專利名稱：針對人免疫缺陷病毒的遺傳疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于刺激人或者其它宿主的免疫應(yīng)答的疫苗，特別是涉及在宿主中表達人免疫缺陷病毒(HIV)的異源抗原并激發(fā)針對HIV感染的免疫應(yīng)答的重組病毒。
背景技術(shù)：
用于開發(fā)疫苗的現(xiàn)有技術(shù)在很大程度上基于這樣的理念使用變性的病毒或者使用由細菌制得的純化的病毒蛋白。這些類型的疫苗只對有限數(shù)目的感染劑有效，而且其保護率也是有限的。
對于包括埃博拉病毒和HIV病毒在內(nèi)的、含有膜(包膜)糖蛋白(GPs)的病毒，使用變性的病毒或者純化的病毒蛋白通常達不到滿意的效果。這可能是由于以下幾個原因。首先，這些病毒的GPs對變性過程敏感，因而蛋白的表位會被變性過程改變。其次，GPs的糖部分是中和抗體的重要的抗原決定簇。比較而言，由細菌制得的蛋白不能被適當(dāng)?shù)奶腔铱烧郫B成具有不同于那些天然病毒蛋白的抗原性的稍微不同的結(jié)構(gòu)。而且，許多基于消弱或者變性病毒的疫苗只能提供對少量免疫抗原的弱免疫應(yīng)答。此外，這些疫苗制劑常常只能提供有限的保護，而不是我們所期望的終生免疫。
其它疫苗途徑通過將質(zhì)粒直接注射到體內(nèi)來表達抗原，即所謂的裸DNA或者DNA疫苗技術(shù)。這些方法包括在體內(nèi)通過用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞而將攜帶抗原編碼基因的DNA質(zhì)粒特意導(dǎo)入。這些質(zhì)粒表達能夠引起免疫應(yīng)答的抗原。由DNA疫苗所激發(fā)的免疫應(yīng)答可能效率很低，其原因可能是由于攝取質(zhì)粒的水平低或者抗原在細胞的表達水平低所致。DNA疫苗還存在因載體降解所致的抗原表達時期極短的特征。另外，大量生產(chǎn)DNA疫苗不但困難而且昂貴。
人們已經(jīng)對可復(fù)制型活疫苗進行了修飾，用以表達乙型肝炎病毒(HBV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，流感和瘧疾抗原的基因?？墒窃谝恍┣闆r下，對重組疫苗的免疫應(yīng)答常常在性質(zhì)和量度上受限。因此，例如，盡管使用牛痘流感重組體進行的外周免疫能夠提供針對下呼吸道感染的良好保護作用，但是卻無法在上呼吸道中誘導(dǎo)免疫。另一方面，當(dāng)需要局部免疫而不是全身免疫的時候，例如在胃腸道中，用重組疫苗進行的外周免疫被證明是低效的。
用表達埃博拉病毒GP的重組體痘苗病毒所進行的免疫已經(jīng)被用來嘗試在豚鼠中進行局部保護。Gilligan，K.J.，等.，Vaccines，9787-92(1997)。用表達GP或者核殼蛋白(NP)的DNA構(gòu)建體接種保護受到埃博拉病毒致命威脅的小鼠。Vanderzanden，L.，等.，Virology，246(1)134-44(1998)。然而，這些方法每種均有其局限性，從而使得它們不能成為用于人類的埃博拉病毒疫苗的理想選擇。例如，痘苗病毒會很快殺死被載體感染的細胞。因此，疫苗抗原只能表達很短的時間。然而，該方法的主要局限性在于痘苗病毒的復(fù)制引起免疫系統(tǒng)主要反應(yīng)于牛痘蛋白，而只有少部分免疫應(yīng)答指向致病病毒的抗原。這種現(xiàn)象已被定義為“抗原稀釋”。
先前試圖彌補這些缺陷的方法，包括通過具有較強啟動子如痘病毒來表達疫苗抗原，尚未獲得顯著的成功。
迄今為止，還沒有疫苗能夠給予針對HIV感染的有效保護。因此，研制疫苗的嘗試因此到現(xiàn)在為止還很不成功。某些與HIV反應(yīng)的抗體，特別是抗GP160/120抗體，在HIV感染的無癥狀期和癥狀期都呈現(xiàn)出高水平，這暗示與其說這些抗體起到了保護作用，還不如說它們實際上促進了病毒黏附并進入宿主細胞。更重要的是，目前的疫苗尚不能誘導(dǎo)針對感染細胞-新釋放的病毒粒子的來源的有效的細胞反應(yīng)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了遺傳病毒疫苗。設(shè)計這些疫苗以模擬致病病毒的天然感染，而不會在將被免疫的宿主如人、家畜及其它哺乳動物體內(nèi)引起與這些致病病毒天然相關(guān)的疾病。
這些疫苗是復(fù)制缺陷或者不能復(fù)制的重組體良性病毒?？梢詫@些良性病毒進行設(shè)計以使其表達來自廣譜病原體如病毒、細菌和寄生蟲的抗原。這樣就可以用它們來治療天然表達這些抗原的廣譜病毒、細菌和寄生蟲。被感染了這些良性病毒后，宿主細胞會表達這些致病病毒的抗原并且將這些抗原以其天然構(gòu)象和途徑提呈，就好像細胞被致病病毒感染了一樣，而且還會在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)出強烈且持久的免疫應(yīng)答。
在一個實施方案中，提供了一種用于在病毒感染的宿主中激發(fā)免疫應(yīng)答的重組體良性病毒。該重組體病毒包括異源于所述良性病毒的、編碼來自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，該病毒抗原在宿主中的表達激發(fā)針對所述致病病毒和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答；和，編碼免疫刺激因子的、異源于所述良性病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達提高所述病毒抗原的免疫原性。該重組體病毒是不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與致病病毒相關(guān)的疾病。
在該實施方案的一個變體中，所述的重組體良性病毒可以是不能復(fù)制的病毒如腺病毒、腺相關(guān)病毒，SV40病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，單純皰疹病毒或者痘苗病毒。優(yōu)選地，所述的良性病毒不具有良性病毒天然祖先的致病區(qū)域但是卻保留了其傳染性。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的良性病毒是不能復(fù)制的腺病毒，更優(yōu)選為5型腺病毒。所述的異源抗原序列可以被放置在所述腺病毒的E1，E3或者E4區(qū)域中。所述的免疫刺激因子序列可以被放置在所述腺病毒的E4，E3或者E1區(qū)域中。
在所述優(yōu)選實施方案的一個變體中，所述的異源抗原序列和免疫刺激因子序列被放置在腺病毒的E1，E3或者E4區(qū)域中，在此區(qū)域中，所述的異源抗原序列和免疫刺激因子序列通過內(nèi)部核糖體進入位點或者通過剪接供體-受體機制從啟動子處被雙順反子地表達。
所述病毒抗原或者免疫刺激因子的表達可以由與所述重組體病毒的天然祖先同源的啟動子調(diào)控。或者，所述病毒抗原的表達可以由與所述重組體病毒的天然祖先異源的啟動子調(diào)控。例如，與所述重組體病毒的天然祖先異源的啟動子可以是真核啟動子如胰島素啟動子，人巨細胞病毒(CMV)啟動子及其早期啟動子，猿猴病毒SV40啟動子，勞斯肉瘤病毒LTR啟動子/增強子，雞胞質(zhì)β-肌動蛋白啟動子，和可誘導(dǎo)的啟動子如可四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子。
所述的致病病毒可以是任何在人或其它動物中引起致病效果或者疾病的致病病毒。因此，所述的重組體良性病毒可以被用作使宿主免于致病病毒感染的疫苗。
在一個變體中，所述的致病病毒可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的各種菌株，如HIV-1和HIV-2。病毒抗原可以是HIV糖蛋白(或者表面抗原)如HIV GP120和GP41，或者衣殼蛋白(或者結(jié)構(gòu)蛋白)如HIV P24蛋白。
在另一個變體中，所述的致病病毒可以是埃博拉病毒。病毒抗原可以是埃博拉病毒的糖蛋白或表面抗原如埃博拉病毒的GP1或者GP2蛋白。
在另一個變體中，所述的致病病毒可以是肝炎病毒如A，B，C，D或者E型肝炎病毒。例如，所述的病毒抗原可以是B型肝炎病毒的表面抗原或者核心蛋白例如小乙肝病毒表面抗原(SHBsAg)(也稱澳大利亞抗原)，中乙肝病毒表面抗原(MHBsAg)和大乙肝病毒表面抗原(LHBsAg)。所述的病毒抗原可以是C型肝炎病毒的表面抗原或者核心蛋白例如NS3，NS4和NS5抗原。
在另一個變體中，所述的致病病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。例如，RSV病毒抗原可以是RSV的糖蛋白(G-蛋白)或融合蛋白(F-蛋白)，其序列可以從基因庫中得到。
在另一個變體中，所述的致病病毒可以是單純皰疹病毒(HSV)如HSV-1和HSV-2。例如，所述的HSV病毒抗原可以是來自HSV-2的糖蛋白D。
在另一個變體中，所述的病毒抗原可以是腫瘤抗原如乳腺癌細胞的Her2和淋巴瘤細胞上的CD20，病毒癌基因如人乳頭瘤病毒的E6和E7，或者細胞癌基因如突變的ras。
應(yīng)該注意到，其它的病毒相關(guān)蛋白或者抗原對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很容易獲得的。對致病病毒和與所述致病病毒相關(guān)的病毒抗原的選擇不是本發(fā)明的限制因素。
所述的重組體病毒還表達免疫刺激因子，以模擬當(dāng)病毒感染宿主細胞時的細胞因子釋放反應(yīng)，并進一步擴大對來自所述重組體病毒共表達的病毒抗原的免疫應(yīng)答。所述的免疫刺激因子可以優(yōu)選為細胞因子。細胞因子的實例包括但不限于白細胞介素-2，白細胞介素-8，白細胞介素-12，β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
所述的病毒抗原可以是全長的抗原病毒蛋白，或者是含有主要抗原、中和抗原或者致病病毒表位的抗原病毒蛋白的一部分?；蛘?，所述的病毒抗原含有至少兩個所述致病病毒毒株的糖蛋白的恒定區(qū)。
在一個變體中，所述的病毒抗原可以是突變自所述致病病毒糖蛋白的、被修飾的抗原，所述突變使得所述的病毒抗原成了無功能的病毒組分但卻保留了其抗原性。所述對病毒抗原的修飾作用包括缺失糖蛋白的蛋白水解切割位點，以及對所述糖蛋白免疫抑制肽區(qū)域的復(fù)制和重排。
在另一個實施方案中，提供了一種用來在被病毒感染的宿主體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答的重組體腺病毒。所述的重組體病毒包括異源于腺病毒并編碼來自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體腺病毒感染的時候，該病毒抗原的表達激發(fā)針對所述病毒抗原的免疫應(yīng)答。
在該實施方案的一個優(yōu)選的變體中，所述的重組體病毒是不能復(fù)制的腺病毒。特別地，所述的致病病毒是HIV，包括HIV的各種類型(例如HIV-1和HIV-2)、毒株(例如HIV-1的毒株BH10和pNL4-3)、分離物(isolate)、一組分離物內(nèi)的進化枝(例如M組HIV-1分離物的A，B，C，D，E，F(xiàn)，和G進化枝)。所述的病毒抗原可以是1)HIV糖蛋白(或者表面抗原)如HIV包膜蛋白Env，其或是全長的野生型(gp160)、被截短型(如gp120或者gp41)，或是被插入、缺失或取代的修飾型；2) HIV結(jié)構(gòu)蛋白Gag，其或是全長的野生型、被修飾型，或是各種類型的蛋白酶加工的產(chǎn)物或片段(例如天然的、分泌的或者膜結(jié)合形式的HIV衣殼蛋白如HIVp24和p17)；和3)HIV調(diào)控蛋白如Tat，Vif，Nef，和Rev。
根據(jù)此變體，所述的HIV抗原是由選自由SEQ ID NOs14，16，20，21，22，23和24組成的組的多核苷酸所編碼的HIV包膜蛋白。該多核苷酸還可以編碼HIV調(diào)控蛋白Tat，Vif，Nef和Rev。
同樣根據(jù)此變體，所述的HIV抗原是被修飾了的HIV包膜蛋白，該包膜蛋白包括多進化枝的可變環(huán)。優(yōu)選地，所述多進化枝的可變環(huán)是來自各種進化枝如M組HIV-1分離物的進化枝A，B，C，D，E，F(xiàn)，和G的V3環(huán)。所述被修飾的、包括多進化枝可變環(huán)的HIV包膜蛋白可以含有來自不同HIV進化枝的兩個或者多個V3環(huán)，優(yōu)選由選自由SEQ ID NOs25，26，27，28，29，30，和31組成的組的多核苷酸所編碼的V3環(huán)。更優(yōu)選地，所述的被修飾的、包含多進化枝可變環(huán)的HIV包膜蛋白由選自由SEQ ID NOs32，52和54組成的組的多核苷酸所編碼。
同樣根據(jù)此變體，所述的HIV抗原是HIV結(jié)構(gòu)蛋白。該HIV結(jié)構(gòu)蛋白可以是由SEQ ID NO17編碼的全長野生型Gag，或者是Gag的蛋白水解片段如p17/24，p17和p24。片段p17/24可以是天然形式且由SEQ ID NO34編碼，分泌形式且由SEQ ID NO34編碼，或者是膜結(jié)合形式且由SEQID NO36編碼。片段p17可以是天然形式且由SEQ ID NO40編碼，分泌形式且由SEQ ID NO41編碼，或者是膜結(jié)合形式且由SEQ ID NO42編碼。同樣，p24可以是天然形式且由SEQ ID NO46編碼，分泌形式且由SEQ ID NO47編碼，或者是膜結(jié)合形式且由SEQ ID NO48編碼。
所述的重組體病毒還可以包含編碼HIV蛋白酶PI的多核苷酸如SEQ ID NO56，此序列的表達能促進對表達自相同重組體病毒或另一載體的Gag的蛋白水解加工。PI可以與Gag作為融合蛋白一起表達，或者從不同的啟動子分開地表達，或者從Gag相同的啟動子經(jīng)由IRES或者剪接供體/受體機制表達。
所述的重組體病毒還可以包含這樣的多核苷酸，其編碼HIV蛋白酶PI及HIV逆轉(zhuǎn)錄酶RT的融合蛋白-PI-RT。PI可以與Gag作為融合蛋白一起表達，或者從不同的啟動子分開地表達，或者從Gag相同的啟動子經(jīng)由IRES或者剪接供體/受體機制表達。
所述的重組體病毒還可以包括多核苷酸，其是HIV pol基因，且編碼HIV酶蛋白HIV蛋白酶PI，逆轉(zhuǎn)錄酶RT和整合酶IN。Pol可以與Gag作為融合蛋白一起表達，或者從不同的啟動子分開地表達，或者從Gag相同的啟動子經(jīng)由IRES或者剪接供體/受體機制表達。
任選地，所述的重組體病毒還可以包含異源于該重組體病毒的免疫刺激因子序列，該序列編碼的免疫刺激因子在宿主中的表達能夠增強病毒抗原的免疫原性。
本發(fā)明還提供了將多種抗原提呈給宿主的病毒疫苗，以進一步模擬天然致病病毒的天然感染并且在宿主中誘導(dǎo)針對各種毒株或類型致病病毒的強烈且持久的免疫應(yīng)答。
在一個實施方案中，提供了這樣一種重組體病毒，其被用作病毒疫苗以在被該病毒感染的宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。該重組體病毒包含異源于該重組體病毒的多個抗原序列，每個序列編碼來自相同致病病毒、不同毒株致病病毒、或者不同種類致病病毒的病毒抗原，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，所述多個抗原序列的表達能夠在宿主中激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒可以優(yōu)選為不能復(fù)制的，而且其不能在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
根據(jù)此實施方案，重組體病毒可以是任何病毒，優(yōu)選為不能復(fù)制的腺病毒、腺相關(guān)病毒、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒或者痘苗病毒。所述的良性病毒也可以優(yōu)選將良性病毒天然祖先的致病區(qū)缺失但卻保留了其傳染性。
同樣根據(jù)此實施方案，所述的多個抗原序列可以是相同抗原序列的多個拷貝或者是相互不同的多個抗原序列。
在所述實施方案的一個變體中，所述的多個抗原序列中至少有兩個是經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點或者經(jīng)由剪接供體受體機制從啟動子雙順反子地表達的。
任選地，所述的多個抗原序列中至少有兩個從一個啟動子表達而產(chǎn)生融合蛋白。
同樣根據(jù)此實施方案，所述的病毒基因組還包含至少一個異源于所述重組體病毒天然祖先的啟動子，其控制所述多個抗原序列中至少兩個序列的表達。異源于重組體病毒天然祖先的啟動子的實例包括但不限于，胰島素啟動子，CMV啟動子及其早期啟動子，SV40啟動子，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子/增強子，雞胞質(zhì)β-肌動蛋白啟動子，和可誘導(dǎo)的啟動子如可四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子。
同樣根據(jù)此實施方案，所述的多個抗原序列可以是來自至少兩個致病病毒毒株的抗原組合。
任選地，所述的多個抗原序列可以是來自至少兩個不同致病病毒的抗原組合。例如，所述的多個抗原序列可以是來自HIV-1，HIV-2，單純皰疹病毒1型，單純皰疹病毒2型，埃博拉病毒，馬爾堡病毒，蟲媒病毒(一組由蚊子攜帶的病毒，可引起腦炎、黃熱病和登革熱)以及肝炎A，B，C，D，和E病毒。
在所述實施方案的一個變體中，所述的重組體病毒還可以含有一個或者多個免疫刺激因子序列，這些序列異源于良性病毒且編碼免疫刺激因子，該刺激因子在宿主中的表達提高所述病毒抗原的免疫原性。例如，所述的免疫刺激因子可以是細胞因子。細胞因子的實例包括但不限于白細胞介素-2，白細胞介素-4，白細胞介素-12、β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，G-CSF，和GM-CSF。
根據(jù)此變體，所述的一個或者多個免疫刺激因子序列可以是相同免疫刺激因子序列的多個拷貝，或者是相互不同的多個免疫刺激因子序列。
任選地，免疫刺激因子序列中至少有兩個可以是經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點或者經(jīng)由剪接供體受體機制從一個啟動子多順反子地表達的。或者，免疫刺激因子序列中至少有兩個可以從一個啟動子表達而產(chǎn)生融合蛋白。
本發(fā)明還提供了激發(fā)針對致病細菌的強烈且持久的免疫應(yīng)答的遺傳疫苗。在一個實施方案中，提供了一種被用作遺傳細菌疫苗的重組體病毒以在被此重組體病毒感染的宿主中激發(fā)免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒包括異源于該重組體病毒的多個抗原序列，每個序列編碼來自相同致病細菌的細菌抗原，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，所述多個細菌抗原序列的表達在宿主中激發(fā)針對所述細菌抗原和表達所述細菌抗原的細胞的免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒可優(yōu)選為不能復(fù)制的，而且其不能在宿主中引起與致病細菌天然相關(guān)的惡性腫瘤。
所述的致病細菌可以是任何在宿主中引起致病效果或者疾病的致病細菌，例bacillus tuberculoses，炭疽桿菌(bacillus anthracis)(引起植物性炭疽)，和在動物中引起萊姆病的螺旋體布氏疏螺旋菌(spirochete Borreliaburgdorferi)。所述的多個抗原序列可以編碼致病細菌的致死因子，保護性抗原，水腫因子，或其組合。
本發(fā)明還提供了激發(fā)針對致病性寄生蟲的強烈且持久的免疫應(yīng)答的針對寄生蟲的疫苗。在一個實施方案中，提供了一種被用作寄生蟲疫苗的重組體病毒以在被此重組體病毒感染的宿主的激發(fā)針對免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒包括異源于該良性病毒的多個抗原序列，每個序列編碼來自致病性寄生蟲的寄生蟲抗原，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，所述多個寄生蟲抗原序列的表達在宿主中激發(fā)針對所述寄生蟲抗原和表達所述寄生蟲抗原的細胞的免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒可優(yōu)選為不能復(fù)制的，而且其不能在宿主中引起與致病性寄生蟲天然相關(guān)的惡性腫瘤。
所述的致病性寄生蟲可以是任何在宿主中引起致病效果或者疾病的致病性寄生蟲，如瘧疾和原生動物例如隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、艾美球蟲屬(Eimeria)、組織滴蟲屬(Histomonas)、白細胞蟲屬(Leucocyozoon)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、弓形蟲屬(Toxoplasma)、毛滴蟲屬(Trichomonas)、利什曼蟲屬(Leishmania)、錐蟲屬(Trypanosoma)、賈第鞭毛蟲屬(Giardia)、巴貝蟲屬(Babesia)和泰累爾梨漿蟲屬(Theileria)。所述的多個抗原序列可以編碼致病性寄生蟲的外殼蛋白、附著蛋白、或其組合。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明病毒疫苗的藥物組合物。該藥物組合物可以包含任何上文描述的重組體病毒及藥用載體或稀釋劑。
所述的藥物組合物還可以包含用來增強針對表達自所述重組體病毒的病毒抗原的免疫應(yīng)答的佐劑。佐劑的實例包括但不限于結(jié)核菌苗(bacillus Calmette-Guerin)、內(nèi)毒素脂多糖、鑰孔血藍蛋白、白細胞介素-2、GM-CSF以及環(huán)磷酰胺。
本發(fā)明還涉及試劑盒，這些試劑盒可以含有本發(fā)明的任何一種或者多種疫苗并結(jié)合以把所述疫苗遞送至宿主的組合物，和/或?qū)⑺鲆呙邕f送至宿主的裝置如注射器。
本發(fā)明還提供了用上述的重組體病毒來增強宿主免疫力的方法。
在一個實施方案中，所述的方法包括將重組體病毒以有效劑量給予宿主以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒包含異源于所述重組體病毒的、編碼來自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，該病毒抗原在宿主中的表達激發(fā)針對所述致病病毒和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答；和，編碼免疫刺激因子的、異源于所述良性病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達提高所述病毒抗原的免疫原性。該重組體病毒可優(yōu)選為不能復(fù)制的病毒而且不會在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
可以經(jīng)由任何藥用給藥途徑將所述的重組體病毒給予宿主?？梢越?jīng)由肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、粘膜內(nèi)、直腸、口和胃腸外(parental)給藥。
在另一個實施方案中，提供了一種用多個抗原增強宿主對致病性病毒的免疫力的方法。所述的方法包括將重組體病毒以有效劑量給予宿主以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒包含異源于該良性病毒的多個抗原序列，每個序列編碼來自致病病毒的病毒抗原，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，所述多個抗原序列的表達在宿主中激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答。該重組體病毒可以優(yōu)選為不能復(fù)制的，而且不會在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
任選地，所述的重組體病毒還可以含有一個或者多個異源于所述重組體病毒的免疫刺激因子序列，該序列所編碼的免疫刺激因子在宿主內(nèi)的表達提高所述病毒抗原的免疫原性。
在另一個實施方案中，提供了一種通過使用復(fù)合重組體病毒疫苗(或者病毒)來增強宿主對致病病毒的免疫力的方法。該復(fù)合重組體病毒可以在每個重組體病毒中攜帶不同的抗原?？梢酝瑫r或者分步地將所述的復(fù)合重組體病毒給予宿主。
所述的方法包括將有效劑量的第一和第二重組體病毒給予宿主以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。第一重組體病毒包括異源于第一重組體病毒的、編碼來自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，該病毒抗原在宿主中的表達激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答。第二重組體病毒包含編碼免疫刺激因子的、異源于所述重組體病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達能提高所述病毒抗原的免疫原性。所述的第一和第二重組體病毒優(yōu)選是不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
根據(jù)此實施方案，第一和第二重組體病毒可以是任何良性病毒，例如不能復(fù)制的腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、Alpha病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒和痘苗病毒。
任選地，第一和第二重組體病毒均可以是不能復(fù)制的腺病毒。同樣任選地，第一和第二重組體病毒中的一個可以是重組體腺病毒，另一個可以是重組體AAV、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、Alpha病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒和痘苗病毒。
在另一個實施方案中，提供了一種用來增強宿主對病原體免疫力的方法。該方法包括給予宿主重組體病毒和一個或多個免疫刺激因子。所述的重組體病毒可以是任何上述的重組體病毒。特別地，所述的重組體病毒含有一個或者多個異源于所述重組體病毒的、編碼來自該病原體的一個或多個抗原的抗原序列。當(dāng)宿主被所述重組體病毒感染的時候，所述抗原在宿主中的表達激發(fā)針對所述抗原和表達所述抗原的細胞的免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒優(yōu)選為不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與所述病原體天然相關(guān)的惡性腫瘤。所述的病原體可以是致病病毒如HIV、肝炎病毒和埃博拉病毒，致病細菌或寄生蟲。
根據(jù)此實施方案，所述的免疫刺激因子可以是任何這樣的分子，其能夠增強被所述重組體病毒感染的細胞所表達的抗原的免疫原性。優(yōu)選地，所述的免疫刺激因子是細胞因子，其包括但不限于白細胞介素-2，白細胞介素-8，白細胞介素-12，β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，粒細胞集落刺激因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子及其組合。所述細胞因子可以以純化蛋白的方式單獨給予宿主，也可以將其與一種或者多種藥用賦形劑一起配制。或者，可以將所述細胞因子以表達載體的方式給予宿主，該表達載體在轉(zhuǎn)染或者導(dǎo)入宿主細胞時能夠表達所述細胞因子的編碼序列。
根據(jù)所述方法的任何上述實施方案，所述方法還可以包括再次給予宿主所述的重組體病毒以加強免疫應(yīng)答。優(yōu)選在首次接種后幾周到幾個月的時間內(nèi)，使用重組體病毒進行這種加強接種。為了保證對感染持續(xù)高水平的保護作用或者保證對病原體感染引發(fā)疾病的有效治療作用，定期如每幾年進行一次再次給予宿主加強免疫可能是有益的。在加強免疫中所給予的重組體病毒可以與在初次免疫中所給予的重組體病毒相同或者不同。
同樣根據(jù)所述方法的任何上述實施方案，所述方法還可以包括給予宿主編碼這樣的抗原的質(zhì)粒載體，所述的抗原與所述重組體病毒所編碼的抗原相同或者不同。該質(zhì)粒載體優(yōu)選為能夠在轉(zhuǎn)染宿主細胞時表達抗原的真核質(zhì)粒表達載體。
同樣根據(jù)所述方法的任何上述實施方案，所述方法還可以包括給予所述宿主第二重組體病毒以加強免疫應(yīng)答和/或使宿主免疫系統(tǒng)對重組體病毒的中和作用減到最低。
任選地，所述的第二重組體病毒包含來自第二病原體的第二抗原序列，其不同于在初次免疫中給予的第一重組體病毒所包含的第一抗原序列。優(yōu)選地，所述的第二抗原序列編碼的抗原與由第一抗原序列編碼的抗原類型相同，但來自相同病原體的不同菌株、血清型、或者亞型/進化枝。或者，與第一抗原相比，所述的第二抗原可以是不同類型的抗原，例如，第一抗原是表面蛋白，而第二抗原是相同或者不同病原體的核心蛋白。
同樣根據(jù)所述方法的任何上述實施方案，所述方法還可以包括在給予宿主任何上述實施方案中的重組體病毒的之前、同時或之后，將病毒載體給予所述宿主，以將宿主的免疫系統(tǒng)對所述重組體病毒的中和作用降到最低。優(yōu)選地，病毒載體的給予后于重組體病毒的給予。
所述的病毒載體可以是所述重組體病毒的天然后代。例如，病毒載體可以是5型野生型腺病毒(Ad5)，而重組體病毒是遺傳修飾的Ad5。
任選地，病毒載體可以是重組體病毒不同血清型的野生型病毒或者是遺傳修飾的病毒。例如，重組體病毒可以是遺傳修飾的Ad5，而病毒載體是血清型不同于Ad5例如血清型1-4或者6-51的野生型或遺傳修飾的腺病毒載體。應(yīng)該注意，其它以后發(fā)現(xiàn)和/或分類的血清型也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
同樣任選地，病毒載體可以是與所述重組體病毒不同的病毒。例如，所述的重組體病毒可以是遺傳修飾的Ad5，而病毒載體可以是遺傳修飾的AAV、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、Alpha病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒或痘苗病毒。該病毒載體可以含有或可以不含有異源抗原序列。優(yōu)選地，該病毒載體可以含有與所述重組體病毒攜帶的抗原序列相同或者不同的另一段抗原序列。
同樣任選地，病毒載體可以是基于重組體病毒的天然祖先進行了修飾的嵌合載體。例如，如果重組體病毒的天然祖先是5型腺病毒，那么病毒載體可以是嵌合的5型腺病毒，其骨架的某些區(qū)域從5型變成了其它腺病毒血清型的相應(yīng)區(qū)域。例如，可以用來自腺病毒血清型1-4和6-51骨架的相應(yīng)區(qū)域來替代5型腺病毒骨架中的纖維結(jié)(fiber knot)、干(shaft)和/或五鄰體基底(penton base)。
同樣任選地，病毒載體還可以含有一個或者多個與重組體病毒中的那些相同或者不同的異源抗原序列和/或免疫刺激因子序列。
上述的方法可以被用于疾病的防治或者治療。在治療方法中，給藥本發(fā)明的重組體病毒可以用于“預(yù)防性”或者“治療性”目的。當(dāng)用于預(yù)防的時候，可將所述的重組體病毒在任何癥狀呈現(xiàn)之前提供給患者。預(yù)防性給予所述的重組體病毒可用來預(yù)防或者改善任何后來的感染或疾病。當(dāng)用于治療的時候，可以在感染或者疾病癥狀呈現(xiàn)之時(或者之后)提供該重組體病毒。因此，可以在下列情況下提供本發(fā)明預(yù)計到將被暴露于引發(fā)疾病制劑以前，或者在感染或疾病開始和/或進展之后。
應(yīng)該注意的是，本發(fā)明的創(chuàng)新方法也可被用于癌癥疫苗的構(gòu)建。例如，可以用編碼腫瘤特異性抗原的序列替代上述重組體病毒實施方案及其使用方法中編碼病毒抗原的抗原序列。在宿主中表達腫瘤特異性抗原應(yīng)該激發(fā)特異的免疫應(yīng)答，以防止患者患有癌癥發(fā)展的風(fēng)險增加(即預(yù)防性免疫)或者聯(lián)合其它治療來增進癌癥治療，預(yù)防首次手術(shù)后的疾病復(fù)發(fā)(抗轉(zhuǎn)移接種)，或者作為擴大體內(nèi)CTL數(shù)量的工具，從而提高其根除擴散腫瘤的效力(治療已經(jīng)被確立的疾病)。另外，本發(fā)明的方法可以在患者中激發(fā)免疫應(yīng)答，其在被傳遞回腫瘤攜帶者之前在離體情況下被增強(即過繼免疫治療)。
同樣根據(jù)本方法的任何上述實施方案，所述的方法還可以包括在給予重組體病毒以后，收集宿主的血清。所收集的血清應(yīng)該含有針對所述重組體病毒編碼的抗原的抗體。任選地，所述的方法還包括在給予重組體病毒以后，從宿主分離針對所述病原體的一種抗體或多種抗體。可以將所收獲的血清或者被分離的抗體存儲一段時期以另外應(yīng)用。例如，可以將一個健康的志愿者作為宿主，在預(yù)期病原體感染后或處于病原體感染過程中，將從他/她那里收集的血清或抗體作為通過激發(fā)針對病原體的被動免疫而作為預(yù)防或治療劑給回他/她自身或者給予另一個不同的人。任選地，所述的宿主可以是非人動物，而且從被重組體病毒免疫的動物那里所收獲的血清或者所分離的抗體可以被用作預(yù)防或治療劑來治療預(yù)期病原體感染或處于病原體感染如爆發(fā)生物戰(zhàn)的人或非人動物。
應(yīng)該注意到，任何上述包含在重組體病毒中的抗原和免疫刺激因子的DNA序列都可以被改變和修飾而仍然保持所述突變體的相同功能。例如，可以用要被免疫的宿主例如人所優(yōu)選的密碼子來代替上述抗原的野生型密碼子。所得到的突變體也應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。
附圖簡述

圖1A-1C圖解了如何構(gòu)建本發(fā)明遺傳疫苗的實例。
圖1A圖解了穿梭載體pLAd的實例。攜帶多個抗原基因如抗原1和抗原2的抗原可以在SD和SA位點，經(jīng)由剪接供體-受體機制從CMVie啟動子雙順反子地表達。
圖1B圖解了穿梭載體pRAd的實例。攜帶多個細胞因子基因如IL-2，INF，和IL-基因的細胞因子可以經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點IRES和在SD和SA位點的剪接供體-受體機制，從CMVie啟動子雙順反子地表達。
圖1C圖解了通過連接腺病毒骨架和衍生于穿梭載體pLAd的片段而構(gòu)建的遺傳疫苗實例?？乖鄠€抗原基因和衍生于穿梭載體pRAd的一段片段。細胞因子包含多個細胞因子基因。
圖2圖解了野生型GP基因，其編碼兩種形式的糖蛋白(sGP和GP)，包含產(chǎn)生未編輯的和編輯的mRNA的RNA編輯信號。sGP合成自未編輯的mRNA，GP合成自編輯的mRNA(在7個尿苷中的一個具有插入)。圖2還描述了對RNA進行的修飾作用，其用來防止sGP合成。RNA編輯位點被從UUU UUU U修飾成了UUC UUC UU。這一修飾作用移除了編輯信號并產(chǎn)生只編碼GP的mRNA。
圖3圖解了對位于GP2中的免疫抑制肽(IS)的修飾作用。圖3A顯示了野生型GP。圖3B顯示了IS肽被刪除了10個氨基酸的GP。圖3C顯示了被分開的、翻轉(zhuǎn)的和重復(fù)的IS肽。縮寫詞FP，融合肽；IS，免疫抑制肽；TM，跨膜結(jié)構(gòu)域。
圖4A和4B圖解了用來產(chǎn)生作為針對埃博拉病毒的遺傳疫苗的重組體腺病毒載體的過程。
圖4A圖解了攜帶作為抗原的埃博拉病毒GP基因的穿梭載體pLAd/EBO-GP，和攜帶IL-2和IL-4基因的穿梭載體pRAdIL2，4。
圖4B圖解了通過連接腺病毒骨架和衍生于穿梭載體pLAd/EBO-GP的一段片段的重組體腺病毒載體的構(gòu)建，其包含GP基因和衍生于穿梭載體pRAdIL2，4并包含IL-2和IL-4基因的片段。
圖5圖解了作為本發(fā)明遺傳疫苗的一個實例的復(fù)合腺病毒載體。埃博拉病毒GP基因由E1區(qū)域的CMVie啟動子表達。GP基因后面的INF-γ和GM-CSF由兩個IRES序列表達。這種構(gòu)型允許從一個單獨的mRNA表達三種蛋白。IL-2和IL-4的表達受控于作為雙順反子盒的第二CMVie啟動子，其后的第二雙順反子盒由SV40早期啟動子表達出E4區(qū)域中IL-12的兩個亞基。
圖6顯示了在一組小鼠中針對HIV抗原的抗體的相對滴度。
圖7顯示了在另一組小鼠中針對HIV抗原的抗體的相對滴度。
圖8A-C顯示了作為對靶細胞刺激的響應(yīng)，由活化的脾細胞分泌的INF-γ，所述的脾細胞收獲自用腺病毒載體接種的小鼠。
圖9顯示了作為對靶細胞刺激的響應(yīng)，由活化的脾細胞分泌的粒酶A，所述的脾細胞收獲自用腺病毒載體接種的小鼠。
圖10A顯示了在一組小鼠中針對HBV表面抗原的抗體的相對滴度。
圖10B顯示了在另一組小鼠中針對HBV表面抗原的抗體的相對滴度。
圖11A顯示了在一組小鼠中針對HBV核心抗原的抗體的相對滴度。
圖11B顯示了在另一組小鼠中針對HBV核心抗原的抗體的相對滴度。
圖12A顯示了在小鼠中用Ad-3C/EmΔCΔT300-G免疫10周后針對HIVGag的抗體相對滴度。
圖12B顯示了在小鼠中用Ad-3C/EmΔCΔT300-G免疫14周后/加強免疫3周后針對HIVGag的抗體相對滴度。
圖13A顯示了在小鼠中用Ad-3C/EmΔCΔT99-G免疫10周后指向HIVGag的抗體相對滴度。
圖13B顯示了在小鼠中用Ad-3C/EmΔCΔT99-G免疫14周后/加強免疫3周后針對HIVGag的抗體相對滴度。
圖14A顯示了對系列1小鼠的粒酶A的測定結(jié)果，測定時間為Ad.3C.env.gag接種后4，6，8周和二次接種后12/1，13/2，14/3(初次免疫/加強免疫)周。
圖14B顯示了對系列2小鼠的粒酶A的測定結(jié)果，測定時間為Ad.3C.env.gag接種后2，4，6，8周。
圖15A顯示了系列1中4只小鼠的ELISPOT結(jié)果，測定時間為Ad.3C.env.gag接種后13/2(初次免疫/加強免疫)周。
圖15B顯示了系列1中4只小鼠的ELISPOT結(jié)果，測定時間為Ad.3C.env.rev.gag接種后13/2(初次免疫/加強免疫)周。
圖16A圖解了穿梭載體pLAd-E.T.R。
圖16B圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-IL2。
圖17A圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-cmv-EmΔCΔT300-G。
圖17B圖解了穿梭載體pLAd-3C。
圖18圖解了穿梭載體pRAd-EmΔCΔT99.T.R-G。
圖19A圖解了穿梭載體pLAd-EmΔV1，2ΔCΔT.T.R-IL2。
圖19B圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-G.IL2。
圖20圖解了穿梭載體pLAd-EmΔC.T.R.N。
圖21圖解了穿梭載體pLAd-EmΔC.N。
圖22圖解了穿梭載體pLAd-EmΔCΔT300.T。
圖23A圖解了穿梭載體pLAd-EmΔC。
圖23B圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-EmΔC。
圖24圖解了用PCR構(gòu)建多進化枝插入物的過程。
圖25圖解了穿梭載體pLAd-Em.V3。
圖26圖解了穿梭載體pLAd-Em.2xV3。
圖27A圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-p17/p24。
圖27B圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-p17/p24sec。
圖27C圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-p17/p24MB。
圖28A圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-p17。
圖28B圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-p17sec。
圖28C圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-p17MB。
圖29A圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-p24。
圖29B圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-p24sec。
圖29C圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-p24MB。
圖30A-B圖解了Ad-Em.2xV3m/p17/24MB的構(gòu)建過程。
圖31A-B圖解了Ad-Em.2xV3m/p17MB的構(gòu)建過程。
圖32A-B圖解了Ad-Em.2xV3m/p24MB的構(gòu)建過程。
圖33圖解了穿梭載體pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T。
圖34圖解了穿梭載體pLAd-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R。
圖35圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-G.PI。
圖36圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-G-PI。
圖37圖解了克隆載體SD/SA1.2.3。
圖38顯示了編碼來自HIV-1毒株BH10的Env/Tat/Rev的DNA序列。
圖39顯示了編碼突變的IL-2(IL-2ΔX)的DNA序列。
圖40顯示了編碼被修飾的Env(EmΔCΔT(BH10)的DNA序列。
圖41A顯示了編碼全長HIV Gag的DNA序列。
圖41B顯示了全長HIV Gag的氨基酸序列。
圖42顯示了編碼Env，以及全長Tat和Rev的DNA序列。
圖43顯示了編碼EmΔV1，2ΔCΔT.T.R的DNA序列。
圖44顯示了編碼EmΔC.T.R.N的DNA序列。
圖45顯示了編碼EmΔC.N的DNA序列。
圖46顯示了編碼EmΔCΔT300T的DNA序列。
圖47顯示了編碼Em/Em的DNA序列。
圖48顯示了B，A，C，D，E，F(xiàn)，和G進化枝的V3環(huán)的DNA序列。
圖49A顯示了這樣的DNA序列，其編碼包含多進化枝V3環(huán)的被修飾的Env。
圖49B顯示了這樣的氨基酸序列，其編碼包含多進化枝V3環(huán)的被修飾的Env。
圖50A顯示了分別編碼天然形式、分泌形式和膜結(jié)合形式p17/p24的DNA序列。
圖50B分別顯示了天然形式、分泌形式和膜結(jié)合形式p17/p24的氨基酸序列。
圖51A顯示了分別編碼天然形式、分泌形式和膜結(jié)合形式p17的DNA序列。
圖51B分別顯示了天然形式、分泌形式和膜結(jié)合形式p17的氨基酸序列。
圖52A顯示了分別編碼天然形式、分泌形式和膜結(jié)合形式p24的DNA序列。
圖52B分別顯示了天然形式、分泌形式和膜結(jié)合形式p24的氨基酸序列。
圖53A顯示了這樣的DNA序列，其編碼包含多進化枝V3環(huán)的被修飾的Env，和Tat。
圖53B顯示了包括多進化枝V3環(huán)的被修飾的Env，和Tat的氨基酸序列。
圖54A顯示了這樣的DNA序列，其編碼包含多進化枝V3環(huán)的被修飾的Env，Tat和Rev。
圖54B顯示了包括多進化枝V3環(huán)的被修飾的Env，Tat和Rev的氨基酸序列。
圖55A顯示了編碼HIV蛋白酶PI的DNA序列。
圖55B顯示了HIV蛋白酶PI的氨基酸序列。
圖56A顯示了編碼HIV Gag-PI的DNA序列。
圖56B顯示了HIV Gag-PI的氨基酸序列。
圖57顯示了用來從多HIV進化枝克隆V3環(huán)的PCR引物。
圖58圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-Gag/PI-RT。
圖59圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-Gag-PI-RT。
圖60圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-Gag/Pol。
圖61圖解了穿梭載體pRAd-ORF6-Gag-Pol。
圖62圖解了右穿梭載體pR-Ad.5/35-6m。
圖63顯示了嵌合載體的各種實施方案，所述的嵌合載體的Ad5纖維區(qū)個體結(jié)構(gòu)域被Ad35纖維區(qū)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域所取代。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了遺傳疫苗，包含所述疫苗的藥物組合物，和使宿主獲得針對廣譜致病病毒、細菌和寄生蟲感染的免疫方法。所述的遺傳疫苗是復(fù)制缺陷的重組體良性病毒而且不能在要被免疫的宿主體內(nèi)引起惡性腫瘤。使用本發(fā)明遺傳疫苗所進行接種模擬了天然病毒感染，這是因為被所述遺傳疫苗感染的細胞所表達的抗原以其天然構(gòu)型被提呈給宿主免疫系統(tǒng)，這樣，與傳統(tǒng)的、使用變性蛋白或病毒作為疫苗的“外-內(nèi)”方法相比，本發(fā)明所使用的是“內(nèi)-外”機制。所述的重組體病毒能夠表達復(fù)合致病抗原，從而模擬了天然病原體感染。特別是，可以用重組體病毒表達野生型或突變型的復(fù)合致病抗原如HIV包膜蛋白Env和結(jié)構(gòu)蛋白Gag的組合，這樣不但可以激發(fā)體液免疫應(yīng)答(即，從B細胞，輔助性T細胞和抑制性T細胞來產(chǎn)生抗體)而且可以通過產(chǎn)生特異針對這些抗原的細胞毒T淋巴細胞(CTL)來產(chǎn)生細胞應(yīng)答。另外，可以對被天然表達為細胞內(nèi)蛋白的致病抗原進行修飾而使其成為可分泌形式抗原從而使其結(jié)合到細胞表面，這樣就能更好地將抗原呈遞給機體的免疫系統(tǒng)。此外，被所述遺傳疫苗感染的細胞還可以釋放出高水平的細胞因子，從而進一步模擬細胞在病毒感染的壓力下所呈現(xiàn)的天然反應(yīng)而不會引起對細胞的致病效應(yīng)。由于接受到這個“致病病毒感染”的錯誤信息，宿主的免疫系統(tǒng)就會對被感染細胞呈遞的抗原發(fā)動強烈的免疫防御。因此，在某種意義上，本發(fā)明的遺傳疫苗的作用就好像“披著狼皮的羊”，其呈遞病毒抗原以誘導(dǎo)強烈的免疫應(yīng)答卻不引起病原體本應(yīng)對宿主引起的有害作用。本發(fā)明的這些重組體病毒不但可以用作疫苗來預(yù)防病原體感染，而且可以用作治療制劑來治療與病原體感染相關(guān)的疾病。
