專利名稱：促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素－尾加壓素系統(tǒng)在治療炎性疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療炎性疾病的藥物組合物。特別的，本發(fā)明涉及含有合成CRH-R1拮抗劑和/或合成CRH-R2激動(dòng)劑的藥物組合物。
另一方面，本發(fā)明涉及利用合成CRH-R1拮抗劑和/或合成CRH-R2激動(dòng)劑治療炎性疾病。
背景技術(shù)：
1.炎性反應(yīng)術(shù)語(yǔ)炎癥是指對(duì)引起組織損傷的有害的內(nèi)源性或外源性刺激的局部反應(yīng)，其特征在于毛細(xì)血管擴(kuò)張和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥的典型信號(hào)和癥狀包括腫脹、發(fā)紅、局部和/或總體溫度升高以及疼痛。內(nèi)源及外源有害試劑引起包括傳染性疾病在內(nèi)的炎癥。炎癥是一種宿主防御機(jī)制，其可最終損害防御生物。在嚴(yán)重的傳染性疾病和多種炎性疾病中可見(jiàn)高水平的這些細(xì)胞因子。病因未知的急性或慢性炎性疾病可能由于難以分離的傳染物(infectious agents)引起。一個(gè)周知的實(shí)例是大多數(shù)胃潰瘍是由于細(xì)胞幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染造成的。另一方面，通常不與炎癥相關(guān)聯(lián)的疾病實(shí)際上是由低級(jí)別的慢性炎癥引起的。實(shí)際上，動(dòng)脈硬化是一個(gè)特征性實(shí)例。自身免疫疾病也可引起炎癥反應(yīng)，其特征是免疫復(fù)合物沉積疾病的例子。促炎細(xì)胞因子IL-1，TNF-α和IL-6(經(jīng)刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)物)在引發(fā)炎癥過(guò)程中起關(guān)鍵作用。應(yīng)當(dāng)注意傳染物也可引起病因未知的急性或慢性炎性疾病。
2.CRH系統(tǒng)神經(jīng)肽的促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)家族由多個(gè)成員組成，哺乳動(dòng)物中最主要的是CRH，一種41個(gè)氨基酸的下丘腦肽，和尾加壓素(urocortin，(UCN))，一種40個(gè)氨基酸的肽，與CRH有45％的序列同源性。CRH的生物學(xué)作用由至少兩種不同類型的受體介導(dǎo)，即屬于G-蛋白偶聯(lián)受體超家族的CRH-R1和CRH-R2。與CRH-R2相比，CRH對(duì)CRH-R1的親和力高10倍。在免疫系統(tǒng)中，業(yè)已在脾和胸腺中鑒別了CRH-R1受體。近來(lái)，CRH-R1受體的非肽受體拮抗劑的合成為更精確的在組織水平評(píng)估CRH的功能性意義提供了有用的工具。與對(duì)CRH-R2亞型具有低親和性的CRH相反，UCN與所有已知的CRH功能效應(yīng)物結(jié)合，包括CRH-R1、CRH-R2α、CRH-R2β受體和CRH結(jié)合蛋白質(zhì)(CRH-BP)。
3.CRH與免疫系統(tǒng)的相互作用CRH直接在炎癥反應(yīng)位點(diǎn)影響免疫系統(tǒng)，且以間接的方式，通過(guò)刺激來(lái)自腎上腺的皮質(zhì)醇的產(chǎn)生。CRH在炎癥反應(yīng)的位點(diǎn)通過(guò)神經(jīng)末稍和上皮細(xì)胞釋放，其直接影響炎癥附近的駐留免疫細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)注意當(dāng)CRH的間接作用是抗炎性時(shí)，其直接的旁分泌作用無(wú)疑是促炎癥性的。因此，特異性抗CRH血清的局部效應(yīng)的阻斷在數(shù)種體內(nèi)炎癥模型中減弱了炎癥反應(yīng)。CRH的一個(gè)免疫靶標(biāo)是肥大細(xì)胞。但是，除了肥大細(xì)胞，許多其他免疫細(xì)胞顯示特異性的CRH結(jié)合位點(diǎn)，包括小鼠脾細(xì)胞、人外周血單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Th細(xì)胞。CRH受體也存在于發(fā)炎的滑膜和發(fā)炎的皮下組織。CRH-R1受體在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)通過(guò)接觸脂多糖(LPS)被上調(diào)。實(shí)際上，炎癥位點(diǎn)的CRH受體數(shù)目增加與CRH濃度相平行。CRH的作用主要與肥大細(xì)胞相關(guān)，因?yàn)槠涫┯脤?dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒，這是一種由CRH-R1受體拮抗劑安他拉明(antalarmin)抑制的作用。
巨噬細(xì)胞屬于炎癥反應(yīng)過(guò)程中起始細(xì)胞中的一種，其是一系列促炎細(xì)胞因子的主要來(lái)源。巨噬細(xì)胞的活化通過(guò)抗原性信號(hào)如細(xì)菌LPS發(fā)生，其結(jié)合于Toll樣受體4(TLR-4)，活化細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄并由這些細(xì)胞分泌。無(wú)論是在局部還是在系統(tǒng)性炎癥過(guò)程中，巨噬細(xì)胞均是促炎細(xì)胞因子的主要來(lái)源。
2.在胃腸道(GI)炎癥中的CRH系統(tǒng)CRH家族的肽在胃腸道的全長(zhǎng)中表達(dá)。實(shí)際上，CRH通過(guò)人結(jié)腸中的腸嗜鉻細(xì)胞表達(dá)，而UCN在大鼠的胃和結(jié)腸中均可檢出。近來(lái)公開(kāi)的報(bào)告提示CRH家族的肽及其受體參與了GI活動(dòng)性的調(diào)節(jié)，以及GI對(duì)炎癥性過(guò)程的應(yīng)答。實(shí)際上，目前業(yè)已確立CRH存在于患有潰瘍性結(jié)腸炎的患者之結(jié)腸粘膜中，起局部促炎癥作用。此外，業(yè)已在人結(jié)腸粘膜的粘膜固有層中鑒別了UCN，其參與局部炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。通常，胃腸道中CRH家族的肽顯示受體類型特異性，CRH-R1和CRH-R2受體具有或多或少的相對(duì)作用。實(shí)際上，CRH-R1受體的活化導(dǎo)致結(jié)腸推進(jìn)活性增加，而CRH-R2受體活化導(dǎo)致小鼠和大鼠胃內(nèi)容排出速度的抑制。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及治療方式在治療急性或慢性炎性疾病中的用途。根據(jù)本發(fā)明的治療方案涉及合成CRH-R1受體拮抗劑和/或合成CRH-R2受體激動(dòng)劑的用途，其旨在調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化、增殖、分化、凋亡和細(xì)胞因子產(chǎn)生的反應(yīng)，由此，控制炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。數(shù)據(jù)顯示CRH增大炎癥反應(yīng)，其通過(guò)CRH-R1受體起作用，而UCN減弱該反應(yīng)，其通過(guò)CRH-R2受體起作用。CRH和UCN的這些作用是所述肽對(duì)在其表面表達(dá)CRH-R1受體且表達(dá)CRH-R2受體的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的直接作用的結(jié)果。
