檢測人類免疫缺陷病毒1型的pcr引物組、探針及其試劑盒和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，涉及一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR引物組、探 針及其試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是一種慢性致死性傳染病，由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV)引起，分為人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1)和人類免疫缺陷病毒2型（HIV-2)，HIV-1 是目前全球包括中國在內(nèi)流行的主要毒株，HIV-2型目前只在西非流行。HIV感染后導(dǎo)致 人體免疫機(jī)能缺陷，從而發(fā)生機(jī)會(huì)性感染和腫瘤等一系列臨床綜合征，病死率幾乎達(dá)100%。 根據(jù)2011年數(shù)據(jù)，艾滋病已經(jīng)波及全球200多個(gè)國家和地區(qū)，感染者總數(shù)已超過6000萬， 2000萬人死于艾滋病。由于該病潛伏期長、隱蔽性強(qiáng)、傳播途徑多樣化、病死率高，目前既無 能治愈的藥物也無有效的疫苗預(yù)防，給防治工作帶來了嚴(yán)重困難。
[0003] 我國目前處于HIV/AIDS廣泛流行期，政府采取了一系列堅(jiān)決的措施，已經(jīng)有效地 控制了非法采供血行為，用血安全性得到最大限度的保障，但是經(jīng)靜脈注射吸毒和經(jīng)性傳 播HIV的勢頭并未得到很好的控制，尤其是性傳播已成為主要傳播方式，而且在一些地區(qū) 已出現(xiàn)HIV感染者的第二代傳播（母嬰傳播、家庭內(nèi)性傳播等），對(duì)全國HIV/AIDS的流行 蔓延無疑起到推波助瀾之作用。按照國家2014年最新頒布的治療標(biāo)準(zhǔn)，其中超過8成需要 立即開展和持續(xù)終生高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（Highly active antiretroviral therapy， HAART)，在公衛(wèi)、臨床、立法、治安等多方面均形成嚴(yán)重挑戰(zhàn)。擴(kuò)大HIV檢測和抗病毒治療， 早診早治，降低新發(fā)數(shù)和病死率，是我國"十二五"以來艾滋病整體防控的戰(zhàn)略目標(biāo)。
[0004] 目前國內(nèi)外HIV檢測主要存在以下問題： (1) "窗口期"（指感染后到體內(nèi)產(chǎn)生抗體、并達(dá)到檢出水平之間這段時(shí)間，期間具有感 染性但抗體檢測為陰性，受不同檢測方法和個(gè)體差異影響)及早期診斷。HIV感染后確定感 染的病毒標(biāo)志物依次出現(xiàn)的順序?yàn)椋翰《竞怂幔≧NA與前病毒DNA)、病毒蛋白（如p 24抗 原)、病毒抗體。目前，國內(nèi)外HIV常規(guī)檢測主要還是抗體血清學(xué)檢測（ELISA、WB)。此技術(shù) 已建立20余年，成熟可靠，然而一直受所謂"窗口期"問題的困擾，"窗口期" 一般在40天 以上。核酸檢測方面，由于病毒標(biāo)志物出現(xiàn)更早，在窗口期前移上具有抗體檢測技術(shù)不可比 擬的優(yōu)勢。但受靈敏度限制，目前外周血血清HIV RNA檢測（目前國內(nèi)外已上市的病毒載量 檢測試劑盒檢出限在20~200拷貝/mL之間）仍有11天左右窗口期。
[0005] 雖然HIV-1是逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有傳染力的病毒子是RNA，但是HIV進(jìn)入人體后，會(huì)進(jìn) 入到CD4+ T細(xì)胞，靠自身的逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為DNA，也就是通常所說的前病毒，然后整合到 細(xì)胞的基因組中，從而感染T細(xì)胞。目前國內(nèi)已上市的HIV-1核酸檢測試劑盒是通過檢測 血里面的HIV RNA濃度來診斷是否艾滋病感染。在早期感染或正在進(jìn)行抗艾滋病治療的患 者中，游離病毒子很少，而且病毒RNA在提取過程中容易降解，這類試劑盒難以檢測到。但 是細(xì)胞中還是有整合的HIV病毒基因，一旦人的免疫能力下降或者未及時(shí)用藥，這些整合 的病毒子就會(huì)開始復(fù)制，使病情發(fā)展。
[0006] (2)病毒儲(chǔ)存庫檢測。臨床對(duì)HIV抗病毒治療的結(jié)果評(píng)價(jià)分為"徹底治愈"和"功 能性治愈"。前者要求實(shí)現(xiàn)長期不進(jìn)行任何抗病毒治療，體內(nèi)仍檢測不到HIV核酸；后者效 果類似病毒精英控制者，體內(nèi)仍可檢測到低水平的HIV-1 RNA和/或DNA，但長期免于HIV 相關(guān)疾患的損害。后續(xù)的研宄發(fā)現(xiàn)，接受HAART治療患者體內(nèi)其實(shí)一直存在著另一種潛伏 形式的HIV-1，即所謂病毒儲(chǔ)存庫。chun等1997年首次發(fā)現(xiàn)了整合在靜止的記憶性⑶4+T 淋巴細(xì)胞中的病毒儲(chǔ)存庫，其中小部分含有整合的HIV DNA，可以在某種刺激下重新開始復(fù) 制-組裝病毒。這些潛伏的感染細(xì)胞十分穩(wěn)定，因此病毒儲(chǔ)存庫已被廣泛認(rèn)為是HAART無 法從患者體內(nèi)清除HIV的主要原因和艾滋病治愈的最大障礙。
[0007] 近年來病毒儲(chǔ)存庫相關(guān)主要檢測技術(shù)包括：①Q(mào)VOA (Quantitative viral outgrowth assay)，又名 IUPM (Infectious Units Per Million)分析，由 Siliciano 和Siliciano 2005年建立。該方法對(duì)人員和設(shè)備要求較高，價(jià)格昂貴，樣本需求量大 (120-180mL血液)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且結(jié)果準(zhǔn)確性影響因素眾多，檢出率偏低，也不適用于組織活 檢。②⑶4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，多采用⑶4/8/3流式儀檢測，但沒有證據(jù)表明能直接反映HIV 病毒儲(chǔ)存庫的變化，有無一定相關(guān)性尚待進(jìn)一步求證。③RNA檢測。如上述，由于HAART能 夠非常有效地控制患者血漿HIV-1 RNA含量，甚至將其降低至臨床常規(guī)檢測的低限（20-50 拷貝/mL)以下，而且RNA檢測對(duì)設(shè)備、人員及標(biāo)本提取要求較高，因此其無法應(yīng)用于病毒儲(chǔ) 存庫檢測。