在一個實施方案中，提供了一種用來在被病毒感染的宿主體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答的重組體病毒。該重組體病毒包含異源于所述重組體病毒的、編碼來自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，該病毒抗原在宿主中的表達激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答；和，編碼免疫刺激因子的、異源于所述重組體病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達能提高所述病毒抗原的免疫原性。該重組體病毒是不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
在另一個實施方案中，提供了一種用來在被病毒感染的宿主體內(nèi)激發(fā)針對多個抗原的免疫應(yīng)答的作為病毒疫苗的重組體病毒。該重組體病毒包含異源于該良性病毒的多個抗原序列，每個序列編碼來自一個或多個致病病毒的不同病毒抗原，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，所述多個抗原序列的表達能夠在宿主中激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答。該重組體病毒可以優(yōu)選為不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
本發(fā)明的疫苗可以用于免疫宿主抗廣譜和不同毒株致病病毒或致病細菌，所述病毒如HIV-1，HIV-2，1型單純皰疹病毒，2型單純皰疹病毒，埃博拉病毒，埃博拉病毒，以及肝炎A，B，C，D，和E病毒；所述致病細菌如bacillus tumerculoses和炭疽桿菌。
本發(fā)明的重組體疫苗是這樣的重組體病毒，其含有編碼病毒基因組中一個或多個病毒抗原的核酸序列。當(dāng)宿主被該重組體疫苗免疫的時候，即被該重組體病毒感染的時候，病毒在宿主細胞中的感染引起該病毒抗原表達在被感染細胞的表面。由于病毒抗原的表達受強啟動子的驅(qū)動，所以表達可以維持在高水平。當(dāng)宿主的免疫系統(tǒng)識別到細胞表面出現(xiàn)大量病毒抗原的時候，它就會對病毒抗原發(fā)動強烈的免疫防御，從而獲得針對衍生病毒抗原的致病病毒的持久免疫力。
與分離的那些由細菌、酵母或者昆蟲細胞表達的蛋白并將其作為疫苗進行免疫相比，本發(fā)明重組體病毒表達的病毒抗原能夠更好地在其結(jié)構(gòu)和功能上模擬天然病毒抗原。分離的蛋白疫苗不能采用天然病毒抗原的天然構(gòu)型而且在細菌、酵母或昆蟲細胞中無法被正確地糖基化。當(dāng)將這樣的分離的蛋白疫苗注射到宿主中時，抗原是從宿主細胞的外面被呈遞的。這種傳統(tǒng)的“外-內(nèi)”方法通常不會產(chǎn)生強烈的、持續(xù)時間長的免疫應(yīng)答，這可能是由于疫苗的抗原性被改變并且蛋白疫苗被免疫清除細胞很快清除的結(jié)果。
相反，本發(fā)明的遺傳疫苗，即重組體病毒，通過“內(nèi)-外”機制呈遞病毒抗原。病毒抗原的表達是在宿主細胞被重組體病毒感染之后。這更好地模擬了由致病病毒進行的病毒抗原的天然產(chǎn)生和提呈。
通過使用不能復(fù)制的病毒，該病毒除了最先被感染的細胞之外不能將感染擴散開來，本發(fā)明顯著降低了由使用可復(fù)制的活病毒可能產(chǎn)生的副作用的危險。例如，基于活痘苗病毒的疫苗就能夠在宿主細胞中復(fù)制，這樣就會給宿主細胞造成高水平的壓力并最終導(dǎo)致細胞死亡。
另外，與將衰減或者失活的病毒作為疫苗的方法相比，本發(fā)明遺傳疫苗的制造過程要安全得多。給大量的人群或者動物群體進行接種需要大量的疫苗。對于劇毒病毒如埃博拉病毒和HIV，從活病毒來大規(guī)模生產(chǎn)衰減或失活的病毒往往會對環(huán)境和操作活病毒的人員造成很大危險。
本發(fā)明的重組體病毒可以被用來從相同的病毒載體同時表達多個抗原序列。這樣，所述的重組體病毒可以編碼來自致病病毒相同毒株的多個抗原，來自相同致病病毒不同毒株的多個抗原，或者編碼來自不同種類病毒、細菌或寄生蟲的不同抗原。這樣可以使本發(fā)明的疫苗用于免疫廣譜病毒和其它感染劑。由于在重組體病毒基因組中，這些復(fù)合抗原序列被重排，所以實際上消除了這些病毒序列潛在的重新組合而產(chǎn)生致病病毒的危險。
本發(fā)明的遺傳疫苗還優(yōu)選表達大量的免疫刺激因子如細胞因子。在病毒感染的天然過程中，病毒感染的細胞將病毒抗原呈遞在它們表面上MHC-I受體的附近，而呈現(xiàn)MHC-II受體相關(guān)抗原的專職抗原提呈細胞將病毒顆粒消化。作為對病毒感染的應(yīng)答，產(chǎn)生大量細胞因子和干擾素，引起強烈的、針對病毒抗原的體液和細胞應(yīng)答。同時，大量記憶細胞被保留以擊退任何新的感染。在使用分離的蛋白疫苗接種情況下，蛋白會被免疫清除細胞很快清除。在此過程中，只發(fā)生MHC-II抗原呈遞，沒有細胞因子釋放應(yīng)答或者該應(yīng)答被大大降低。結(jié)果，只產(chǎn)生很少的細胞應(yīng)答和很少的“記憶”細胞。
相反，通過將抗原呈遞在被感染的表面并產(chǎn)生大量免疫調(diào)節(jié)細胞因子，來自本發(fā)明的重組體病毒的病毒抗原和細胞因子的共表達有效地模擬了宿主細胞對病毒感染的天然應(yīng)答。由于高水平的、表達自被遺傳疫苗感染的宿主細胞的細胞因，被“哄騙”的宿主免疫系統(tǒng)對疫苗發(fā)動了強烈的應(yīng)答，從而產(chǎn)生持續(xù)時間更長的免疫力。
另外，盡管使用所述遺傳疫苗的接種模擬了致病病毒的天然病毒感染，但是疫苗本身是不具有致病病毒有害效應(yīng)的良性病毒。例如，致病病毒如HIV、流感病毒和埃博拉病毒的感染對宿主具有很強的免疫抑制作用，這可能是由于病毒糖蛋白的免疫抑制功能所致。依照本發(fā)明，由遺傳疫苗所攜帶的病毒抗原序列優(yōu)選被刪除了其致病區(qū)或免疫抑制區(qū)。在這種意義上，本發(fā)明的遺傳疫苗就象是“披著狼皮的羊”，其呈遞病毒抗原以誘導(dǎo)強烈的免疫應(yīng)答而不會對宿主引起有害影響。
1.本發(fā)明的遺傳疫苗本發(fā)明涉及疫苗，其模擬天然致病病毒的特征但并不激發(fā)免疫抑制和致病性，因此引起宿主發(fā)動有效的防御卻不會帶來任何實際的感染危險。這些遺傳疫苗是不能復(fù)制或者復(fù)制缺陷的病毒，編碼一個或者多個病毒抗原的一個或者多個DNA序列被插入到此病毒基因組中對其傳染力非必需的區(qū)域中。該重組體病毒表達病毒抗原并在體內(nèi)激發(fā)細胞介導(dǎo)的、針對所述抗原和表達所述抗原的細胞的免疫應(yīng)答。
在一個實施方案中，提供了用來在被所述病毒感染的宿主體內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答的重組體病毒。所述的重組體病毒包括異源于所述重組體病毒的、編碼來自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，該病毒抗原在宿主中的表達激發(fā)針對所述致病病毒和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答；和，編碼免疫刺激因子的、異源于所述重組體病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達能提高所述病毒抗原的免疫原性。該重組體病毒是不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
任何病毒都可以用來構(gòu)建所述的重組體病毒，只要使其原始祖先成為無法復(fù)制的病毒。例如，通過將病毒抗原插入到對重組體病毒傳染力非必需的區(qū)域，不能復(fù)制的腺病毒、腺相關(guān)病毒、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒和痘苗病毒可以被用來產(chǎn)生所述的重組體病毒。因此，優(yōu)選的重組體病毒不具有所述良性病毒天然祖先的致病區(qū)域但卻保留了其對宿主的傳染力。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述的重組體病毒是不能復(fù)制度腺病毒。
本發(fā)明的重組體腺病毒可以指導(dǎo)高水平的抗原表達，這樣就提供了對免疫系統(tǒng)的強大的刺激作用。被腺病毒感染的細胞所表達的抗原，在被感染的細胞中以模擬病原體感染細胞的方式被加工并呈遞。據(jù)信這一階段對于誘導(dǎo)對被感染細胞的細胞免疫方面非常重要，而使用傳統(tǒng)接種方法的時候這一階段卻完全沒有。另外，所述的重組體腺病毒可以感染樹突細胞，其是非常有效的抗原提呈細胞。此外，所述的重組體腺病毒還能攜帶編碼增強免疫的細胞因子的基因以進一步增強免疫力。而且，所述的重組體腺病毒可以天然感染人的氣道和內(nèi)臟上皮細胞，因此該疫苗可以通過鼻噴和口咽方式給予。另外，由于本發(fā)明的重組體腺病毒是不能復(fù)制的，所以它應(yīng)該是安全的。
可以將所述的異源抗原序列放置在腺病毒的E1，E3，或者E4區(qū)域?？梢詫⑺龅拿庖叽碳ひ蜃有蛄蟹胖迷谙俨《镜腅1，E3，或者E4區(qū)域。
在所述優(yōu)選實施方案的一個變體中，所述的異源抗原序列和免疫刺激因子序列被放置在腺病毒的E1，E3或者E4區(qū)域中，在此區(qū)域中，所述的異源抗原序列和免疫刺激因子序列通過內(nèi)部核糖體進入位點或者通過剪接供體-受體機制從啟動子處被雙順反子地表達。
所述病毒抗原或者免疫刺激因子的表達可以由與所述重組體病毒的天然祖先同源的啟動子調(diào)控?；蛘撸霾《究乖谋磉_可以由與所述重組體病毒的天然祖先異源的啟動子調(diào)控。例如，所述的與重組體病毒的天然祖先異源的啟動子可以是真核啟動子如胰島素啟動子，人巨細胞病毒(CMV)啟動子及其早期啟動子，猿猴病毒SV40啟動子，勞斯肉瘤病毒LTR啟動子/增強子，雞胞質(zhì)β-肌動蛋白啟動子，和可誘導(dǎo)的啟動子如可四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子。
所述的致病病毒可以是任何在宿主如人、家畜或其它哺乳動物中引起致病效果或者疾病的致病病毒。因此，所述的重組體病毒可以被用作使宿主免于致病病毒感染的疫苗。
在一個變體中，所述的致病病毒可以是人免疫缺陷病毒(HIV)的各種毒株，如HIV-1和HIV-2。所述的病毒抗原可以是HIV糖蛋白(或者表面抗原)如HIV GP120和GP41，衣殼蛋白(或者結(jié)構(gòu)蛋白)如HIV P24蛋白或者其它HIV調(diào)控蛋白如Tat、Vif和Ref蛋白。
在另一個變體中，所述的致病病毒可以是流感病毒。病毒抗原可以是流感病毒糖蛋白如流感病毒HA1，HA2和NA。
在另一個變體中，所述的致病病毒可以是埃博拉病毒。病毒抗原可以是埃博拉糖蛋白或者表面抗原如埃博拉病毒的GP1和GP2蛋白。
在另一個變體中，所述的致病病毒可以是肝炎病毒如肝炎A，B，C，D或者E病毒。病毒抗原可以是肝炎A，B，C，D或者E病毒的表面抗原或者核心蛋白。例如，所述的病毒抗原可以是乙肝病毒的表面抗原或者核心蛋白例如小乙肝病毒表面抗原(SHBsAg)(也稱澳大利亞抗原)，中乙肝病毒表面抗原(MHBsAg)和大乙肝病毒表面抗原(LHBsAg)。所述的病毒抗原也可以是丙肝病毒的表面抗原或者核心蛋白例如NS3，NS4和NS5抗原。
在另一個變體中，所述的致病病毒可以是呼吸道合胞病毒(RSV)。例如，該RSV病毒抗原可以是RSV的糖蛋白(G-蛋白)或者融合蛋白(F-蛋白)，其序列可以在基因庫中得到。
在另一個變體中，所述的致病病毒可以是單純皰疹病毒(HSV)如HSV-1和HSV-2。例如，所述的HSV病毒抗原可以是來自HSV-2的糖蛋白D。
在另一個變體中，所述的病毒抗原可以是腫瘤抗原或病毒癌基因如人乳頭瘤病毒的E6和E7，或者細胞癌基因如突變的ras或者p53。
應(yīng)該注意的是，其它的病毒相關(guān)蛋白或者抗原對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是很容易獲得的。對致病病毒和病毒抗原的選擇并不是本發(fā)明的限制因素。
所述的病毒抗原可以是全長的抗原病毒蛋白，或者是含有主要抗原、中和抗原或者致病病毒表位的所述抗原病毒蛋白的一部分?；蛘撸龅牟《究乖兄辽賰蓚€相同致病病毒毒株間的保守的糖蛋白區(qū)域。
在一個變體中，所述的病毒抗原可以是突變自所述致病病毒糖蛋白的被修飾的抗原，所述突變使得所述的病毒抗原成了無功能的病毒組分但卻保留了其抗原性。所述對病毒抗原的修飾作用包括刪除了所述糖蛋白的蛋白水解切割位點，以及對所述糖蛋白免疫抑制肽區(qū)域的復(fù)制和重排。
所述的重組體病毒還表達免疫刺激因子，以模擬當(dāng)病毒感染宿主細胞時的釋放細胞因子反應(yīng)，并進一步擴大對共表達自重組體病毒的病毒抗原的免疫應(yīng)答。所述的免疫刺激因子可以優(yōu)選為細胞因子。細胞因子的實例包括但不限于白細胞介素-2，白細胞介素-4，白細胞介素-12，β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在另一個實施方案中，提供了用來在被所述病毒感染的宿主中激發(fā)免疫應(yīng)答的重組體病毒。所述的重組體病毒包括異源于所述重組體病毒并編碼來自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，該病毒抗原在宿主中的表達激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答。
根據(jù)此實施方案，所述的重組體病毒優(yōu)選為不能復(fù)制的腺相關(guān)病毒、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒或者痘苗病毒。所述的良性病毒優(yōu)選刪除了良性病毒天然祖先的致病區(qū)域，但卻保留了其對宿主的感染力。
任選地，所述的重組體病毒包含異源于該重組體病毒的免疫刺激因子序列，該序列編碼的免疫刺激因子在宿主中的表達能夠增強病毒抗原的免疫原性。
本發(fā)明還提供了激發(fā)針對致病細菌的強烈且持久的免疫應(yīng)答的遺傳疫苗。在一個實施方案中，提供了一種被用作遺傳細菌疫苗的重組體病毒以在被此重組體病毒感染的宿主中激發(fā)免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒的病毒基因組包括異源于該重組體病毒的多個抗原序列，每個序列編碼來自致病細菌的細菌抗原，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，所述多個細菌抗原序列的表達在宿主中激發(fā)針對所述細菌抗原和表達所述細菌抗原的細胞的免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒可優(yōu)選為不能復(fù)制的而且不能在宿主中引起與致病細菌天然相關(guān)的惡性腫瘤。
所述的致病細菌可以是任何在宿主中引起致病效果或者疾病的致病細菌，例如bacillus tuberculoses，炭疽桿菌，和在動物中引起萊姆病的螺旋體布氏疏螺旋菌。所述的多個抗原序列可以編碼致病細菌的致死因子，保護性抗原，水腫因子，或其組合。
本發(fā)明還提供了激發(fā)針對致病性寄生蟲的強烈且持久的免疫應(yīng)答的寄生蟲疫苗。在一個實施方案中，提供了一種被用作寄生蟲疫苗的重組體病毒以在被此良性病毒感染的宿主中激發(fā)免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒包括異源于該重組體病毒的多個抗原序列，每個序列編碼來自致病寄生蟲的寄生蟲抗原，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，所述多個寄生蟲抗原序列的表達能夠在宿主中激發(fā)針對所述寄生蟲抗原和表達所述寄生蟲抗原的細胞的免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒可優(yōu)選為不能復(fù)制的，而且不能在宿主中引起與致病寄生蟲天然相關(guān)的惡性腫瘤。
所述的致病寄生蟲可以是任何在宿主中引起致病效果或者疾病的致病寄生蟲，如瘧疾和原生動物例如隱孢子蟲屬、艾美球蟲屬、組織滴蟲屬、白細胞蟲屬、瘧原蟲屬、弓形蟲屬、毛滴蟲屬、利什曼蟲屬、錐蟲屬、賈第鞭毛蟲屬、巴貝蟲屬和泰累爾梨漿蟲屬。所述的多個抗原序列可以編碼致病寄生蟲的外殼蛋白、附著蛋白、或其組合。
本發(fā)明還提供了將多種抗原提呈給宿主的病毒疫苗，以進一步模擬天然致病病毒的天然感染并且在宿主中誘導(dǎo)針對各種毒株或類型致病病毒的強烈且持久的免疫應(yīng)答。
在一個實施方案中，提供了一種重組體病毒，其被作為病毒疫苗來在被該病毒感染的細胞內(nèi)激發(fā)免疫應(yīng)答。該重組體病毒包含異源于該重組體病毒的多個抗原序列，每個序列編碼來自致病病毒的病毒抗原，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，所述多個抗原序列的表達在宿主中激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒可以優(yōu)選為不能復(fù)制的而且不能在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
根據(jù)此實施方案，重組體病毒可以是任何病毒，優(yōu)選為不能復(fù)制的腺病毒、腺相關(guān)病毒、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒或者痘苗病毒。重組體病毒也可以優(yōu)選為具有刪除了良性病毒天然祖先的致病區(qū)但卻保留了其對宿主的傳染性。
同樣根據(jù)此實施方案，所述的多個抗原序列可以是相同抗原序列的多個拷貝或者是相互不同的多個抗原序列。
在所述實施方案的一個變體中，所述的多個抗原序列中至少有兩個是經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點或者經(jīng)由剪接供體-受體機制從一個啟動子雙順反子地表達的。
或者，所述的多個抗原序列中至少有兩個從一個啟動子表達而產(chǎn)生融合蛋白。
同樣根據(jù)此實施方案，所述的重組體病毒還包含至少一個異源于所述重組體病毒天然祖先的啟動子，其控制所述多個抗原序列中至少兩個序列的表達。異源于重組體病毒天然祖先的啟動子包括但不限于，胰島素啟動子，CMV啟動子及其早期啟動子，SV40啟動子，勞斯肉瘤病毒LTR啟動子/增強子，雞胞質(zhì)β-肌動蛋白啟動子，和可誘導(dǎo)的啟動子如可四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子。
同樣根據(jù)此實施方案，所述的多個抗原序列可以是來自至少兩個致病病毒毒株的抗原組合。
任選地，所述的多個抗原序列可以是來自至少兩個不同致病病毒的抗原組合。例如，所述的多個抗原序列可以是來自HIV-1，HIV-2，1型單純皰疹病毒，2型單純皰疹病毒，流感病毒，馬爾堡病毒，埃博拉病毒，蟲媒病毒(一組由蚊子攜帶的病毒，可引起腦炎、黃熱病和登革熱)以及肝炎A，B，C，D，和E病毒。
在所述實施方案的一個變體中，所述重組體病毒的病毒基因組還可以含有一個或者多個免疫刺激因子序列，這些序列異源于重組體病毒且編碼免疫刺激因子，該刺激因子在宿主中的表達可提高所述病毒抗原的免疫原性。例如，所述的免疫刺激因子可以是細胞因子。細胞因子的實例包括但不限于白細胞介素-2，白細胞介素-4，白細胞介素-12、β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，G-CSF，和GM-CSF。
根據(jù)此變體，所述的一個或者多個免疫刺激因子序列可以是相同免疫刺激因子序列的多個拷貝，或者是相互不同的多個免疫刺激因子序列。
任選地，所述的多個免疫刺激因子序列中至少有兩個可以是經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點或者經(jīng)由剪接供體-受體機制從一個啟動子雙順反子地表達的。或者，所述的免疫刺激因子序列中至少有兩個可以從一個啟動子表達而產(chǎn)生融合蛋白。
編碼病毒抗原的DNA序列被插入到復(fù)制缺陷病毒的任何非必需區(qū)域中。例如，當(dāng)使用腺病毒時，優(yōu)選將所述的核酸序列插入到腺病毒的E1，E3，和/或E4區(qū)域，最優(yōu)選插入到E4區(qū)域。由于E1，E3和E4區(qū)域均可被用作插入位點，所以本發(fā)明還考慮將多于一個的編碼序列分別插入。
在本發(fā)明的重組體病毒載體疫苗中，所選擇的病毒抗原的核苷酸序列被可操作連接到調(diào)控元件上，此調(diào)控元件指導(dǎo)其在受試者體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄或者表達?？梢允褂猛椿蛘弋愒吹牟《菊{(diào)控序列。有效的異源調(diào)控序列通常包括那些衍生于編碼宿主(hostian)或者病毒基因的序列。其實例包括但不限于巨細胞病毒(CMV)啟動子如CMV即早啟動子區(qū)(CMVie)，SV40早期啟動子，小鼠乳腺瘤病毒LTR啟動子，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)，單純皰疹病毒啟動子，和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子。優(yōu)選地，可以將任何強的組成型啟動子與病毒抗原或者細胞因子可操作連接。更優(yōu)選地，病毒啟動子是CMV即早啟動子(CMVie)。
圖1A-1C描述了用來將重組體腺病毒構(gòu)建成本發(fā)明遺傳疫苗的方法。通過使用攜帶多個抗原基因和多個細胞因子基因的穿梭質(zhì)?；蜉d體來構(gòu)建本發(fā)明的重組體腺病毒載體。
圖1A圖解了含有兩個抗原基因抗原1和抗原2的穿梭質(zhì)粒(pLAd.抗原)。穿梭質(zhì)粒pLAd.抗原含有包含左側(cè)長末端重復(fù)L-TR的腺病毒基因組左側(cè)末端，和腺病毒包裝信號(ψ)。腺病毒的E1區(qū)被多基因表達盒和CMVie啟動子所取代。
編碼抗原1和抗原2的基因通過在SD和SA位點的剪接機制被置于CMVie啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。質(zhì)粒pLAd.抗原還含有SV40多聚腺苷酸位點，以及用于DNA在細菌中傳播的原核復(fù)制起點和氨芐青霉素抗性基因。
圖1B圖解了另一個含有多個細胞因子基因如IL-2，INF和IL-8的穿梭質(zhì)粒(pRAd.細胞因子)。穿梭質(zhì)粒pRAd.細胞因子含有包括右側(cè)長末端重復(fù)R-TR的腺病毒基因組右側(cè)末端。E4區(qū)域的大部分區(qū)域(除了orf6)被細胞因子基因所取代。細胞因子的表達經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和在SD與SA位點的剪接機制被置于CMVie啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。質(zhì)粒pLAd.細胞因子還包含牛生長激素(BGH)多聚腺苷酸位點，以及用于DNA在細菌中傳播的原核復(fù)制起點和氨芐青霉素抗性基因。
所述的重組體腺病毒基因組由兩個穿梭質(zhì)粒pLAd.抗原和pRAd.細胞因子組裝而成，其分別攜帶腺病毒基因組的左和右末端。分別用限制性酶如XbaI和EcoRI來消化穿梭質(zhì)粒pLAd.抗原和pRAd.細胞因子。
如圖1C所示，來自這兩個穿梭質(zhì)粒pLAd.抗原和pRAd.細胞因子的、相應(yīng)于腺病毒左和右末端的片段，被分離并連接到腺病毒基因組(腺病毒骨架)的中間部分。
隨后用此被連接的載體基因組DNA轉(zhuǎn)染表達腺病毒E1蛋白的293HK細胞。在E1蛋白存在的情況下，已被刪除了E1的載體基因組可以被復(fù)制并被包裝到病毒顆粒中，即產(chǎn)生可被用作本發(fā)明遺傳疫苗的重組體腺病毒載體。在天然腺病毒基因組被保留但是在重組體病毒基因組中被刪除的E1區(qū)，是天然于重組體病毒天然祖先(野生型腺病毒)致病區(qū)的實例。
圖5圖解了通過使用上述方法構(gòu)建的遺傳疫苗的實例。所述的復(fù)制缺陷的腺病毒5型是載體的骨架，病毒抗原和細胞因子插入在其E1區(qū)。用CMVie啟動子來表達病毒抗原。病毒抗原基因的后面是編碼INF-γ和GM-CSF的基因，其利用2個IRES序列來實現(xiàn)由單個mRNA來表達三種蛋白。IL2和IL4由作為雙順反盒的第二CMVie啟動子控制，其后面是在E4區(qū)域表達IL-12的兩個亞單位的第二雙順反盒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，本發(fā)明并不限于上面討論的結(jié)構(gòu)，還可以使用備選的其它細胞因子或者結(jié)合使用這些或者其它的細胞因子。有關(guān)這些細胞因子的詳細信息描述在下面的部分中。
2.與病毒抗原共表達的細胞因子本發(fā)明的重組體病毒還可以表達免疫刺激因子以模擬宿主在受到病毒感染的時候作出的釋放細胞因子反應(yīng)，并進一步擴大針對共表達自重組體病毒的病毒抗原的免疫應(yīng)答。所述的免疫刺激因子可以是免疫增強細胞因子以進一步刺激免疫系統(tǒng)。所述的重組體病毒可以編碼一種或者以任何方式組合的多個細胞因子?；蛘?，可以由多于一個重組體病毒來表達多個細胞因子，或者通過使用其它技術(shù)如經(jīng)由裸DNA質(zhì)粒遞送或者注射細胞因子蛋白來而遞送到宿主。
細胞因子的實例包括但不限于白細胞介素-2，白細胞介素-4，白細胞介素-8，白細胞介素-12，β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
細胞因子是在本發(fā)明疫苗中特別有用的免疫調(diào)節(jié)分子，由于它們是調(diào)節(jié)并形成免疫應(yīng)答質(zhì)量和強度的多效(pleitropic)調(diào)節(jié)劑。細胞因子有時是自分泌或者內(nèi)分泌的，但是多數(shù)情況下是由淋巴細胞和單核細胞天然產(chǎn)生的旁分泌激素。
這里使用的術(shù)語“細胞因子”指的是由免疫系統(tǒng)的細胞產(chǎn)生的并調(diào)節(jié)或者控制免疫應(yīng)答的蛋白或多肽類的成員。這種控制可以發(fā)生在體液或者細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，這種調(diào)節(jié)可以發(fā)生在體液或細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，并且包括對T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、抗原提呈細胞或者其它免疫系統(tǒng)細胞的效應(yīng)器功能的調(diào)節(jié)。
典型的細胞因子是分子量小于大約30kDa的小蛋白或者糖蛋白。這里使用的術(shù)語細胞因子包括那些由淋巴細胞和其它細胞類型分泌的細胞因子(常表示為淋巴因子)，以及由單核細胞和巨噬細胞及其它細胞類型分泌的細胞因子(通常稱為單核因子)。這里使用的術(shù)語細胞因子包括那些由淋巴細胞和其它類型細胞分泌的細胞因子，以及由單核細胞和巨噬細胞及其它細胞類型分泌的細胞因子。術(shù)語細胞因子包括白細胞介素和人促炎細胞因子，白細胞介素如IL-2，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-15，和IL-18，它們是由主要影響造血和免疫系統(tǒng)細胞的生長和分化的白細胞所分泌的分子；人促炎細胞因子如IL-1a，TNF-a和TNF-b。術(shù)語細胞因子還包括造血生長因子，特別是集落刺激因子如集落刺激因子-1，粒細胞集落刺激因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
這些細胞因子可以具有天然發(fā)生細胞因子的序列，或者與天然發(fā)生細胞因子的序列具有實質(zhì)的氨基酸序列相似性，如60-95％的氨基酸序列類似，優(yōu)選70-98％的氨基酸序列，最優(yōu)選75-95％的氨基酸序列相似性。
因此，應(yīng)該理解，可以對天然存在的序列進行有限的修飾作用而不會破壞該細胞因子的生物功能。例如，對γ-干擾素進行的、不破壞其功能的少量修飾作用仍屬于γ-干擾素的定義范圍內(nèi)。這些修飾可以是故意進行的，如通過位點專一誘變，或者可以是偶然發(fā)生的如通過突變。優(yōu)選的細胞因子是IL-2，IL-8，IL-12，或γ-干擾素，β-干擾素，λ-干擾素，GM-CSF，或者G-CSF，或其組合。
白細胞介素-2是由輔助性T細胞產(chǎn)生的淋巴因子并且在調(diào)控免疫應(yīng)答的量度和類型中有活性。Smith，K.A.，Ann.Rev.Immunol.2，319-333(1984)。其它也歸屬于IL-2的功能包括激活NK細胞(Minato，N.等.，J.Exp.Med.154，750(1983))和在大粒狀淋巴細胞和B細胞中刺激細胞分裂。Tsudo，M.等..J.Exp.Med.160，612-616(1984)。對小鼠和人進行的研究證明，IL-2在體內(nèi)和體外都可以增強不足的免疫應(yīng)答。例如，外源IL-2可以在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠(Merluzzi，V.J.等.Cancer Res.41，850-853(1981))和無胸腺(裸)小鼠中恢復(fù)免疫應(yīng)答。Wagner，H.等.Nature 284，278-80(1982)。另外，IL-2可以在患有免疫缺陷疾病如麻風(fēng)和癌的患者中恢復(fù)淋巴細胞的應(yīng)答。Vose，B.M.等.Cancer Immuno.13，105-111(1984)。這些用于鼠科的(Yokota，T.等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，68-72(1985))和人類的(Taniguchi，T.等.Nature，302，305-307(1983))IL-2基因已經(jīng)被克隆并被測序。
白細胞介素-4是衍生于T細胞的因子，其充當(dāng)靜止B細胞的誘導(dǎo)因子、B細胞分化因子和B細胞生長因子。Sevenusar，E.Eur.J.Immunol.17，67-72(1987)。人類的IL-4基因已經(jīng)被分離并測序。Lee，F(xiàn).等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，2061-2065(1986)。
IL-12是近來才被表征的異源二聚體細胞因子，其分子量為75kDa而且由二硫鍵連接的40kDa和35kDa的亞單位組成。其由抗原提呈細胞如巨噬細胞產(chǎn)生，并結(jié)合到活化的T，B和NK細胞受體上。(Desai，B.B.，等.，J.Immunol.，1483125-3132(1992)；Vogel，L.A.，等.，Int.Immunol.，81955-1962(1996))。其具有的多種作用包括1)增強T細胞和NK細胞的增殖，2)增加T細胞，NK細胞和巨噬細胞的細胞溶解活性，3)誘導(dǎo)IFN-的產(chǎn)生，并在較小的程度上誘導(dǎo)TNF-α和GM-CSF的產(chǎn)生，和4)活化TH1細胞。(Trinchieri，G.，等.，Blood，844008-4027(1994)。已經(jīng)表明，IL-12在Th1克隆的增殖上是重要的共刺激因子(Kennedy等.，Eur.J.Immunol.242271-2278(1994))而且引起血清中IgG2a抗體的產(chǎn)生增加(Morris，S.C.，等.，J.Immunol.1521047-1056(1994)；Germann，T.M.，等.，Eur.J.Immunol.，25823-829(1995)；Sher，A.，等.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，795202-207(1996)；Buchanan，J.M.，等.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)；Metzger，D.W.等.，Eur.J.Imunol.，271958-1965(1997))。給予IL-12還可以暫時地降低IgG1抗體的產(chǎn)生(Morris，S.C.，等.，J.Immunol.1521047-1056(1994)；Mcknight，A.J.，J.Immunol.1522172-2179(1994)；Buchanan，J.M.，等.，Int.Immunol.，71519-1528(1995))，這表明了對Th2應(yīng)答的抑制作用。對IL-12的純化和克隆公開在WO92/05256和WO90/05147，以及EP322,827(確定為“CLMF”)中。上述的所有效應(yīng)均是在成年動物中觀察到的。
干擾素(IFNs)是相對較小的、種類特異的單鏈多肽，其由應(yīng)答于暴露在多種誘導(dǎo)劑如病毒、多肽、有絲分裂原等的宿主細胞產(chǎn)生。它們表現(xiàn)出抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)特性，并且因此非常有前景被用作控制癌癥和各種其它抗病毒疾病的治療制劑(J.Desmyter等.，Lancet 11，645-647(1976)；R.Derynck等.，Nature 287，193(1980))?；谒鼈兊募毎麃碓春涂乖?，人干擾素被分成三類α-干擾素(白細胞)，β-干擾素(成纖維細胞)和γ-干擾素(B細胞)。每一類中的重組體類型已經(jīng)被研制出來并且可以商購。
γ-干擾素還是衍生于T細胞的分子，對免疫應(yīng)答有深遠的影響。該分子通過IL-2刺激的活化的B細胞來促進免疫球蛋白的產(chǎn)生。γ-干擾素還增加組織相容性抗原在與病毒抗原相關(guān)的細胞上的表達，以刺激細胞毒性T細胞。人γ-干擾素的基因已經(jīng)被分離并被測序。Gray，P.W.等.，Nature 295，503-508(1982)。
人α干擾素(也稱為白細胞干擾素)包含大約30個蛋白質(zhì)種類的家族，由至少14個不同的基因和大約16個等位基因編碼。已經(jīng)表明，這些α干擾素蛋白種類中有一些具有抗病毒、抗生長和免疫調(diào)節(jié)活性。參見例如Pestka等.，Ann.Rev.Biochem.，56727(1987)。人α干擾素對人癌癥和病毒疾病的治療功效已經(jīng)得到證明。例如，目前重組體干擾素(IFNα-2a，IFNα-2b，IFNα-2c)，衍生于細胞系的干擾素(IFNα-n1)，和衍生于白細胞的干擾素(IFNα-n3)被用于治療尖銳濕疣(Condylomaacuminata)，肝炎(Weck等.，Am.J.Med.，85(Suppl 2A)159(1988)；Korenman等.，Annal.Intern.Med.，114.629(1991)；Friedman-Kien等.，JAMA，259533(1988))，用于某些惡性腫瘤的退變(Baron等.，JAMA，2661375(1991))，和用于治療AIDS相關(guān)的卡波濟肉瘤(Physicians DeskReference，第47版.，eds.Medical Economics Data，Montvale，N.J.，2194和2006頁(1993))，目前正在考慮將其單獨或者與其它抗病毒制劑結(jié)合以用于治療人獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)(Hirsch，Am.J.Med.，85(Suppl2A)182(1988))。
通過化學(xué)測定β-干擾素的碳水化合物含量，結(jié)果顯示其是糖蛋白。其具有一個N-糖苷基粘附位點(E.Knight，Jr.，Proc.Natl.Acad.Sci.，73，520(1976)；E.Knight，Jr.，和D.Fahey，J.Interferon Res.，2(3)，421(1982))。雖然還不太清楚究竟是那種類型的糖組成了β-干擾素的碳水化合物部分，但是已經(jīng)表明碳水化合物部分對其抗原性、生物活性或疏水性并非必需(T.Taniguchi等.，supra；E.Knight，Jr.，supra；和E.Knight，Jr.和D.Fahey，supra)。在成纖維細胞中，β-干擾素可由病毒激發(fā)誘導(dǎo)，其包含大約165個氨基酸。β-干擾素的序列是已知的。Fiers等.Philos.Tmas.R.Soc.Lond.，B，Biol.Sci.29929-38(1982)。
GM-CSF是一種對樹突細胞的成熟和功能十分重要的細胞因子。其與樹突細胞上的受體結(jié)合并刺激這些細胞成熟、提呈抗原并準備原始T細胞。樹突細胞形成一個高效的抗原呈遞細胞系統(tǒng)。在捕獲周邊的抗原后，樹突細胞遷移到淋巴器官并將抗原呈遞給T細胞。這些有效的抗原呈遞細胞在其與活化的原始T細胞相互作用的能力方面是獨一無二的。樹突細胞的這種有效的抗原呈遞能力可能部分是由于其獨特的生命周期和高水平表達的主要組織相容性復(fù)合物I和II類分子以及共刺激分子所致。人GM-CSF序列是已知的。Wong等.，Science 228810-815(1985)。
粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是一種造血生長因子，也稱作集落刺激因子，其刺激定型祖細胞分化并形成分化的血細胞集落。G-CSF優(yōu)先刺激嗜中性粒細胞的生長和發(fā)育，并且對治療中性白細胞減少癥有用。Welte等.，PNAS-USA 821526-1530(1985)；Souza等.，Science 23261-65(1986)和Gabrilove，J.Seminars in Hematology 26(2)1-14(1989)。G-CSF增加循環(huán)粒細胞的數(shù)量并且已經(jīng)報道能夠改善膿毒病模型中的感染。給予G-CSF還抑制腫瘤壞死因子(TNF)的釋放，TNF是一種在膿毒病和排斥反應(yīng)過程中對組織損傷非常重要的細胞因子。參見例如Wendel等.，J.Immunol.，149918-924(1992)。人(Nagata等.，Nature319；415，1986)和小鼠(Tsuchiya等.，PNAS83，7633，1986)G-CSF的cDNA已經(jīng)被分離，這可以使我們進一步表征G-CSF的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。
內(nèi)源性G-CSF在人的血漿中是可以探測到的。Jones等.，Bailliere′sClinical Hematology 2(1)83-111(1989)。G-CSF是由成纖維細胞，巨噬細胞，滋養(yǎng)層T細胞，內(nèi)皮細胞和上皮細胞產(chǎn)生的，并且是位于17號染色體、包含4個外顯子和5個內(nèi)含子的單拷貝基因的表達產(chǎn)物。此基因座的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一種mRNA類型，其被差別加工，產(chǎn)生兩種類型G-CSF mRNA，一種編碼一個177個氨基酸的蛋白質(zhì)，另一個編碼一個174個氨基酸的蛋白質(zhì)。Nagata等.，EMBO J 5575-581(1986)。包含174個氨基酸的那種類型已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有最特異的體內(nèi)生物學(xué)活性。G-CSF在種間會交叉反應(yīng)，因此當(dāng)將人G-CSF給予另一個宿主如小鼠、犬或者猴子的時候，會激發(fā)持續(xù)的嗜中性粒細胞白細胞增多。Moore等.PNAS-USA847134-7138(1987)。
本發(fā)明提供了用來增強針對重組體病毒的特異外來抗原多肽的免疫應(yīng)答的有效方法。盡管任何外來抗原多肽均可以被用于本發(fā)明的疫苗，但是本發(fā)明的疫苗在針對HIV病毒和埃博拉病毒的疫苗中特別有用，這是因為這些病毒對宿主的免疫系統(tǒng)具有負面影響。本發(fā)明的疫苗對免疫肝炎B和C病毒也非常有用。
3.針對HIV感染的遺傳疫苗本發(fā)明的遺傳疫苗還致力于解決針對HIV病毒的有效疫苗的需求。依照本發(fā)明，所述的遺傳疫苗可以是其病毒基因組攜帶一個或者多個來自HIV的抗原如HIV糖蛋白(如GP120和GP41)或者衣殼蛋白(如p24)的重組體良性病毒。這些HIV抗原的序列可以是被修飾的如刪除了HIV糖蛋白的免疫抑制區(qū)域。
HIV病毒引起的疾病稱為獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)。自從AIDS首先在1981年被報道以后，它就被描述為現(xiàn)代瘟疫，據(jù)稱僅在美國就有超過60,000的患者，已有32,000例死亡。該疾病被表征為在長時間的無癥狀期后，免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變。在癥狀出現(xiàn)前，該病毒可以潛伏在被感染個體的體內(nèi)長達5或者更多年，因此在此期間該疾病的真正影響不會表現(xiàn)出來。許多美國人可能在不知道的情況下被HIV感染，并且還能夠傳染其它可能與其體液進行接觸的人。因此，如果不加以抑制，AIDS對個人、社會和經(jīng)濟的影響都將是巨大的。
HIV病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。因此，其遺傳物質(zhì)是編碼病毒復(fù)制信息的RNA。當(dāng)宿主細胞被感染的時候，RNA充當(dāng)轉(zhuǎn)錄成DNA的模板，此過程由被稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的酶所催化。如此產(chǎn)生的DNA進入到細胞核中，在這里，該DNA作為前病毒被整合到宿主DNA中。當(dāng)被適當(dāng)激活的時候，此衍生于逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA被轉(zhuǎn)錄并被翻譯，產(chǎn)生含有RNA病毒粒子，該病毒粒子隨后經(jīng)由出芽過程從細胞釋放出來。
當(dāng)個體被HIV感染的時候，病毒優(yōu)先黏附并進入到被稱作T4淋巴細胞的一種特殊種類的白細胞中，該細胞的特征在于在細胞表面呈現(xiàn)被定義為CD4的標記。這些白細胞在免疫系統(tǒng)中起著必要的作用，其作為體液和細胞免疫應(yīng)答的重要組分發(fā)揮功能。HIV的許多有害作用都可以歸于對T4淋巴細胞的功能性抑制或者破壞作用。
完整的HIV病毒粒子是粗糙的球形，其直徑大約為110nm。該病毒粒子具有被由糖蛋白gp160/120構(gòu)成的釘狀構(gòu)件所布滿的外層膜。另外，該病毒粒子還存在被定義為gp41的跨膜蛋白。病毒粒子里面是兩個結(jié)構(gòu)蛋白由磷蛋白p17構(gòu)成的外殼，和由磷蛋白p24組成的內(nèi)核或者中心核。病毒RNA與兩個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄酶p66/51出現(xiàn)在核的內(nèi)部，該逆轉(zhuǎn)錄酶對于病毒DNA從RNA模板的合成是必要的。HIV的RNA基因組編碼三個主要結(jié)構(gòu)基因gag，pol和env，這些基因的兩端都接有長末端重復(fù)(LTR)序列。Gag基因編碼組特異的核蛋白p55，p39，p24，p17和p15。Pol基因編碼逆轉(zhuǎn)錄酶p66/p51和蛋白酶p31。Env基因編碼外層包膜糖蛋白gp120、其前體gp160、以及跨膜糖蛋白gp41。這些基因中有一些基因趨向于高度可變，特別是env基因。另外，HIV還有5個其它逆轉(zhuǎn)錄病毒所不具有的基因，這些基因或者參與轉(zhuǎn)錄或者翻譯調(diào)控，或者編碼其它結(jié)構(gòu)蛋白。HIV的整個基因組目前已經(jīng)被測序。參見Ratner等.Nature 313277(1985)，該文獻在此加入作為參考。
HIV包膜蛋白已經(jīng)被廣泛地描述，編碼許多HIV毒株的HIV包膜的氨基酸和RNA序列都是已知的。參見Myers，G.等.，Human Retrovirusesand AIDSA compilation and analysis of nucleic acid and amino acidsequences，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，N.M.(1992)。預(yù)計各種毒株HIV的env基因編碼850-880個氨基酸的蛋白。在合成過程中，對Env的前體多聚蛋白的廣泛糖基化作用產(chǎn)生了gp160(大約160千道爾頓)，其也是在被感染的細胞中檢測到的env基因產(chǎn)物的主要類型。Gp160形成同源三聚體并在高爾基體中經(jīng)歷了糖基化作用。
Gp160的功能性結(jié)構(gòu)域包括從N端開始，信號肽，包含CD4結(jié)合位點(如Thr257、Trp427、Asp368/Glu370和Asp457)的可變區(qū)域1-5，蛋白水解加工位點(也稱為gp120和gp41之間的切割位點)，融合結(jié)構(gòu)域，亮氨酸拉鏈基序，跨膜結(jié)構(gòu)域和慢病毒屬裂解肽(LLP)1和2。盡管gp120的核苷酸和氨基酸序列以及從各種HIV的分離物和毒株的編號方式可能會不同，但是編碼功能性結(jié)構(gòu)域的區(qū)域卻可以很容易通過下列書籍中的教導(dǎo)鑒別開來Luciw(1996)″Fundamental Virology″，第3版，編輯.，F(xiàn)ields等.，Lippincott-Raven發(fā)行人，Philadelphia，27章，845-916頁。
Env前體gp160的N末端的信號肽將核糖體所翻譯的新生蛋白引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；在Env糖蛋白的生物發(fā)生過程中，細胞內(nèi)蛋白酶將此信號肽移除。Env前體gp160在加工位點被細胞蛋白酶切割以生成gp120(稱為SU亞單位)和gp41(稱為TM亞單位)。Gp120包含多數(shù)外部的、表面暴露的、包膜糖蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)域。Gp41含有跨膜結(jié)構(gòu)域并保留著三聚體的構(gòu)型，而且它以非共價的方式與gp120相互作用。Gp41的亞單位包括融合肽，亮氨酸拉鏈樣區(qū)域，跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)，LLP1和LLP2。