已使用三種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)CRH系統(tǒng)對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用(a)巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)，(b)體內(nèi)動(dòng)物模型，和(c)人炎癥性疾病的實(shí)例。
(a)在體外實(shí)驗(yàn)中我們使用兩種類型的巨噬細(xì)胞RAW 264.7單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞系(其衍生自小鼠骨髓瘤，應(yīng)答LPS產(chǎn)生所有促炎細(xì)胞因子)和來(lái)自Balb/c小鼠的硫膠質(zhì)(thioglycollate)引發(fā)的腹膜巨噬細(xì)胞。CRH增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6產(chǎn)生。另一方面，UCN通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡緩解炎癥反應(yīng)。的這一作用在LPS誘導(dǎo)的RAW-264.7巨噬細(xì)胞和原代骨髓巨噬細(xì)胞中尤其明顯。用UCN處理RAW264.7細(xì)胞導(dǎo)致應(yīng)激誘導(dǎo)的激酶JNK和p38MAPK的快速活化，Bax的上調(diào)以及Fas配基表達(dá)的增強(qiáng)和凋亡。
(b)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們?cè)贐alb/c小鼠中使用LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克模型，一種用于系統(tǒng)性炎癥的成熟模型，其中巨噬細(xì)胞是負(fù)責(zé)形成休克的促炎細(xì)胞因子的主要來(lái)源。我們發(fā)現(xiàn)在LPS之前施用合成CRH-R1受體拮抗劑以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式延長(zhǎng)了存活。該作用在內(nèi)毒素休克的早期更明顯。CRH-R1阻斷抑制了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子(TNF-a、IL-1β和IL-6)的水平，證實(shí)了細(xì)胞因子表達(dá)中CRH信號(hào)的作用。
(c)人類數(shù)據(jù)我們使用患有胃炎的患者。在此前瞻性研究中所選的胃炎模型是由幽門螺桿菌引起的，因?yàn)槠渚奂瓦吔缜宄男再|(zhì)，以及其在適當(dāng)?shù)母翁幚砗笸耆目赡嫘?。我們的新鮮組織樣本獲自胃鏡活檢樣品。研究的設(shè)計(jì)基于如下的小規(guī)模數(shù)據(jù)，其顯示CRH轉(zhuǎn)錄物和肽在正常人胃粘膜中可能無(wú)法檢出，而UCN可能存在并聚集于胃上皮細(xì)胞。我們的數(shù)據(jù)證實(shí)了我們的假設(shè)，表明在人胃中，UCN是炎癥的強(qiáng)力抑制劑。
因此，本發(fā)明人正證實(shí)體內(nèi)和體外CRH-R1激動(dòng)劑均增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，CRH-R1拮抗劑緩解炎癥反應(yīng)；CRH-R2激動(dòng)劑也緩解炎癥反應(yīng)。本發(fā)明涉及使用這樣的化合物用于治療人類局部和系統(tǒng)性炎癥。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及含有一種或多種合成CRH-R1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑的藥物組合物。
與本發(fā)明所述化合物相連的術(shù)語(yǔ)“合成的”是指目標(biāo)化合物不是天然發(fā)生的化合物，而是利用一些技術(shù)方法制備的。合成化合物因此包括例如蛋白質(zhì)和肽(只要使用了重組技術(shù)或化學(xué)合成的)以及小有機(jī)化合物。
因此，“合成CRH-R1拮抗劑”是一種抑制CRH-R1功能的合成化合物，當(dāng)加入CRH-R1檢驗(yàn)方法中，阻斷CRH肽的作用以及合成CRH-R1激動(dòng)劑的作用，導(dǎo)致與不含所述化合物的相同檢驗(yàn)相比，用激動(dòng)劑配基(如CRH)刺激CRH-R1受體時(shí)較小的信號(hào)。“合成CRH-R2激動(dòng)劑”是一種活化CRH-R2的合成化合物，相比于不含所述化合物的相同檢驗(yàn)中，在CRH-R2檢驗(yàn)中作為CRH-R2受體活化的結(jié)果而產(chǎn)生信號(hào)，如CRH。
CRH-R1和CRH-R2檢驗(yàn)為本領(lǐng)域公知。原則上，任一本領(lǐng)域公知的合適的CRH-R1和CRH-R2檢驗(yàn)均可用于確定一種侯選的合成化合物分別是激動(dòng)劑或拮抗劑。業(yè)已開(kāi)發(fā)了優(yōu)選的CRH-R1和CRH-R2檢驗(yàn)的實(shí)例。通過(guò)CRH-R1受體的生物活性檢驗(yàn)(a)CRH活化p38細(xì)胞分裂素活化的蛋白激酶，刺激Fas配基產(chǎn)生，誘導(dǎo)PC12大鼠中嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡。CRH-R1拮抗劑安他拉明阻斷所有這些CRH介導(dǎo)的作用(Dermitzaki等人，2002)；(b)CRH增強(qiáng)體外巨噬細(xì)胞對(duì)脂多糖的炎癥性反應(yīng)。CRH的增強(qiáng)作用被CRH-R1拮抗劑安他拉明完全阻斷(Agelaki等人，2002)。通過(guò)CRH-R2受體的生物活性檢驗(yàn)尾加壓素和尾加壓素II誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。此作用由CRH-R2受體介導(dǎo)，因?yàn)樘禺愋赞卓箘┩芷そ祲弘?30完全消除此作用(Tsatsanis等人，已提交)。
安他拉明是合成CHR-R1拮抗劑的實(shí)例。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種或多種合成CRH-R1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑用于制備治療炎性疾病或病癥的藥物組合物的用途。
除了活性化合物，藥物組合物可包含常用佐劑，如稀釋劑、填充劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、香料和色料。藥物組合物可配制成適于任一途徑適用的形式，包括經(jīng)口、非胃腸道或靜脈內(nèi)施用。優(yōu)選的施用形式是注射。
藥物組合物中活性化合物的量取決于具體的活性化合物、受者的年齡、體重和一般狀況。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉如何基于常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定給定活性化合物的適合的量。
待施用的量和頻率以及施用途徑取決于給定化合物和待治療的具體病癥，將由處置醫(yī)生決定。
待用本發(fā)明的藥物組合物治療的炎性疾病或病癥包括但不限于慢性炎癥性腸病、特發(fā)性炎性疾病、結(jié)締組織炎性疾病、炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病、炎性肌病、包括滑囊炎的關(guān)節(jié)炎性疾病、纖維肌痛綜合征和上胃腸道炎性疾病。
