的情況下對患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類似物給藥。
15.一種治療脊髓損傷患者的方法，所述方法包括在有效激發(fā)脊髓損傷部位神經(jīng)再生的情況下對患者進(jìn)行嘌呤核苷或其類似物給藥。
16.一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的試劑盒，所述試劑盒包括向損傷部位施加電刺激和嘌呤核苷或其類似物的方法。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，所述向損傷部位施加電刺激的方法包括振蕩場電刺激裝置以及包括肌苷在內(nèi)的嘌呤核苷或其類似物。
18.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，還包括用于皮下、靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)輸遞嘌呤核苷或其類似物的裝置。
19.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，還包括關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷治療的文字說明。
全文摘要
對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，尤其是脊髓損傷，是通過給予患者嘌呤核苷或類似物并任選電刺激損傷部位來治療的。
文檔編號A61N1/08GK1732011SQ200380107820
公開日2006年2月8日 申請日期2003年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者R·B·博根斯 申請人:泊達(dá)研究基金會