Gp120亞單位含有5個可變區(qū)和6個保守區(qū)。根據(jù)Modrow等(1987)″Computer-assisted analysis of envelope protein sequences of seven humanimmunodeficiency virus isolatespredictions of antigenic epitopes inconserved and variable regions″，J.Virol.61570-578的命名法，Gp120的可變(V)結(jié)構(gòu)域和保守(C)結(jié)構(gòu)域是特定的。Modrow等。
Gp120分子由60,000道爾頓的多肽核構(gòu)成，其被N聯(lián)糖基化作用廣泛地修飾，以增加該分子表觀分子量到120,000道爾頓。在所有g(shù)p120序列中，Gp120一級序列中的18個半胱氨酸殘基的位置和gp120序列中的大約24個N聯(lián)糖基化作用位點的13個都是共有的。超可變結(jié)構(gòu)域含有大量氨基酸取代、插入和缺失。在這些結(jié)構(gòu)域中的序列變化導(dǎo)致了來自多種病毒分離物的gp120分子間的高達30％的總序列可變性。盡管存在可變性，但是所有的gp120序列保留了病毒與病毒受體CD4結(jié)合的能力和病毒與gp41相互作用的能力，以誘導(dǎo)病毒與宿主細胞膜融合。
HIV病毒通過包膜糖蛋白與細胞表面受體的相互作用黏附到宿主細胞上。似乎當(dāng)HIV與T4細胞接觸時，gp120就與CD4受體相互作用。近來，通過絡(luò)合蛋白質(zhì)與人CD的片段和來自阻斷結(jié)合趨化因子受體的病毒中和抗體的抗原結(jié)合片段，已經(jīng)解開了HIV-1 gp120(毒株HXB-2，進化枝B病毒)的核心結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。Kwong等.(1998)″Structure of anHIVgp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and aneutralizing human antibody″，Nature 393648-659。這些研究揭示了gp120核心具有獨特的分子結(jié)構(gòu)，其包含兩個結(jié)構(gòu)域-“內(nèi)部結(jié)構(gòu)域”(面對gp41)和“外部結(jié)構(gòu)域”(主要暴露在寡聚包膜糖蛋白復(fù)合物的表面)。這兩個gp120結(jié)構(gòu)域被一個不屬于任何結(jié)構(gòu)域部分的“橋板(bridging sheet)”分隔開。與CD4的結(jié)合會引起gp120的構(gòu)象改變，其將所述橋板暴露出來并可能相對彼此移動內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)域。同樣發(fā)現(xiàn)，多數(shù)被加在gp120上的碳水化合物分子被加到了外部結(jié)構(gòu)域。這與病毒使用碳水化合物分子來掩蓋gp120上的外部抗原表位這一想法相吻合。
Gp120不僅結(jié)合到CD4受體上，而且還結(jié)合到HIV共受體如細胞趨化因子受體(如CCR5)。當(dāng)與受體和/或共受體結(jié)合的時候，病毒包膜隨后與細胞膜融合，病毒的內(nèi)部核心進入到被感染的細胞內(nèi)，在被感染的細胞內(nèi)，RNA經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄酶的催化轉(zhuǎn)錄成為DNA前病毒。細胞中的前病毒以潛伏形式保留幾個月或者幾年，在此期間，被感染的個體是無癥狀的。但是，一旦病毒后來被激活，就會引起病毒復(fù)制和免疫抑制，被感染個體就很容易受到與AIDS相關(guān)的機會性感染。
在一個本發(fā)明HIV疫苗的實施方案中，提供了一種用來激發(fā)針對HIV感染的強烈免疫應(yīng)答的重組體病毒。該重組體病毒包含異源于所述重組體病毒的、編碼來自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，該HIV抗原在宿主中的表達激發(fā)針對HIV抗原和表達HIV抗原的細胞的免疫應(yīng)答；和，編碼免疫刺激因子的、異源于所述重組體病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達能提高HIV抗原的免疫原性。在一個優(yōu)選的實施方案中，該重組體病毒是不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與HIV天然相關(guān)的惡性腫瘤。將所述的重組體病毒作為遺傳疫苗給予宿主，以誘導(dǎo)或者激發(fā)針對HIV感染的強烈且持久的免疫力。
與其它使用變性的或減毒HIV病毒體開發(fā)HIV疫苗的方法相比，可能通過與感染宿主的野生型HIV重組，本發(fā)明的方法在激發(fā)強烈免疫應(yīng)答但不產(chǎn)生HIV再活化危險方面將是更安全和更有效的。
依照本發(fā)明，由遺傳疫苗表達的HIV抗原可以是任何衍生自HIV病毒的抗原，如HIV表面蛋白，核心/衣殼蛋白，調(diào)節(jié)蛋白，酶蛋白和輔助蛋白。HIV表面蛋白的實例包括但不限于env基因的產(chǎn)物如gp120和gp41。HIV衣殼蛋白的實例包括但不限于gag基因的產(chǎn)物如Pr55gag被病毒編碼的蛋白酶PR所切割的產(chǎn)物成熟衣殼蛋白MA(p17)，CA(p24)，p2，NC(p7)，p1和p6。Herderson等.(1992)J.Virol.661856-1865。病毒調(diào)控蛋白的實例包括但不限于tat和rev基因產(chǎn)物Tat和Rev。病毒酶蛋白的實例包括但不限于pol基因的產(chǎn)物p11(蛋白酶或者PR)，p51(逆轉(zhuǎn)錄酶或者RT)和p32(整合酶或者IN)。病毒輔助蛋白的實例包括但不限于vif，vpr，vpx，vpu和nef基因的產(chǎn)物Vif，Vpr，Vpx，Vpu和Nef。
在一個實施方案中，HIVNef蛋白可以充當(dāng)由本發(fā)明重組體病毒表達的HIV抗原。例如，可以將編碼Nef的序列(例如，HIVBH10毒株8152-8523位置的nef序列和HIV pNL4-3毒株8787-9407位置的nef序列)插入到所述的載體中。
在另一個實施方案中，HIV Rev蛋白可以充當(dāng)由本發(fā)明重組體病毒表達的HIV抗原。例如，可以將編碼Rev的序列(例如，HIV pNL4-3毒株5969-6044位置的rev1序列和8369-8643位置的rev2序列)插入到所述的載體中。
在另一個實施方案中，全長HIV Gag蛋白可以充當(dāng)由本發(fā)明重組體病毒表達的HIV抗原。例如，可以將編碼Gag的序列(例如，HIVBH10毒株112-1650位置的gag序列和HIV pNL4-3毒株790-2292位置的gag序列)插入到所述的載體中。
或者，來自HIV Gag蛋白的衣殼蛋白(如p24 CA)可以充當(dāng)由本發(fā)明重組體病毒表達的HIV抗原。例如，可以將編碼p24CA的序列(例如，HIV BH10毒株1186-1878位置的序列和HIV pNL4-3毒株508-1200位置的序列)插入到所述的載體中。
在另一個實施方案中，由重組體病毒表達的HIV抗原衍生于env基因產(chǎn)物。例如，抗原衍生于Env蛋白。
根據(jù)此實施方案，可以用修飾或者誘變方法來缺失或者突變Env的一某區(qū)域來使其失去功能但是依然保留了其天然抗原性的中和表位。例如，可以缺失或者突變Env的蛋白水解加工位點以使其抵抗細胞蛋白酶切割以產(chǎn)生gp120和gp41片段。缺失或突變也可以在gp41的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域如TM、LLP-1和LLP2結(jié)構(gòu)域中進行。與野生型Env相比，突變的Env蛋白被整合到感染宿主的野生型HIV中的危險性和被HIV利用來實現(xiàn)其促進目的-破壞宿主的免疫系統(tǒng)的危險性應(yīng)該被降低了。
例如，可以用下列途徑來修飾野生型HIV Env。可以用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI來消化來自HIV BH10毒株并且包含Env、Tat和Rev編碼序列的野生型gp120序列，以產(chǎn)生始于核苷酸5101、止于核苷酸8252的片段?？梢酝ㄟ^缺失來自HIV BH10毒株7848-8150位置和pNL4-3毒株8610-8785位置的編碼序列的核苷酸來去除Env的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?？梢酝ㄟ^缺失HIV BH10毒株7101-7112位置和pNL4-3毒株7736-7747位置的編碼氨基酸序列REKR的12個核苷酸來去除Env的切割位點。
同樣根據(jù)本實施方案，修飾的Env蛋白可以在不含有中和表位的區(qū)域包含缺失。例如，可以缺失gp120的V1和V5結(jié)構(gòu)域而不需要喪失gp120的天然抗原性。同樣可以缺失不含有中和表位的gp120的V2和V3結(jié)構(gòu)域部分。雖然已經(jīng)在V3結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了主要中和結(jié)構(gòu)域(PND)，但是也發(fā)現(xiàn)gp120的V2和C4結(jié)構(gòu)域也含有中和表位。在各種HIV的毒株和進化枝中，中和表位的氨基酸序列是可變的。但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)變化的數(shù)量是高度受限制的。因此，應(yīng)該很容易確定不含有中和表位的序列。
例如，可以在HIV BH10毒株的5961-6032位置和pNL4-3毒株的6602-6673位置缺失編碼Env V1區(qū)域的序列?？梢栽贖IV BH10毒株的6060-6161位置和pNL4-3毒株的6700-6796位置缺失編碼Env V2區(qū)域的序列。任選地，可以在HIV BH10毒株的5961-6161位置和pNL4-3毒株的6602-6796位置同時缺失編碼Env V1和V2區(qū)域的序列。
或者，所述重組體病毒表達的HIV抗原可以是包含一個或者多個選擇的可變(V)和/或保守(C)結(jié)構(gòu)域的gp120的亞單位。例如，HIV抗原可以是包含V2，V3和C4結(jié)構(gòu)域，或者V3和C4結(jié)構(gòu)域的gp120亞單位。V3結(jié)構(gòu)域中中和表位的位置為人所熟知。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)V2和C4結(jié)構(gòu)域的中和表位分別位于163和200殘基之間，和大約420和440之間。另外，用于抗體結(jié)合的殘基還包括V2結(jié)構(gòu)域中的殘基171，174，177，181，183，187，188，以及C4結(jié)構(gòu)域中的殘基429和432。Berman等.(1999)Virology2651-9；和Berman(1998)AIDS Res.Human Retroviruses 15115-132。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的重組體病毒所表達的HIV抗原可以是在糖基化位點具有缺失和/或突變的修飾的Env蛋白。HIV-1的gp120含有用于N-聯(lián)糖基化作用(Asn-X-Ser/Thr)的24個潛在位點；這24個糖基化基序中大約有13個在不同的病毒分離物中是保守的。對HIV-1 Env gp蛋白的分析已經(jīng)證明，24個潛在的糖基化位點中有17個是被糖類側(cè)鏈修飾的。Mizuochi等.(1990)J.Biol.Chem.2658519-8524；和Leonard等.(1990)J.Biol.Chem.26510373-10382。由于Env gp蛋白的廣泛糖基化作用，gp120肽骨架中只有很少的區(qū)域從糖類部分中突出。已經(jīng)在非中和表位中發(fā)現(xiàn)了一些糖基化位點，這些非中和表位弱化了針對真正中和表位的免疫力或者作為假表位。因此，缺失或者突變這些糖基化位點可能會通過暴露真正的中和表位而提高抗原的免疫力。
在另一個實施方案中，可以通過本發(fā)明的相同重組體病毒來表達不同的HIV抗原。例如，可以從相同的啟動子如CMV即早啟動子、經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體-受體機制同時表達Env、Tat和Rev蛋白。任選地，全長、截短或者修飾形式的HIV Gag蛋白(如衣殼蛋白p24)還可以與其它HIV抗原如Env、Tat和Rev一起表達。另外，還可以將這些HIV抗原與單獨或者多拷貝的免疫刺激因子(例如IL-2，IL-12，INF-γ，和GM-CSF)、通過相同的重組體病毒載體一起表達。
例如，可以將編碼HIV抗原的序列插入到腺病毒載體的E1區(qū)域并經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體-受體機制或IRES機制從CMV即早啟動子表達?？梢詫⒕幋a免疫刺激因子的序列插入到相同腺病毒的E4區(qū)域并經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體-受體機制或IRES機制從另一個CMV即早啟動子表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明重組體病毒中編碼HIV抗原的序列是包含來自不同HIV病毒毒株、分離物和/或進化枝序列的嵌合體抗原。HIV毒株是分離自個體(分離物)、被表征并被給予了毒株名稱的HIV(例如，MN，LAI)。由于HIV的異質(zhì)性，沒有兩個分離物是完全相同的。一組相關(guān)的HIV分離物是根據(jù)其遺傳類似度如其包膜蛋白來分類的。目前存在兩組HIV分離物M和O。M組由至少9個進化枝(也稱為亞型)組成A-I。O組可能由類似數(shù)目的進化枝組成。進化枝在遺傳上不同，但是都有傳染性。據(jù)信通過在本發(fā)明遺傳疫苗的設(shè)計中使用嵌合體HIV抗原，所產(chǎn)生的疫苗應(yīng)該更能刺激產(chǎn)生針對更廣譜“野生型”HIV毒株的抗HIV抗體和HIV特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)。
在一個實施方案中，重組體病毒中的嵌合體HIV抗原所包含的抗原來自多個HIV進化枝，包括進化枝A(登記號HIV-1 92UG037WHO.0108HED)，B(登記號pNL4-3)，C(登記號HIV-1 92BR025WHO.109HED)，D(登記號HIV-1 92UG024.2)，E(登記號HIV-1 93TH976.17)，F(xiàn)(登記號HIV-1 93BR020.17)，和G(登記號HIV-1 92RU131.9)。任選地，可以將來自不同進化枝的HIV抗原的限制性片段(如AvaI片段)的多個重復(fù)，頭尾相接地連接起來以產(chǎn)生更復(fù)雜的嵌合體HIV抗原。
例如，腺病毒載體可以作為嵌合體HIV抗原被構(gòu)建到多個進化枝的V3環(huán)。任選地，來自多個進化枝的、gp41缺失的HIV抗原可以作為嵌合體HIV抗原?；蛘?，來自多個進化枝的、V1和V2環(huán)從進化枝B(pNL4-3)缺失的HIV抗原可以作為嵌合體HIV抗原。
還任選地，可以將編碼氨基酸序列SWLLLLLLSLSLLQATDFMSL[SEQ ID NO9]的人基因Thy-1 GPA錨定序列添加到所述的重組體病毒構(gòu)建體中。
在另一個實施方案中，所述的嵌合體HIV抗原包含Env蛋白，該蛋白含有衍生于不同HIV病毒毒株、分離物和/或進化枝的gp120的可變和恒定結(jié)構(gòu)域。例如，可以將來自M組進化枝B的V2結(jié)構(gòu)域與來自O(shè)組進化枝C的V3和C4結(jié)構(gòu)域混合，以產(chǎn)生嵌合體HIV抗原。用這樣的嵌合體抗原來接種個體，可以用交叉進化枝活性來刺激CTLs。換句話說，這些CTLs可以識別并殺死被不同進化枝HIV感染的靶細胞。
或者，重組體病毒可以表達多個HIV抗原，每個抗原分別來自HIV的不同毒株、分離物或者進化枝。例如，可以將來自不同HIV進化枝的env基因克隆到重組體病毒中并串聯(lián)表達以在宿主細胞中產(chǎn)生來自這些進化枝的各種Env蛋白。據(jù)信，在宿主細胞中表達來自不同HIV毒株、分離物或者進化枝的不同Env蛋白，將增強本發(fā)明遺傳疫苗刺激產(chǎn)生針對更廣譜“野生型”HIV毒株的抗HIV抗體和HIV特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)的能力。用這種疫苗接種的宿主能夠獲得針對各種HIV毒株感染的免疫力。
通過使用本發(fā)明的遺傳疫苗，沒有被HIV感染的個體可以獲得針對HIV的免疫。對于已被HIV感染的個體，所述疫苗也可以增強他們的免疫應(yīng)答并協(xié)助對抗此致命病毒。由于該遺傳疫苗可以同時表達高水平的抗原和/或多種HIV糖蛋白和衣殼蛋白，被接種的個體應(yīng)該能夠獲得針對各種HIV毒株如HIV-1和HIV-2的免疫力。另外，由于遺傳疫苗能夠表達高水平的細胞因子以模仿機體對天然病毒感染的應(yīng)答，所以機體對這種針對HIV的遺傳疫苗的免疫應(yīng)答應(yīng)該是強烈且持久的，從而實現(xiàn)針對此致命病毒的終生免疫。
4.針對肝炎病毒的遺傳疫苗本發(fā)明的遺傳疫苗還致力于解決針對肝炎病毒如肝炎A，B，C，D，和E型病毒的有效疫苗的需求。依照本發(fā)明，所述的遺傳疫苗可以是其病毒基因組攜帶一個或者多個來自肝炎病毒抗原如肝炎病毒糖蛋白和核心蛋白的重組體良性病毒。這些HIV抗原的序列可以是被修飾的，如缺失了肝炎糖蛋白或者核心蛋白致病區(qū)域。
特別是，本發(fā)明的重組體病毒可以被用作使個體獲得針對乙肝病毒感染的免疫力的疫苗。病毒性乙型肝炎是由肝炎B型病毒(HBV)引起的。據(jù)估計HBV已經(jīng)在全世界感染了4億人，這使HBV成為最常見的人類病原體之一。人類最常見的癌癥之一-肝癌(HCC)主要就是由慢性HBV感染所致。
HBV在嗜肝DNA病毒科中是主要為雙鏈的DNA病毒。雖然其病毒粒子主要包含DNA，但是由于其緊湊的形式、使用重疊的讀碼框和依靠逆轉(zhuǎn)錄酶步驟，HBV基因組在所有病毒中是獨特的。HBV基因組具有4個基因pol，env，前核和X，其分別編碼病毒DNA聚合酶，包膜蛋白，前核蛋白(被加工成病毒衣殼)和蛋白X。蛋白X的功能尚不清楚，但是它可能參與宿主細胞基因的活化和癌癥的形成。
HBV感染的診斷通?；谘鍖W(xué)。事實上，所有被HBV感染的個體都有可檢測得到的血清肝炎表面抗原(HBsAg)。盡管針對HBV感染的疫苗已經(jīng)獲得了顯著的成功，但是它仍然是正在進行的任務(wù)。在Eddleston中可以發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代肝炎疫苗的綜述，包括許多主要參考文獻。The Lancet，1142頁，1990年5月12日.也參見Viral Hepatitis and Liver Disease，Vyas，B.N.，Dienstag，J.L.，和Hoofnagle，J.H.，編輯.，Gruneand Stratton，Inc.(1984)和Viral Hepatitis and Liver Disease，Proceedings of the 1990International Symposium，編輯F.B.Hollinger，S.M.Lemon和H.Margolis，由Williams和Wilkins發(fā)表。根據(jù)本發(fā)明，所述的病毒抗原可以是乙肝病毒的表面抗原或核心蛋白如小乙型肝炎表面抗原(SHBsAg)(也稱澳大利亞抗原)、中乙型肝炎表面抗原(MHBsAg)和大乙型肝炎表面抗原(LHBsAg)。
可以用所述的重組體病毒表達不同HBV類型的抗原如亞洲C型和美洲A型，以激發(fā)針對這些HBV類型的免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^本發(fā)明重組體病毒來分別地或者組合(HBsAg+HBcAg)地表達HBV表面抗原(HBsAg)或者核心抗原(HBcAg)。
例如，可以將編碼多個HBV抗原的序列插入到腺病毒載體的E1或者E4區(qū)，并且經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體-受體機制或者IRES機制從CMV即早啟動子表達。另外，可以將這些HBV抗原與一種或者多種單獨或者多拷貝的免疫刺激因子如IL-2，IFN-γ和GM-CSF組合在一起表達?？梢詫⒕幋a這些細胞因子的序列插入到?jīng)]有被抗原序列占據(jù)的E1或者E4區(qū)域，并經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體-受體機制或IRES機制從另一個CMV即早啟動子表達。
具體的插入組合包括但不限于HBsAg+HBcAg；HBsAg+HBcAg+IL-2；HBsAg+HBcAg+IFN-γ+GMCSF；和HBsAg+IFN-γ+IFN-γ+GMCSF。
可以將編碼免疫刺激因子的序列插入到相同腺病毒載體的E4區(qū)域，并經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體-受體機制或IRES機制從另一個CMV即早啟動子表達。
同樣根據(jù)本發(fā)明，病毒抗原可以是丙肝病毒的表面抗原或者核心蛋白如NS3，NS4和NS5抗原。
例如，可以將編碼一個或多個HCV抗原的序列插入到腺病毒載體的E1或者E4區(qū)，并且單獨或者與一種或者多種單獨或者多拷貝的免疫刺激因子如IL-2，IL-12，IFN-γ和GM-CSF組合在一起表達。
具體的組合包括但不限于(1)HCV野生型E2+野生型E1；(2)HCV核心；(3)HCV E2+E1+核心；(4)HCV E2+E1+核心+IL-2；(5)HCV E2+E1+核心+IL-2+IFN-γ+GM-CSF；和(6)HCVE2+E1+核心+IL-2+IFN-γ+IL-12。
在另一個實施方案中，可以將多個拷貝的HIV E1和E2的超可變區(qū)(HVR)例如5個拷貝的HVR(5×HVR)作為重組體病毒的病毒抗原，并且可以將他們單獨地表達或者與一個或者多個單獨或多拷貝的免疫刺激因子如IL-2，IL-12，IFN-γ和GM-CSF組合在一起表達。
具體的組合包括但不限于(1)E2-5×HVR+E1；(2)E2-5×HVR+E1+IL-2；(3)E2-5×HVR+E1+核心+IL-2；(4)E2-5×HVR+E1+核心+IL-2+IFN-γ+GM-CSF；和(5)E2-5×HVR+E1+核心+IL-2+IL-12。
通過使用本發(fā)明的遺傳疫苗，沒有被肝炎病毒感染的個體可以獲得針對肝炎病毒的免疫。對于已被肝炎病毒感染的個體，所述疫苗也可以用于增強他們的免疫應(yīng)答并協(xié)助對抗肝炎病毒。由于該遺傳疫苗可以同時表達高水平的抗原和/或多種肝炎糖蛋白和核心蛋白，被接種的個體應(yīng)該能夠獲得針對各種毒株和/或類型肝炎病毒如肝炎病毒A，B，C，D，和E型的免疫力。另外，由于遺傳疫苗能夠表達高水平的細胞因子以模仿機體對天然病毒感染的應(yīng)答，所以機體對這種針對肝炎病毒的遺傳疫苗的免疫應(yīng)答應(yīng)該強烈且持久，從而實現(xiàn)針對肝炎病毒的終生免疫。
5.針對埃博拉病毒的遺傳疫苗本發(fā)明的遺傳疫苗還致力于解決針對埃博拉致命病毒的有效疫苗的需求。依照本發(fā)明，所述的遺傳疫苗可以是其病毒基因組攜帶一個或者多個來自埃博拉病毒的抗原如埃博拉病毒糖蛋白(如GP1和GP2)的重組體良性病毒。這些埃博拉抗原的序列可以是被修飾的，如缺失了埃博拉病毒的免疫抑制區(qū)域和/或其它致病區(qū)。
埃博拉病毒是已知的對人類最致命病毒中的一種，致死率高達90％。Johnson，K.M.，Ann Intern Med 91(1)117-9(1979)。埃博拉病毒感染的受害者會經(jīng)歷可怕的出血性疾病，往往在幾天內(nèi)死亡。該病毒的天然貯主還不清楚，感染的具體發(fā)病機制也不清楚。該病毒對肝細胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細胞如巨噬細胞具有特殊的向性。該疾病的一個標記特征是肝臟受到大規(guī)模破壞。
盡管埃博拉病毒感染很少見，但是公共衛(wèi)生官員很關(guān)注，因為該疾病可能會成為國際流行病，因為埃博拉病毒很容易通過人體接觸而傳染并且傳染性特別強。由于現(xiàn)代旅游的廣泛和快速，近來在非洲爆發(fā)的那些疾病也可能在發(fā)達國家發(fā)生。近來在非洲發(fā)現(xiàn)的埃博拉病毒感染個例發(fā)出了強烈預(yù)警應(yīng)該為預(yù)防這種極度危險感染性疾病做好準備。另外，如果被恐怖國家或者恐怖組織用作生物武器，埃博拉病毒將是一種極大的潛在威脅。在病毒感染的多數(shù)病例中，對埃博拉病毒爆發(fā)的最好處理途徑是接種疫苗。但是，目前尚沒有針對埃博拉病毒感染的有效疫苗或者可用的方法。
埃博拉病毒是包膜的、負鏈RNA病毒，其屬于絲狀病毒科。有三種絲狀病毒毒株埃博拉、馬爾堡和Reston。埃博拉病毒可以以多種不同的方式進入體內(nèi)，例如由于該病毒可以由通過空氣傳播的顆粒攜帶，所以它可以通過空氣進入的開口進入體內(nèi)；其還可以通過其它皮膚中的開口如傷口進入體內(nèi)。
埃博拉病毒具有編碼所有病毒結(jié)構(gòu)蛋白(核蛋白、基質(zhì)蛋白VP24和VP40)、非結(jié)構(gòu)蛋白(VP30，VP35)和病毒聚合酶的非分段的RNA基因組。Peters，C.J.，West JMed164(1)36-8(1996)。在這些病毒蛋白中，包膜糖蛋白(GP)以兩種形式存在由轉(zhuǎn)錄編輯產(chǎn)生的分泌形式糖蛋白(50-70kDa)和跨膜糖蛋白(130-170kDa)。Sanchez，A.等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，93(8)3602-7(1996)。盡管這兩種類型的GP共有295個氨基酸的同源性，它們卻具有不同的結(jié)合特性，這表明它們在病毒感染的過程中起著不同的作用。分泌的糖蛋白(sGP)是由被感染的細胞所合成并分泌的主要類型。它可能在抑制宿主免疫系統(tǒng)中起作用(Yang，Z.，等.，Science 279(5353)1034-7(1998))并且可以作為假目標來使病毒顆粒避開中和抗體，原因在于兩種類型的GPs部分具有它們的抗原性。對來自扎伊爾的埃博拉病毒幸存者中所獲得的單克隆抗體進行分析，結(jié)果表明它們的極大多數(shù)特異于sGP，只有很少與GP弱結(jié)合。Maruyama，T.，等.，J Infect Dis，.179Suppl 1S235-9(1999)，Maruyama，T.，等.，J Virol，73(7)6024-30(1999)。盡管對sGP可抑制免疫系統(tǒng)的確切機制尚不清楚，但是在感染早期合成的大量sGP很可能是抑制被感染位點嗜中性粒細胞浸潤的原因(Yang，Z.，等.，Science 279(5353)1034-7(1998))和被埃博拉病毒感染的患者缺乏體液免疫應(yīng)答的原因。Baize，S.，等.，Nat Med，5(4)423-6(1999)。這種蛋白還可以超活化那些能夠引起大規(guī)模血管內(nèi)凋亡-主要是使免疫系統(tǒng)關(guān)閉的許多類型的免疫細胞。Baize，S.，等.，Nat Med，5(4)423-6(1999)。sGP對埃博拉病毒生命周期的重要性也由它出現(xiàn)在迄今為止調(diào)查過的所有埃博拉病毒毒株中而得到提示。Feldmann，H.，等.，Arch Virol Suppl，15159-69(1999)。
膜糖蛋白負責(zé)使病毒顆粒黏附并穿透靶細胞，這一過程通過與受體結(jié)合和病毒-細胞膜融合來實現(xiàn)。Wool-Lewis，等.，J.Virol，72(4)3155-60(1998)，Ito H.，等.，J.Virol，73(10)8907-12(1999)。它們被合成為單肽前體并被細胞酶(弗林蛋白酶或者組織蛋白酶B)切割成兩個成熟類型GP1和GP2。這兩種GPs通過一個二硫鍵鍵合保持聯(lián)系并且通過一個跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域保持錨定到病毒膜中。Ito H.，等.，J.Virol，73(10)8907-12(1999)；Malashkevich，V.N.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，96(6)2662-7(1999)。蛋白水解切割位點由4-5個堿性氨基酸殘基組成，這些殘基類似于那些發(fā)現(xiàn)于逆轉(zhuǎn)錄病毒、流感病毒和副粘病毒GPs中的殘基。Garten，W.，等.，Biochimie，76(3-4)217-25(1994)。切割事件對于病毒傳染性是必需的，而且其可能是通過與切割逆轉(zhuǎn)錄病毒或者流感病毒GPs相同的酶來執(zhí)行的。Garten，W.，等.，Biochimie，76(3-4)217-25(1994)；Volchkov，V.E.，等.，Virology，245(1)110-9(1994)。另外，埃博拉病毒GP可以與逆轉(zhuǎn)錄病毒和流感病毒糖蛋白介導(dǎo)的病毒感染具有共同的機制。Weissenhorn，W.，等.，Mol Membr Biol，16(1)3-9(1999)。由于膜結(jié)合的GPs在發(fā)動病毒感染中起著關(guān)鍵作用，而且其還是暴露于病毒顆粒表面的主要蛋白，因此它們是中和針對病毒的抗體的主要靶目標。
埃博拉病毒能夠抑制宿主的免疫系統(tǒng)，這一特性使得它們對宿主來說是致命的。對死于埃博拉病毒感染的患者的血清學(xué)分析揭示沒有體液或者細胞免疫應(yīng)答跡象。Baize，S.，等.，Nat Med，5(4)423-6(1999)。與此相反，在一些少數(shù)存活者中查到了針對病毒蛋白抗體和病毒特異性T細胞活性。Baize，S.，等.，Nat Med，5(4)423-6(1999)。盡管現(xiàn)在還不清楚免疫抑制的機理，但是高水平的sGP和GP中的免疫抑制肽很可能是導(dǎo)致埃博拉病毒感染患者體內(nèi)缺乏體液和細胞免疫應(yīng)答的原因。
負責(zé)埃博拉病毒初始感染的蛋白是病毒糖蛋白。因此，它們是中和抗體的靶目標。但是，埃博拉病毒已經(jīng)演化出了防止或者延緩宿主免疫應(yīng)答的“策略”，直到感染已經(jīng)無法恢復(fù)。生產(chǎn)針對埃博拉病毒的疫苗的傳統(tǒng)方法通常沒有效果，這可能是由于下列原因(1)在細菌、酵母或者昆蟲細胞中產(chǎn)生的病毒糖蛋白沒有被正確地糖基化，因此不具有病毒蛋白的真正抗原性；(2)埃博拉病毒太危險，無法大批量生產(chǎn)滅活的病毒疫苗；和(3)滅活病毒的操作過程往往破壞了蛋白的構(gòu)象，因此改變了它們的抗原性。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，重組體病毒疫苗具有編碼一個或多個埃博拉病毒抗原的核酸序列。埃博拉病毒(包括扎伊爾毒株)的限制性圖譜和全長序列信息可以在基因庫中得到。
所述的遺傳疫苗是重組體良性病毒，其是復(fù)制缺陷或者不能復(fù)制的，因此不會傳播到最初被感染細胞之外。例如，即使埃博拉病毒蛋白與重組體病毒功能不具有相關(guān)性，本發(fā)明的重組體腺病毒疫苗也能介導(dǎo)埃博拉病毒抗原高水平表達兩周或更多周的時間。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，重組體病毒表達一種或者多種修飾的埃博拉病毒抗原。被修飾的埃博拉病毒抗原優(yōu)選為埃博拉病毒包膜糖蛋白和/或其免疫活性部分。優(yōu)選地，所述的糖蛋白是修飾的GP和sGP糖蛋白。埃博拉病毒的GP和sGP糖蛋白被修飾以破壞其致病功能和免疫抑制功能，但卻保留了其大部分天然抗原性，這是由于它們被表達、折疊、糖基化并被靶向可以被埃博拉病毒大量感染的細胞內(nèi)的細胞的膜。所述的修飾是使用標準的分子遺傳操作技術(shù)如限制性消化和聚合酶鏈式反應(yīng)進行的。
對埃博拉病毒包膜糖蛋白的優(yōu)選修飾作用破壞了埃博拉病毒GP的感染功能?？梢允褂萌魏纹茐陌２├《靖腥竟δ艿男揎椬饔茫莾?yōu)選的修飾作用是在GP的切割位點缺失5個氨基酸。見實施例1。該切割位點由5個堿性氨基酸組成，從讀碼框開始的位置501RRTRR?？梢杂肞CR擴增來將所述的缺失引入埃博拉病毒GP的cDNA，該技術(shù)在本領(lǐng)域為人所熟知。
另一個對埃博拉病毒基因組的優(yōu)選修飾作用防止了sGP的合成?？梢允褂萌魏畏乐惯@種合成的修飾作用。優(yōu)選地，這種修飾作用將RNA編輯位點從UUUUUUU變成UUCUUCUU。見實施例1。
另一個對本疫苗中使用的埃博拉病毒抗原的優(yōu)選修飾作用是修飾位于GP2的免疫抑制(IS)肽。所述的IS肽基序位于氨基酸585-609。氨基酸590-600之間的10個氨基酸缺失會使其失去功能。第二，翻轉(zhuǎn)并復(fù)制IS肽基序的每一半。見圖2。這進一步確保了其功能被破壞并且也增加了其抗原性。
此外，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，很容易生產(chǎn)出編碼本發(fā)明埃博拉病毒抗原的核苷酸序列的變體或者衍生物，這些變體或衍生物改變了所述編碼蛋白的氨基酸序列。雖然被改變的表達抗原可以具有改變的氨基酸序列，但是其仍然激發(fā)與埃博拉病毒抗原反應(yīng)的免疫應(yīng)答，并且被認為是功能等價物。另外，也可以構(gòu)建編碼部分全長蛋白的全長基因片段。這些片段可以編碼激發(fā)與埃博拉病毒反應(yīng)的抗體的蛋白或者肽，并且被認為是功能等價物。
用本發(fā)明疫苗對個體進行接種導(dǎo)致腺病毒顆粒進入到了細胞內(nèi)，并且表達埃博拉病毒抗原如包膜糖蛋白以及免疫刺激因子。埃博拉病毒抗原在細胞中的表達會誘導(dǎo)強烈且持續(xù)的免疫應(yīng)答，就好像感染已經(jīng)發(fā)生一樣。所述的遺傳疫苗具有天然感染的所有免疫原性，包括天然病毒蛋白的表達和持久的抗原刺激，但是不具有真正病毒感染的致病性。在本發(fā)明的疫苗中，埃博拉病毒的免疫抑制機制的喪失，抗原以其天然形式存在并且與細胞膜相關(guān)聯(lián)，免疫刺激作用持續(xù)數(shù)周。這種新型疫苗的作用是持久的并且提供了針對埃博拉病毒感染的高保護率。
本發(fā)明還涉及對人進行免疫以使其免受埃博拉病毒感染的方法。該方法包括給藥上述的疫苗。將這些疫苗給予人體的方法在健康領(lǐng)域為人所熟知。
通過使用本發(fā)明的遺傳疫苗，個體可以獲得針對埃博拉病毒的免疫。由于所述的遺傳疫苗可以同時高水平地表達抗原和/或多種糖蛋白，被接種的個體應(yīng)該可以獲得針對各種毒株埃博拉病毒的免疫。另外，由于所述的遺傳疫苗可以表達高水平的細胞因子以模仿指向天然病毒感染的機體應(yīng)答，機體對這種指向埃博拉病毒的遺傳疫苗的免疫應(yīng)答應(yīng)該強烈且持久，從而獲得針對埃博拉病毒的終生免疫力。
6.制劑和給藥途徑本發(fā)明還涉及包含上述疫苗的藥物組合物，以及藥用稀釋劑、載體或者賦形劑載體。另外，所述疫苗還可以含有水性介質(zhì)或者含水混懸液，其通常與其它組分混合以增強其活性和/或貯藏期。這些組分可以是鹽、pH緩沖劑、穩(wěn)定劑(例如脫脂乳或者酪蛋白水解物)、乳化劑和防腐劑。
可以在所述的藥物組合物中加入佐劑以增強指向表達自所述重組體病毒的病毒抗原的免疫應(yīng)答。佐劑的實例包括但不限于胞壁酰二肽、氫氧化鋁、皂苷、聚陰離子、兩親物質(zhì)(anamphipatic substance)、卡介菌(BCG)、內(nèi)毒素脂多糖、鑰孔血藍蛋白(GKLH)、白細胞介素-2(IL-2)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GS-CSF)和環(huán)磷酰胺，環(huán)磷酰胺是一種據(jù)信能夠在低劑量給予的時候降低腫瘤誘導(dǎo)的抑制的化學(xué)治療劑。
本發(fā)明還提供了用來增強宿主對病原體免疫力的試劑盒。這些試劑盒可以包括依照本發(fā)明的任何一種或者多種疫苗，并結(jié)合了用來將疫苗傳送給宿主的組合物，和/或?qū)⒁呙鐐魉徒o宿主的裝置如注射器。
可以以傳統(tǒng)的主動免疫方案來給予依照本發(fā)明的疫苗以與劑量制劑相容的方式單獨或者重復(fù)地給予；所給予的劑量應(yīng)在疾病預(yù)防中有效，即免疫抗原或者重組體微生物的劑量能夠表達可以在人體中誘導(dǎo)出針對致病病毒或細菌激發(fā)的免疫力的抗原，所述的病毒如致病性強的埃博拉病毒，HIV，肝炎A、B、C、D和E型病毒和bacillus tuberculous。所述的免疫力被定義為與未被接種的人體相比，在接種以后誘導(dǎo)顯著水平的保護。
可以經(jīng)由任何藥用途徑將本發(fā)明的疫苗即重組體病毒給予宿主、優(yōu)選人受試者。給藥途徑包括但不限于肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、直腸、粘膜內(nèi)、口和腸胃外途徑給予。如果需要，可以結(jié)合使用給藥途徑，或者根據(jù)免疫所針對的致病病毒的類型或者想要保護的身體部位調(diào)整給藥途徑。
在影響所誘導(dǎo)免疫力的性質(zhì)以及保護程度方面，給藥途徑可能是特別重要的。例如，盡管腸胃外給藥可能只激活系統(tǒng)免疫應(yīng)答，但是經(jīng)口給予還能另外提供粘膜免疫應(yīng)答。本發(fā)明重組體病毒激發(fā)粘膜免疫的這種能力使其在粘膜和性傳播感染中有重要用途。
重組體病毒的劑量或者有效量可能依賴于下列因素，如疾病、所選擇的病毒或者細菌抗原、宿主的年齡、體重和健康程度；而且在不同宿主之間是可以變化的。通常，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，所要給予的病毒粒子數(shù)量依賴于例如疫苗給予的次數(shù)和所需應(yīng)答的水平。
給予個體的本發(fā)明重組體病毒的合適滴度應(yīng)該是這樣的滴度，其能夠調(diào)節(jié)針對病毒或者細菌抗原的免疫應(yīng)答并激發(fā)針對衍生抗原的致病病毒或者細菌的抗體。可以使用下面的測試方法確定有效的滴度利用在將疫苗給予個體后確定免疫效應(yīng)細胞的活性的檢測；或者通過在體內(nèi)使用為人熟知的診斷分析來監(jiān)測治療的效果。例如，本發(fā)明重組體腺病毒在預(yù)防學(xué)上的有效量或者劑量，可以是含有濃度大約1×104-1×108蝕斑形成單位(pfu)病毒/ml的、范圍在約100μl-約10ml之間的鹽水溶液。當(dāng)使用其它質(zhì)粒DNA載體的時候，優(yōu)選的劑量范圍是每次給予1-1000μg。初次免疫和加強免疫的劑量可以是相同的，或者與初次給予的劑量相比，改變在加強免疫階段給予的重組體病毒量的理想的。本發(fā)明重組體病毒接種物的劑量取決于或者依賴于具體重組體病毒的特有性質(zhì)和所要實現(xiàn)的特定免疫效應(yīng)，如技術(shù)人員所充分鑒別的。
7.增強宿主對病原體免疫力的方法本發(fā)明還提供了用上述的重組體病毒來提高宿主對病原體免疫力的方法。
在一個實施方案中，提供了增強宿主對致病病毒的免疫力的方法。該方法包括將重組體病毒以有效劑量給予宿主以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。該重組體病毒包含異源于所述良性病毒的、編碼來自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，該病毒抗原在宿主中的表達能激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答；和，編碼免疫刺激因子的、異源于所述良性病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達能提高所述病毒抗原的免疫原性。該重組體病毒是優(yōu)選不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
可以經(jīng)由任何藥用給藥途徑將所述的重組體病毒給予宿主?？梢越?jīng)由肌肉內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)、粘膜內(nèi)、直腸、口和腸胃外途徑對宿主給予重組體病毒。
在另一個實施方案中，提供了這樣的一種方法，該方法用多個抗原免疫宿主來抗致病病毒，所述抗原激發(fā)針對這多個抗原的強烈且持久的免疫應(yīng)答，從而使宿主獲得針對致病病毒的免疫力。該方法包括將重組體病毒以有效劑量給予宿主以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。該重組體病毒包含異源于該重組體病毒的多個抗原序列，每個序列編碼來自一個或多個致病病毒的不同病毒抗原，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，所述多個抗原序列的表達能夠在宿主中激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答。該重組體病毒可以優(yōu)選為不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
任選地，所述的重組體病毒還可以包含一個或者多個異源于所述重組體病毒的編碼免疫刺激因子的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達能夠增強病毒抗原的免疫原性。
在另一個實施方案中，提供了一種用多個遺傳疫苗或者病毒免疫使宿主抗致病病毒的方法。在多個重組體病毒中，每一個重組體病毒可以攜帶不同的抗原?？梢酝瑫r或者分步地將所述的多個重組體病毒給予宿主。
所述的方法包括以有效劑量給予宿主第一和第二重組體病毒以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的免疫應(yīng)答。第一重組體良性病毒包括異源于第一重組體病毒的、編碼來自致病病毒的病毒抗原的抗原序列，當(dāng)宿主被該重組體病毒感染的時候，該病毒抗原在宿主中的表達能激發(fā)針對所述病毒抗原和表達所述病毒抗原的細胞的免疫應(yīng)答。第二重組體病毒包含編碼免疫刺激因子的、異源于所述第二重組體病毒的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達能提高所述病毒抗原的免疫原性。所述的第一和第二重組體病毒可優(yōu)選是不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與致病病毒天然相關(guān)的惡性腫瘤。
根據(jù)此實施方案，所述的第一和第二重組體病毒可以是任何良性病毒，例如不能復(fù)制的腺病毒、腺相關(guān)病毒、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、Alpha病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒和痘苗病毒。任選地，第一和第二重組體病毒均可以是不能復(fù)制的腺病毒。同樣任選地，第一和第二重組體病毒中的一個可以是重組體腺病毒，另一個可以是重組體痘苗病毒。
在另一個實施方案中，提供了一種用來增強宿主對病原體免疫力的方法。該方法包括給予宿主重組體病毒和一個或多個免疫刺激因子。所述的重組體病毒可以是任何上述的重組體病毒。特別地，所述的重組體病毒含有一個或者多個異源于所述重組體病毒的、編碼來自該病原體的一個或多個抗原的抗原序列。當(dāng)宿主被所述重組體病毒感染的時候，所述抗原在宿主中的表達能夠激發(fā)針對所述抗原和表達所述抗原的細胞的免疫應(yīng)答。所述的重組體病毒優(yōu)選為不能復(fù)制的而且不會在宿主中引起與所述病原體天然相關(guān)的惡性腫瘤。所述的病原體可以是致病病毒如HIV、肝炎病毒和埃博拉病毒，致病細菌或寄生蟲。
根據(jù)此實施方案，所述的免疫刺激因子可以是任何這樣的分子，其能夠增強被所述重組體病毒感染的細胞所表達的抗原的免疫原性。優(yōu)選地，所述的免疫刺激因子是細胞因子，其包括但不限于白細胞介素-2，白細胞介素-8，白細胞介素-12，β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，粒細胞集落刺激因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子及其組合。
所述細胞因子可以以純化蛋白的方式被給予宿主，或者，可以將所述細胞因子以表達載體的方式給予宿主，該表達載體在轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細胞時能夠表達所述細胞因子的編碼序列。
根據(jù)所述方法的任何上述實施方案，所述方法還可以包括再次給予宿主所述的重組體病毒以增進免疫應(yīng)答。優(yōu)選在首次接種的幾周到幾個月后，再次使用重組體病毒進行這種加強接種。為了保證對感染持續(xù)高水平的保護作用或者保證對病原體感染引發(fā)疾病的有效治療作用，定期如每幾年進行一次再次給予宿主加強免疫是有益的。在加強免疫中所給予的重組體病毒可以與在初次免疫中所給予的重組體病毒相同，也可以不同。
同樣根據(jù)所述方法的任何上述實施方案，所述方法還可以包括給予宿主這樣的質(zhì)粒載體，該載體所編碼的抗原與所述重組體病毒所編碼抗原相同或者不同。該質(zhì)粒載體優(yōu)選為能夠在轉(zhuǎn)染宿主細胞時表達抗原的真核質(zhì)粒表達載體。
同樣根據(jù)所述方法的任何上述實施方案，所述方法還可以包括給予所述宿主第二重組體病毒以增進免疫應(yīng)答和/或使宿主免疫系統(tǒng)對重組體病毒的中和作用減到最低。
任選地，所述的第二重組體病毒包含來自第二病原體的第二抗原序列，其不同于在初次免疫中給予的第一重組體病毒所包含的第一抗原序列。優(yōu)選地，由所述的第二抗原序列編碼的抗原與由第一抗原序列編碼的抗原類型相同，但來自相同病原體的不同毒株、血清型、或者亞型/進化枝。或者，與第一抗原相比，所述的第二抗原可以是不同類型的抗原，例如，第一抗原是表面蛋白，而第二抗原是相同或者不同病原體的核心蛋白。
同樣根據(jù)所述方法的任何上述實施方案，所述方法還可以包括在給予宿主任何上述實施方案中的重組體病毒的之前、同時或之后，將病毒載體給予所述宿主，從而將宿主的免疫系統(tǒng)對所述重組體病毒的中和作用降到最低。優(yōu)選地，病毒載體的給予后于重組體病毒的給予。