術(shù)語(yǔ)“治療”應(yīng)當(dāng)廣義的理解，除了治療以外也包括疾病的預(yù)防、癥狀或疾病的緩解以及預(yù)防炎性疾病或病癥的復(fù)發(fā)。
如果意在將一種以上的活性化合物用于治療特定疾病，根據(jù)本發(fā)明，例如通過(guò)使用一種合成CRH-R1拮抗劑和一種合成CRH-R2激動(dòng)劑用于治療特定疾病，則可將一種以上的活性化合物配制在一種藥物組合物中，其中包括所有的活性化合物；或者可將一種以上的活性化合物配制在兩種或多種不同的藥物組合物中，每種含有一種或多種活性化合物。
當(dāng)活性化合物的組合配制在兩種或多種單獨(dú)的藥物組合物中時(shí)，藥物組合物可同時(shí)施用或其可在不同的時(shí)間點(diǎn)或頻率配制。
當(dāng)所述活性化合物的組合配制入兩種或多種單獨(dú)的藥物組合物中時(shí)，這些藥物組合物適于在試劑盒中提供，所述試劑盒含有一種或多種CRHR1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑，其包括在一種或多種單獨(dú)的藥物組合物中。
因此，在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于治療炎性疾病或病癥的試劑盒，其含有一種或多種CRHR1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑，其包括在一種或多種單獨(dú)的藥物組合物中。
所述試劑盒也可含有關(guān)于試劑盒中的藥物組合物的施用頻率、量和時(shí)間的指示。


圖1.用10-9M UCN和10μg/ml LPS處理的RAW264.7細(xì)胞，用核小體形成測(cè)量凋亡。
圖2.UCN增強(qiáng)RAW264.7巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的p38MAPK和JNK活化。
圖3.CRH增加LPS誘導(dǎo)的來(lái)自RAW264.7巨噬細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子分泌a)用CRH，LPS和CRH+LPS處理的細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α的水平。當(dāng)細(xì)胞用CRH和LPS處理時(shí)TNF-α的水平明顯高于單獨(dú)用LPS處理的；b)CRH以顯著的方式促使LPS誘導(dǎo)的IL-1β分泌；c)CRH促使從RAW264.7細(xì)胞分泌LPS誘導(dǎo)的IL-6。
圖4.a)CRH在轉(zhuǎn)錄水平增加促炎細(xì)胞因子。IL-1β(上圖)，TNF-α(第二圖)和IL-6(第三圖)mRNA水平用半定量RT-PCR方法確定。CRH誘導(dǎo)全部三種細(xì)胞因子表達(dá)，且促使LPS誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化。b，C，d)IL-1β(B)，TNF-α(C)和IL-6(D)的RT-PCR產(chǎn)物的密度分析。
圖5.在來(lái)自Balb/c小鼠的硫膠質(zhì)誘導(dǎo)的腹膜巨噬細(xì)胞中CRH促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子表達(dá)。IL-1β(A上圖)，TNF-a(B上圖)和IL-6(C上圖)mRNA表達(dá)用對(duì)肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的RT-PCR產(chǎn)物的密度定量。
圖6.CRH-R1受體拮抗劑安他拉明延長(zhǎng)了腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)衍生的LPS處理之動(dòng)物的存活。
圖7.CRH-R1受體被安他拉明的阻斷明顯降低經(jīng)歷LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克之小鼠中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。
圖8.在從人正常胃粘膜的一份活檢樣品、來(lái)自兩個(gè)不同的胃炎患者的炎性粘膜的兩個(gè)活檢樣品以及人足月胎盤中分離的總RNA中RT-PCR分析CRH-樣肽。在所有樣品中均可見(jiàn)預(yù)定大小的UCN的145bp的DNA產(chǎn)物。陰性對(duì)照樣品中也顯示無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶(無(wú)RT)或無(wú)DNA模板。僅在胎盤RNA樣品中檢測(cè)到預(yù)定大小的CRH的360bp的DNA產(chǎn)物。進(jìn)行針對(duì)肌動(dòng)蛋白的RT-PCR以確保所有樣品中的RNA質(zhì)量。
圖9.來(lái)自患有與幽門螺桿菌感染相關(guān)的慢性胃炎之患者的胃粘膜中UCN的免疫組化染色(C，D)。人胎盤用作陽(yáng)性對(duì)照(圖A，B)。用抗UCN抗體染色胃粘膜和胎盤組織切片(表B，D)。免疫活性尾加壓素(Ir-UCN)聚集在小凸(F)和粘液分泌腺(G)。在毛細(xì)管(C)和散見(jiàn)在胃粘膜間質(zhì)(S)主要是漿細(xì)胞(P)中的炎性元件中也觀察到陽(yáng)性染色。在胎盤切片中，滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞(T)對(duì)UCN染色陽(yáng)性，與相鄰的間質(zhì)絨毛(V)相反。對(duì)照免疫染色，采用正常的兔IgG或UCN肽失活抗體(圖A，C)，均為陰性。原始放大倍數(shù)x250。
圖10.在人胃粘膜活檢中UCN的水平。圖A。無(wú)胃炎(正常)的患者以及診斷為患有由于幽門螺桿菌感染的胃炎之患者的比較。在患有幽門螺桿菌胃炎和胃炎癥的患者組中可見(jiàn)Ir-UCN明顯升高(p＜0.001)。圖B.在治療前和接受根除幽門螺桿菌的藥物治療兩個(gè)月后的患者的比較。根據(jù)病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，后者被分成應(yīng)答者(急性和慢性炎癥逆轉(zhuǎn)，無(wú)幽門螺桿菌感染信號(hào))和非應(yīng)答者(持續(xù)炎癥和/或幽門螺桿菌信號(hào))。在治療組但是不是非應(yīng)答者的患者中觀察到ir-UCN水平的明顯提高(p＜0.001)。
圖11.UCN水平與患有胃炎之患者的胃活檢中炎性活性水平之間的相關(guān)性分析(n＝30)。
A慢性炎癥；B急性炎癥；C幽門螺桿菌感染。
在所有三個(gè)參數(shù)中觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的陰性關(guān)聯(lián)(Spearman′s級(jí)數(shù)關(guān)聯(lián))。
實(shí)驗(yàn)本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)工作予以描述，其不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。
材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞在Dulbecco′s Modified Eagle培養(yǎng)基(補(bǔ)加10％胎牛血清(FCS)，10mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素，0.1mg/ml鏈霉素(均購(gòu)自Gibco)于5％CO2和37℃中培養(yǎng)。在刺激前一天細(xì)胞種板于25cm2燒瓶中。然后細(xì)胞用10μg/ml大腸桿菌衍生的LPS(血清型0111B4，cat.#L2630，Sigma)和濃度為10-8M的重組CRH(Sigma)刺激。
分離和刺激硫膠質(zhì)引發(fā)的巨噬細(xì)胞施用前2天制備4％硫膠質(zhì)溶液并滅菌。將1.5ml硫膠質(zhì)溶液腹膜內(nèi)注射入BALB/c小鼠，用Dulbecco′s Modified Medium灌洗腹腔分離腹膜巨噬細(xì)胞。然后將細(xì)胞在補(bǔ)加有10％ FCS，10mM L-谷氨酸，100U/ml青霉素，0.1mg/ml鏈霉素(Gibco)的DMEM中培養(yǎng)。在刺激前24小時(shí)將細(xì)胞以5×105/ml的濃度接種并在培養(yǎng)基中維持24小時(shí)。
動(dòng)物使用雄性20-25克Balb/c小鼠(8-10周齡)。在每次實(shí)驗(yàn)前至少在動(dòng)物房中滯留一周，以適應(yīng)環(huán)境并確認(rèn)其健康。每一動(dòng)物接受嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼料，隨意飲食和飲水。所用CRH-R1拮抗劑由兒科和生殖內(nèi)分泌組(Pediatric and Reproductive Endocrinology Branch)，NICHD，NIH，Bethesda，MD提供。起初將安他拉明以200mg/ml的濃度溶于100％乙醇，然后以1∶1的比例用Cremaphor EL(Sigma)稀釋，最終得到工作儲(chǔ)液溶于10％乙醇的2mg/ml安他拉明和溶于無(wú)菌水的10％cremaphor EL的2mg/ml安他拉明。大腸桿菌脂多糖(血清型0111B4，cat.#L2630)和腸炎沙門氏菌脂多糖(cat.#L6011)購(gòu)自Sigma。抗體和用于確定TNF-α、IL-1β和IL-6的試劑購(gòu)自R & D(NE，USA)。
脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克為確定LD50，由5只小鼠組成的組腹膜內(nèi)注射(i.p)200，400，600，700或1000μg/小鼠沙門氏菌衍生的LPS(Sigma)，其溶于PBS，濃度為10mg/ml。在7天內(nèi)監(jiān)視動(dòng)物的存活。對(duì)于大腸桿菌衍生的LPS(011B4)使用相同的方案。為確定在注射LPS的小鼠存活中安他拉明的作用，將40只小鼠分成4個(gè)不同的組第一組接受濃度為20mg/kg體重的安他拉明；第二組接受20mg/kg體重的安他拉明和濃度為每25g體重0.7mg的LPS；第三組接受LPS和安他拉明稀釋劑；而第四組僅接受安他拉明稀釋劑。在LPS注射前1.5小時(shí)用安他拉明或稀釋劑預(yù)處理小鼠，根據(jù)本方案，且為了不明顯改變HPA軸應(yīng)答。CRH-R1受體拮抗劑安他拉明單獨(dú)對(duì)動(dòng)物的存活無(wú)作用，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未重復(fù)單獨(dú)注射安他拉明。
總RNA的分離和RT PCR利用Trizol試劑(Gibco)分離總RNA。逆轉(zhuǎn)錄后(ThermoscriptRT，Invitrogen)，通過(guò)33個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增1μl cDNA產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)注意到在33個(gè)循環(huán)時(shí)，所有的mRNA擴(kuò)增在擴(kuò)增的指數(shù)期，如每一對(duì)引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線所示(數(shù)據(jù)未顯示)。在3％瓊脂糖凝膠中分離10μl擴(kuò)增的產(chǎn)物并用溴乙錠染色。條帶的密度用TINAscan軟件定量。
對(duì)于肌動(dòng)蛋白的引物為有義5′-TCA GAA GAA CTC CTA TGTGG-3′；反義5′-TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′，得到499bp的產(chǎn)物；對(duì)于Tnf-α的引物為5′-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTTCG-3′；5′-GGCTGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′，得到590bp的產(chǎn)物；對(duì)于IL-1β為5′-GGA TGA GGA CAT GAG CAC CT-3′和5′-TCC ATT GAG GTG GAGAGC TT-3′，得到196bp的產(chǎn)物；對(duì)于IL-6，5′-TGA AGT TCC TCT CTGCAA GAG ACT-3′，5′-TGA GGA AGG CCG TGG TTG T-3′，得到200bp的產(chǎn)物。總細(xì)胞RNA利用Trizol試劑(Gibco)分離。逆轉(zhuǎn)錄后(Thermoscript RT，Invitrogen)，通過(guò)33個(gè)(退火溫度在55℃)循環(huán)的PCR(Platinum Taq polymerase，Invitrogen)擴(kuò)增1μl cDNA產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)注意到在33個(gè)循環(huán)時(shí)，所有的mRNA擴(kuò)增在擴(kuò)增的指數(shù)期，如每一對(duì)引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線所示(數(shù)據(jù)未顯示)。利用BioRad MolecularAnalyst System在3％瓊脂糖凝膠中分離10μl擴(kuò)增的產(chǎn)物并用溴乙錠染色。定量用TINAscan軟件。每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次。
從冰凍的胃竇組織活檢中利用Trizol試劑(Gibco BRL co，MD)提取總組織RNA。加入DNase(Gibco BRL)除去污染的基因組DNA。利用SuperScript Preamplification System(Gibco BRL)和隨機(jī)六聚體在總體積20μl中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。2μl RT產(chǎn)物用作模板，利用如下條件在總反應(yīng)體積50μl中進(jìn)行PCR擴(kuò)增2mM MgCl2，1X PCR緩沖液，0.2mM有義和反義引物，0.2mM dNTP和2.5U Taq聚合酶(Gibco)。使用如下循環(huán)參數(shù)在Perkin-Elmer DNA Thermal cycler中進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增循環(huán)(變性98℃5分鐘，退火65℃1分鐘，延伸72℃1分鐘)，2個(gè)循環(huán)(退火溫度63℃1分鐘)，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)(變性95℃1分鐘，退火60℃1分鐘，延伸72℃1分鐘)，最后的延伸步驟為72℃7分鐘。針對(duì)公開(kāi)的人序列設(shè)計(jì)寡核苷酸，對(duì)于Ucn有義引物5′-CAGGCGAGCGGCCGCG-3′，反義引物5′-CTTGCCCACCGAGTCGAAT-3′，對(duì)于CRH有義引物5′-CAACTTTTTCCGCGTGTTGCT-3′，反義引物5′-ATGGCATAAGAGCAGCGCTAT-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物的大小預(yù)期為145bp(對(duì)于Ucn)和360bp(對(duì)于CRH)。寡核苷酸根據(jù)客戶要求由MWG-Biotech，AG(Munchen，德國(guó))合成。在每次檢測(cè)中均加入陰性對(duì)照，其中在UCN RNA陽(yáng)性樣品中不加RT酶(無(wú)RT)，或不加DNA模板(無(wú)DNA)以排除基因組或其它DNA污染的可能性。對(duì)于激動(dòng)蛋白的PCR也利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，以確保RNA和cDNA制備的質(zhì)量。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳分級(jí)分離，通過(guò)溴乙錠染色在紫外下檢測(cè)。