所述的病毒載體可以是所述重組體病毒的天然后代。例如，病毒載體可以是野生型5型腺病毒(Ad5)，而重組體病毒是遺傳修飾的Ad5。
任選地，病毒載體可以不同血清型重組體病毒的野生型或者遺傳修飾的病毒。例如，重組體病毒可以是遺傳修飾的Ad5，而病毒載體是血清型不同于Ad5例如血清型1-4或者6-51的遺傳修飾的腺病毒載體。應(yīng)該注意，其它以后發(fā)現(xiàn)和/或分類的血清型也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
例如，重組體病毒是編碼一種或者多種異源抗原和/或免疫刺激因子的重組體Ad5，而病毒載體也可以是編碼相同或者不同抗原和/或免疫刺激因子但是血清型不同(例如Ad2，Ad4，Ad9，Ad12，Ad35和Ad40)的重組體腺病毒。據(jù)信這種血清型轉(zhuǎn)換提高了轉(zhuǎn)基因的表達并且增加了疫苗的免疫原性。為了驗證這種想法，可以首先將野生型非Ad5載體給予小鼠，注射三周后用ELISA測定抗腺病毒抗體的水平。隨后在首次注射后4-5周將編碼異源抗原(例如HBV核心蛋白)的重組體Ad5給予小鼠。在第二次注射后的4-5周，測定針對異源抗原(如HBV核心蛋白)的抗體的水平。
同樣任選地，病毒載體可以是與所述重組體病毒不同的病毒。例如，所述的重組體病毒可以是遺傳修飾的Ad5，而病毒載體是遺傳修飾的AAV、SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、Alpha病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎(VEE)病毒或痘苗病毒。該病毒載體可以含有也可以不含有異源抗原序列。優(yōu)選地，該病毒載體可以含有與所述重組體病毒攜帶的抗原序列相同或者不同的另一段抗原序列。
同樣任選地，病毒載體可以是基于重組體病毒的天然祖先進行了修飾的嵌合載體。例如，如果重組體病毒的天然祖先是5型腺病毒，那么病毒載體可以是嵌合5型腺病毒，其骨架的某些區(qū)域從5型變成了其它腺病毒血清型的相應(yīng)區(qū)域。據(jù)信該方法是有利的，這是因為當(dāng)僅骨架的一部分具有另一血清型的相應(yīng)部分時，克隆操作是容易進行的。這可以通過構(gòu)建穿梭載體實現(xiàn)，其方法是通過將Ad5纖維DNA包括進來并部分地或者全部地將Ad5纖維DNA與來自另一種血清型腺病毒的相應(yīng)部分進行交換。如圖62所示，構(gòu)建右穿梭載體pR-Ad.5/35-6m以用Ad35的纖維區(qū)取代Ad5的纖維區(qū)。此右穿梭載體可以與左穿梭載體以及Ad5骨架相結(jié)合以產(chǎn)生嵌合Ad5載體。
迄今為止，已經(jīng)鑒定出51種血清型的人腺病毒并將其分成6個亞組A-F。腺病毒進入細胞是分兩步進行的，其包括病毒經(jīng)由Ad纖維結(jié)黏附到膜；隨后是當(dāng)五鄰體基底RGD基序與細胞表面的ανβ3和ανβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合時的內(nèi)化。De Long等.(1999)J.Clin.Microbiol.373940；Sallusto等.(1994)J.Exp.Med.1791109；Huang等.(1995)J.Virol.692257-2263；和Mathias等.(1994)J.Virol.686811-6814。腺病毒纖維被認為是高效結(jié)合靶細胞的重要介質(zhì)。亞組C，Ad5纖維利用柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)來介導(dǎo)高親和力結(jié)合。Nemerow(1999)Mol.Biol.Rev.63725-734。在CAR-缺陷的細胞中，通過備選途徑發(fā)生的Ad5黏附效率要差得多，所述途徑涉及纖維與I類MHC重鏈α2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用；或者五鄰體與細胞整聯(lián)蛋白之間的相互作用。Bergelson等.(1997)Science2751320-1323。
腺病毒纖維可以被分為三個結(jié)構(gòu)域。保守的N末端尾部含有與五鄰體基底相關(guān)聯(lián)的序列。De Long等.(1999)J.Clin.Microbiol.373940。柱樣的纖維干含有6-23個形成β片層的重復(fù)。Davison等.(1999)J.Virol.734513。C末端包含球狀的結(jié)結(jié)構(gòu)域，纖維干和結(jié)都參與原發(fā)受體的相互作用。Huang等.(1996)J.Virol.704502。
根據(jù)本發(fā)明，例如，可以用腺病毒血清型1-4，和6-51骨架的相應(yīng)區(qū)域替代5型腺病毒骨架中的纖維結(jié)(即頭部)、干、和/或五鄰體基底(即尾部)。圖63顯示了具有被Ad35纖維區(qū)相應(yīng)結(jié)構(gòu)域取代了Ad5纖維區(qū)個體結(jié)構(gòu)域的嵌合載體的各種實施方案。優(yōu)選地，由于結(jié)結(jié)構(gòu)域被認為能夠決定受體-配體的相互作用，所以用來自另一血清型腺病毒的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域交換Ad5的纖維區(qū)的結(jié)結(jié)構(gòu)域。
例如，所述的重組體病毒是編碼一個或多個異源抗原和/或免疫刺激因子的重組體Ad5，而嵌合病毒載體也可以是編碼相同或者不同抗原和/或免疫刺激因子、但是具有來自不同血清型腺病毒(例如Ad2，Ad4，Ad9，Ad12，Ad35和Ad40)纖維區(qū)的重組體Ad5。據(jù)信這種血清型轉(zhuǎn)換提高了轉(zhuǎn)基因的表達并且增加了疫苗的免疫原性。為了驗證這種想法，可以首先將攜帶GFP的Ad5載體給予小鼠，注射后4周用ELISA測定抗GFP抗體的水平。隨后在首次注射后4-5周將另一個也攜帶GFP但是具有來自不同血清型腺病毒(例如Ad9，Ad11或者Ad35)的纖維區(qū)的重組體Ad5給予小鼠。在第二次注射后的4-5周，測定針對GFP的抗體的水平。
上述的方法也可以用來預(yù)防或者治療疾病。在治療方法中，給予本發(fā)明的重組體病毒可以用于“預(yù)防”或者“治療”目的。當(dāng)用來預(yù)防的時候，可將所述的重組體病毒在任何癥狀呈現(xiàn)之前提供給患者。預(yù)防性給予所述的重組體病毒可用來預(yù)防或者改善任何后來的感染或疾病。當(dāng)用來治療的時候，可以在感染或者疾病癥狀呈現(xiàn)之時(或者之后)提供該重組體病毒。因此，可以在下列情況下提供本發(fā)明在預(yù)計到將要被暴露于引發(fā)疾病制劑以前，或者在感染或疾病開始和/或進展之后。
應(yīng)該注意的是，本發(fā)明的創(chuàng)新方法也可被用于癌癥疫苗的構(gòu)建。例如，可以用編碼腫瘤特異性抗原的序列替代任何上述重組體病毒實施方案及其使用方法中編碼病毒抗原的抗原序列。在宿主中表達腫瘤特異性抗原應(yīng)該能激發(fā)特異的免疫應(yīng)答，以防止患者癌癥發(fā)展增加的風(fēng)險(即預(yù)防性免疫)或者聯(lián)合其它治療來增進癌癥治療、預(yù)防首次手術(shù)后的疾病復(fù)發(fā)(抗轉(zhuǎn)移接種)、或者作為擴大體內(nèi)CTL數(shù)量的工具，從而提高其根除擴散腫瘤的效力(治療已經(jīng)被確立的疾病)。另外，本發(fā)明的方法可以在患者中激發(fā)免疫應(yīng)答，其在被傳遞回腫瘤攜帶者之前在離體情況下已經(jīng)得到了提高(即過繼免疫治療)。
同樣根據(jù)本方法的任何上述實施方案，所述的方法還可以包括在給予重組體病毒以后，收集宿主的血清。所收集的血清應(yīng)該含有針對所述重組體病毒編碼的抗原的抗體。任選地，所述的方法還包括在給予重組體病毒以后，從宿主分離針對病原體的一種抗體或多種抗體?？梢詫⑺斋@的血清或者被分離的抗體存儲一段時期以另外應(yīng)用。例如，可以將一個健康的志愿者作為宿主，在預(yù)期病原體感染后或處于病原體感染過程中，將從他/她那里收集的血清或抗體作為通過激發(fā)針對病原體的被動免疫而作為預(yù)防或治療劑給回他/她自身或者給予另一個不同的人。任選地，所述的宿主可以是非人動物，而且從被重組體病毒免疫的動物那里所收獲的血清或者所分離的抗體可以被用作預(yù)防或治療劑來治療預(yù)期病原體感染或處于病原體感染如爆發(fā)生物戰(zhàn)的人或非人動物。
應(yīng)該注意到，任何上述包含在重組體病毒中的抗原和免疫刺激因子的DNA序列，都可以被改變和修飾而仍然保持所述突變體的相同功能。例如，可以用要被免疫的宿主例如人所優(yōu)選的密碼子來代替上述抗原的野生型密碼子?？梢灾苽浜铣傻亩嗪塑账岫蛊浒ā叭嗽椿笨乖膬?yōu)選密碼子。這種人源化的過程是有利的，這是因為由于通過使用了優(yōu)選的密碼子，所以重組體病毒所表達的抗原的翻譯效率得以顯著提高，其反過來在宿主中引起更高水平的體液和/或細胞免疫應(yīng)答。所有上述的突變體應(yīng)該屬于本發(fā)明的范圍。
核酸內(nèi)切酶消化、連接和電泳的標準步驟依照生產(chǎn)商或者供應(yīng)商的說明書進行。標準技術(shù)在這里不再詳述而且為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。除非另外說明，本發(fā)明的實際操作使用本領(lǐng)域中的常規(guī)病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有詳述。參見例如Sambrook，等.Molecular CloningA laboratory Manual；DNA CloningAPractical Approach，卷I & II(D.Glover編輯)；Oligonucleotide Synthesis(N.Giat，編輯)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins，編輯，現(xiàn)行版)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins，編輯.，現(xiàn)行版)；Fundamental Virology，第二版，卷.I & II(B.N.Fields和D.M.Knipe，編輯)。
以下提供了實施例以描述本發(fā)明的內(nèi)容，但是并不能認為本發(fā)明只限于這些實施例。
實施例對下面步驟的描述闡明了如何制備本發(fā)明的針對各種致病病毒的遺傳疫苗。所述的遺傳疫苗基于腺病毒載體，具有衍生于致病病毒(例如埃博拉病毒、乙肝病毒和HIV)的修飾的抗原，其被插入到腺病毒骨架中。另外，所述的重組體腺病毒還攜帶編碼各種細胞因子的多個基因。所述的重組體腺病毒是不能復(fù)制的，但是依然保留了腺病毒的傳染性。
應(yīng)該注意的是，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還可以遵照以下詳細描述的類似程序來構(gòu)建針對其它致病病毒、細菌和寄生蟲的遺傳疫苗。
1.針對埃博拉病毒的遺傳疫苗以下詳細描述了針對埃博拉病毒的遺傳疫苗，以及構(gòu)建它們的方法的實施方案。
1)埃博拉病毒膜糖蛋白的遺傳修飾使用標準的分子遺傳操作技術(shù)如限制性內(nèi)切酶消化和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)來執(zhí)行所述的修飾作用。
對埃博拉病毒的糖蛋白進行修飾以產(chǎn)生適用于埃博拉病毒疫苗的最適抗原。構(gòu)建兩種修飾類型的GP蛋白，使其具有滅活的免疫抑制和傳染機制但是保留了野生型糖蛋白的天然抗原性。(1)、缺失mRNA編輯信號以防止產(chǎn)生免疫抑制的分泌形式糖蛋白(sGP)；和(2)、缺失糖蛋白前體的蛋白水解切割位點以防止功能性糖蛋白(GP1和GP2)的形成。Sanchez，A.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.93(8)3602-7(1996)。在一種類型中，缺失了免疫抑制肽區(qū)域以防止其功能；在另一種類型中，免疫抑制肽基序被分開以破壞其功能但保留了其免疫原性。這些步驟產(chǎn)生了用于所述疫苗的有效且安全的抗原。
埃博拉病毒的包膜糖蛋白(GP)被合成為一個單獨的前體蛋白并在轉(zhuǎn)運過程中被細胞酶(弗林蛋白酶)切割成兩個亞單位(GP1和GP2)。Volchkov，V.E.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，95(10)5762-7(1998)。這種蛋白水解切割對于成熟糖蛋白的形成和位于切割位點C末端的融合肽的釋放是必需的。成熟的糖蛋白作為三聚體被整合到病毒粒子中(每個單體是通過二硫鍵連接的GP1和GP2的異源二聚體)Sanchez，A.，等.，J.Virol72(8)6442-7(1998)。埃博拉病毒的糖蛋白是暴露于病毒膜表面的主要蛋白，而且負責(zé)引發(fā)病毒進入宿主細胞。因此，它們是中和抗體的主要目標。
糖蛋白切割位點由從讀碼框起始位點開始的501位置的5個堿性氨基酸殘基組成(RRTRR[SEQ ID NO10])。埃博拉病毒的糖蛋白切割位點與發(fā)現(xiàn)在其它病毒糖蛋白如RSV或者MuLV的包膜糖蛋白中的保守序列類似。我們以前已經(jīng)顯示，缺失或者點突變這些堿性氨基酸殘基可以阻斷切割并使糖蛋白在RSV中失去功能。Dong，J.Y，等.，J.Virol 66(2)865-74(1992)。
為了破壞埃博拉病毒糖蛋白的傳染能力，這5個在切割位點的堿性氨基酸被缺失。通過使用PCR擴增來將這一缺失引入埃博拉病毒GP cDNA?；蛘撸梢愿淖兦懈钗稽c如通過位點特異的突變來消除切割。
埃博拉病毒的另一個重要特征在于兩種類型的糖蛋白是從一個基因合成的一種為分泌形式(sGP)，另一種為膜結(jié)合形式(GP)。這兩種類型的產(chǎn)生是由于在7個尿嘧啶(位于從起始位點開始的1020-1028位置)序列發(fā)生的選擇性RNA編輯事件所致，該序列在所有4種埃博拉病毒亞型中高度保守。Sanchez，A.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.93(8)3602-7(1996)。sGP合成自未編輯的mRNA并且很可能具有免疫抑制功能。GP合成自編輯的mRNA而且很可能具有免疫抑制功能。GP合成自編輯的mRNA，其中在所述的7個尿嘧啶中的一個中具有插入。該RNA編輯引起移碼并且導(dǎo)致編碼完整的跨膜糖蛋白(GP2)的第二讀碼框被翻譯。
為了防止sGP的合成，將RNA編輯位點從UUUUUUU[SEQ ID NO2]修飾成UUCUUCUU[SEQ ID NO3]。在cDNA中，等效序列分別是AAAAAAA[SEQ ID NO4]和AAGAAGAA[SEQ ID NO5]。這一修飾作用完成了兩件事(1)所有的mRNAs只編碼GP(等效于-1移碼的編輯型)，和(2)雖然UUUUUU[SEQ ID NO6]與UUCUUC[SEQ ID NO7]編碼相同的氨基酸殘基，但是其防止了聚合酶進一步滑過這六個尿嘧啶序列的可能性。額外的編輯作用會導(dǎo)致缺失更多的一個尿嘧啶并且會進一步(-2)移碼。這種修飾作用機制圖解在圖2中。
可以將第三種修飾引入到埃博拉病毒的糖蛋白中，該修飾涉及缺失位于GP2的免疫抑制(IS)肽。此IS肽基序(從起始位點開始，氨基酸585-609)在線狀病毒中是高度保守的并且與已經(jīng)顯示出具有免疫抑制作用的致瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒糖蛋白中的一個基序具有高度同源性。Volchkov，V.E.，等.，F(xiàn)EBS Lett 305(3)181-4(1992)；Will，C.，等.，J.Virol 67(3)1203-10(1993)；Mitani，M.，等.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.84(1)237-40(1987)；Gatot，J.S.，等.，J.Biol Chem 273(21)12870-80(1998)；Denner，J.，等，JAcquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 12(5)442-50(1996)。首先，在該基序的核心區(qū)域(氨基酸590-600間)引入10個氨基酸缺失以去除其功能。其次，將此基序的每一半翻轉(zhuǎn)并復(fù)制以破壞其功能并增加抗原性。據(jù)信針對IS肽的抗體可以在感染過程中抑制埃博拉病毒的免疫抑制功能。此修飾作用的基本策略圖解在圖3A-3C中。
如3A-3C所示，在GP2基因上對免疫抑制肽(IS)進行修飾。圖3A圖解了野生型GP。圖3B圖解了其IS肽被缺失了10個氨基酸的GP。圖3C圖解了被分開、翻轉(zhuǎn)并被復(fù)制的IS肽。
經(jīng)過這些修飾作用，所產(chǎn)生的埃博拉病毒糖蛋白是沒有功能的、沒有免疫抑制作用、但是它們?nèi)匀槐４媪薌P的天然抗原性。這些被修飾的GP序列被用來產(chǎn)生針對埃博拉病毒的本發(fā)明疫苗的抗原。
用序列分析證實所得到的被改變的GP基因的DNA序列。隨后將被修飾的GP序列克隆到質(zhì)粒載體(intoplasmid vector)中，所述的質(zhì)粒載體包含有對在宿主細胞中有效表達這些GPs所必需的DNA元件。表達和正確定位到細胞膜取決于HeLa或293細胞的瞬時轉(zhuǎn)染，用蛋白印跡雜交和FACS進行分析，使用分別用辣根過氧化酶(HRP)或者熒光標記來標記的來自超免疫馬血清的多克隆抗體和抗馬第二抗體。
2)一系列介導(dǎo)修飾的埃博拉病毒GPs高水平表達的復(fù)制缺陷腺病毒疫苗的構(gòu)建本發(fā)明的疫苗利用重組體良性病毒來攜帶修飾的埃博拉病毒抗原以欺騙宿主發(fā)動針對埃博拉病毒的強大的免疫防御。優(yōu)選的良性病毒是不能復(fù)制的腺病毒。這些載體是疫苗表達的最佳選擇，這是由于下列幾個原因。首先，腺病毒載體指導(dǎo)抗原高水平地表達，提供了對免疫系統(tǒng)的強烈刺激作用。第二，這些載體表達的抗原在被轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞中的加工和表達模擬了病原體感染的細胞。據(jù)信這一階段對于誘導(dǎo)針對被感染細胞的細胞免疫十分重要，而且在傳統(tǒng)免疫接種方法中完全沒有這一階段。第三，腺病毒載體感染非常有效的提呈抗原細胞-樹突細胞。Diao，J.等.，Gene Ther 6(5)845-53(1999)；Zhong，L.，等.，Eur J Immunol 29(3)964-72(1999)；Wan，Y.，等.，Int J Oncol 14(4)771-6(1999)；Wan，Y.，等.，Hum Gene Ther 8(11)1355-63(1997)。第四，可以對這些載體進行設(shè)計以使其攜帶增強免疫的細胞因子基因以進一步增強免疫力。第五，腺病毒天然感染人體的通氣道和腸上皮細胞，因此可以通過經(jīng)鼻噴灑或者經(jīng)口攝服進行遞送。最后，由于本發(fā)明的腺病毒載體是復(fù)制缺陷的而且已經(jīng)被以高劑量(109-1012腹膜內(nèi)/劑量)用于基因治療研究的臨床試驗，因此它們是安全的。Gahery-Segard，H.，等.，J.Clin Invest 100(9)2218-26(1997)；Bellon，G.，等.，Hum Gene Ther 8(1)15-25(1997)；Boucher，R.C.，等.，Hum GeneTher 5(5)615-39(1994)。實際上，甚至活病毒也已經(jīng)被安全的用于軍隊中的新兵以預(yù)防普通感冒。
該載體構(gòu)建系統(tǒng)也被用于建立表達多個基因或者調(diào)控機制的復(fù)合載體。例如，所述的載體構(gòu)建體被用于在單個復(fù)合載體中表達埃博拉GP抗原和多個細胞因子，以進一步增強免疫誘導(dǎo)。或者，可以把抗原和細胞因子置于分開的載體中。這樣可以使通過用兩個或者三個載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)(感染)從而操縱細胞因子與抗原的不同組合成為可能。
在圖4中圖解了腺病毒載體的構(gòu)建。使用穿梭載體pLAd(圖4A左側(cè))，將編碼被修飾GP的cDNA克隆到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，產(chǎn)生穿梭載體pLAd/EBO-GP。pLAd/EBO-GP載體含有包括左側(cè)長末端重復(fù)L-TR和腺病毒包裝信號ψ的腺病毒基因組左末端。使用穿梭載體pRAd(圖4A，右側(cè))，將編碼細胞因子如IL-2和IL-4的基因插入到腺病毒載體的E4區(qū)域，產(chǎn)生穿梭載體pRAdIL2，4。pRAdIL2，4包含包括右側(cè)長末端重復(fù)R-TR的腺病毒基因組右末端。
為了構(gòu)建只攜帶GP基因的腺病毒載體，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶如XbaI消化穿梭載體pLAd/EBO-GP。將含有GP基因的片段連接到腺病毒骨架和pRAd載體。
為了構(gòu)建同時在E1區(qū)域攜帶GP基因和在E4區(qū)域攜帶細胞因子基因的腺病毒載體，pLAd/EBO-GP和pRAdIL2，4被線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)。
為了產(chǎn)生重組體腺病毒載體，用被連接的載體基因組轉(zhuǎn)染293細胞，在該細胞中，只有帶有兩個腺病毒末端重復(fù)的、被正確連接的基因組才能復(fù)制并產(chǎn)生傳染性病毒顆粒。人293細胞(Graham等.，J.Gen.Virol.，3659-72(1977)，可從ATCC獲得，登記號No.CRL1573)具有穩(wěn)定整合到其基因組中的腺病毒E1a和E1b基因。293細胞補充了已經(jīng)從載體骨架中缺失的腺病毒的必需的E1基因。最終的載體缺失了E1、E3和部分E4，其只能在293細胞中復(fù)制而不能在靶細胞中復(fù)制。腺病毒載體在293中擴增并通過在氯化銫梯度中超速離心來進行純化。載體的滴度由系列稀釋和在感染293細胞后計算感染顆粒(ip)來確定。
3)確定針對遺傳疫苗的免疫應(yīng)答用體外分析來對應(yīng)答于疫苗而形成的中和抗體數(shù)量進行定量。該分析基于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，而這一系統(tǒng)基于莫洛尼鼠類白血病毒系統(tǒng)。表達GAG和POL蛋白的載體和包裝細胞已經(jīng)被廣泛地表征并且可以商購。使用攜帶作為報道基因的β-半乳糖苷酶基因的包裝載體構(gòu)建體。將表達膜形式的埃博拉病毒GP的新的載體構(gòu)建體與β-Gat報道基因載體共轉(zhuǎn)染，得到GAG-POL包裝細胞系，該細胞系產(chǎn)生埃博拉病毒GP取代了其原始包膜蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。
4)確定哪種修飾的GP抗原在動物模型中能夠更好地產(chǎn)生中和抗體對攜帶兩個GP變體的腺病毒疫苗載體進行測試，測試其在CD-1小鼠(Charles River實驗室；來自洛克菲勒研究所(Rockefeller Institute)的遠交種Swiss小鼠)中誘導(dǎo)針對埃博拉病毒GP的免疫應(yīng)答的能力。特別是，比較了由帶有和不帶有IS基序的GP變體所誘導(dǎo)的中和抗體的滴度和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對埃博拉病毒GP抗原的活性。用105ip的、分別表達GP變體1(缺失IS肽)、GP變體2(IS肽被分開并翻轉(zhuǎn))和β-半乳糖苷酶(對照載體)的腺病毒載體皮下注入三組(每組有30只8周齡的小鼠)小鼠。在接種后的1、2、4、8和16周，處死(用二氧化碳窒息和頸脫位)每組中的6只小鼠，收集它們的血液和脾臟。另外，用鹽水模擬接種6只小鼠并在兩天后處死小鼠以提供免疫前對照。
對于用對照β-Gal載體注射的小鼠，其載體注射位點的組織切片被取出、固定并用X-gal溶液染色，以確定在感染后的不同時間點的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的數(shù)量和類型。另外，進行溶血素染色以確定在載體傳遞位點的各種免疫細胞(嗜中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞等等)的浸潤度。
如已經(jīng)描述的，使用標準的96孔板ELISA規(guī)程來測試來自被接種動物的血清的總GP結(jié)合抗體。Van Ginkel，F(xiàn).W.，等.，Hum Gene Ther 6(7)895-903(1995)；Van Ginkel，F(xiàn).W.，等.，J Immunol 159(2)685-93(1997)。通過在將載體與不同濃度的血清溫育之后，監(jiān)測埃博拉病毒GP-假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Wool-Lewis，等.，J.Virol，72(4)3155-60(1998))對Hela細胞的感染活性來分析血清的中和活性。將β-半乳糖苷酶在被感染細胞裂解物中的表達作為血清的中和活性的指示物(β-半乳糖苷酶活性越低，EBO-β-Gal載體已經(jīng)被中和的越多)并且使用一種非常靈敏的熒光底物(Galacto-Light試劑盒J)和熒光板讀數(shù)器來進行測量。將抗-GP血清中和的感染率與不存在血清并且存在非-GP活化的血清情況下的感染率作比較。
如前所述，從小鼠的脾臟中提取細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)。VanGinkel，F(xiàn).W.，等.，Hum Gene Ther 1995；6(7)895-903；Dong，J.Y.，等.，Hum Gene Ther 1996；7(3)319-31。將它們與恒定數(shù)量的分離的LnCaP細胞(上皮來源的前列腺癌細胞)混合在一起，所述的LnCaP細胞被攜帶未修飾的埃博拉病毒GP蛋白的腺病毒載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用10∶1、3∶1和1∶1的效應(yīng)物∶靶細胞比率。將細胞種入96孔板，24小時后，移除所有未黏附的細胞(包括所有的效應(yīng)物CTLs和死亡或瀕死的LnCaP細胞)，用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-20-基)2，5-聯(lián)苯基四唑溴化物)切割分析來定量剩下的存活(黏附的)細胞。這種分析已經(jīng)被用來測定淋巴細胞的細胞毒活性(Ni，J.，等.，J Clin Lab Anal 1996；10(1)42-52)，而且與放射性分析方法比較，其在靈敏度、可信度和速度上更有優(yōu)勢。
5)復(fù)合細胞因子的免疫增強功能及其對遺傳疫苗效力的影響為了擴大疫苗的效果，導(dǎo)入載體介導(dǎo)的基因以表達免疫增強細胞因子如使用IL-2，IL-4，IL-12，INF-γ和GM-CSF。起先，分別克隆每種細胞因子，或者以各種組合將細胞因子克隆到與編碼病毒抗原的載體分開的腺病毒載體中。通過共轉(zhuǎn)染編碼細胞因子的載體和攜帶抗原的載體，研究個體細胞因子或其組合的免疫增強效應(yīng)。比較血清抗體的滴度，比較在動物體中達到有效滴度所需的時間，所述的動物體被接種了結(jié)合了各種表達細胞因子的載體的疫苗。這些實驗可以確定是否免疫增強細胞因子能夠誘導(dǎo)更高水平的抗體、縮短誘導(dǎo)時間、和延長針對埃博拉病毒的免疫力。
在確定了表現(xiàn)最佳的被修飾的GP變體后，通過向免疫位點共傳遞攜帶分析的各種細胞因子的載體增強其所激發(fā)的免疫應(yīng)答的程度。已經(jīng)證實白細胞介素-2自身或者其與IL-4或IL-12的組合大大增強細胞毒性T細胞、自然殺傷(NK)細胞和B細胞的活化和增殖。Michael，B.N.等.，CellImmunol 1994；158(1)；105-15；Bruserud，O.，等.，Eur J.Haematol 1992；48(4)；221-7；Jacobsen，S.E.，等.，Res Immunol 1995；146(7-8)506-14；Wolf，S.F.，等.，Res Immunol 1995；146(7-8)；486-9；Tepper，R.I.，Res Immunol1993；144(8)633-7；O′Garra A.，等.，Res Immunol 1993；144(8)620-5；Ohe，Y.，等.，Int J Cancer 1993；53(3)432-7；Delespesse，G.，等.，Res Immunol1995；146(7-8)461-6.[36-43]。IFN-γ刺激體液免疫應(yīng)答并在其分泌部位增加血管壁的滲透性(Chensue，S.W.等.，J Immunol 154(11)5969-76(1995)；Szente，B.E.，等.，Biochem Biophys Res Commun 203(3)1645-54(1994)；Adams R.B.等.，J Immunol 150(6)2356-63(1993))，而Gm-CSF激活并吸引巨噬細胞和其它專職APCs到達感染位點。Bober，L.A.，等.，Immunopharmacology 29(2)111-9(1995)；Dale，D.C.，等.，Am J.Hematol57(1)7-15(1998)；Zhao，Y.，等.，Chung Hua I Hsueh Tsa Chih 77(10)32-6(1997)。
用5×104ip的選擇的GP變體載體和5×104ip的下述載體Ad-β-Gal、Ad-IL2、Ad-IL2/IL4、Ad-IL2/IL12、Ad-IFN-γ和Ad-GM-CSF之一的混合物皮下注射6組30只8周齡小鼠。
處死每組的六只小鼠所述在第1，2，4，8和16周分析。使用ELISA分析總IgG，作為干擾EBO-GP假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染HeLa細胞的能力分析中和活性，并通過混合脾提取的CTL和用如實施例4所述的Ad-EBO-GP構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶LnCaP細胞進行抗GP CTL分析。血清中各種細胞因子的水平也通過利用可商購檢驗的ELISA定量。在一些情況下，這些檢測可在相同細胞因子的人和鼠版間區(qū)分，提供使用腺病毒載體遞送的細胞因子的表達水平和它們?nèi)绾闻c免疫應(yīng)答的發(fā)展相關(guān)的直接信息。
在分析完個體細胞因子后，組合檢測那些效果最好的。用5×104i.p.選擇的GP變體載體和5×104i.p.高達3種選擇的表達細胞因子的載體(如果使用少于3種細胞因子載體，則用Ad-β-Gal載體補足i.p.數(shù))的混合物皮下注射四組30只8周齡的小鼠。在1，2，4，8和16周處死每組6只小鼠，并如上所述分析。
為了證明不同物種中對GP載體和多個細胞因子的免疫應(yīng)答的強烈和可再現(xiàn)的性質(zhì)，在兔中再次進行如上所述的實驗。如上所述，用下述載體組合之一注射5組六只白新西蘭兔股肌肉Ad-β-Gal載體(106ip)，選擇的GP載體(2.5×105每種細胞因子載體)和GP載體(2.5×105ip)。在接種前2天將動物放血(免疫前放血)，然后按照上述程序進行。每段時間取5-10ml血。以類似于小鼠的方式進行分析(參見上述內(nèi)容)。
由于編碼人細胞因子的基因被應(yīng)用于小鼠和兔模型，所以它們的免疫系統(tǒng)對那些蛋白有可能具有不相同(對人而言)的應(yīng)答。但是，人和鼠的細胞因子及其受體之間存在高度的同源性，已經(jīng)發(fā)表的文獻報道，在小鼠實驗中使用人和其它宿主的細胞因子，結(jié)果顯示了高水平的同等性。如果需要，可以獲得這些細胞因子的物種特異性版本并將其克隆到本發(fā)明的腺病毒載體中以用于物種靶向的細胞因子活性研究。
6)最優(yōu)化給予疫苗的效率和速度，在非靈長類動物和靈長類動物模型中進行安全性和病原激發(fā)研究在確定了細胞因子和抗原的最佳組合以后，構(gòu)建最終版本的疫苗載體。這些復(fù)合重組體腺病毒載體使用單個載體將細胞因子與抗原的組合傳遞到靶細胞中。在小鼠和兔中進行劑量-滴度分析以鑒定產(chǎn)生最大水平免疫應(yīng)答所需的最低劑量。比較疫苗給予的不同路徑，例如肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi)注射，經(jīng)口攝服以及經(jīng)鼻噴灑。對于安全研究，在小鼠和兔中進行劑量擴大實驗，直到觀察到毒性或者直到達到了有效劑量10倍的水平。最后，在靈長類動物中進行附加的安全性和病原激發(fā)實驗。
2.針對HIV的遺傳疫苗以下詳細描述了針對HIV的遺傳疫苗及其構(gòu)建方法的具體實施方案。A.針對HIV的復(fù)制缺陷腺病毒疫苗的構(gòu)建1)Ad-E.T.R/IL2構(gòu)建腺病毒載體Ad-E.T.R/IL2以使其在相同的載體中同時攜帶編碼多個HIV抗原包括Env、Tat和Rev蛋白和白細胞介素-2(IL-2)的序列。HIV抗原和IL-2的表達由位于腺病毒載體不同區(qū)域的啟動子分別控制。據(jù)信這一設(shè)計可以確保同時高水平表達病毒抗原和免疫刺激因子IL-2，并能夠增強腺病毒疫苗的免疫原性。如下一部分中的實驗數(shù)據(jù)所示，該腺病毒載體能夠在動物中激發(fā)針對HIV抗原的強烈的體液免疫應(yīng)答。
使用類似于如上詳細描述構(gòu)建針對埃博拉病毒的腺病毒疫苗那樣的策略來構(gòu)建腺病毒載體Ad-E.T.R/IL2。簡而言之，使用穿梭載體，將編碼野生型包膜糖蛋白gp160(全長gp120和gp41)、全長野生型Tat和全長野生型Rev的來自HIV-1毒株BH10的EcoRI/XhoI酶切片段(HIV-1或者HTLV-IIIB，進化枝B，登記號NoM15654)插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，產(chǎn)生穿梭載體pLAd-E.T.R(圖16A)。在圖38中顯示了該EcoRI/XhoI限制酶切片段的DNA序列[SEQ ID NO14]。
使用穿梭載體，將編碼IL-2的序列(在氨基酸位置79將CTA沉寂突變成CTT以缺失XbaI位點)插入到腺病毒載體的E4區(qū)域，產(chǎn)生穿梭載體pRAd-ORF6-IL2(圖16B)。在圖39中顯示了編碼此突變IL-2(IL-2ΔX)的DNA序列[SEQ ID NO15]。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦溉鏧baI和EcoRI將pLAd-E.T.R和pRAd-OFR6-IL2線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-E.T.R/IL2。
2)Ad-3C/EmΔCΔT300-G構(gòu)建另一個腺病毒載體Ad-3C/EmΔCΔT300-G以使其在相同的載體中攜帶編碼多個HIV抗原的序列和3個不同的細胞因子(在氨基酸位置79將CTA沉寂突變成CTT以缺失XbaI位點的IL-2、INF-γ和GM-CSF)，所述的HIV抗原包括缺失了gp120和gp41之間的切割位點和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的修飾的Env(gp160)和Gag蛋白。HIV抗原和所述細胞因子的表達由位于腺病毒載體不同區(qū)域的啟動子分別控制。據(jù)信這一設(shè)計可以確保同時高水平表達病毒抗原和免疫刺激因子和增強腺病毒疫苗的免疫原性。如下一部分中的實驗數(shù)據(jù)所示，該腺病毒載體能夠在動物中激發(fā)針對HIV抗原的強烈的體液免疫應(yīng)答。
使用類似于如上詳細描述構(gòu)建針對埃博拉病毒的腺病毒疫苗那樣的策略來構(gòu)建腺病毒載體Ad-3C/EmΔCΔT300-G。簡而言之，對來自HIV-1毒株BH10的、編碼Env/gp160(核苷酸位置5580-7850)的序列進行修飾以缺失編碼切割位點(REKR[SEQ ID NO11]由位置7101-7112的核苷酸編碼)和100個氨基酸長度的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(由在位置7850-8150的核苷酸編碼)的序列，而后，使用穿梭載體，將其與編碼全長Gag的序列一起插入到腺病毒基因組的右末端(E4區(qū)域)。圖40和41A分別顯示了此被修飾Env(EmΔCΔT(BH10)的DNA序列[SEQ ID NO16]和全長Gag的DNA序列[SEQ ID NO17](其氨基酸序列為SEQ ID NO18，圖41B)。
這兩個HIV抗原分別從一個CMV啟動子、在兩個剪接受體位點SA1和SA2經(jīng)由剪接供體(SD)和受體(SA)機制表達。為了促進對各種基因片段的有效克隆，構(gòu)建克隆載體SD/SA1.2.3以使其包括逆轉(zhuǎn)錄病毒SD位點和多個逆轉(zhuǎn)錄病毒SA位點SA1，SA2，SA3和SA4。在此實施例中，SD和SA位點衍生于莫洛尼鼠類白血病毒(MMLV)，它們的序列如下所示SD位點(MMLV nt204-210)AGGTAAG[SEQ ID NO72]；和SA1-4位點(MMLV nt560-568)CTGCTGCAG[SEQ ID NO73]。使用標準的PCR誘變，將每一個SD位點以及具有相同序列的SA1，SA2，SA3和SA4(SA1-4)位點插入到克隆載體pSP73的多克隆位點。如圖37所示，SA1被插入到緊接著SD位點下游，其后是SA2，SA3和SA4。為了測試經(jīng)由SD/SA機制的多個基因的表達水平，將GFP(綠色熒光蛋白)基因插入到SD/SA1與SA2，SA2與SA3，SA3與SA4之間，以及SA4之后。在這四個位點中表達水平的比例是10∶1∶5∶4。
將編碼EmΔCΔT300和Gag的DNA序列分別在SD/SA1以及SA2之后插入到克隆載體SD/SA1.2.3。用EcoR V和Xho I消化所得到的載體，將包含EmΔCΔT和Gag的片段插入到腺病毒穿梭載體中，得到pRAd-ORF6-cmv-EmΔCΔT300-G(圖17A)。使用相同的策略構(gòu)建能夠經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒SD/SA機制表達其它蛋白的穿梭載體(如下所示)。
使用穿梭載體，將編碼多個免疫刺激因子的序列插入到腺病毒基因組的E1區(qū)域，所述的免疫刺激因子包括IL-2(帶有由Xba I位點缺失導(dǎo)致的沉寂突變)、INF-γ和GM-CSF。這三種免疫刺激因子經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體(SD)和受體(SA)機制，在三個剪接受體位點SA1、SA2和SA3從另一個CMV啟動子分別地表達。所得到的穿梭載體被命名為pLAd-3C(圖17B)。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦溉鏧baI和EcoRI將pRAd-ORF6-cmv-EmΔCΔT300-G和pLAd-3C線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-3C/EmΔCΔT300-G。
3)Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G構(gòu)建另一個腺病毒載體Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G以使其在一個相同的載體中攜帶編碼多個來自毒株pNL4-3的HIV抗原的序列(登記號NoM19921)和3個不同的細胞因子(在氨基酸位置79將CTA沉寂突變成CTT以缺失XbaI位點的IL-2、INF-γ和GM-CSF)，所述的HIV抗原包括修飾的Env(缺失了33個氨基酸長度的切割位點和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的gp160)，全長Rev和Gag蛋白。HIV抗原和所述細胞因子的表達由位于腺病毒載體不同區(qū)域的啟動子分別控制。據(jù)信這一設(shè)計可以確保同時高水平表達病毒抗原和免疫刺激因子，并能夠增強腺病毒疫苗的免疫原性。如下一部分中的實驗數(shù)據(jù)所示，該腺病毒載體能夠在動物中激發(fā)針對HIV抗原的強烈的體液免疫應(yīng)答。
使用類似于如上詳細描述構(gòu)建針對埃博拉病毒的腺病毒疫苗那樣的策略來構(gòu)建腺病毒載體Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G。簡而言之，對來自HIV-1毒株pNL4-3的、編碼Env/gp160(核苷酸位置6221-8686)的序列進行修飾以缺失在長度上編碼切割位點(由位置7736-7747的核苷酸編碼)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(由在位置8687-8785的核苷酸編碼)的序列，而后，使用穿梭載體，將其與編碼全長Tat、Rev和Gag(來自HIV毒株BH10)的序列一起插入到腺病毒基因組的右末端(E4區(qū)域)。
這三種HIV抗原經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體(SD)和受體(SA)機制，在三個剪接受體位點SA1、SA2和SA3從CMV啟動子分別地表達。所得到的穿梭載體被命名為pRAd-EmΔCΔT99.T.R-G(圖18)。在圖42中顯示了編碼被修飾的Env以及全長Tat和Rev的DNA序列[SEQ ID NO19]。在圖41A和41B中分別顯示了來自HIV毒株BH10的全長Gag的DNA[SEQ ID NO17]和氨基酸序列。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦溉鏧baI和EcoRI將穿梭載體pRAd-EmΔCΔT99.T.R-G和pLAd-3C(圖17B)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G。
4)Ad-EmΔV1，2ΔCΔT99.T.R-IL2/G.IL2構(gòu)建另一個腺病毒載體Ad-EmΔV1，2ΔCΔT99.T.R-IL2/G.IL2以使其攜帶編碼多個來自HIV-1毒株pNL4-3的HIV抗原的序列。對來自HIV-1毒株pNL4-3的、編碼Env/gp160的序列(核苷酸位置6221-8686)進行修飾，以缺失編碼V1和V2環(huán)的位于6602-6796nt的序列并且插入編碼氨基酸序列GAG[SEQ ID NO13]的核苷酸序列GGA GCT GGT[SEQ ID NO12]。同樣對此HIV Env/gp160進行修飾以缺失由位于7736-7747(ΔC)的核苷酸編碼的切割位點以及由位于8687-8785(ΔT99)的核苷酸編碼的33個氨基酸的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。使用穿梭載體，將此修飾的env與編碼全長Rev(R)和Tat(T)的序列一起插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)。在圖43中顯示了編碼插入物(EmΔV1，2ΔCΔT.T.R)的DNA序列[SEQ ID NO20]。
另外，將IL-2(帶有由XbaI位點缺失導(dǎo)致的沉寂突變，DNA SEQ IDNO15)插入到被修飾的env的下游。將修飾的Env和IL-2經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體(SD)和受體(SA)機制，在兩個剪接受體位點SA1和SA2/SA3從CMV啟動子分別地表達。所得到的穿梭載體被命名為pLAd-EmΔV1，2ΔCΔT.T.R-IL2(圖19A)。
使用穿梭載體，將編碼IL-2的序列(帶有由Xba I位點缺失導(dǎo)致的沉寂突變，DNA SEQ ID NO15)和編碼來自HIV-1毒株BH10的Gag的序列(nt 112-1650，DNA SEQ ID NO17)插入到腺病毒基因組的E4區(qū)域。將這兩個蛋白經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體(SD)和受體(SA)機制，在兩個剪接受體位點SA1和SA2從CMV啟動子分別地表達。所得到的穿梭載體被命名為pRAd-ORF6-G.IL2(圖19B)。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-cmv-EmΔV1，2ΔCΔT.T.R-G和pRAd-ORF6-G.IL2線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔV1，2ΔCΔT.T.R-G/G.IL2。
5)Ad-EmΔC.T.R.N/G.IL2構(gòu)建另一個腺病毒載體Ad-EmΔC.T.R.N/G.IL2以使其攜帶編碼多個來自HIV-1毒株BH10的HIV抗原的序列。通過缺失Env的編碼切割位點的序列和插入SpeI限制性內(nèi)切位點對來自HIV-1毒株BH10的、編碼全長Env/gp160(核苷酸位置5580-8150)，Tat，Rev和Nef的序列進行修飾。在圖44中顯示了該插入物的DNA序列[SEQ ID NO21]，使用穿梭載體，將該序列插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，得到穿梭載體pLAd-EmΔC.T.R.N(圖20)。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔC.T.R.N和pRAd-ORF6-G.IL2(圖19B)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔC.T.R.N/G.IL2。
6)Ad-EmΔC.N/G.IL2構(gòu)建另一個腺病毒載體Ad-EmΔC.N/G.IL2以使其攜帶編碼多個來自HIV-1毒株BH10的HIV抗原的序列。通過缺失編碼Env、Tat和Rev切割位點的序列和插入SpeI限制性內(nèi)切位點對來自HIV-1毒株BH10的、編碼全長Env/gp160(核苷酸位置5580-8150，具有前述的Kozak序列)，Tat，Rev和Nef的序列進行修飾。在圖45中顯示了該插入物的DNA序列[SEQ ID NO22]，使用穿梭載體，將該序列插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，得到穿梭載體pLAd-EmΔC.N(圖21)。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔC.N和pRAd-ORF6-G.IL2(圖19B)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔC.N/G.IL2。