ELISA和RIA來(lái)自軀干血的ELISA和RIA血清如下收集a)為確定TNF-a，LPS施用后1小時(shí)，和b)為確定IL-1β或IL-6水平，施用后4小時(shí)。每次實(shí)驗(yàn)中每一時(shí)間點(diǎn)和處理組由5只動(dòng)物組成。收集血清并冷凍直至根據(jù)制造商說(shuō)明用于ELISA確定細(xì)胞因子(R & D，NE，USA)。類似的，在刺激后24小時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-70℃儲(chǔ)存直至分析時(shí)。皮質(zhì)酮的測(cè)定是通過(guò)RIA在LPS施用后1小時(shí)收集的血清中進(jìn)行。每次處理使用5只動(dòng)物。血清在-70℃儲(chǔ)存，依照制造商推薦的方法分析(ICN，USA)。
調(diào)亡的定量測(cè)定以初始濃度每孔10,000個(gè)細(xì)胞將細(xì)胞接種于96孔板。按照制造商方案用“細(xì)胞死亡檢測(cè)”ELISA試劑盒通過(guò)核小體DNA片段的確定直接測(cè)量調(diào)亡。
FACS分析于所示濃度在不同時(shí)間點(diǎn)用UCN和/或LPS處理細(xì)胞，收集于PBS，用7-氨基放線菌素(7AAD)孵育10分鐘。洗滌細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析(Coulter)。
Western印跡分析刺激后收集細(xì)胞并裂解于62.5mM Tris HCI pH＝6.8，10％甘油，2％SDS和新鮮加入的抑制劑戊甲基磺酰氯(10μg/ml)，0.5mM DTT和50mM Na2F。
人組織樣品具有持續(xù)一個(gè)月以上的心口痛和/或消化不良癥狀史的患者接受胃鏡檢查，作為現(xiàn)Heraklion大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)施的診斷方案。排除如下類型的患者具有十二指腸或胃潰瘍史的患者，由于胃食管回流或感染造成的食管炎，食管和上胃腸道活動(dòng)性疾病，膽囊和膽管結(jié)石病，胰腺炎，肝硬化，炎性腸疾病(Crohn′s和潰瘍性結(jié)腸炎)，糖尿病或癌癥。也排除了在此前月份中服用任何藥物(除了抗酸劑antacids)的患者。在小心排除了所有上述病例后，接受胃鏡檢查的患者分成兩組對(duì)照(n＝8)，和診斷為幽門螺桿菌胃炎的患者(n＝15)。在兩組之間，關(guān)于年齡、性別、飲食習(xí)慣或是否抽煙均無(wú)差異。作為對(duì)照，定義為具有正常內(nèi)窺鏡結(jié)果且在竇活檢樣品中無(wú)炎癥因子的患者。作為具有由于幽門螺桿菌的慢性胃炎之患者，定義為具有相符的病史和診斷發(fā)現(xiàn)，包括胃粘膜扁平或突起的糜爛和滲出物的個(gè)體。損傷通常主要是在胃竇。幽門螺桿菌的存在通過(guò)組織學(xué)方法檢測(cè)，且通過(guò)在含有尿素的培養(yǎng)液中放置竇活檢樣品，允許樣品檢測(cè)隨著生物產(chǎn)生氨時(shí)發(fā)生的pH改變(CLO-實(shí)驗(yàn)，Delta West，Bent1ey，Australia)。在根治性治療后兩個(gè)月進(jìn)行第二次胃鏡，所述治療由如下組成雙重抗生素10天療程(阿莫西林1g P.O.b.i.d，克拉霉素500mg P.O.b.i.d.)和奧美拉唑(20mg P.O b.i.d.進(jìn)行10天，然后20mg q.d.進(jìn)行一個(gè)月)。為在胃竇中獲得更具代表性的尾加壓素(ir-Ucn)水平免疫活性測(cè)量，通過(guò)內(nèi)窺鏡活檢鉗從胃竇收集樣品(小曲和大曲面，前壁和后壁)。合并每一患者的樣品，立即于-70℃冷凍。胃炎的組織學(xué)分級(jí)基于Sydney分類法，由不知曉患者組差異的同一人完成。慢性炎癥分級(jí)為溫和，中度和嚴(yán)重，分別用(+)，(++)和(+++)表示。無(wú)任何炎癥用0表示。幽門螺桿菌的存在用(+)，(++)和(+++)分級(jí)表示，取決于其在竇粘膜表面上皮上的密度。作為正?；顧z，是指無(wú)炎癥且幽門螺桿菌陰性的那些。人足月胎盤從在婦產(chǎn)科，Heraklon UniversityHospital經(jīng)產(chǎn)的婦女獲得。在收集樣品前業(yè)已獲得知情同意和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
尾加壓素的RIA在冰冷的0.1N HCl中勻漿化來(lái)自每一患者的合并的胃鏡竇活檢樣品，于4℃下10,000g離心20分鐘。通過(guò)10體積0.1 N HCl酸化上清液，10,000g離心10min分鐘，得到的新上清液通過(guò)活化的Sep-Pak C18柱提取(Sep-Pak，Waters Associates，Milord，MA)，用20ml 0.1N HCl洗滌，用3ml 80％乙腈和20％ 0.01N HCl洗脫，真空干燥(Speed-Vac)。通過(guò)RIA Ucn試劑盒(PeninsulaLaboratories，Inc.，CA，USA)按照制造商指示檢驗(yàn)UCN。使用的兔抗血清(RIK 8034)顯示與人UCN的100％交叉反應(yīng)性，與人CRH，尾加壓素II和III，蛙皮降壓肽，硬骨魚緊張肽I和II無(wú)交叉反應(yīng)性。目前，檢驗(yàn)的靈敏度胃10pg，且IC50 109pg/管。結(jié)果表示為pgir-CRH/μg總細(xì)胞蛋白(通過(guò)Bradford方法對(duì)總細(xì)胞勻漿物的測(cè)定)。
免疫組化免疫染色在甲醛固定的石蠟包埋的組織切片上進(jìn)行。來(lái)自胃竇的石蠟切片被切割，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(APAAP)方法染色(DAKO，A/S，Glostrup，丹麥)。簡(jiǎn)言之，在與抗體孵育前在檸檬酸溶液中于微波爐加熱石蠟切片。二甲苯脫蠟、乙醇脫水的切片置于填充0.1M檸檬酸三鈉的染色缸中，700W加熱5分鐘。載玻片冷卻15分鐘，在Tris緩沖鹽液(TBS)中洗滌。通過(guò)與正常兔血清(1∶20，30min，RT)在濕室中孵育，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，與第一抗體孵育(1h，RT)，使用上述兔抗UCN多克隆血清(IHC 8034，Penin-sula Laboratories，Inc.，1∶1000稀釋)。用TBS洗滌后，切片與抗兔IgG和APAAP復(fù)合物(DAKO)孵育。使用Fast red TR(DAKO，A/S，Glostrup，Denmark)為發(fā)色團(tuán)，淡蘇木精負(fù)染，切片用溫甘油酯固定(DAKO)。通過(guò)與非免疫IgG而不是第一抗體或使用由1μM UCN肽滅活的抗血清(Sigma，St.Louis，MO，USA)室溫下孵育過(guò)夜，在每一次實(shí)驗(yàn)中包括陰性對(duì)照。在標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡中用Kodak EliteChrome膠卷100 ASA拍照。
結(jié)果A.體外研究UCN對(duì)巨噬細(xì)胞的作用在血清耗貧的LPS誘導(dǎo)的RAW-264.7巨噬細(xì)胞中UCN促進(jìn)的調(diào)亡由核小體形成和流式細(xì)胞儀分析確定。當(dāng)細(xì)胞在有血清條件下培養(yǎng)時(shí)，UCN促進(jìn)細(xì)胞增殖。在原代骨髓瘤巨噬細(xì)胞中也觀察到相同作用，其中UCN增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的調(diào)亡。
UCN促進(jìn)巨噬細(xì)胞調(diào)亡的分子機(jī)制用UCN處理RAW264.7細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的激酶JNK和p38MAPK的快速活化，Bax上調(diào)以及Fas配基表達(dá)的增強(qiáng)。
CRH增強(qiáng)由RAW264.7細(xì)胞LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生。
為確定CRH對(duì)巨噬細(xì)胞的作用，在存在或不存在CRH(1×10-8M的濃度)的條件下，在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，并用大腸桿菌衍生的LPS刺激。使用的濃度在CRH于腹膜組織中的生理范圍之內(nèi)，因?yàn)樵谔ケP中的濃度為10-6M，在腎上腺中可在10-6至10-9M之間變化。在存在LPS條件下處理細(xì)胞24小時(shí)刺激了TNF-α，IL-1β和IL-6的分泌。在存在CRH時(shí)，所有三種細(xì)胞因子的水平均明顯較高，表明CRH增強(qiáng)了LPS的信號(hào)。但是，當(dāng)細(xì)胞單獨(dú)用CRH處理時(shí)，僅對(duì)細(xì)胞因子分泌有最小的作用。具體的，CRH明顯增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌(p＝0.04)，IL-1β分泌(p＝0.01)和IL-6分泌(p＝0.04)。
為確定CRH是否對(duì)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄有作用，在存在或不存在CRH的情況下，從用LPS處理的細(xì)胞中分離RNA，利用半定量RT-PCR方法確定TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA的水平。PCR進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，其中擴(kuò)增在指數(shù)期，如每一產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線所確定。對(duì)于所有三種細(xì)胞因子，CRH在基礎(chǔ)mRNA水平具有小的增強(qiáng)作用，對(duì)LPS誘導(dǎo)的水平具有較強(qiáng)的增強(qiáng)作用。在對(duì)肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化后的RT-PCR產(chǎn)物的密度分析顯示，CRH單獨(dú)誘導(dǎo)最小的TNF-α，IL-1β或IL-6轉(zhuǎn)錄，但是其強(qiáng)烈增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生的增加低于在蛋白質(zhì)水平所示的增加，提示其可能是CRH在轉(zhuǎn)錄后水平的額外作用。或者，其可為半定量RT-PCR方法的較低靈敏度的結(jié)果。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次具有相似的結(jié)果。
CRH增強(qiáng)硫膠質(zhì)引發(fā)的腹膜巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生為確定是否CRH對(duì)原代巨噬細(xì)胞具有相同的作用，我們用CRH和CRH加LPS處理硫膠質(zhì)誘導(dǎo)的腹膜巨噬細(xì)胞。硫膠質(zhì)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞為引發(fā)的(primed)炎性巨噬細(xì)胞，并用于此方法，可用于研究巨噬細(xì)胞而不必用LPS加速。CRH不能誘導(dǎo)TNF-α，IL-1β或IL-6轉(zhuǎn)錄，但是明顯增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。分析密度數(shù)據(jù)顯示與在RAW264.7細(xì)胞中觀察的有類似的差異。因此，CRH在活化的RAW264.7細(xì)胞和活化的原代巨噬細(xì)胞中均有強(qiáng)烈作用，在缺乏強(qiáng)力共刺激物如LPS時(shí)，其不能引發(fā)細(xì)胞因子表達(dá)。
B.體內(nèi)研究CRH-R1拮抗劑安他拉明延長(zhǎng)經(jīng)歷LPS誘導(dǎo)的感染性休克的小鼠之存活。以每25克體重0.2、0.4、0.6、0.7和1mg的濃度腹膜內(nèi)施用LPS。每25克體重0.2mg的LPS處理的小鼠100％存活，而用每25克體重0.4mg處理的動(dòng)物80％存活，用每25克體重0.6mg處理的動(dòng)物60％存活，用每25克體重0.7mg或1mg處理的動(dòng)物沒(méi)有存活。在每25克體重0.5mg評(píng)估LD50，在每25克體重0.7mg或更高的濃度評(píng)估LD100。為了實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，我們希望使用高于LD50的劑量以確定CRH-R1阻斷的可能的保護(hù)性作用。因此，用用0.7mg/25g的LPS注射小鼠，這是一個(gè)LD100劑量，但是不會(huì)太高以至于掩蓋了CRH-R1阻斷可能的保護(hù)性作用。為確定CRH-R1信號(hào)在感染性休克過(guò)程中發(fā)生的事件之級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的作用，為確保根據(jù)此前報(bào)告的吸收于施用LPS之前1.5小時(shí)，施用或不施用CRH-R1拮抗劑安他拉明，使小鼠接受致死劑量的LPS。施用兩種不同類型的LPS以證實(shí)所得結(jié)果不是對(duì)特定類型LPS有特異性。用每25克體重0.7mg的劑量腹膜內(nèi)注射LPS在注射后12-31小時(shí)誘導(dǎo)致死現(xiàn)象。具體的，在單獨(dú)用腸炎沙門氏菌處理的小鼠中在14-31小時(shí)之間觀察到致死現(xiàn)象。
在第18小時(shí)，69％的動(dòng)物死亡，而用CRH-R1拮抗劑安他拉明預(yù)處理的小鼠只有20％死亡?？傊?，在用CRH-R1拮抗劑安他拉明預(yù)處理的小鼠中存活明顯延長(zhǎng)(p＝0.022)。類似的，注射大腸桿菌衍生的LPS并用CRH-R1拮抗劑安他拉明預(yù)處理的小鼠中有72％在18小時(shí)仍存活，而所有僅用大腸桿菌LPS處理的動(dòng)物均死亡。用LPS加CRH-R1拮抗劑安他拉明處理且在內(nèi)毒素休克中存活的小鼠在7天內(nèi)存活，且仍舊存活，表明用CRH-R1拮抗劑安他拉明處理不僅延長(zhǎng)存活，而且改善存活。所有單獨(dú)用CRH-R1拮抗劑安他拉明處理的動(dòng)物存活。在存在CRH-R1拮抗劑安他拉明的條件下，總存活明顯改善(p＝0.002)。對(duì)于每一LPS亞型使用每組10個(gè)動(dòng)物對(duì)每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