7)Ad-EmΔCΔT300.T/G.IL2構(gòu)建另一個腺病毒載體Ad-EmΔCΔT300.T/G.IL2以使其攜帶編碼多個來自HIV-1毒株BH10的HIV抗原的序列。通過缺失編碼切割位點的序列和編碼胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的300nt序列，但是仍然包含全長的Tat(T)序列，對來自HIV-1毒株BH10的、編碼全長Env/gp160(核苷酸位置5580-8150)的序列進行修飾。在圖46中顯示了該插入物的DNA序列[SEQ ID NO23]，使用穿梭載體，將該序列插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，得到穿梭載體pLAd-EmΔCΔT300.T(圖22)。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔCΔT300.T和pRAd-ORF6-G.IL2(圖19B)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔCΔT300.T/G.IL2。
8)Ad-EmΔC/EmΔC構(gòu)建另一個腺病毒載體Ad-EmΔC/EmΔC以使其攜帶編碼兩個拷貝的修飾的來自HIV-1毒株BH10的Env的序列。通過缺失編碼切割位點的序列，對來自HIV-1毒株BH10的、編碼全長Env/gp160(核苷酸位置5580-8150)的序列進行修飾。在圖47中顯示了修飾的Env的DNA序列[SEQ ID NO24]，使用穿梭載體，將該序列插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，得到穿梭載體pLAd-EmΔC(圖23A)。
使用穿梭載體，將編碼修飾的Env(EmΔC)的DNA序列[SEQ IDNO24]同樣插入到腺病毒基因組的E1區(qū)，得到穿梭載體pRAd-ORF6-EmΔC(圖23B)。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔC和pRAd-ORF6-EmΔC線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔC/EmΔC。
9)Ad-Em.V3m/G.IL-2構(gòu)建另一個腺病毒載體Ad-Em.V3m/G.IL-2以使其攜帶編碼具有多進化枝V3環(huán)的修飾的HIV-1 Env和Gag和IL-2的序列。在圖48中顯示了編碼來自HIV-1 M組中的進化枝B，A，C，D，E，F(xiàn)和G的V3環(huán)的序列。如圖48所示，對于進化枝B(HIV-1毒株BH10)選擇編碼V3環(huán)，nt885-992的DNA序列[SEQ ID NO25]。在該具體實施方案中，對于進化枝A(HIV-1毒株192UG037WHO.01083hED)選擇編碼V3環(huán)，nt888-992的DNA序列[SEQ ID NO26]。對于進化枝C(HIV-1毒株192BR025WHO.01093hED)選擇編碼V3環(huán)，nt876-980的DNA序列[SEQID NO27]。對于進化枝D(HIV-1毒株192UG024.2)選擇編碼V3環(huán)，nt888-989的DNA序列[SEQ ID NO28]。對于進化枝E(HIV-1毒株193TH976.17)選擇編碼V3環(huán)，nt894-998的DNA序列[SEQ ID NO29]。對于進化枝F(HIV-1毒株193BR020.17)選擇編碼V3環(huán)，nt888-992的DNA序列[SEQ ID NO30]。對于進化枝G(HIV-1毒株192RU131.9)選擇編碼V3環(huán)，nt885-989的DNA序列[SEQ ID NO31]。
通過PCR連接編碼來自HIV進化枝A，C，D，E，F(xiàn)和G的V3環(huán)的DNA序列，以形成含多進化枝V3環(huán)的單一片段?？寺∵@些來自它們的同源HIV進化枝的V3環(huán)的引物列于圖57。由于HIV進化枝B的V3環(huán)已經(jīng)包含在HIV-1gp120骨架中，所以將克隆的來自進化枝A，C，D，E，F(xiàn)和G的V3環(huán)插入到進化枝B的V3環(huán)之后。
圖24描述了這樣一個過程用PCR產(chǎn)生連接的多進化枝V3環(huán)并隨后將其克隆到編碼修飾的進化枝B的gp120的構(gòu)建體中。如圖24所示，使用列在圖57中的一組正向和反向引物，用PCR分別地擴增編碼來自進化枝A，C，D，E，F(xiàn)和G的包膜V3環(huán)區(qū)域的每個基因片段。PCR循環(huán)的參數(shù)如下，變性94℃1分鐘；退火50-60℃30秒鐘；和延伸72℃1分鐘；共20個循環(huán)。
用PCR將編碼一個進化枝V3環(huán)的PCR產(chǎn)物與另一個相連接。例如，將編碼進化枝A和C V3環(huán)的PCR產(chǎn)物混合在一起、連接、并使用圖24中所示的引物1和4進行PCR擴增，產(chǎn)生A/C片段。類似地，使用引物5和8來產(chǎn)生編碼連接的進化枝D和E的V3環(huán)的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生D/E片段；使用引物9和12(圖24)的進化枝F和G，產(chǎn)生F/G片段。
仍然參照圖24，使用引物1和8，用PCR連接A/C和D/E片段，并在EcoRI和BamHI位點將其克隆進載體。用BamHI和Xbal限制性消化F/G片段，并將其與序列A/C/D/E融合以產(chǎn)生多進化枝序列ACDEFG(V3m)。
為了產(chǎn)生兩個重復(fù)的多進化枝ACDEFG序列，用AvaI(在引物1和12)限制性消化編碼多進化枝ACDEFG序列的PCR終產(chǎn)物并頭尾重新連接，產(chǎn)生兩個重復(fù)的多進化枝序列2×V3m。隨后在編碼gp120的構(gòu)建體中，將編碼V3m或者2×V3m的DNA序列插入到編碼進化枝B V3環(huán)序列的后面，所述的構(gòu)建體被修飾如下。
編碼HIV毒株BH10(進化枝B)的Env(nt5580-8150)的DNA序列被如下修飾a)缺失編碼切割位點(nt7101-7112)的序列；b)缺失V1和V2環(huán)(nt5961-6161)并插入編碼氨基酸序列GAG[SEQ ID NO13]的核苷酸序列GGA GCT GGT[SEQ ID NO12]；c)在位置nt6572插入多進化枝V3環(huán)(V3m)序列；和d)用編碼乙二醇磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol)的GPI錨定序列SWLLLLLLSLSLLQATDFMSL[SEQ ID NO9]來替代gp41跨膜結(jié)構(gòu)域序列。在圖49A中顯示了編碼此被修飾的Env的DNA序列[SEQ ID NO32](其氨基酸序列是SEQ ID NO33，圖49B)，使用穿梭載體，將該序列插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，產(chǎn)生穿梭載體pLAd-Em.V3m(圖25)。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-Em.V3m和pRAd-ORF6-G.IL2(圖19B)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-Em.V3m./G.IL2。
10)穿梭載體pLAd-Em.2xV3m為了增加多進化枝V3環(huán)的表達水平，將編碼兩個重復(fù)的V3m序列(2xV3m，如上構(gòu)建)的序列插入到上述部分9)中所述編碼修飾的Env的序列中。將得到的穿梭載體表示為pLAd-Em.2xV3m，并顯示在圖26中。
11)編碼p17和/或p24的穿梭載體天然狀態(tài)下，Pr55 Gag蛋白可被加工成4種不同的蛋白，p17MA，p24CA，p7NC和p6。p17MA蛋白保持與脂包膜的內(nèi)部相關(guān)，并且在將包膜錨定到病毒顆粒中發(fā)揮重要作用。所有逆轉(zhuǎn)錄病毒的p24CA蛋白包含有效的病毒復(fù)制和顆粒產(chǎn)生所需的主要同源區(qū)(MHR)。獲得的elispot數(shù)據(jù)暗示p17MA(或p17)和p24CA(或p24)可能有意義地負責(zé)在作肽圖實驗Pr55 gag蛋白中特異CTL應(yīng)答。依照本發(fā)明，這些HIV結(jié)構(gòu)蛋白由重組體病毒表達，以激發(fā)針對HIV感染的特異CTL應(yīng)答。此外，這些結(jié)構(gòu)蛋白可被修飾以包括信號肽序列(如由SEQ ID NO74atgagagtgaaggagaaatatcagcacttgtggagatgggggtggagatggggcaccatgctccttgggatgttgatgatctgtagtgct所編碼的HIV gp120信號肽)，以促進這些胞內(nèi)蛋白由被感染的細胞所分泌。而且，通過向分泌形式的HIV蛋白加入膜錨定結(jié)構(gòu)域(如由SEQ ID NO75ttattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctgtagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaatcccgagggga所編碼的HIV gp41跨膜結(jié)構(gòu)域)，使得這種修飾的HIV結(jié)構(gòu)蛋白被賦予了膜結(jié)合特性，其更好地將HIV抗原提呈給機體的免疫系統(tǒng)。這些修飾可以賦予突變體抗原比胞內(nèi)捕獲的天然抗原更強烈的免疫原性。
構(gòu)建腺病毒穿梭載體以編碼加工的Gag蛋白，p17，p24和p17/p24，每個以3種不同形式存在天然形式，分泌形式和膜結(jié)合形式。
3種形式的p17/p24的DNA序列[SEQ ID NO34-36]示于圖50A中(相應(yīng)的氨基酸序列[SEQ ID NO37-39]，圖50B)，并且使用穿梭載體每個插入到腺病毒基因組的E4區(qū)，分別產(chǎn)生穿梭載體pRAd-ORF6-p17/24(天然形式，圖27A)，pRAd-ORF6-p17/24sec(分泌形式，圖27B)和pRAd-ORF6-p17/24MB(膜結(jié)合形式，圖27C)。
在圖51A中顯示了三種形式p17的DNA序列[SEQ ID NOs40-42](對應(yīng)的氨基酸序列為[SEQ ID NOs43-45，圖51B])，并且使用穿梭載體將每個插入到腺病毒基因組的E4區(qū)域，分別得到穿梭載體pRAd-ORF6-p17(天然形式，圖28A)，pRAd-ORF6-p17sec(分泌形式，圖28B)和pRAd-ORF6-p17MB(膜結(jié)合形式，圖28C)。
在圖52A中顯示了三種形式p24的DNA序列[SEQ ID NOs46-48](對應(yīng)的氨基酸序列為[SEQ ID NOs49-51，圖52B])，使用穿梭載體將每個插入到腺病毒基因組的E4區(qū)域，分別得到穿梭載體pRAd-ORF6-p24(天然形式，圖29A)，pRAd-ORF6-p24sec(分泌形式，圖29B)和pRAd-ORF6-p24MB(膜結(jié)合形式，圖29C)。
可以以組合的方式將以上構(gòu)建的pLAd-和pRAd-穿梭載體組合起來以產(chǎn)生更多樣的重組體腺病毒載體。以下僅是這樣的重組體腺病毒載體的幾個實例。
12)Ad-Em.2xV3m/p17/24MB圖30A-B描述了這樣的重組體腺病毒載體的構(gòu)建，其編碼被修飾的、含有兩個拷貝多進化枝V3環(huán)和膜結(jié)合形式p17/p24的Env。如圖30A-B中所示，使用限制性酶EcoRI和XbaI將pLAd-Em.2xV3m(載體的詳細資料見圖26)和pRAd-ORF6-p17/24MB(載體的詳細資料見圖27C)線性化并連接到腺病毒的骨架，得到重組體腺病毒載體Ad-Em.2xV3m/p17/24MB。
13)Ad-Em.2xV3m/p17MB圖31A-B描述了這樣的重組體腺病毒載體的構(gòu)建，其編碼被修飾的、含有兩個拷貝多進化枝V3環(huán)和膜結(jié)合形式p17的Env。如圖31A-B中所示，使用限制性酶EcoRI和XbaI將pLAd-Em.2xV3m(載體的詳細資料見圖26)和pRAd-ORF6-p17MB(載體的詳細資料見圖28C)線性化并連接到腺病毒的骨架，得到重組體腺病毒載體Ad-Em.2xV3m/p17MB。
14)Ad-Em.2xV3m/p24MB圖32A-B描述了這樣的重組體腺病毒載體的構(gòu)建，其編碼被修飾的、含有兩個拷貝多進化枝V3環(huán)和膜結(jié)合形式p24的Env。如圖32A-B中所示，使用限制性酶EcoRI和XbaI將pLAd-Em.2xV3m(載體的詳細資料見圖26)和pRAd-ORF6-p24MB(載體的詳細資料見圖29C)線性化并連接到腺病毒的骨架，得到重組體腺病毒載體Ad-Em.2xV3m/p24MB。
15)Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24sec編碼來自HIV毒株BH10的Env的DNA序列(包含Tat1(nt5189-5403)和Tat2(7734-7779))被修飾如下a)缺失編碼切割位點(nt7101-7112)的序列；b)缺失V1和V2環(huán)(nt5961-6161)并插入編碼氨基酸序列GAG[SEQ ID NO13]的核苷酸序列GGA GCT GGT[SEQ ID NO12]；c)在位置nt6572插入兩個拷貝的多進化枝V3環(huán)(2×V3m)序列；和d)缺失100個氨基酸長度的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(由位置7850-8150的核苷酸編碼)。在圖53A中顯示了編碼此被修飾的Env的DNA序列[SEQ ID NO52](其氨基酸序列是SEQ ID NO53，圖53B)，使用穿梭載體，將該序列插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，產(chǎn)生穿梭載體pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T(圖33)。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T和pRAd-ORF6-p17/24sec(圖27B)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24sec。
16)Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24MB使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T(圖33)和pRAd-ORF6-p17/24MB(圖27C)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24MB。
17)Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24sec編碼來自HIV毒株BH10的Env的DNA序列(包含Tat1(nt5189-5403)，Rev1(nt5328-5403)，Tat2(7734-7779)和Rev2(7734-8008))被修飾如下a)缺失編碼切割位點(nt7101-7112)的序列；b)缺失V1和V2環(huán)(nt5961-6161)并插入編碼氨基酸序列GAG[SEQ ID NO13]的核苷酸序列GGA GCT GGT[SEQ ID NO12]；c)在位置nt6572插入兩個拷貝的多進化枝V3環(huán)(2×V3m)序列；和d)缺失33個氨基酸長度(nt8687-8785)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在圖54A中顯示了編碼此被修飾的Env的DNA序列[SEQ ID NO54](其氨基酸序列是SEQ ID NO55，圖54B)，使用穿梭載體，將該序列插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，產(chǎn)生穿梭載體pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T.R(圖34)。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T.R和pRAd-ORF6-p17/24sec(圖27B)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24sec。
18)Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24MB使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R(圖34)和pRAd-ORF6-p17/24MB(圖27C)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24MB。
19)Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G.PI作肽圖和Elispot數(shù)據(jù)顯示，Gag蛋白的特定區(qū)域可能在激發(fā)被本發(fā)明腺病毒載體所免疫的動物中的CTL應(yīng)答方面起重要的作用。為了促進腺病毒載體有效表達p17MA和p24CA，在穿梭載體pRAd-ORF6-G.PI中，將編碼來自HIV毒株BH10的pol區(qū)的蛋白酶的DNA序列(PI，DNA SEQID NO56，圖55A；氨基酸SEQ ID NO57，圖55B)插入到Gag編碼序列的下游區(qū)(圖35)。如圖35所示，Gag和PI經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體(SD)和受體(SA)機制，在兩個剪接受體位點SA1和SA2/SA3從CMV啟動子分別表達。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T(圖33)和pRAd-ORF6/G.PI(圖35)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G.PI。
20)Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G-PI或者，通過在位置nt1410插入一個C殘基以使pol處于與gag相同的讀碼框之內(nèi)，HIV蛋白酶PI可以與Gag一起被表達為融合蛋白。在圖56A和56B中，分別顯示了Gag-PI融合蛋白的DNA[SEQ ID NO58]和氨基酸[SEQ ID NO59]序列。如圖36所示，在相同讀碼框內(nèi)Gag和PI從相同的CMV啟動子表達。所得到的穿梭載體被命名為pRAd-ORF6/G-PI。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦笇LAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T(圖33)和pRAd-ORF6/G-PI(圖36)線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G-PI。
21)pRAd-ORF6-Gag/PI-RT在穿梭載體pRAd-ORF6-Gag/PI-RT中中，將編碼來自HIV毒株BH10pol區(qū)域的蛋白酶(PI)和逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的DNA序列插入到Gag編碼序列的下游區(qū)(圖58)。如圖58所示，Gag和PI-RT經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體(SD)和受體(SA)機制，在兩個剪接受體位點SA1和SA2/SA3從CMV啟動子分別表達。
可以將右穿梭載體pRAd-ORF6-Gag/PI-RT與上述任何左穿梭載體(pLAd)結(jié)合以產(chǎn)生重組體腺病毒載體。
22)pRAd-ORF6-Gag-PI-RT或者，通過在位置nt1410插入一個C殘基以使pol處于與gag相同的讀碼框之內(nèi)，PI-RT可以與Gag一起被表達為融合蛋白。如圖59所示，在相同讀碼框內(nèi)Gag和PI-RT從相同的CMV啟動子表達。所得到的穿梭載體被命名為pRAd-ORF6-Gag-PI-RT。
可以將右穿梭載體pRAd-ORF6-Gag-PI-RT與上述任何左穿梭載體(pLAd)結(jié)合以產(chǎn)生重組體腺病毒載體。
23)pRAd-ORF6-Gag/Pol在穿梭載體pRAd-ORF6-Gag/Pol中，將編碼來自HIV毒株BH10 pol區(qū)域的HIV酶PI、RT和IN的DNA序列插入到Gag編碼序列的下游區(qū)(圖60)。如圖60所示，Gag和Pol經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體(SD)和受體(SA)機制，在兩個剪接受體位點SA1和SA2/SA3從CMV啟動子分別表達。
可以將右穿梭載體pRAd-ORF6-Gag/Pol與上述任何左穿梭載體(pLAd)結(jié)合以產(chǎn)生重組體腺病毒載體。
24)pRAd-ORF6-Gag-Pol或者，通過在位置nt1410插入一個C殘基以使pol處于與gag相同的讀碼框之內(nèi)，Pol可以與Gag一起被表達為融合蛋白。如圖61所示，在相同讀碼框內(nèi)Gag和Pol從相同的CMV啟動子表達。所得到的穿梭載體被命名為pRAd-ORF6-Gag-Pol。
可以將右穿梭載體pRAd-ORF6-Gag/Pol與上述任何左穿梭載體(pLAd)結(jié)合以產(chǎn)生重組體腺病毒載體。
B.動物對針對HIV抗原的腺病毒疫苗的免疫應(yīng)答用以上構(gòu)建的腺病毒疫苗Ad.tat.env.IL2(如上述A部分1小部分所述，也稱為″Ad-E.T.R/IL2″))來免疫接種實驗小鼠，以激發(fā)針對由此載體表達的HIV抗原的免疫應(yīng)答。通過測量針對HIV tat和env的抗體的滴度來確定腺病毒載體的免疫原性。
圖6和7分別顯示了兩組小鼠中針對HIV Env蛋白的Ad.tat.env.IL2的免疫原性。在如圖中所示的不同日期，向這些組的C57BL/6小鼠(由Charles River實驗室提供。威爾明頓，馬薩諸塞州)肌肉內(nèi)注射107pfu的Ad.tat.env.IL2。在免疫接種后每兩周從4只動物中收集血液(每只動物大約150-500μl)并制備血清。接種后77天，用額外107pfu的Ad.tat.env.IL2重新激發(fā)這些小鼠。第二次激發(fā)后每天從3只動物中收集血液。通過對被Ad.tat.env.IL2感染的HeLa細胞的裂解物進行ELISA來確定被激發(fā)針對HIV tat和env的抗體的滴度。
簡而言之，被Ad.tat.env.IL2感染的HeLa細胞的裂解物如下制備。以20感染復(fù)數(shù)(MOI)用Ad.tat.env.IL2感染HeLa細胞。感染后48小時，收集HeLa細胞并將其重懸于含有1％TritonX-100的緩沖液中。以15,000×g離心裂解物5分鐘，獲得核后(post-nuclear)上清液。將裂解物稀釋至10μg/ml用于涂布ELISA孔板。執(zhí)行標準的ELISA分析以測定血清的OD450，并且通過將其與小鼠免疫前血清的OD450平均值相對標準化來計算針對HIV tat和env蛋白的抗體的相對滴度。
如圖6所示，該組中的三只小鼠具有針對由腺病毒載體Ad.tat.env.IL2表達的HIV抗原的強烈的免疫應(yīng)答，抗體對HIV抗原的滴度在接種后的大約42天達到最高。使用Ad.tat.env.IL2進行的二次接種再次增強了免疫應(yīng)答而且滴度在二次接種后的大約5天內(nèi)達到很高的水平。
如圖7所示，該組中的三只小鼠也具有針對由腺病毒載體Ad.tat.env.IL2表達的HIV抗原的強烈的免疫應(yīng)答，抗體對HIV抗原的滴度在接種后的大約70天達到最高。使用Ad.tat.env.IL2進行的二次接種再次增強了免疫應(yīng)答而且滴度在二次接種后的大約5天內(nèi)達到很高的水平。
圖12A-B顯示了在小鼠中由重組體腺病毒載體Ad.3C.env.gag(如上述A部分2小部分所述，也稱為“Ad-3C/EmΔCΔT300-G”)激發(fā)的抗體產(chǎn)生。用107pfu的Ad.3C.env.gag肌肉內(nèi)注射C57BL/6小鼠。在接種后77天，用另外的107pfu Ad.3C.env.gag再次激發(fā)這些小鼠。在免疫(或初次免疫)后10周(圖12A)和初次免疫后14周/加強免疫后3周(圖12B)，用針對純化重組體Gag(獲自NHI AIDS Research and Reference ReagentProgram；貝塞斯達，馬里蘭州)的ELISA來測定這些小鼠的相對抗體滴度。如圖12A和12B所示，用Ad.3C.env.gag接種的小鼠具有針對HIV抗原Gag的強烈的免疫應(yīng)答。
圖13A-B顯示了在小鼠中由重組體腺病毒載體Ad.3C.env.rev.gag(如上述A部分3小部分所述，也稱為“Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G”)激發(fā)的抗體產(chǎn)生。用107pfu的Ad.3C.env.rev.gag肌肉內(nèi)注射C57BL/6小鼠。在接種后77天，用另外的107pfu Ad.3C.env.rev.gag再次激發(fā)這些小鼠。在免疫(或初次免疫)后10周(圖13A)和初次免疫后14周/加強免疫后3周(圖13B)，用針對純化重組體Gag的ELISA來測定這些小鼠的相對抗體滴度。如圖13A和13B所示，用Ad.3C.env.rev.gag接種的小鼠具有針對HIV抗原Gag的強烈的免疫應(yīng)答。
C.通過用針對HIV抗原的腺病毒疫苗免疫活化細胞毒性T淋巴細胞(CTL)通過用兩種獨立的測試方法來測定被針對HIV抗原的腺病毒疫苗免疫活化的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)IFNγ分析和粒酶A分析。對IFNγ和粒酶分析進行設(shè)計以檢測T細胞的抗原-特異性活化作用。IFNγ是由活化的CTL和在特異性在細胞免疫途徑中發(fā)揮作用的TH1輔助T細胞所分泌的。粒酶A也由活化的CTL分泌。基本方法是將脾細胞與表達目的抗原的靶細胞一起溫育，觀察分泌到培養(yǎng)基中的IFNγ或粒酶A。
1)IFNγ分析除了在將靶細胞和脾細胞一起溫育以前不對靶細胞進行放射性標記之外，IFNγ分析是標準51Cr-釋放胞溶分析(Current Protocols inImmunology，Coligan等.，編輯)的變體。該分析的詳細步驟描述在DiFabio等.(1994)″Quantitation of human influenza virus-specific cytotoxic Tlymphocytescorrelation of cytotoxicity and increased numbers ofIFN-gamma-(or IFNγ-)producing CD8+T cells″Int.Immunol.611-9中。簡而言之，將約1×105的脾細胞與1×105的靶細胞(例如，用攜帶靶抗原的適當(dāng)病毒感染)在100μl的總體積內(nèi)溫育。將細胞在37℃溫育4小時。通過ELISA從25μl培養(yǎng)基中測量IFNγ。
通過利用如上所述IFNγ分析，確定用針對HIV抗原的腺病毒疫苗接種的小鼠中CTL的活化。簡而言之，用107pfu Ad.tat.env.IL2肌肉內(nèi)注射12只C57BL/6小鼠。在圖8A-C中所示的時間點，從4只接種的小鼠中收獲脾。通過與已被Ad.tat.env.IL2感染的B16-F1細胞(C57BL/6的黑素瘤細胞系，ATCC號CRL-6323)溫育來活化脾細胞。在刺激7天后，將活化的脾細胞與用指定的病毒感染的B16-F1細胞混合。通過ELISA(R&D系統(tǒng)，明尼阿波利斯，明尼蘇達州)確定IFNγ分泌到培養(yǎng)基中。
圖8A-C顯示在接種后4-8周的時間內(nèi)分泌到培養(yǎng)基中IFNγ的量增加的百分比。如圖8A所示，在用Ad.tat.env.IL2接種后4周收獲的4只小鼠的脾細胞中IFNγ的分泌顯著增加。相反，當(dāng)脾細胞與用腺病毒載體感染的B16 F-1細胞或未感染的B16 F-1細胞溫育時，發(fā)生IFNγ分泌的少量增加，所述腺病毒載體表達非特異的蛋白β-Gal(Ad.lacZ)。
如圖8B所示，在接種后6周收獲的小鼠脾細胞中IFNγ的分泌增加更多。值得注意的是，在小鼠5脾細胞中IFNγ的分泌增加近100％(圖8B)。
如圖8C所示，接種后8周收獲的小鼠脾細胞中IFNγ的分泌非常顯著的增加。在小鼠11的脾細胞中IFNγ的分泌增加多于300％(圖8C)。這些結(jié)果證實針對HIV的強烈體液免疫應(yīng)答，如高滴度抗體的誘導(dǎo)和特異靶向HIV抗原的CTL活化已經(jīng)通過用腺病毒疫苗接種動物得以實現(xiàn)，所述腺病毒疫苗同時表達HIV病毒抗原和免疫刺激因子如IL-2。免疫應(yīng)答類似于在病毒感染疾病的恢復(fù)過程中的那些免疫應(yīng)答。這些結(jié)果傾向于表明本發(fā)明的遺傳疫苗模擬天然病毒感染，其極有前景被用作人類對抗HIV的有效疫苗。
2)粒酶A分析使用更改自描述在Deitz等.(2000)″MHC I-dependent antigenpresentation is inhibited by poliovirus protein 3A″Proc.Natl.Acad.Sci.9713790-13795中的方案來進行粒酶A分析。描述在Deitz等中的粒酶A分析是描述在Kane等.(1989)″Cytolytic T-lymphocyte response to isolatedclass I H-2 proteins and influenza peptides″Nature(London)340157-159中的方案的一個變體。
粒酶A分析的步驟與IFNγ分析的操作步驟類似，只是存在以下的不同之處。通過酶分析來確定分泌到培養(yǎng)基中的粒酶A。通過計算反應(yīng)線性階段過程中的活性斜率來確定粒酶A的單位。一個單位的粒酶A被定義為在一小時內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化成1OD405所需的酶量。
簡而言之，象INFγ分析那樣，將大約1×105的活化的脾細胞與大約1×105的靶細胞一起溫育。通過在96孔板中混合20μl培養(yǎng)基和180μl反應(yīng)混合物(0.2mM BLT(N-α-芐氧基羰基-L-賴氨酸硫代芐基酯，Sigma，St.Louis，MO)，0.22mM DTNB(5，5′-二硫-二(2-硝基苯甲酸，Sigma，St.Louis，MO))并在室溫下溫育確定粒酶A的活性。在數(shù)小時監(jiān)測在405nm處的吸光度。在反應(yīng)的線性階段確定酶活性的斜率并將其轉(zhuǎn)換成酶單位。
圖9顯示了由接種8周后收集的小鼠脾細胞分泌到培養(yǎng)基中的粒酶A的量的增加。如圖9所示，用Ad.tat.env.IL2接種8周后所收集的4只小鼠的脾細胞中，粒酶A的分泌顯著增加。相反，當(dāng)脾細胞與被表達非特異蛋白β-Gal(Ad.lacZ)的腺病毒載體、同時表達乙肝表面抗原和IL-2的腺病毒載體感染的B16-F1細胞或未感染的B16 F-1細胞溫育時，發(fā)生非常少的粒酶A分泌。類似地，在沒有與靶細胞一起培育地這些脾細胞中，只有很少的自發(fā)粒酶A分泌。
圖14A顯示了在所示的不同時間點，對系列1小鼠進行粒酶A分析的結(jié)果，所述的時間點包括在用Ad.3C.env.gag進行免疫后的4、6、8周和二次接種后的12/1、13/2、14/3周(初次免疫/加強免疫)。
圖14B顯示了在所示的不同時間點，對系列2小鼠進行粒酶A分析的結(jié)果，所述的時間點包括在用Ad.3C.env.gag進行免疫后的2、4、6、8周。
通過使用獨立于IFNγ分析的粒酶A分析獲得的這些結(jié)果又一次證明了用同時表達HIV病毒抗原和免疫刺激因子如IL-2的腺病毒疫苗接種小鼠，誘導(dǎo)出了強烈的特異靶向HIV抗原的CTL活性。這些結(jié)果同時也支持這一觀念本發(fā)明提供的遺傳疫苗極有前景被用作人類對抗HIV的有效疫苗。
3)ELISPOT分析進行ELISPOT分析以確定被重組體腺病毒載體Ad.3C.env.gag和Ad.3C.env.gag.rev接種的小鼠的CTL活化。用107pfu的Ad.3C.env.gag或者Ad.3C.env.gag.rev接種C57BL/6小鼠。以兩周的間隔處死小鼠并制備脾細胞(參見Current Protocols in Immunology，Coligan等編輯)。在11周，以第二劑量107pfu的Ad.3C.env.gag或Ad.3C.env.gag.rev接種小鼠。將2×105的脾細胞與4×104的MC57G細胞(ATCC #CRL-2295)在96孔、小鼠INFγ、ELISPOT板(R&D系統(tǒng)，明尼阿波利斯，明尼蘇達州)中溫育30小時，所述的MC57G細胞被表達Env、Gag或Rev的痘苗病毒所感染。隨后加入4μg/ml的PHA(Sigma，St.Louis，密蘇里州)而不是表達抗原的細胞來檢測非特異性活化。根據(jù)試劑盒的說明書來顯影IFNγ斑點并計數(shù)。野生型和重組體痘苗病毒來自NHI AIDS Research andReference Reagent Program，貝塞斯達，馬里蘭州。
圖15A顯示了對4只系列1中的小鼠用Ad.3C.env.gag進行初次免疫/加強免疫后13/2周所獲得的ELISPOT結(jié)果。圖15B顯示了對4只系列1中的小鼠用Ad.3C.env.rev.gag進行初次免疫/加強免疫后13/2周所獲得的ELISPOT結(jié)果。這些結(jié)果顯示用本發(fā)明的遺傳疫苗免疫小鼠可以誘導(dǎo)出強烈的針對HIV Gag的CTL活化。
3.針對乙型肝炎病毒的遺傳疫苗以下詳細描述了針對乙型肝炎病毒的遺傳疫苗及其構(gòu)建方法的具體實施方案。
1)構(gòu)建針對乙型肝炎病毒的復(fù)制缺陷的腺病毒疫苗構(gòu)建兩種腺病毒載體Ad.HBsAg.IL2和Ad.HBcAg.IL2以使其分別攜帶編碼乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和HBV核心抗原(HBcAg)的序列。在相同的載體中，還包括編碼白細胞介素-2(IL-2)的DNA序列，其由與表達病毒抗原不同的啟動子來表達。據(jù)信這一設(shè)計可以確保同時高水平表達病毒抗原和免疫刺激因子IL-2，并能夠增強腺病毒疫苗的免疫原性。如下一部分中的實驗數(shù)據(jù)所示，這兩種腺病毒載體都能夠在動物中激發(fā)針對乙型肝炎抗原的強烈且持久的免疫應(yīng)答。
使用類似于如上詳述的構(gòu)建針對埃博拉病毒的腺病毒疫苗那樣的策略來構(gòu)建這兩種腺病毒載體Ad.HBsAg.IL2和Ad.HBcAg.IL2。
a)Ad.HBsAg.IL2簡而言之，使用穿梭載體pLAd(圖4A，左側(cè))，將全長HBsAg(帶有由XbaI位點缺失所致的沉寂突變)插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)，產(chǎn)生穿梭載體pLAd-CMV-HBsAg。
使用穿梭載體pRAd(圖4A，右側(cè))，將編碼IL-2的序列(帶有由XbaI位點缺失所致的沉寂突變)插入到腺病毒基因組的E4區(qū)域，產(chǎn)生穿梭載體pRAd-CMV-IL2。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦溉鏧baI和EcoRI將pLAd-CMV-HBsAg和pRAd-CMV-IL2線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體被命名為Ad.HBsAg.IL2a)Ad.HBcAg.IL2簡而言之，使用穿梭載體pLAd(圖4A，左側(cè))，將編碼全長HBsAg(帶有由XbaI位點缺失所致的沉寂突變)和全長HBcAg的序列插入到腺病毒基因組的左末端(E1區(qū)域)。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體(SD)受體(SA)機制，在剪接受體位點SA1和SA2從另一個CMV啟動子分別表達HBsAg和HBcAg。產(chǎn)生的穿梭載體被命名為pLAd-CMV-SD/SA1-HBsAg-SA2-HbcAg。
使用穿梭載體pRAd(圖4A，右側(cè))，將編碼包括IL-2(帶有由XbaI位點缺失所致的沉寂突變)、INF-γ和GM-CSF在內(nèi)的多個免疫刺激因子的序列插入到腺病毒基因組的E4區(qū)域。這三種免疫刺激因子經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄病毒供體(SD)和受體(SA)機制，在三個剪接受體位點SA1、SA2和SA3從另一個CMV啟動子分別地表達。所得到的穿梭載體被命名為pRAd-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-SA3-GMCSF。
使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦溉鏧baI和EcoRI將pLAd-CMV-SD/SA1-HBsAg-SA2-HbcAg和pRAd-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-INFγ-SA3-GMCSF線性化并連接到腺病毒的骨架(圖4B)，得到重組體腺病毒載體被命名為Ad.HBcAg.IL2。
2)動物對針對HBV抗原的腺病毒疫苗的免疫應(yīng)答用上面構(gòu)建的腺病毒疫苗Ad.HBsAg.IL2和Ad.HBcAg.IL2接種實驗小鼠，以分別激發(fā)針對由此二載體表達的乙肝病毒表面抗原和核心抗原的免疫應(yīng)答。通過測量針對HBsAg和HbcAg的抗體的滴度來分別確定這些腺病毒載體的免疫原性。
a)HBV表面抗原(HBsAg)抗體滴度用幾種不同濃度的Ad.HBsAg.IL2100、1×106、1×107、1×108、5×105、5×106和5×107pfu病毒經(jīng)肌肉內(nèi)注射給予CD-1小鼠(CharlesRiver實驗室，威爾明頓，馬薩諸塞州)。圖10A顯示了相對抗-HBsAg抗體的滴度，這是通過測定收集自被接種了1×105和5×105pfu的小鼠的血清而得到的。每次測量中的血清被稀釋1∶500。圖10B顯示了相對抗-HbsAg抗體的滴度，這是通過測定收集自被接種了1×107和1×108pfu的小鼠的血清而得到的。每次測量中的血清被稀釋1∶1500。
為了測定由Ad.HBsAg.IL2所激發(fā)的抗-HbsAg抗體的相對滴度，每兩周從被免疫的小鼠中收集每只動物的血液(大約150-500μl)并制備血清。將血液在室溫下溫育2-3小時以使其凝結(jié)。隨后將血液在4℃下過夜冷卻以使血凝塊縮小。將未凝結(jié)的液體轉(zhuǎn)移到干凈的管中并以2000×g的速度離心5分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到另一個干凈管中。加入疊氮化鈉(NaN3)至0.05％作為防腐劑。將其分為小等份，保存在4℃短期貯存，保存在-80℃長期貯存。
對純化自酵母(來自Aldevron，LLC，F(xiàn)argo，ND)的重組體HBsAg進行ELISA，以確定相對抗-HBsAg滴度。如圖10A所示，在接種8周內(nèi)，組1中的小鼠對由腺病毒載體Ad.HBsAg.IL2表達的HBsAg具有增加的強烈的免疫應(yīng)答。該載體的低達5×105pfu的滴度足以誘導(dǎo)特異針對HBsAg的高水平抗體。
圖10B顯示了更高滴度Ad.HBsAg.IL2的免疫原性。如圖10B所示，當(dāng)腺病毒載體的滴度從1×107pfu增加到1×108pfu的時候，Ad.HBsAg.IL2的免疫原性顯著增加。
這些結(jié)果證明同時表達乙型肝炎表面抗原和IL-2的腺病毒載體能夠在接種了該載體的小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)強烈的、特異靶向所述病毒抗原的免疫應(yīng)答。這些結(jié)果同樣支持這樣的觀念本發(fā)明提供的遺傳疫苗極有前景被用作人類對抗乙型肝炎病毒的有效疫苗。
b)HBV核心抗原(HBcAg)抗體滴度在不同日期，用1×107pfu的Ad.HBcAg.IL2經(jīng)肌肉內(nèi)注射給予C57BL/6小鼠組(Charles River實驗室，威爾明頓，馬薩諸塞州)。在接種后每兩周從4只動物收集血液，并制備血清。在接種后91天(組3，圖11A)或者84天(組4，圖11B)，額外用1×107pfu的病毒再次激發(fā)這些小鼠。在第二次激發(fā)后，每天從3只動物中收集血液。對純化自大腸桿菌(來自Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)的重組體HBcAg進行ELISA以確定抗體滴度。
如圖11A所示，組3中的小鼠對由腺病毒載體Ad.HBcAg.IL2所表達的肝炎核心抗原HBcAg具有強烈的免疫應(yīng)答，抗體對HBcAg的滴度在接種后大約28天達到最高。用Ad.HBcAg.IL2進行的二次接種又一次增強了免疫應(yīng)答，在二次接種后的大約3天內(nèi)獲得了非常高的滴度。
如圖11B所示，組4中的小鼠對由腺病毒載體Ad.HBcAg.IL2所表達的肝炎核心抗原HBcAg也具有強烈的免疫應(yīng)答，抗體對HBcAg的滴度在接種后大約34天達到最高。用Ad.HBcAg.IL2進行的二次接種又一次增強了免疫應(yīng)答，在二次接種后的大約3天內(nèi)獲得了非常高的滴度。
這些結(jié)果證明同時表達乙型肝炎核心抗原和IL-2的腺病毒載體能夠在接種了該載體的小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)強烈的、特異靶向所述病毒抗原的免疫應(yīng)答。這些結(jié)果又一次支持了這樣的觀念本發(fā)明提供的遺傳疫苗極有前景被用作人類對抗乙型肝炎病毒的有效疫苗。
序列表<110>健方公司<120>針對人免疫缺陷病毒的遺傳疫苗<130>US056PC04086<140>PCT/US02/65112<141>2002-11-01<150>US09/585,599<151>2000-06-02<150>PCT/US01/18238<151>2001-06-04<150>US10/003,035<151>2001-11-01<160>75<210>1<211>7<212>DNA<213>埃博拉病毒<400>1ttttttt 7<210>2<211>7<212>RNA<213>埃博拉病毒<400>2uuuuuuu 7<210>3<211>8<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的RNA編輯信號<400>3uucuucuu 8<210>4<211>7<212>DNA<213>埃博拉病毒<400>4aaaaaaa 7<210>5<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的RNA編輯信號的DNA<400>5aagaagaa 8<210>6<211>6<212>RNA
<213>埃博拉病毒<400>6uuuuuu 6<210>7<211>6<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的RNA編輯信號<400>7uucuuc 6<210>8<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的RNA編輯信號的DNA<400>8ttcttc 6<210>9<211>21<212>PRT<213>人<400>9Ser Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala5 10 15Thr Asp Phe Met Ser Leu20<210>10<211>5<212>PRT<213>埃博拉病毒<400>10Arg Arg Thr Arg Arg5<210>11<211>4<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>11Arg Glu Lys Arg<210>12<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GAG位點的DNA<400>12ggagctggt 9<210>13<211>3
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>GAG位點<400>13Gly Ala Gly<210>14<211>3157<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Env/Tat/Rev<400>14gaattctgca acaactgctg tttatccatt ttcagaattg ggtgtcgaca 50tagcagaata ggcgttactc gacagaggag agcaagaaat ggagccagta 100gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaaaactgc 150ttgtaccaat tgctattgta aaaagtgttg ctttcattgc caagtttgtt 200tcataacaaa agccttaggc atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag 250cgacgaagac ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa 300gcagtaagta gtacatgtaa tgcaacctat acaaatagca atagtagcat 350tagtagtagc aataataata gcaatagttg tgtggtccat agtaatcata 400gaatatagga aaatattaag acaaagaaaa atagacaggt taattgatag 450actaatagaa agagcagaag acagtggcaa tgagagtgaa ggagaaatat 500cagcacttgt ggagatgggg gtggagatgg ggcaccatgc tccttgggat 550gttgatgatc tgtagtgcta cagaaaaatt gtgggtcaca gtctattatg 600gggtacctgt gtggaaggaa gcaaccacca ctctattttg tgcatcagat 650gctaaagcat atgatacaga ggtacataat gtttgggcca cacatgcctg 700tgtacccaca gaccccaacc cacaagaagt agtattggta aatgtgacag 750aaaattttaa catgtggaaa aatgacatgg tagaacagat gcatgaggat 800ataatcagtt tatgggatca aagcctaaag ccatgtgtaa aattaacccc 850actctgtgtt agtttaaagt gcactgattt gaagaatgat actaatacca 900atagtagtag cgggagaatg ataatggaga aaggagagat aaaaaactgc 950tctttcaata tcagcacaag cataagaggt aaggtgcaga aagaatatgc 1000atttttttat aaacttgata taataccaat agataatgat actaccagct 1050atacgttgac aagttgtaac acctcagtca ttacacaggc ctgtccaaag 1100gtatcctttg agccaattcc catacattat tgtgccccgg ctggttttgc 1150gattctaaaa tgtaataata agacgttcaa tggaacagga ccatgtacaa 1200atgtcagcac agtacaatgt acacatggaa ttaggccagt agtatcaact 1250caactgctgt taaatggcag tctggcagaa gaagaggtag taattagatc 1300tgccaatttc acagacaatg ctaaaaccat aatagtacag ctgaaccaat 1350ctgtagaaat taattgtaca agacccaaca acaatacaag aaaaagtatc 1400cgtatccaga gaggaccagg gagagcattt gttacaatag gaaaaatagg 1450aaatatgaga caagcacatt gtaacattag tagagcaaaa tggaataaca 1500ctttaaaaca gatagatagc aaattaagag aacaatttgg aaataataaa 1550acaataatct ttaagcagtc ctcaggaggg gacccagaaa ttgtaacgca 1600cagttttaat tgtggagggg aatttttcta ctgtaattca acacaactgt 1650ttaatagtac ttggtttaat agtacttgga gtactaaagg gtcaaataac 1700actgaaggaa gtgacacaat caccctccca tgcagaataa aacaaattat 1750aaacatgtgg caggaagtag gaaaagcaat gtatgcccct cccatcagtg 1800gacaaattag atgttcatca aatattacag ggctgctatt aacaagagat 1850ggtggtaata gcaacaatga gtccgagatc ttcagacctg gaggaggaga 1900tatgagggac aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa 1950ttgaaccatt aggagtagca cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag 2000agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct ttgttccttg ggttcttggg 2050agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc aatgacgctg acggtacagg 2100ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa tttgctgagg 2150gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa ctcacagtct ggggcatcaa 2200gcagctccag gcaagaatcc tggctgtgga aagataccta aaggatcaac 2250agctcctggg gatttggggt tgctctggaa aactcatttg caccactgct 2300gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa tctctggaac agatttggaa 2350taacatgacc tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct 2400taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa 2450caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa 2500cataacaaat tggctgtggt atataaaatt attcataatg atagtaggag 2550gcttggtagg tttaagaata gtttttgctg tactttctgt agtgaataga 2600gttaggcagg gatattcacc attatcgttt cagacccacc tcccaatccc 2650gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga agaagaaggt ggagagagag 2700acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatccttagc acttatctgg 2750gacgatctgc ggagcctgtg cctcttcagc taccaccgct tgagagactt 2800
actcttgatt gtaacgagga ttgtggaact tctgggacgc agggggtggg 2850aagccctcaa atattggtgg aatctcctac agtattggag tcaggagcta 2900aagaatagtg ctgttagctt gctcaatgcc acagctatag cagtagctga 2950ggggacagat agggttatag aagtagtaca aggagcttat agagctattc 3000gccacatacc tagaagaata agacagggct tggaaaggat tttgctataa 3050gatgggtggc aagtggtcaa aaagtagtgt ggttggatgg cctgctgtaa 3100gggaaagaat gagacgagct gagccagcag cagatggggt gggagcagca 3150tctcgag3157<210>15<211>508<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的IL-2<400>15tcactctctt taatcactac tcacagtaac ctcaactcct gccacaatgt 50acaggatgca actcctgtct tgcattgcac taagtcttgc acttgtcaca 100aacagtgcac ctacttcaag ttctacaaag aaaacacagc tacaactgga 150gcatttactg ctggatttac agatgatttt gaatggaatt aataattaca 200agaatcccaa actcaccagg atgctcacat ttaagtttta catgcccaag 250aaggccacag aactgaaaca tcttcagtgt cttgaagaag aactcaaacc 300tctggaggaa gtgctaaatt tagctcaaag caaaaacttt cacttaagac 350ccagggactt aatcagcaat atcaacgtaa tagttctgga actaaaggga 400tctgaaacaa cattcatgtg tgaatatgct gatgagacag caaccattgt 450agaatttctg aacagatgga ttaccttttg tcaaagcatc atctcaacac 500taacttga 508<210>16<211>2280<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的Env<400>16gaattcgcca ccatgggagt gaaggagaaa tatcagcact tgtggagatg 50ggggtggaga tggggcacca tgctccttgg gatgttgatg atctgtagtg 100ctacagaaaa attgtgggtc acagtctatt atggggtacc tgtgtggaag 150gaagcaacca ccactctatt ttgtgcatca gatgctaaag catatgatac 200agaggtacat aatgtttggg ccacacatgc ctgtgtaccc acagacccca 250acccacaaga agtagtattg gtaaatgtga cagaaaattt taacatgtgg 300aaaaatgaca tggtagaaca gatgcatgag gatataatca gtttatggga 350tcaaagccta aagccatgtg taaaattaac cccactctgt gttagtttaa 400agtgcactga tttgaagaat gatactaata ccaatagtag tagcgggaga 450atgataatgg agaaaggaga gataaaaaac tgctctttca atatcagcac 500aagcataaga ggtaaggtgc agaaagaata tgcatttttt tataaacttg 550atataatacc aatagataat gatactacca gctatacgtt gacaagttgt 600aacacctcag tcattacaca ggcctgtcca aaggtatcct ttgagccaat 650tcccatacat tattgtgccc cggctggttt tgcgattcta aaatgtaata 700ataagacgtt caatggaaca ggaccatgta caaatgtcag cacagtacaa 750tgtacacatg gaattaggcc agtagtatca actcaactgc tgttaaatgg 800cagtctggca gaagaagagg tagtaattag atctgccaat ttcacagaca 850atgctaaaac cataatagta cagctgaacc aatctgtaga aattaattgt 900acaagaccca acaacaatac aagaaaaagt atccgtatcc agagaggacc 950agggagagca tttgttacaa taggaaaaat aggaaatatg agacaagcac 1000attgtaacat tagtagagca aaatggaata acactttaaa acagatagat 1050agcaaattaa gagaacaatt tggaaataat aaaacaataa tctttaagca 1100gtcctcagga ggggacccag aaattgtaac gcacagtttt aattgtggag 1150gggaattttt ctactgtaat tcaacacaac tgtttaatag tacttggttt 1200aatagtactt ggagtactaa agggtcaaat aacactgaag gaagtgacac 1250aatcaccctc ccatgcagaa taaaacaaat tataaacatg tggcaggaag 1300taggaaaagc aatgtatgcc cctcccatca gtggacaaat tagatgttca 1350tcaaatatta cagggctgct attaacaaga gatggtggta atagcaacaa 1400tgagtccgag atcttcagac ctggaggagg agatatgagg gacaattgga 1450gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta 1500gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagactagtg cagtgggaat 1550aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg 1600cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata 1650gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct 1700
gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1750ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc 1800tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag 1850taataaatct ctggaacaga tttggaataa catgacctgg atggagtggg 1900acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa 1950tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa 2000atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata 2050taaaattatt cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt 2100tttgctgtac tttctgtagt gaatagagtt aggcagggat attcaccatt 2150atcgtttcag acccacctcc caatcccgag gggacccgac aggcccgaag 2200gaatagaaga agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta 2250gtgaacggat ccttagcact tatctggtaa 2280<210>17<211>1496<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>全長Gag<400>17ggctagaagg agagaggatg ggtgcgagag cgtcagtatt aagcggggga 50gaattagatc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa 100atataaatta aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgactac 150aaccatccct tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt atataataca 200gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa 250ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt aagaaaaaag 300cacagcaagc agcagctgac acaggacaca gcagtcaggt cagccaaaat 350taccctatag tgcagaacat ccaggggcaa atggtacatc aggccatatc 400acctagaact ttaaatgcat gggtaaaagt agtagaagag aaggctttca 450gcccagaagt aatacccatg ttttcagcat tatcagaagg agccacccca 500caagatttaa acaccatgct aaacacagtg gggggacatc aagcagccat 550gcaaatgtta aaagagacca tcaatgagga agctgcagaa tgggatagag 600tacatccagt gcatgcaggg cctattgcac caggccagat gagagaacca 650aggggaagtg acatagcagg aactactagt acccttcagg aacaaatagg 700atggatgaca aataatccac ctatcccagt aggagaaatt tataaaagat 750ggataatcct gggattaaat aaaatagtaa gaatgtatag ccctaccagc 800attctggaca taagacaagg accaaaagaa ccttttagag actatgtaga 850ccggttctat aaaactctaa gagccgagca agcttcacag gaggtaaaaa 900attggatgac agaaaccttg ttggtccaaa atgcgaaccc agattgtaag 950actattttaa aagcattggg accagcggct acactagaag aaatgatgac 1000agcatgtcag ggagtaggag gacccggcca taaggcaaga gttttggctg 1050aagcaatgag ccaagtaaca aatacagcta ccataatgat gcagagaggc 1100aattttagga accaaagaaa gatggttaag tgtttcaatt gtggcaaaga 1150agggcacaca gccagaaatt gcagggcccc taggaaaaag ggctgttgga 1200aatgtggaaa ggaaggacac caaatgaaag attgtactga gagacaggct 1250aattttttag ggaagatctg gccttcctac aagggaaggc cagggaattt 1300tcttcagagc agaccagagc caacagcccc accatttctt cagagcagac 1350cagagccaac agccccacca gaagagagct tcaggtctgg ggtagagaca 1400acaactcccc ctcagaagca ggagccgata gacaaggaac tgtatccttt 1450aacttccctc agatcactct ttggcaacga cccctcgtca caataa 1496<210>18<211>492<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>18Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg5 10 15Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys20 25 30Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Leu Gln35 40 45Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn50 55 60Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys65 70 75Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys80 85 90Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser95 100 105
Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly110 115 120Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp125 130 135Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro140 145 150Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn155 160 165Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met170 175 180Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val185 190 195His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu200 205 210Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu215 220 225Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu230 235 240Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg245 250 255Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys260 265 270Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg275 280 285Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr290 295 300Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys305 310 315Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys320 325 330Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu335 340 345Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Thr Ala Thr Ile Met Met Gln Arg350 355 360Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys365 370 375Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys380 385 390Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp395 400 405Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser410 415 420Tyr Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro425 430 435Thr Ala Pro Pro Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro440 445 450Pro Glu Glu Ser Phe Arg Ser Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro455 460 465Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser470 475 480Leu Arg Ser Leu Phe Gly Asn Asp Pro Ser Ser Gln485 490<210>19<211>2941<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>來自HIV毒株pNL4-3的修飾的Env<400>19gaattctgca acaactgctg tttatccatt tcagaattgg gtgtcgacat 50agcagaatag gcgttactcg acagaggaga gcaagaaatg gagccagtag 100atcctagact agagccctgg aagcatccag gaagtcagcc taaaactgct 150tgtaccaatt gctattgtaa aaagtgttgc tttcattgcc aagtttgttt 200catgacaaaa gccttaggca tctcctatgg caggaagaag cggagacagc 250gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc atcaagcttc tctatcaaag 300cagtaagtag tacatgtaat gcaacctata atagtagcaa tagtagcatt 350agtagtagca ataataatag caatagttgt gtggtccata gtaatcatag 400aatataggaa aatattaaga caaagaaaaa tagacaggtt aattgataga 450ctaatagaaa gagcagaaga cagtggcaat gagagtgaag gagaagtatc 500agcacttgtg gagatggggg tggaaatggg gcaccatgct ccttgggata 550ttgatgatct gtagtgctac agaaaaattg tgggtcacag tctattatgg 600
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<223>來自pNL4-3的修飾的Env/Tat/Rev<400>20gaattctgca acaactgctg tttatccatt tcagaattgg gtgtcgacat 50agcagaatag gcgttactcg acagaggaga gcaagaaatg gagccagtag 100atcctagact agagccctgg aagcatccag gaagtcagcc taaaactgct 150tgtaccaatt gctattgtaa aaagtgttgc tttcattgcc aagtttgttt 200catgacaaaa gccttaggca tctcctatgg caggaagaag cggagacagc 250gacgaagagc tcatcagaac agtcagactc atcaagcttc tctatcaaag 300cagtaagtag tacatgtaat gcaacctata atagtagcaa tagtagcatt 350agtagtagca ataataatag caatagttgt gtggtccata gtaatcatag 400aatataggaa aatattaaga caaagaaaaa tagacaggtt aattgataga 450ctaatagaaa gagcagaaga cagtggcaat gagagtgaag gagaagtatc 500agcacttgtg gagatggggg tggaaatggg gcaccatgct ccttgggata 550ttgatgatct gtagtgctac agaaaaattg tgggtcacag tctattatgg 600ggtacctgtg tggaaggaag caaccaccac tctattttgt gcatcagatg 650ctaaagcata tgatacagag gtacataatg tttgggccac acatgcctgt 700gtacccacag accccaaccc acaagaagta gtattggtaa atgtgacaga 750aaattttaac atgtggaaaa atgacatggt agaacagatg catgaggata 800taatcagttt atgggatcaa agcctaaagc catgtgtaaa attaacccca 850
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<223>來自毒株BH10的修飾的Env/Tat/Rev<400>21gaattctgca acaactgctg tttatccatt ttcagaattg ggtgtcgaca 50tagcagaata ggcgttactc gacagaggag agcaagaaat ggagccagta 100gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaaaactgc 150ttgtaccaat tgctattgta aaaagtgttg ctttcattgc caagtttgtt 200tcataacaaa agccttaggc atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag 250cgacgaagac ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa 300gcagtaagta gtacatgtaa tgcaacctat acaaatagca atagtagcat 350tagtagtagc aataataata gcaatagttg tgtggtccat agtaatcata 400gaatatagga aaatattaag acaaagaaaa atagacaggt taattgatag 450actaatagaa agagcagaag acagtggcaa tgagagtgaa ggagaaatat 500cagcacttgt ggagatgggg gtggagatgg ggcaccatgc tccttgggat 550gttgatgatc tgtagtgcta cagaaaaatt gtgggtcaca gtctattatg 600gggtacctgt gtggaaggaa gcaaccacca ctctattttg tgcatcagat 650gctaaagcat atgatacaga ggtacataat gtttgggcca cacatgcctg 700tgtacccaca gaccccaacc cacaagaagt agtattggta aatgtgacag 750aaaattttaa catgtggaaa aatgacatgg tagaacagat gcatgaggat 800ataatcagtt tatgggatca aagcctaaag ccatgtgtaa aattaacccc 850actctgtgtt agtttaaagt gcactgattt gaagaatgat actaatacca 900atagtagtag cgggagaatg ataatggaga aaggagagat aaaaaactgc 950tctttcaata tcagcacaag cataagaggt aaggtgcaga aagaatatgc 1000atttttttat aaacttgata taataccaat agataatgat actaccagct 1050atacgttgac aagttgtaac acctcagtca ttacacaggc ctgtccaaag 1100gtatcctttg agccaattcc catacattat tgtgccccgg ctggttttgc 1150gattctaaaa tgtaataata agacgttcaa tggaacagga ccatgtacaa 1200atgtcagcac agtacaatgt acacatggaa ttaggccagt agtatcaact 1250caactgctgt taaatggcag tctggcagaa gaagaggtag taattagatc 1300
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<223>來自毒株BH10的修飾的Env/Nef<400>22gaattcgcca ccatgggagt gaaggagaaa tatcagcact tgtggagatg 50ggggtggaga tggggcacca tgctccttgg gatgttgatg atctgtagtg 100ctacagaaaa attgtgggtc acagtctatt atggggtacc tgtgtggaag 150gaagcaacca ccactctatt ttgtgcatca gatgctaaag catatgatac 200agaggtacat aatgtttggg ccacacatgc ctgtgtaccc acagacccca 250acccacaaga agtagtattg gtaaatgtga cagaaaattt taacatgtgg 300aaaaatgaca tggtagaaca gatgcatgag gatataatca gtttatggga 350tcaaagccta aagccatgtg taaaattaac cccactctgt gttagtttaa 400agtgcactga tttgaagaat gatactaata ccaatagtag tagcgggaga 450atgataatgg agaaaggaga gataaaaaac tgctctttca atatcagcac 500aagcataaga ggtaaggtgc agaaagaata tgcatttttt tataaacttg 550atataatacc aatagataat gatactacca gctatacgtt gacaagttgt 600aacacctcag tcattacaca ggcctgtcca aaggtatcct ttgagccaat 650tcccatacat tattgtgccc cggctggttt tgcgattcta aaatgtaata 700ataagacgtt caatggaaca ggaccatgta caaatgtcag cacagtacaa 750tgtacacatg gaattaggcc agtagtatca actcaactgc tgttaaatgg 800cagtctggca gaagaagagg tagtaattag atctgccaat ttcacagaca 850atgctaaaac cataatagta cagctgaacc aatctgtaga aattaattgt 900acaagaccca acaacaatac aagaaaaagt atccgtatcc agagaggacc 950agggagagca tttgttacaa taggaaaaat aggaaatatg agacaagcac 1000attgtaacat tagtagagca aaatggaata acactttaaa acagatagat 1050
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<223>來自毒株BH10的修飾的Env/Tat<400>23gaattctgca acaactgctg tttatccatt ttcagaattg ggtgtcgaca 50tagcagaata ggcgttactc gacagaggag agcaagaaat ggagccagta 100gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaaaactgc 150ttgtaccaat tgctattgta aaaagtgttg ctttcattgc caagtttgtt 200tcataacaaa agccttaggc atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag 250cgacgaagac ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa 300gcagtaagta gtacatgtaa tgcaacctat acaaatagca atagtagcat 350tagtagtagc aataataata gcaatagttg tgtggtccat agtaatcata 400gaatatagga aaatattaag acaaagaaaa atagacaggt taattgatag 450actaatagaa agagcagaag acagtggcaa tgagagtgaa ggagaaatat 500cagcacttgt ggagatgggg gtggagatgg ggcaccatgc tccttgggat 550gttgatgatc tgtagtgcta cagaaaaatt gtgggtcaca gtctattatg 600gggtacctgt gtggaaggaa gcaaccacca ctctattttg tgcatcagat 650gctaaagcat atgatacaga ggtacataat gtttgggcca cacatgcctg 700tgtacccaca gaccccaacc cacaagaagt agtattggta aatgtgacag 750aaaattttaa catgtggaaa aatgacatgg tagaacagat gcatgaggat 800ataatcagtt tatgggatca aagcctaaag ccatgtgtaa aattaacccc 850actctgtgtt agtttaaagt gcactgattt gaagaatgat actaatacca 900atagtagtag cgggagaatg ataatggaga aaggagagat aaaaaactgc 950tctttcaata tcagcacaag cataagaggt aaggtgcaga aagaatatgc 1000atttttttat aaacttgata taataccaat agataatgat actaccagct 1050atacgttgac aagttgtaac acctcagtca ttacacaggc ctgtccaaag 1100gtatcctttg agccaattcc catacattat tgtgccccgg ctggttttgc 1150gattctaaaa tgtaataata agacgttcaa tggaacagga ccatgtacaa 1200atgtcagcac agtacaatgt acacatggaa ttaggccagt agtatcaact 1250caactgctgt taaatggcag tctggcagaa gaagaggtag taattagatc 1300tgccaatttc acagacaatg ctaaaaccat aatagtacag ctgaaccaat 1350
ctgtagaaat taattgtaca agacccaaca acaatacaag aaaaagtatc 1400cgtatccaga gaggaccagg gagagcattt gttacaatag gaaaaatagg 1450aaatatgaga caagcacatt gtaacattag tagagcaaaa tggaataaca 1500ctttaaaaca gatagatagc aaattaagag aacaatttgg aaataataaa 1550acaataatct ttaagcagtc ctcaggaggg gacccagaaa ttgtaacgca 1600cagttttaat tgtggagggg aatttttcta ctgtaattca acacaactgt 1650ttaatagtac ttggtttaat agtacttgga gtactaaagg gtcaaataac 1700actgaaggaa gtgacacaat caccctccca tgcagaataa aacaaattat 1750aaacatgtgg caggaagtag gaaaagcaat gtatgcccct cccatcagtg 1800gacaaattag atgttcatca aatattacag ggctgctatt aacaagagat 1850ggtggtaata gcaacaatga gtccgagatc ttcagacctg gaggaggaga 1900tatgagggac aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa 1950ttgaaccatt aggagtagca cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag 2000actagtgcag tgggaatagg agctttgttc cttgggttct tgggagcagc 2050aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac gctgacggta caggccagac 2100aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct gagggctatt 2150gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 2200ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc 2250tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct 2300tggaatgcta gttggagtaa taaatctctg gaacagattt ggaataacat 2350gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa caattacaca agcttaatac 2400actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa tgaacaagaa 2450ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac 2500aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg 2550taggtttaag aatagttttt gctgtacttt ctgtagtgaa tagagttagg 2600cagggatatt caccattatc gtttcagacc cacctcccaa tcccgagggg 2650acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga aggtggagag agagacagag 2700acagatccat tcgattagtg aacggatcct tagcacttat ctggtaa2747<210>24<211>2583<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>修飾的Env<400>24gaattcgcca ccatgggagt gaaggagaaa tatcagcact tgtggagatg 50ggggtggaga tggggcacca tgctccttgg gatgttgatg atctgtagtg 100ctacagaaaa attgtgggtc acagtctatt atggggtacc tgtgtggaag 150gaagcaacca ccactctatt ttgtgcatca gatgctaaag catatgatac 200agaggtacat aatgtttggg ccacacatgc ctgtgtaccc acagacccca 250acccacaaga agtagtattg gtaaatgtga cagaaaattt taacatgtgg 300aaaaatgaca tggtagaaca gatgcatgag gatataatca gtttatggga 350tcaaagccta aagccatgtg taaaattaac cccactctgt gttagtttaa 400agtgcactga tttgaagaat gatactaata ccaatagtag tagcgggaga 450atgataatgg agaaaggaga gataaaaaac tgctctttca atatcagcac 500aagcataaga ggtaaggtgc agaaagaata tgcatttttt tataaacttg 550atataatacc aatagataat gatactacca gctatacgtt gacaagttgt 600aacacctcag tcattacaca ggcctgtcca aaggtatcct ttgagccaat 650tcccatacat tattgtgccc cggctggttt tgcgattcta aaatgtaata 700ataagacgtt caatggaaca ggaccatgta caaatgtcag cacagtacaa 750tgtacacatg gaattaggcc agtagtatca actcaactgc tgttaaatgg 800cagtctggca gaagaagagg tagtaattag atctgccaat ttcacagaca 850atgctaaaac cataatagta cagctgaacc aatctgtaga aattaattgt 900acaagaccca acaacaatac aagaaaaagt atccgtatcc agagaggacc 950agggagagca tttgttacaa taggaaaaat aggaaatatg agacaagcac 1000attgtaacat tagtagagca aaatggaata acactttaaa acagatagat 1050agcaaattaa gagaacaatt tggaaataat aaaacaataa tctttaagca 1100gtcctcagga ggggacccag aaattgtaac gcacagtttt aattgtggag 1150gggaattttt ctactgtaat tcaacacaac tgtttaatag tacttggttt 1200aatagtactt ggagtactaa agggtcaaat aacactgaag gaagtgacac 1250aatcaccctc ccatgcagaa taaaacaaat tataaacatg tggcaggaag 1300taggaaaagc aatgtatgcc cctcccatca gtggacaaat tagatgttca 1350tcaaatatta cagggctgct attaacaaga gatggtggta atagcaacaa 1400tgagtccgag atcttcagac ctggaggagg agatatgagg gacaattgga 1450gaagtgaatt atataaatat aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta 1500gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt 1550gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta 1600tgggcgcagc gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct 1650ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca 1700gcatctgttg caactcacag tctggggcat caagcagctc caggcaagaa 1750tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg 1800ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag 1850
ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaataacatg acctggatgg 1900agtgggacag agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt 1950gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt 2000agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt 2050ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga 2100atagtttttg ctgtactttc tgtagtgaat agagttaggc agggatattc 2150accattatcg tttcagaccc acctcccaat cccgagggga cccgacaggc 2200ccgaaggaat agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt 2250cgattagtga acggatcctt agcacttatc tgggacgatc tgcggagcct 2300gtgcctcttc agctaccacc gcttgagaga cttactcttg attgtaacga 2350ggattgtgga acttctggga cgcagggggt gggaagccct caaatattgg 2400tggaatctcc tacagtattg gagtcaggag ctaaagaata gtgctgttag 2450cttgctcaat gccacagcta tagcagtagc tgaggggaca gatagggtta 2500tagaagtagt acaaggagct tatagagcta ttcgccacat acctagaaga 2550ataagacagg gcttggaaag gattttgcta taa 2583<210>25<211>108<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>25tgtacaagac ccaacaacaa tacaagaaaa agtatccgta tccagagagg 50accagggaga gcatttgtta caataggaaa aataggaaat atgagacaag 100cacattgt 108<210>26<211>105<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>26tgtaccagac ctaacaacaa tacaagaaaa agtgtacgta taggaccagg 50acaaacattc tatgcaacag gtgatataat aggggatata agacaagcac 100attgt 105<210>27<211>105<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>27tgtacgagac ccaacaataa tacaagaaaa agtataagga taggaccagg 50acaagcattc tatgcaacag gagaaataat aggagatata agacaagcac 100attgt 105<210>28<211>102<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>28tgcacaaggc cctacaacaa tataagacaa aggaccccca taggactagg 50gcaagcactc tatacaacaa gaagaataga agatataaga agagcacatt 100gt 102<210>29<211>105<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>29tgtaccagac cctccaccaa tacaagaaca agtatacgta taggaccagg 50acaagtattc tatagaacag gagacataac aggagatata agaaaagcat 100attgt 105<210>30<211>105<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型
<400>30tgtacaagac ccaacaacaa tacaagaaaa agaatatctt taggaccagg 50acgagtattt tatacagcag gagaaataat aggagacatc agaaaggcac 100attgt 105<210>31<211>105<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>31tgtaccagac ctaataacaa tacaagaaaa agtataactt ttgcaccagg 50acaagcgctc tatgcaacag gtgaaataat aggagatata agacaagcac 100attgt 105<210>32<211>2562<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>具有多進化枝v3環(huán)的Env<400>32atgagagtga aggagaaata tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg 50gggcaccatg ctccttggga tgttgatgat ctgtagtgct acagaaaaat 100tgtgggtcac agtctattat ggggtacctg tgtggaagga agcaaccacc 150actctatttt gtgcatcaga tgctaaagca tatgatacag aggtacataa 200tgtttgggcc acacatgcct gtgtacccac agaccccaac ccacaagaag 250tagtattggt aaatgtgaca gaaaatttta acatgtggaa aaatgacatg 300gtagaacaga tgcatgagga tataatcagt ttatgggatc aaagcctaaa 350gccatgtgta aaattaaccc cactctgtgt tggagctggt agttgtaaca 400cctcagtcat tacacaggcc tgtccaaagg tatcctttga gccaattccc 450atacattatt gtgccccggc tggttttgcg attctaaaat gtaataataa 500gacgttcaat ggaacaggac catgtacaaa tgtcagcaca gtacaatgta 550cacatggaat taggccagta gtatcaactc aactgctgtt aaatggcagt 600ctggcagaag aagaggtagt aattagatct gccaatttca cagacaatgc 650taaaaccata atagtacagc tgaaccaatc tgtagaaatt aattgtacaa 700gacccaacaa caatacaaga aaaagtatcc gtatccagag aggaccaggg 750agagcatttg ttacaatagg aaaaatagga aatatgagac aagcacattg 800tctcgggtgt accagaccta acaacaatac aagaaaaagt gtacgtatag 850gaccaggaca aacattctat gcaacaggtg atataatagg ggatataaga 900caagcacatt gttgtacgag acccaacaat aatacaagaa aaagtataag 950gataggacca ggacaagcat tctatgcaac aggagaaata ataggagata 1000taagacaagc acattgttgc acaaggccct acaacaatat aagacaaagg 1050acccccatag gactagggca agcactctat acaacaagaa gaatagaaga 1100tataagaaga gcacattgtt gtaccagacc ctccaccaat acaagaacaa 1150gtatacgtat aggaccagga caagtattct atagaacagg agacataaca 1200ggagatataa gaaaagcata ttgtggatcc tgtacaagac ccaacaacaa 1250tacaagaaaa agaatatctt taggaccagg acgagtattt tatacagcag 1300gagaaataat aggagacatc agaaaggcac attgttgtac cagacctaat 1350aacaatacaa gaaaaagtat aacttttgca ccaggacaag cgctctatgc 1400aacaggtgaa ataataggag atataagaca agcacattgt ctcgggaaca 1450ttagtagagc aaaatggaat aacactttaa aacagataga tagcaaatta 1500agagaacaat ttggaaataa taaaacaata atctttaagc agtcctcagg 1550aggggaccca gaaattgtaa cgcacagttt taattgtgga ggggaatttt 1600tctactgtaa ttcaacacaa ctgtttaata gtacttggtt taatagtact 1650tggagtacta aagggtcaaa taacactgaa ggaagtgaca caatcaccct 1700cccatgcaga ataaaacaaa ttataaacat gtggcaggaa gtaggaaaag 1750caatgtatgc ccctcccatc agtggacaaa ttagatgttc atcaaatatt 1800acagggctgc tattaacaag agatggtggt aatagcaaca atgagtccga 1850gatcttcaga cctggaggag gagatatgag ggacaattgg agaagtgaat 1900tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt agcacccacc 1950aaggcaaaga gaagagtggt gcagactagt gcagtgggaa taggagcttt 2000gttccttggg ttcttgggag cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa 2050tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat tgtctggtat agtgcagcag 2100cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc tgttgcaact 2150cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 2200gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa 2250ctcatttgca ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc 2300tctggaacag atttggaata acatgacctg gatggagtgg gacagagaaa 2350ttaacaatta cacaagctta atacactcct taattgaaga atcgcaaaac 2400
cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata aatgggcaag 2450tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaatcgt 2500ggctgctgct gctcctgctc tccctctccc tcctccaggc cacggatttc 2550atgtccctgt ga 2562<210>33<211>853<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有多進化枝v3環(huán)的修飾的Env<400>33Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp5 10 15Arg Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala20 25 30Thr Glu Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp35 40 45Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala50 55 60Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val65 70 75Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr80 85 90Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His95 100 105Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val110 115 120Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Gly Ala Gly Ser Cys Asn Thr Ser125 130 135Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro140 145 150Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn155 160 165Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr170 175 180Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu185 190 195Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg Ser200 205 210Ala Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn215 220 225Gln Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg230 235 240Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr245 250 255Ile Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Leu Gly Cys260 265 270Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Val Arg Ile Gly Pro275 280 285Gly Gln Thr Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg290 295 300Gln Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser305 310 315Ile Arg Ile Gly Pro Gly Gln Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Glu Ile320 325 330Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Tyr Asn335 340 345Asn Ile Arg Gln Arg Thr Pro Ile Gly Leu Gly Gln Ala Leu Tyr350 355 360Thr Thr Arg Arg Ile Glu Asp Ile Arg Arg Ala His Cys Cys Thr365 370 375Arg Pro Ser Thr Asn Thr Arg Thr Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly380 385 390Gln Val Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Thr Gly Asp Ile Arg Lys395 400 405Ala Tyr Cys Gly Ser Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys410 415 420Arg Ile Ser Leu Gly Pro Gly Arg Val Phe Tyr Thr Ala Gly Glu425 430 435Ile Ile Gly Asp Ile Arg Lys Ala His Cys Cys Thr Arg Pro Asn440 445 450
Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Phe Ala Pro Gly Gln Ala Leu455 460 465Tyr Ala Thr Gly Glu Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys470 475 480Leu Gly Asn Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gln485 490 495Ile Asp Ser Lys Leu Arg Glu Gln Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile500 505 510Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His515 520 525Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Gln530 535 540Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp Ser Thr Lys Gly545 550 555Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg560 565 570Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met575 580 585Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn Ile590 595 600Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Ser Asn Asn Glu605 610 615Ser Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp620 625 630Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu635 640 645Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Thr Ser650 655 660Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala665 670 675Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala680 685 690Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu695 700 705Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp710 715 720Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr725 730 735Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys740 745 750Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn755 760 765Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp770 775 780Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile785 790 795Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu800 805 810Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr815 820 825Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Ser Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu830 835 840Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Thr Asp Phe Met Ser Leu845 850<210>34<211>1092<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒l型<400>34atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatgggaaaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacatatagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctgttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatcccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaaccctctattg tgtgcatcaa aggatagaga taaaagacac caaggaagctttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aagcacagcaagcagcagct gacacaggac acagcagtca ggtcagccaa aattaccctatagtgcagaa catccagggg caaatggtac atcaggccat atcacctagaactttaaatg catgggtaaa agtagtagaa gagaaggctt tcagcccagaagtaataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc ccacaagatttaaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg
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tgcagggcct attgcaccag gccagatgag agaaccaagg ggaagtgaca 400tagcaggaac tactagtacc cttcaggaac aaataggatg gatgacaaat 450aatccaccta tcccagtagg agaaatttat aaaagatgga taatcctggg 500attaaataaa atagtaagaa tgtatagccc taccagcatt ctggacataa 550gacaaggacc aaaagaacct tttagagact atgtagaccg gttctataaa 600actctaagag ccgagcaagc ttcacaggag gtaaaaaatt ggatgacaga 650aaccttgttg gtccaaaatg cgaacccaga ttgtaagact attttaaaag 700cattgggacc agcggctaca ctagaagaaa tgatgacagc atgtcaggga 750gtaggaggac ccggccataa ggcaagagtt ttgtaa786<210>48<211>915<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<400>48atgagagtga aggagaaata tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg 50gggcaccatg ctccttggga tgttgatgat ctgtagtgct cctatagtgc 100agaacatcca ggggcaaatg gtacatcagg ccatatcacc tagaacttta 150aatgcatggg taaaagtagt agaagagaag gctttcagcc cagaagtaat 200acccatgttt tcagcattat cagaaggagc caccccacaa gatttaaaca 250ccatgctaaa cacagtgggg ggacatcaag cagccatgca aatgttaaaa 300gagaccatca atgaggaagc tgcagaatgg gatagagtac atccagtgca 350tgcagggcct attgcaccag gccagatgag agaaccaagg ggaagtgaca 400tagcaggaac tactagtacc cttcaggaac aaataggatg gatgacaaat 450aatccaccta tcccagtagg agaaatttat aaaagatgga taatcctggg 500attaaataaa atagtaagaa tgtatagccc taccagcatt ctggacataa 550gacaaggacc aaaagaacct tttagagact atgtagaccg gttctataaa 600actctaagag ccgagcaagc ttcacaggag gtaaaaaatt ggatgacaga 650aaccttgttg gtccaaaatg cgaacccaga ttgtaagact attttaaaag 700cattgggacc agcggctaca ctagaagaaa tgatgacagc atgtcaggga 750gtaggaggac ccggccataa ggcaagagtt ttgttattca taatgatagt 800aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctgtagtga 850atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca 900atcccgaggg gataa 915<210>49<211>232<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>49Met Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala5 10 15Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu20 25 30Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser35 40 45Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val50 55 60Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn65 70 75Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly80 85 90Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile95 100 105Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr110 115 120Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile125 130 135Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser140 145 150Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr155 160 165Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln170 175 180Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala185 190 195Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala200 205 210Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro215 220 225Gly His Lys Ala Arg Val Leu
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<223>修飾的Env/Tat<400>52gaattctgca acaactgctg tttatccatt ttcagaattg ggtgtcgaca 50tagcagaata ggcgttactc gacagaggag agcaagaaat ggagccagta 100gatcctagac tagagccctg gaagcatcca ggaagtcagc ctaaaactgc 150ttgtaccaat tgctattgta aaaagtgttg ctttcattgc caagtttgtt 200tcataacaaa agccttaggc atctcctatg gcaggaagaa gcggagacag 250cgacgaagac ctcctcaagg cagtcagact catcaagttt ctctatcaaa 300gcagtaagta gtacatgtaa tgcaacctat acaaatagca atagtagcat 350tagtagtagc aataataata gcaatagttg tgtggtccat agtaatcata 400gaatatagga aaatattaag acaaagaaaa atagacaggt taattgatag 450actaatagaa agagcagaag acagtggcaa tgagagtgaa ggagaaatat 500cagcacttgt ggagatgggg gtggagatgg ggcaccatgc tccttgggat 550gttgatgatc tgtagtgcta cagaaaaatt gtgggtcaca gtctattatg 600gggtacctgt gtggaaggaa gcaaccacca ctctattttg tgcatcagat 650gctaaagcat atgatacaga ggtacataat gtttgggcca cacatgcctg 700tgtacccaca gaccccaacc cacaagaagt agtattggta aatgtgacag 750aaaattttaa catgtggaaa aatgacatgg tagaacagat gcatgaggat 800ataatcagtt tatgggatca aagcctaaag ccatgtgtaa aattaacccc 850actctgtgtt ggagctggta gttgtaacac ctcagtcatt acacaggcct 900gtccaaaggt atcctttgag ccaattccca tacattattg tgccccggct 950ggttttgcga ttctaaaatg taataataag acgttcaatg gaacaggacc 1000atgtacaaat gtcagcacag tacaatgtac acatggaatt aggccagtag 1050tatcaactca actgctgtta aatggcagtc tggcagaaga agaggtagta 1100attagatctg ccaatttcac agacaatgct aaaaccataa tagtacagct 1150gaaccaatct gtagaaatta attgtacaag acccaacaac aatacaagaa 1200aaagtatccg tatccagaga ggaccaggga gagcatttgt tacaatagga 1250aaaataggaa atatgagaca agcacattgt ctcgggtgta ccagacctaa 1300caacaataca agaaaaagtg tacgtatagg accaggacaa acattctatg 1350caacaggtga tataataggg gatataagac aagcacattg ttgtacgaga 1400cccaacaata atacaagaaa aagtataagg ataggaccag gacaagcatt 1450ctatgcaaca ggagaaataa taggagatat aagacaagca cattgttgca 1500caaggcccta caacaatata agacaaagga cccccatagg actagggcaa 1550gcactctata caacaagaag aatagaagat ataagaagag cacattgttg 1600taccagaccc tccaccaata caagaacaag tatacgtata ggaccaggac 1650aagtattcta tagaacagga gacataacag gagatataag aaaagcatat 1700tgtggatcct gtacaagacc caacaacaat acaagaaaaa gaatatcttt 1750aggaccagga cgagtatttt atacagcagg agaaataata ggagacatca 1800gaaaggcaca ttgttgtacc agacctaata acaatacaag aaaaagtata 1850acttttgcac caggacaagc gctctatgca acaggtgaaa taataggaga 1900tataagacaa gcacattgtc tcgggtgtac cagacctaac aacaatacaa 1950gaaaaagtgt acgtatagga ccaggacaaa cattctatgc aacaggtgat 2000ataatagggg atataagaca agcacattgt tgtacgagac ccaacaataa 2050tacaagaaaa agtataagga taggaccagg acaagcattc tatgcaacag 2100gagaaataat aggagatata agacaagcac attgttgcac aaggccctac 2150aacaatataa gacaaaggac ccccatagga ctagggcaag cactctatac 2200aacaagaaga atagaagata taagaagagc acattgttgt accagaccct 2250
ccaccaatac aagaacaagt atacgtatag gaccaggaca agtattctat 2300agaacaggag acataacagg agatataaga aaagcatatt gtggatcctg 2350tacaagaccc aacaacaata caagaaaaag aatatcttta ggaccaggac 2400gagtatttta tacagcagga gaaataatag gagacatcag aaaggcacat 2450tgttgtacca gacctaataa caatacaaga aaaagtataa cttttgcacc 2500aggacaagcg ctctatgcaa caggtgaaat aataggagat ataagacaag 2550cacattgtct cgggaacatt agtagagcaa aatggaataa cactttaaaa 2600cagatagata gcaaattaag agaacaattt ggaaataata aaacaataat 2650ctttaagcag tcctcaggag gggacccaga aattgtaacg cacagtttta 2700attgtggagg ggaatttttc tactgtaatt caacacaact gtttaatagt 2750acttggttta atagtacttg gagtactaaa gggtcaaata acactgaagg 2800aagtgacaca atcaccctcc catgcagaat aaaacaaatt ataaacatgt 2850ggcaggaagt aggaaaagca atgtatgccc ctcccatcag tggacaaatt 2900agatgttcat caaatattac agggctgcta ttaacaagag atggtggtaa 2950tagcaacaat gagtccgaga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 3000acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca 3050ttaggagtag cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agactagtgc 3100agtgggaata ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca 3150ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg tacaggccag acaattattg 3200tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta ttgaggcgca 3250acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 3300gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 3350tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc 3400tagttggagt aataaatctc tggaacagat ttggaataac atgacctgga 3450tggagtggga cagagaaatt aacaattaca caagcttaat acactcctta 3500attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag aattattgga 3550attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 3600tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 3650agaatagttt ttgctgtact ttctgtagtg aatagagtta ggcagggata 3700ttcaccatta tcgtttcaga cccacctccc aatcccgagg ggacccgaca 3750ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag agagagacag agacagatcc 3800attcgattag tgaacggatc cttagcactt atctggtaa 3839<210>53<211>1101<212>PRT<213>人工序列<220>
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agtaataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc ccacaagatt 550taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtacatcc 650agtgcatgca gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa 700gtgacatagc aggaactact agtacccttc aggaacaaat aggatggatg 750acaaataatc cacctatccc agtaggagaa atttataaaa gatggataat 800cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc agcattctgg 850acataagaca aggaccaaaa gaacctttta gagactatgt agaccggttc 900tataaaactc taagagccga gcaagcttca caggaggtaa aaaattggat 950gacagaaacc ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt 1000taaaagcatt gggaccagcg gctacactag aagaaatgat gacagcatgt 1050cagggagtag gaggacccgg ccataaggca agagttttgg ctgaagcaat 1100gagccaagta acaaatacag ctaccataat gatgcagaga ggcaatttta 1150ggaaccaaag aaagatggtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200acagccagaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg 1250aaaggaagga caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaatttct 1300ttagggaaga tctggccttc ctacaaggga aggccaggga attttcttca 1350gagcagacca gagccaacag ccccaccatt tcttcagagc agaccagagc 1400caacagcccc accagaagag agcttcaggt ctggggtaga gacaacaact 1450ccccctcaga agcaggagcc gatagacaag gaactgtatc ctttaacttc 1500cctcagatca ctctttggca acgacccctc gtcacaataa agataggggg 1550gcaactaaag gaagctctat tagatacagg agcagatgat acagtattag 1600aagaaatgag tttgccagga agatggaaac caaaaatgat agggggaatt 1650ggaggtttta tcaaagtaag acagtatgat cagatactca tagaaatctg 1700tggacataaa gctataggta cagtattagt aggacctaca cctgtcaaca 1750taattggaag aaatctgttg actcagattg gttgcacttt aaatttttaa 1800<210>59<211>599<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Gag-PI<400>59Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg5 10 15Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys20 25 30Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala35 40 45Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile50 55 60Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu65 70 75Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln80 85 90Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu95 100 105Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala110 115 120Asp Thr Gly His Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val125 130 135Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro Arg140 145 150Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser155 160 165Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr170 175 180Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln185 190 195Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala200 205 210Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro215 220 225Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr230 235 240Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro245 250 255Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu260 265 270Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile275 280 285
Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe290 295 300Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn305 310 315Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys320 325 330Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu335 340 345Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala350 355 360Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Thr Ala Thr365 370 375Ile Met Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Met Val380 385 390Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys395 400 405Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly410 415 420His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Phe Arg425 430 435Glu Asp Leu Ala Phe Leu Gln Gly Lys Ala Arg Glu Phe Ser Ser440 445 450Glu Gln Thr Arg Ala Asn Ser Pro Thr Ile Ser Ser Glu Gln Thr455 460 465Arg Ala Asn Ser Pro Thr Arg Arg Glu Leu Gln Val Trp Gly Arg470 475 480Asp Asn Asn Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ala Asp Arg Gln Gly Thr485 490 495Val Ser Phe Asn Phe Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu500 505 510Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp515 520 525Thr Gly Ala Asp Asp Thr Val Leu Glu Glu Met Ser Leu Pro Gly530 535 540Arg Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys545 550 555Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys560 565 570Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile575 580 585Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln Ile Gly Cys Thr Leu Asn Phe590 595<210>60<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>60aaatcaaccg gaattgaatt ccctcgggtg taccagacct aacaacaata 50c 51<210>61<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>61attgttgggt ctcgtacaac aatgtgcttg tcttatatcc cc 42<210>62<211>41<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>62ggggatataa gacaagcaca ttgtacgaga cccaacaata c 41<210>63<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>63gttgtagggc cttgtgcaac aatgtgcttg tcttatatc 39<210>64<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>64gatataagac aagcacattg ttgcacaagg ccctacaac 39<210>65<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>65ggtggagggt ctggtacaac aatgtgctct tcttat36<210>66<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>66ataagaagag cacattgttg taccagaccc tccgcc36<210>67<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>67gtattgttgt tgggtcttgt acaacaatat gcttttctta tatctcc47<210>68<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR物
<400>68ggagatataa gaaaagcata ttgttgtaca agacccaaca acaatac47<210>69<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>69gttattaggt ctggtacaac aatgtgcctt tctgatgtc 39<210>70<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>70gacatcagaa aggcacattg ttgtaccaga cctaataac 39<210>71<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>71aataaactag tctagacccc cgagtctaga acaatgtgct tgtcttatat 50ctcc 54<210>72<211>7<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MMLV SD位點<400>72aggtaag 7<210>73<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MMLV SA位點<400>73ctgctgcag 9<210>74<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼gp120信號肽的DNA<400>74atgagagtga aggagaaata tcagcacttg tggagatggg ggtggagatg 50
gggcaccatg ctccttggga tgttgatgat ctgtagtgct90<210>75<211>129<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼gp41跨膜結(jié)構(gòu)域的DNA<400>75ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa tagtttttgc 50tgtactttct gtagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 100ttcagaccCa cctcccaatc ccgagggga129
權(quán)利要求
1.一種重組體腺病毒，其包含編碼HIV抗原的HIV序列，當(dāng)宿主被所述的重組體腺病毒感染的時候，由所述重組體腺病毒表達的HIV抗原在宿主體內(nèi)激發(fā)針對所述HIV抗原的免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其中所述的重組體腺病毒是不能復(fù)制的。
3.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV-1或HIV-2的抗原。
4.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV毒株BH10或者pNL4-3的抗原。
5.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV進化枝A，B，C，D，E，F(xiàn)，或者G的抗原。
6.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV糖蛋白或者表面抗原。
7.權(quán)利要求6的重組體腺病毒，其中所述的HIV糖蛋白是HIV包膜蛋白。
8.權(quán)利要求7的重組體腺病毒，其中所述的HIV包膜蛋白是野生型或者突變體gp160，gp120或者gp41。
9.權(quán)利要求7的重組體腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的切割位點被突變所鈍化。
10.權(quán)利要求7的重組體腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的C末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被缺失。
11.權(quán)利要求7的重組體腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的切割位點和C末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域都被缺失。
12.權(quán)利要求7的重組體腺病毒，其中所述的HIV包膜蛋白是由選自由SEQ ID NOs14，16，20，21，22，23，和24組成的組的多核苷酸所編碼。
13.權(quán)利要求7的重組體腺病毒，其中所述的HIV序列還編碼選自由RT，PR，Tat，Vif，Nef，和Rev組成的組的HIV蛋白。
14.權(quán)利要求7的重組體腺病毒，其中所述的HIV抗原是包含多進化枝可變環(huán)的修飾的HIV包膜蛋白。
15.權(quán)利要求14的重組體腺病毒，其中所述的多進化枝可變環(huán)是來自至少兩個HIV進化枝的V3環(huán)。
16.權(quán)利要求15的重組體腺病毒，其中所述的至少兩個HIV進化枝選自由M組HIV-1分離物的進化枝A，B，C，D，E，F(xiàn)，和G組成的組。
17.權(quán)利要求15的重組體腺病毒，其中所述的V3環(huán)由選自由SEQ ID NOs25，26，27，28，29，30，和31組成的組的多核苷酸所編碼。
18.權(quán)利要求14的重組體腺病毒，其中所述包含多進化枝可變環(huán)的修飾的HIV包膜蛋白是由選自由SEQ ID NOs32，52，和54組成的組的多核苷酸編碼。
19.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其還包含編碼促進所述HIV抗原分泌的信號肽的多核苷酸，所述的HIV抗原是由被所述重組體腺病毒感染的細胞所分泌的。
20.權(quán)利要求19的重組體腺病毒，其中所述的信號肽是HIV gp120信號肽。
21.權(quán)利要求19的重組體腺病毒，其中所述的信號肽由SEQ ID NO74編碼。
22.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其還包含編碼膜錨定結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，所述的結(jié)構(gòu)域使所述HIV抗原結(jié)合到被所述重組體腺病毒感染的細胞的表面。
23.權(quán)利要求22的重組體腺病毒，其中所述的膜錨定結(jié)構(gòu)域是HIV gp41的跨膜結(jié)構(gòu)域。
24.權(quán)利要求22的重組體腺病毒，其中所述的膜錨定結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO75編碼。
25.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV結(jié)構(gòu)蛋白。
26.權(quán)利要求25的重組體腺病毒，其中所述的HIV結(jié)構(gòu)蛋白是野生型HIV Gag。
27.權(quán)利要求25的重組體腺病毒，其中所述的HIV結(jié)構(gòu)蛋白是HIV Gag的蛋白水解片段。
28.權(quán)利要求27的重組體腺病毒，其中所述HIV Gag的蛋白水解片段選自由p17/24，p17和p24組成的組。
29.權(quán)利要求27的重組體腺病毒，其中所述HIV Gag的蛋白水解片段是天然形式，分泌形式或者膜結(jié)合形式。
30.權(quán)利要求27的重組體腺病毒，其中所述Gag的蛋白水解片段是由選自由SEQ ID NOs34，35，36，40，41，42，46，47，和48組成的組的多核苷酸所編碼。
31.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其還包含編碼HIV蛋白酶或者HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的多核苷酸。
32.權(quán)利要求31的重組體腺病毒，其中所述編碼HIV蛋白酶的多核苷酸是SEQ ID NO56。
33.權(quán)利要求31的重組體腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV Gag。
34.權(quán)利要求33的重組體腺病毒，其中所述的蛋白酶與所述HIV Gag一起被表達為融合蛋白。
35.權(quán)利要求33的重組體腺病毒，其中所述的蛋白酶從一個啟動子被分開地表達，所述啟動子不同于用于所述HIV Gag的啟動子。
36.權(quán)利要求33的重組體腺病毒，其中所述的蛋白酶經(jīng)由IRES或者剪接供體/受體機制從與所述HIV Gag相同的啟動子被表達為分開的蛋白質(zhì)。
37.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其還包含編碼HIV蛋白酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的融合蛋白質(zhì)的多核苷酸。
38.權(quán)利要求37的重組體腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV Gag。
39.權(quán)利要求38的重組體腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的融合蛋白質(zhì)與所述HIV Gag一起被表達為融合蛋白質(zhì)。
40.權(quán)利要求38的重組體腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的融合蛋白質(zhì)從一個啟動子被分開地表達，所述啟動子不同于用于所述HIV Gag的啟動子。
41.權(quán)利要求38的重組體腺病毒，其中所述HIV蛋白酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的融合蛋白質(zhì)經(jīng)由IRES或者剪接供體/受體機制從與所述HIV Gag相同的啟動子被表達為分開的蛋白質(zhì)。
42.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其還包含編碼HIV蛋白酶，HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV整合酶的融合蛋白質(zhì)的多核苷酸。
43.權(quán)利要求42的重組體腺病毒，其中所述的HIV抗原是HIV Gag。
44.權(quán)利要求43的重組體腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶，HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV整合酶的融合蛋白質(zhì)與所述HIV Gag一起被表達為融合蛋白質(zhì)。
45.權(quán)利要求43的重組體腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶，HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV整合酶的融合蛋白質(zhì)從一個啟動子被分開地表達，所述啟動子不同于用于所述HIV Gag的啟動子。
46.權(quán)利要求43的重組體腺病毒，其中所述的HIV蛋白酶，HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV整合酶的融合蛋白質(zhì)經(jīng)由IRES或者剪接供體/受體機制從與所述HIV Gag相同的啟動子被表達為分開的蛋白質(zhì)。
47.權(quán)利要求1的重組體腺病毒，其還包含異源于腺病毒并且編碼免疫刺激因子的免疫刺激因子序列，其在所述宿主中的表達提高了所述HIV抗原的免疫原性。
48.權(quán)利要求47的重組體腺病毒，其中所述的HIV序列被放置于所述腺病毒的E1區(qū)域而且所述的免疫刺激因子序列被放置于所述腺病毒的E4區(qū)域。
49.權(quán)利要求47的重組體腺病毒，其中所述的HIV序列和免疫刺激因子序列均被放置于所述腺病毒的E1或者E4區(qū)域，并且經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點或者經(jīng)由剪接供體-受體機制從相同的啟動子被雙順反子地表達。
50.權(quán)利要求47的重組體腺病毒，其中所述HIV抗原或者免疫刺激因子的表達由腺病毒啟動子控制。
51.權(quán)利要求47的重組體腺病毒，其中所述HIV抗原或者免疫刺激因子的表達由非腺病毒啟動子控制。
52.權(quán)利要求51的重組體腺病毒，其中所述的非腺病毒啟動子選自由CMV啟動子，SV40啟動子，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子和雞胞質(zhì)β-肌動蛋白啟動子組成的組。
53.權(quán)利要求47的重組體腺病毒，其中所述的免疫刺激因子是細胞因子。
54.權(quán)利要求53的腺病毒載體，其中所述的細胞因子選自由白細胞介素-2，白細胞介素-4，白細胞介素-12，β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，粒細胞集落刺激因子和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子組成的組。
55.權(quán)利要求47的重組體腺病毒，其中所述的免疫刺激因子是不同細胞因子的組合。
56.權(quán)利要求55的重組體腺病毒，其中所述的細胞因子組合經(jīng)由IRES機制或者逆轉(zhuǎn)錄病毒剪接供體/受體機制表達自相同的啟動子但是被表達為分開的蛋白質(zhì)。
57.一種重組體腺病毒，其包含編碼第一HIV抗原的第一HIV序列，其表達處于第一啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下；和編碼第二HIV抗原的第二HIV序列，其表達處于第二啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下，所述第二啟動子與第一啟動子處在不同區(qū)域，當(dāng)宿主被所述的重組體病毒感染的時候，第一和第二HIV序列的表達激發(fā)針對所述第一和第二HIV抗原的免疫應(yīng)答。
58.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的重組體腺病毒是不能復(fù)制的。
59.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原是相同的。
60.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原是不同的。
61.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一或者第二HIV抗原是HIV包膜蛋白質(zhì)。
62.權(quán)利要求61的重組體腺病毒，其中所述的HIV包膜蛋白是野生型或者突變體gp160，gp120或者gp41。
63.權(quán)利要求62的重組體腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的切割位點被突變所鈍化。
64.權(quán)利要求62的重組體腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的C末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被缺失。
65.權(quán)利要求62的重組體腺病毒，其中所述HIV包膜蛋白的切割位點和C末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域都被缺失。
66.權(quán)利要求61的重組體腺病毒，其中所述的第一或者第二HIV序列還編碼選自由RT，PR，Tat，Vif，Nef，和Rev組成的組的HIV蛋白質(zhì)。
67.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一或者第二HIV抗原是包含多進化枝可變環(huán)的修飾的HIV包膜蛋白質(zhì)。
68.權(quán)利要求67的重組體腺病毒，其中所述的多進化枝可變環(huán)是來自至少兩個HIV進化枝的V3環(huán)。
69.權(quán)利要求68的重組體腺病毒，其中所述的至少兩個HIV進化枝選自由M組HIV-1分離物的進化枝A，B，C，D，E，F(xiàn)，和G組成的組。
70.權(quán)利要求68的重組體腺病毒，其中所述的V3環(huán)由選自由SEQ ID NOs25，26，27，28，29，30，和31組成的組的多核苷酸編碼。
71.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其還包含編碼促進所述第一或者第二HIV抗原分泌的信號肽的多核苷酸，所述的HIV抗原是由被所述重組體腺病毒感染的細胞所分泌的。
72.權(quán)利要求71的重組體腺病毒，其中所述的信號肽是HIV gp120信號肽。
73.權(quán)利要求71的重組體腺病毒，其中所述的信號肽由SEQ ID NO74編碼。
74.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其還包含編碼膜錨定結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，所述的錨定結(jié)構(gòu)域使所述第一或者第二HIV抗原結(jié)合到被所述重組體腺病毒感染的細胞的表面。
75.權(quán)利要求74的重組體腺病毒，其中所述的膜錨定結(jié)構(gòu)域是HIV gp41跨膜結(jié)構(gòu)域。
76.權(quán)利要求74的重組體腺病毒，其中所述的膜錨定結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO75編碼。
77.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原是HIV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。
78.權(quán)利要求77的重組體腺病毒，其中所述的HIV結(jié)構(gòu)蛋白是野生型HIV Gag。
79.權(quán)利要求77的重組體腺病毒，其中所述的HIV結(jié)構(gòu)蛋白是HIV Gag的蛋白水解片段。
80.權(quán)利要求77的重組體腺病毒，其中所述HIV Gag的蛋白水解片段選自由p17/24，p17和p24組成的組。
81.權(quán)利要求77的重組體腺病毒，其中所述HIV Gag的蛋白水解片段是天然形式，分泌形式或者膜結(jié)合形式。
82.權(quán)利要求77的重組體腺病毒，其中所述Gag的蛋白水解片段是由選自由SEQ ID NOs34，35，36，40，41，42，46，47，和48組成的組的多核苷酸所編碼。
83.權(quán)利要求77的重組體腺病毒，其還包含編碼HIV蛋白酶的多核苷酸。
84.權(quán)利要求83的重組體腺病毒，其中所述編碼HIV蛋白酶的多核苷酸是SEQ ID NO56。
85.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一HIV抗原是野生型或者突變型HIV包膜蛋白，而且所述第二HIV抗原是野生型或者突變型的HIV結(jié)構(gòu)蛋白。
86.權(quán)利要求85的重組體腺病毒，其中所述的野生型或者突變型的HIV結(jié)構(gòu)蛋白是野生型Gag或者Gag的蛋白水解片段。
87.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原都是野生型或者突變型HIV包膜蛋白。
88.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一和第二HIV抗原都是野生型或者突變型HIV結(jié)構(gòu)蛋白。
89.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其還包括異源于腺病毒并且編碼免疫刺激因子的免疫刺激因子序列，其在所述宿主中的表達提高了所述第一或者第二HIV抗原的免疫原性。
90.權(quán)利要求89的重組體腺病毒，其中所述的第一或第二HIV序列和免疫刺激因子序列經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點或者經(jīng)由剪接供體受體機制，從相同的啟動子雙順反子地表達。
91.權(quán)利要求89的重組體腺病毒，其中所述的免疫刺激因子是細胞因子。
92.權(quán)利要求91的重組體腺病毒，其中所述的細胞因子選自由白細胞介素-2，白細胞介素-4，白細胞介素-12，β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，粒細胞集落刺激因子和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子組成的組。
93.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一或第二啟動子是腺病毒啟動子。
94.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一或第二啟動子是非腺病毒啟動子。
95.權(quán)利要求94的重組體腺病毒，其中所述的非腺病毒啟動子選自由CMV啟動子，SV40啟動子，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子和雞胞質(zhì)β-肌動蛋白啟動子組成的組。
96.權(quán)利要求57的重組體腺病毒，其中所述的第一啟動子位于所述腺病毒的E1區(qū)域并且所述第二啟動子位于所述腺病毒的E4區(qū)域。
97.一種用于增強宿主對HIV感染免疫力的方法，其包含給予所述宿主第一重組體腺病毒，所述第一重組體腺病毒包含編碼第一HIV抗原的第一HIV序列，當(dāng)宿主被所述重組體腺病毒感染的時候，由所述第一重組體腺病毒所表達的第一HIV抗原在宿主體內(nèi)激發(fā)針對所述第一HIV抗原的免疫應(yīng)答。
98.權(quán)利要求97的方法，其中將重組體腺病毒給予宿主是通過肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，皮內(nèi)，直腸，口和腸胃外進行的。
99.權(quán)利要求97的方法，其中所述的重組體腺病毒還包含一種或者多種異源于腺病毒并且編碼免疫刺激因子的免疫刺激因子序列，其在宿主中的表達提高了所述HIV抗原的免疫原性。
100.權(quán)利要求97的方法，其還包含給予所述宿主一種免疫刺激因子。
101.權(quán)利要求100的方法，其中所述的免疫刺激因子是細胞因子，所述細胞因子選自由白細胞介素-2，白細胞介素-4，白細胞介素-12，β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，粒細胞集落刺激因子和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子組成的組。
102.權(quán)利要求97的方法，其還包含給予所述宿主與所述第一重組體腺病毒不同血清型的第二重組體腺病毒，其包含編碼第二HIV抗原的第二HIV序列，當(dāng)所述宿主被所述重組體腺病毒感染的時候，由所述第二重組體腺病毒所表達的第二HIV抗原在宿主體內(nèi)激發(fā)針對所述第二HIV抗原的免疫應(yīng)答。
103.權(quán)利要求102的方法，其中所述第一重組體腺病毒的血清型是腺病毒血清型5，而且所述第二重組體腺病毒的血清型選自由腺病毒血清型1-4和6-51組成的組。
104.權(quán)利要求102的方法，其中所述的由第一重組體腺病毒編碼的第一HIV抗原與由所述第二重組體腺病毒編碼的第二HIV抗原相同。
105.權(quán)利要求102的方法，其中所述的由第一重組體腺病毒編碼的第一HIV抗原與由所述第二重組體腺病毒編碼的第二HIV抗原不同。
106.權(quán)利要求102的方法，其中所述的第二重組體腺病毒具有與所述第一個相同的腺病毒骨架，除了所述第二重組體腺病毒的纖維區(qū)與所述第一重組體腺病毒的纖維區(qū)血清型不同。
107.權(quán)利要求102的方法，其中所述的第二重組體腺病毒具有與所述第一個相同的腺病毒骨架，除了所述第二重組體腺病毒的纖維區(qū)的結(jié)，干和五鄰體基底結(jié)構(gòu)域與所述第一重組體腺病毒相應(yīng)區(qū)域的血清型不同。
108.權(quán)利要求102的方法，其中在將所述第一重組體腺病毒給予所述宿主至少一周后，將所述第二重組體腺病毒給予宿主。
109.權(quán)利要求97的方法，其還包含在將所述第一重組體腺病毒給予所述宿主后收集血清。
110.權(quán)利要求109的方法，其中所述的宿主是人或者非人靈長類動物。
111.權(quán)利要求109的方法，其還包含將所述的血清存貯至少12個小時；和然后將所述血清給予所述宿主或者另一個宿主。
112.權(quán)利要求111的方法，其中所述的另一個宿主是人或者非人靈長類動物。
113.權(quán)利要求97的方法，其還包含在將所述第一重組體腺病毒給予所述宿主后，從宿主中分離針對所述第一HIV抗原的抗體；和然后將所述抗體給予所述宿主或者另一個宿主。
114.一種增強宿主對HIV感染的免疫力的方法，其包含給予所述宿主重組體腺病毒，所述重組體腺病毒包含編碼第一HIV抗原的第一HIV序列，其表達處于第一啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下；和編碼第二HIV抗原的第二HIV序列，其表達處于位于與所述第一啟動子不同區(qū)域的第二啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下，當(dāng)所述宿主被所述重組體腺病毒感染的時候，所述第一和第二HIV序列的表達激發(fā)針對所述第一和第二HIV抗原的免疫應(yīng)答。
115.權(quán)利要求114的方法，其還包含在首次給予所述的重組體腺病毒之后，至少再一次將所述的重組體腺病毒給予所述宿主。
116.一種增強宿主對第一和第二致病病毒感染的免疫力的方法，其包含給予所述宿主第一重組體腺病毒，其包含異源于天然腺病毒并且編碼來自第一致病病毒的第一病毒抗原的第一抗原序列，當(dāng)宿主被所述第一重組體腺病毒感染的時候，由所述第一重組體腺病毒表達的第一病毒抗原在宿主體內(nèi)激發(fā)針對所述第一病毒抗原的免疫應(yīng)答；和給予所述宿主第二重組體腺病毒，其包含異源于天然腺病毒并且編碼來自第二致病病毒的第二病毒抗原的第二抗原序列，當(dāng)宿主被所述第一重組體腺病毒感染的時候，由所述第二重組體腺病毒表達的第二病毒抗原在宿主體內(nèi)激發(fā)針對所述第二病毒抗原的免疫應(yīng)答。
117.權(quán)利要求116的方法，其中將所述第一或者第二重組體腺病毒給予宿主是通過肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，皮內(nèi)，直腸，口和腸胃外進行的。
118.權(quán)利要求116的方法，其中所述第一重組體腺病毒的血清型是腺病毒血清型5，而且所述第二重組體腺病毒的血清型選自由腺病毒血清型1-4和6-51組成的組。
119.權(quán)利要求116的方法，其中所述的由第一重組體腺病毒編碼的第一病毒抗原與由所述第二重組體腺病毒編碼的第二病毒抗原相同。
120.權(quán)利要求116的方法，其中所述的由第一重組體腺病毒編碼的第一病毒抗原與由所述第二重組體腺病毒編碼的第二病毒抗原不同。
121.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第二重組體腺病毒具有與所述第一個相同的腺病毒骨架，除了所述第二重組體腺病毒的纖維區(qū)與所述第一重組體腺病毒的纖維區(qū)血清型不同。
122.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第二重組體腺病毒具有與所述第一個相同的腺病毒骨架，除了所述第二重組體腺病毒纖維區(qū)的結(jié)，干或五鄰體基底結(jié)構(gòu)域與所述第一重組體腺病毒相應(yīng)區(qū)域的血清型不同。
123.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第二重組體腺病毒具有與所述第一個相同的腺病毒骨架，除了所述第二重組體腺病毒纖維區(qū)的結(jié)結(jié)構(gòu)域與所述第一重組體腺病毒相應(yīng)區(qū)域的血清型不同。
124.權(quán)利要求116的方法，其中在將所述第一重組體腺病毒給予宿主至少一周后，將所述第二重組體腺病毒給予宿主。
125.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二重組體腺病毒是不能復(fù)制的。
126.權(quán)利要求116的方法，其中的第一重組體病毒還包含第三抗原序列，該序列異源于天然腺病毒并編碼來自所述第一或者第二致病病毒的第三病毒抗原。
127.權(quán)利要求126的方法，其中所述的第一和第三抗原序列被分別放置于所述第一重組體腺病毒天然祖先的E1和E3或E4區(qū)域。
128.權(quán)利要求126的方法，其中所述的第一和第三抗原序列被同一個啟動子雙順反子地表達。
129.權(quán)利要求128的方法，其中所述的第一和第二抗原序列經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點或者經(jīng)由剪接供體-受體機制被雙順反子地表達。
130.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一重組體病毒還包含第三抗原序列，該序列異源于天然腺病毒并且編碼來自所述第一或第二致病病毒的第三病毒抗原，和所述的第二重組體病毒還包含第四抗原序列，該序列異源于天然腺病毒并且編碼來自所述第一或第二致病病毒的第四病毒抗原。
131.權(quán)利要求130的方法，其中所述的第一和第三抗原序列被分別置于所述第一重組體腺病毒天然祖先的E1和E3或E4區(qū)域；并且所述的第二和第四抗原序列被分別置于所述第二重組體腺病毒天然祖先的E1和E3或E4區(qū)域。
132.權(quán)利要求131的方法，其中所述的第一和第三抗原序列被相同的啟動子雙順反子地表達，或者所述的第二和第四抗原序列被相同的啟動子雙順反子地表達。
133.權(quán)利要求132的方法，其中所述的雙順反子表達是經(jīng)由內(nèi)部核糖體進入位點或者剪接供體-受體機制進行的。
134.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一和第二致病病毒是相同的。
135.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一和第二致病病毒的類型相同但是亞型或進化枝不同。
136.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一和第二致病病毒是相同病毒的不同類型。
137.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一和第二致病病毒是不同的病毒。
138.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是人免疫缺陷病毒。
139.權(quán)利要求138的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是HIV表面蛋白，核心/衣殼蛋白，調(diào)控蛋白，酶蛋白或者輔助蛋白。
140.權(quán)利要求138的方法，其中所述第一或第二病毒抗原選自由HIVgp120，gp41，Gag，p17，p24，p2，p7，p1，p6，Tat，Rev，PR，RT，IN，Vif，Vpr，Vpx，Vpu和Nef組成的組。
141.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是流感病毒。
142.權(quán)利要求141的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是所述流感病毒的糖蛋白。
143.權(quán)利要求142的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是流感糖蛋白HA1，HA2或者NA。
144.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是埃博拉病毒。
145.權(quán)利要求144的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是埃博拉糖蛋白。
146.權(quán)利要求145的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是埃博拉GP1或者GP2蛋白。
147.權(quán)利要求146的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是埃博拉核殼蛋白。
148.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是馬爾堡病毒。
149.權(quán)利要求148的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是馬爾堡糖蛋白。
150.權(quán)利要求148的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是馬爾堡核殼蛋白。
151.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是蟲媒病毒。
152.權(quán)利要求151的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是蟲媒病毒糖蛋白。
153.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是肝炎病毒。
154.權(quán)利要求153的方法，其中所述的肝炎病毒是肝炎A、B、C、D或者E病毒。
155.權(quán)利要求153的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是乙肝病毒的表面抗原或者核心蛋白。
156.權(quán)利要求155的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是乙肝病毒的SHBsAg，MHBsAg，或者LHBsAg。
157.權(quán)利要求153的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是丙型肝炎病毒的表面抗原或者核心蛋白。
158.權(quán)利要求157的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是丙型肝炎病毒的NS3，NS4或者NS5抗原。
159.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是呼吸道合胞病毒。
160.權(quán)利要求159的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是呼吸道合胞病毒的糖蛋白或者融合蛋白。
161.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是單純皰疹病毒。
162.權(quán)利要求161的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是單純皰疹病毒類型1或者類型2。
163.權(quán)利要求161的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是來自單純皰疹病毒類型2的糖蛋白D。
164.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二致病病毒是人乳頭瘤病毒。
165.權(quán)利要求164的方法，其中所述第一或者第二病毒抗原是人乳頭瘤病毒的E6或者E7。
166.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是全長的抗原病毒蛋白或者該抗原病毒蛋白的一部分，所述的部分包含主要抗原，中和抗原或者所述第一或第二致病病毒的表位。
167.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或者第二病毒抗原是被修飾的抗原，其突變自所述第一或者第二致病病毒的糖蛋白，使得所述的第一或者第二病毒抗原作為病毒組分沒有功能但卻保留了其抗原性。
168.權(quán)利要求167的方法，其中對第一或者第二病毒抗原的修飾作用包括缺失所述糖蛋白的蛋白水解切割位點，以及復(fù)制和重排所述糖蛋白的免疫抑制肽區(qū)域。
169.權(quán)利要求116的方法，其中所述的第一或第二重組體腺病毒還包含異源于天然腺病毒而且編碼免疫刺激因子的免疫刺激因子序列。
170.權(quán)利要求169的方法，其中所述的免疫刺激因子是細胞因子。
171.權(quán)利要求170的方法，其中所述的細胞因子選自由白細胞介素-2，白細胞介素-4，白細胞介素-12，β-干擾素，λ-干擾素，γ-干擾素，粒細胞集落刺激因子和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子組成的組。
172.權(quán)利要求116的方法，其還包含在給予所述的第一和第二重組體腺病毒后從所述收集血清。
173.權(quán)利要求172的方法，其中所述的宿主是人或者非人靈長類動物。
174.權(quán)利要求172的方法，其還包含將所述的血清貯存至少12個小時；和然后將所述血清給予所述宿主或者另一個宿主。
175.權(quán)利要求174的方法，其中所述的另一個宿主是人或者非人靈長類動物。
176.權(quán)利要求116的方法，其還包含在給予所述第一和第二重組體腺病毒后，從所述宿主中分離針對所述第一或第二病毒抗原的抗體；和然后將所述抗體給予宿主或另一個宿主。
177.權(quán)利要求176的方法，其中所述的宿主或另一個宿主是人或者非人靈長類動物。
全文摘要
提供了用以激發(fā)宿主對人免疫缺陷病毒(HIV)作出免疫應(yīng)答的重組體腺病毒以及將其給予宿主的方法。所述的重組體腺病毒能夠表達多種野生型或者突變型HIV抗原，如沒有切割位點或者胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的HIV包膜蛋白，天然、分泌或膜結(jié)合形式的結(jié)構(gòu)蛋白如Gag及其蛋白水解片段，HIV酶如逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和整合酶，以及調(diào)控蛋白如Tat、Rev和Nef。所述的重組體腺病毒還可以表達免疫刺激因子如細胞因子以進一步提高HIV抗原的免疫原性。
文檔編號A61K39/02GK1636063SQ02826611
公開日2005年7月6日 申請日期2002年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月1日
發(fā)明者王丹鶴 申請人:健方公司