CRH-R1拮抗劑安他拉明抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子LPS施用導(dǎo)致血漿TNF-a的快速升高，在1小時(shí)達(dá)到峰值。與單獨(dú)用LPS處理的相比，TNF-a在用安他拉明預(yù)處理的小鼠中明顯降低(n＝5只動(dòng)物每組，p＝0.001)。類似的，血漿IL-1β和IL-6在LPS處理后3-4小時(shí)達(dá)到峰值，且在感染性休克的過(guò)程中保持升高的水平。IL-1β和IL-6在LPS施用后4小時(shí)均增加，但是在用安他拉明預(yù)處理的小鼠中明顯較低(n＝5只動(dòng)物每組，p＝0.013，對(duì)于IL-1β；n＝5只動(dòng)物每組，p＜0.0001，對(duì)于IL-6)。為確定在存在安他拉明時(shí)細(xì)胞因子水平差異是否是動(dòng)力學(xué)改變的結(jié)果，在LPS施用后2小時(shí)測(cè)量了TNF-a，發(fā)現(xiàn)在用安他拉明預(yù)處理的小鼠中保持的TNF-a的水平明顯低于單獨(dú)用LPS處理的小鼠(p＜0.001)。在LPS注射6小時(shí)后測(cè)量IL-1β和IL-6也觀察到類似的差異。因此，在第6小時(shí)，與用LPS加安他拉明處理的小鼠相比，LPS處理的動(dòng)物具有明顯較高的IL-1β(p＜0.01)和IL-6(p＜0.001)。因此我們得出結(jié)論，在LPS誘導(dǎo)的感染性休克中安他拉明延長(zhǎng)存活是通過(guò)降低促炎細(xì)胞因子水平，而不是改變其代謝。
在正常和炎癥人胃粘膜中存在UCN轉(zhuǎn)錄物利用RT-PCR在總RNA制品，在人胃粘膜竇活檢樣品上研究CRH樣肽的表達(dá)。利用靶向于人UCN基因設(shè)計(jì)的引物，在來(lái)自正常和炎性胃粘膜的活檢樣品之RNA制品中擴(kuò)增特異性RP-PCR產(chǎn)物。DNA條帶的大小與從用作陽(yáng)性對(duì)照的人胎盤RNA樣品中擴(kuò)增的相同。在平行進(jìn)行的印象對(duì)照樣品(無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶或無(wú)DNA模板)中未檢出PCR產(chǎn)物，排除了樣品中基因組或其他DNA污染的可能性。相反，當(dāng)利用來(lái)自人CRH基因的引物進(jìn)行RT-PCR時(shí)，在來(lái)自來(lái)自正常和炎性胃粘膜的RNA樣品中無(wú)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。如得到預(yù)定大小的DNA帶之胎盤樣品中。來(lái)自所說(shuō)樣品的RNA制品的質(zhì)量通過(guò)針對(duì)肌動(dòng)蛋白基因的RT-PCR擴(kuò)增確認(rèn)。這些結(jié)果顯示，在人胃的胃粘膜中存在UCN而不是CRH基因轉(zhuǎn)錄物。
正常和炎癥人胃粘膜中的UCN肽UCN存在于患有幽門螺桿菌感染的患者之小凸和粘液分泌腺(竇腺)中的上皮細(xì)胞中。陽(yáng)性染色也聚集于毛細(xì)血管和散見(jiàn)于胃粘液間質(zhì)，主要是血漿細(xì)胞聚集物的炎性元件中。將人足月胎盤染色作為陽(yáng)性對(duì)照。在胎盤切片中，在滋養(yǎng)層上皮細(xì)胞中觀察到特異性陽(yáng)性染色，與相鄰的間質(zhì)陰性絨毛相反，證實(shí)了所述方法的特異性。在該方法前用非免疫IgG替換初級(jí)抗體，或用過(guò)量UCN肽使抗體失活，導(dǎo)致組織型中一致性的陰性免疫染色。
UCN水平與胃粘膜中炎癥的關(guān)系人胃粘膜活檢樣品中ir-UCN的水平與局部炎癥活性的程度相關(guān)聯(lián)。將患者分組如下a)無(wú)活動(dòng)性胃炎的患者，即無(wú)急性或慢性炎癥或幽門螺桿菌感染的證據(jù)(n＝8)，b)具有慢性和急性胃粘膜炎癥和幽門螺桿菌感染之診斷為胃炎的患者(n＝15)，c)幽門螺桿菌根治療法兩個(gè)月后的應(yīng)答者，具有證實(shí)的炎癥逆轉(zhuǎn)和無(wú)幽門螺桿菌感染元件(n＝10)，以及d)保持炎癥元件(慢性或急性)和幽門螺桿菌感染的非應(yīng)答者(n＝5)。與非胃炎組相比(組a，2.0±1.3pg/μg總蛋白)，UCN在幽門螺桿菌胃炎患者中明顯升高(p＜0.001)(組b，10.4±1.8pg/μg總蛋白)。與所有其他組(a，b和d)相比，UCN水平在對(duì)幽門螺桿菌根治治療應(yīng)答者中進(jìn)一步增加(組c，43.1±9.8pg/μg總蛋白，P＜0.001)。應(yīng)當(dāng)注意在對(duì)治療無(wú)應(yīng)答的組中未觀察到所述增加(c，18.7±12.3pg/μg總蛋白)。獲自胃炎活檢樣品的RIA數(shù)據(jù)(n＝30)與所檢查的每一病理參數(shù)(急性和慢性炎癥，幽門螺桿菌的感染程度)的相關(guān)顯示，在UCN水平與通過(guò)急性和慢性炎癥以及幽門螺桿菌感染的胃炎病理分期之間呈明顯的負(fù)相關(guān)，證實(shí)在炎癥活性和幽門螺桿菌感染的逆轉(zhuǎn)過(guò)程中ir-UCN水平的增加。
總之，本發(fā)明提供了通過(guò)使用新的和此前出人意料的方法控制炎癥的藥物手段，包括對(duì)組織CRH系統(tǒng)的藥物操作，其控制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化、增殖、分化、凋亡和細(xì)胞因子產(chǎn)生。我們也發(fā)現(xiàn)CRH增加炎癥反應(yīng)，而UCN減弱之。CRH和UCN的這些作用是對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞直接作用的結(jié)果。在我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，即在Balb/c小鼠中使用LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克模型(一種用于系統(tǒng)性炎癥的成熟模型)，在LPS前施用合成CRH-R1拮抗劑以統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的方式延長(zhǎng)了存活。該作用在內(nèi)毒素休克的早期更明顯。CRH-R1阻斷也抑制了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞衍生的TNF-α，IL-1β和IL-6的增加，證實(shí)了CRH介導(dǎo)的信號(hào)在細(xì)胞因子表達(dá)中的作用。在我們的體外實(shí)驗(yàn)中，即我們使用兩種類型的巨噬細(xì)胞RAW 264.7單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞系(其衍生自鼠骨髓瘤，應(yīng)答LPS產(chǎn)生全部促炎細(xì)胞因子)和來(lái)自Balb/c小鼠的硫膠質(zhì)引發(fā)的腹膜巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CRH增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的TNF-α，IL-1β和IL-6產(chǎn)生。因此，CRH信號(hào)在通過(guò)巨噬細(xì)胞增加LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生中起到早期和關(guān)鍵的作用。我們還發(fā)現(xiàn)UCN通過(guò)巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)緩解炎癥反應(yīng)。UCN的這一作用在體外LPS-誘導(dǎo)的RAW-264.7巨噬細(xì)胞和在原代骨髓巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物中更明顯。用UCN處理RAW264.7細(xì)胞導(dǎo)致應(yīng)激誘導(dǎo)的激酶JNK和p38MAPK的快速活化，Bax上調(diào)以及Fas配基表達(dá)的增強(qiáng)和凋亡。此外，在體外和體內(nèi)的動(dòng)物獲得的發(fā)現(xiàn)在人類中也得以證實(shí)。實(shí)際上，相比于UCN水平在非應(yīng)答患者中保持低水平，在獲自幽門螺桿菌胃炎患者的胃粘膜活檢中，幽門螺桿菌根治治療導(dǎo)致UCN急劇增加，這進(jìn)一步證實(shí)了UCN在針對(duì)包括幽門螺桿菌感染的有害刺激的胃粘膜中的細(xì)胞保護(hù)作用。因此，我們的聯(lián)合數(shù)據(jù)提示CRH-UCN系統(tǒng)通過(guò)他們對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞增殖、分化、凋亡和在炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生中的作用，在炎癥反應(yīng)調(diào)控中起重要作用。
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權(quán)利要求
1.一種或多種合成CRH-R1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑用于治療炎性疾病或病癥的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中一種或多種合成CRH-R1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑修飾單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化、增殖、分化、凋亡或細(xì)胞因子產(chǎn)生的反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中一種或多種合成CRH-R1拮抗劑和/或CRH-R2激動(dòng)劑包括安他拉明。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的用途，其中炎性疾病或病癥為慢性炎癥性腸病、特發(fā)性炎性疾病、結(jié)締組織炎性疾病、炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病、炎性肌病、包括滑囊炎的關(guān)節(jié)炎性疾病、纖維肌痛綜合征和上胃腸道炎性疾病。
5.藥物組合物，包含一種或多種合成CRH-R1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑。
6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中組合物經(jīng)配制用于局部或系統(tǒng)性施用。
7.權(quán)利要求5或6的藥物組合物，其中組合物還含有常用輔劑，如稀釋劑、填充劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、香料和色料。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中制劑經(jīng)配制用于口服、非胃腸道或真皮內(nèi)施用。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，其中組合物經(jīng)配制為注射液。
10.權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中一種或多種合成CRH-R1拮抗劑和/或CRH-R2激動(dòng)劑包括安他拉明。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中一種或多種合成CRH-R1拮抗劑和/或CRH-R2激動(dòng)劑是安他拉明。
12.一種或多種合成CRH-R1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑用于制備治療炎性疾病或病癥的藥物組合物的用途。
13.權(quán)利要求12的用途，其中炎性疾病或病癥為慢性炎癥性腸病、特發(fā)性炎性疾病、結(jié)締組織炎性疾病、炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病、炎性肌病、包括滑囊炎的關(guān)節(jié)炎性疾病、纖維肌痛綜合征和上胃腸道炎性疾病。
14.用于治療炎性疾病或病癥的試劑盒，其包含包括在一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的藥物組合物中的一種或多種CRH-R1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑。
15.權(quán)利要求14的試劑盒，其中一種或多種CRH-R1拮抗劑和/或CHR-R2激動(dòng)劑包括安他拉明。
全文摘要
本發(fā)明涉及促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)受體－1(RI)拮抗劑和/或CRH－R2受體激動(dòng)劑用于治療炎癥性疾病的用途，其是通過(guò)調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化、增殖、分化、凋亡和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。對(duì)于CRH系統(tǒng)，我們限定天然和合成CRH以及尾加壓素(UCN)激動(dòng)劑和拮抗劑用于CRH－R1和CRH－R2受體及其亞型，以及CRH結(jié)合蛋白(BP)，一種CRH假受體。本發(fā)明涉及用于緩解或治療炎性疾病的藥物干預(yù)，其利用CR系統(tǒng)介導(dǎo)的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞控制，其在通過(guò)促炎細(xì)胞因子，如白介素－1，白介素－6和腫瘤壞死因子(TNF)α的產(chǎn)生而起始并維持炎性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。術(shù)語(yǔ)炎癥我們定義為生物對(duì)引起組織損傷的有害的內(nèi)源性或外源性刺激的反應(yīng)。炎癥是一種宿主的防御機(jī)制，其可損害該防御生物。本發(fā)明還提供了用于體外和體內(nèi)評(píng)估控制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的天然和合成CRH系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑的方法。
文檔編號(hào)A61K31/506GK1756566SQ200380104227
公開(kāi)日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月26日
發(fā)明者A·N·瑪吉?dú)W里斯, A·格拉瓦尼斯 申請(qǐng)人:生態(tài)自然E.A.有限公司