[0008] (3)新生兒HIV感染的診斷。HIV感染的母親其嬰兒由于母體抗體的存在，用抗體 檢測法通常為陽性。但實(shí)際上只有20%~60%的嬰兒可在母親的子宮里、在分娩和引產(chǎn)或 通過產(chǎn)后哺乳時(shí)從其母體感染HIV。新生兒血清陽性者并不能說明是HIV感染。因?yàn)槟阁w HIV抗體可持續(xù)大約15個(gè)月之久，在一般情況下，嬰兒并不表現(xiàn)出HIV感染的任何癥狀。病 毒細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)嬰兒并不是一種可靠實(shí)用的方法；HIV特異IgM抗體的檢測在母體抗體存 在下也是不可能的，在過量血清抗體存在下檢出血清中的HIV抗原也十分困難。對(duì)這些嬰 兒用可靠的核酸方法進(jìn)行HIV感染的早期診斷是十分重要的。另外，嬰幼兒被HIV感染后 病情發(fā)展較快，早期診斷對(duì)及時(shí)采取治療措施，延緩阻止病情發(fā)展極為重要。
[0009] 綜上所述，傳統(tǒng)的HIV檢測方法，受限于"窗口期"、耗時(shí)、花費(fèi)及標(biāo)本要求高以及 檢測靈敏度低等特點(diǎn)，亟需開發(fā)一種高敏感的HIV DNA檢測方法。目前國內(nèi)外鮮見有HIV DNA檢測試劑盒，有文章報(bào)道的HIV DNA PCR檢測方法靈敏度均在每百萬細(xì)胞檢測到10拷 貝HIV DNA或以上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決上述問題，本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)研宄篩選出高靈敏和高特異性的引物序 列和檢測探針，及特定的PCR反應(yīng)程序和條件，構(gòu)建了高敏感HIV-1 DNA PCR檢測試劑盒及 檢測方法，最低檢測限可達(dá)每個(gè)反應(yīng)可檢測2拷貝HIV-1 DNA/百萬細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR引物。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測試劑盒。
[0013] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種檢測檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測方 法。
[0014] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR引物組，該引物組為引物組1或引物組2或引物組 3,其中， 引物組 1 由 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 組成； 引物組 2 由 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 組成； 引物組 3 由 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成。
[0015] 檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測探針，其序列為：SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID N0:22;或者為該些序列的核苷酸互補(bǔ)序列。
[0016] 進(jìn)一步的，上述探針序列5'端標(biāo)記的熒光基團(tuán)為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種， 探針序列3'端標(biāo)記的淬滅基團(tuán)為TAMRA、MGB、BHQ中一種。
[0017] 一種檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有至少一組上述 所述的引物組。
[0018] 進(jìn)一步的，上述試劑盒還含有檢測探針；具體探針情況如下： 當(dāng)試劑盒中含有引物組1時(shí)，該試劑盒就還含有探針SEQ ID N0:15或其核苷酸互補(bǔ)序 列； 當(dāng)試劑盒中含有引物組2時(shí)，該試劑盒中就還含有探針SEQ ID NO: 16、SEQ ID N0:17、 SEQ ID NO: 18或者該些序列的核苷酸互補(bǔ)序列中的至少一條探針； 當(dāng)試劑盒中含有引物組3時(shí)，該試劑盒中就還含有探針SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、 SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22或者該些序列的核苷酸互補(bǔ)序列中的至少一條探針。
[0019] 進(jìn)一步的，上述試劑盒還含有細(xì)胞定量引物組和細(xì)胞定量探針，所述細(xì)胞定量引 物組由 SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25 和 SEQ ID N0:26 組成；所述探針為 含SEQ ID NO:27或者為其核苷酸互補(bǔ)序列； 細(xì)胞定量探針序列所標(biāo)記的熒光基團(tuán)可從FAM、HEX、VIC、CY5、TET選擇，但不同于上述 檢測目的基因探針的熒光基團(tuán)。
[0020] 進(jìn)一步的，上述試劑盒還含有：強(qiáng)陽性對(duì)照品、弱陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、陽性定 量參考品和含有酶與UNG酶的酶系。
[0021] 進(jìn)一步的，上述陽性定量參考品為8E5或Ach2細(xì)胞株基因組，用于同時(shí)對(duì)HIV DNA 及細(xì)胞數(shù)定量。
[0022] -種檢測人類免疫缺陷病毒1型的PCR檢測方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) DNA提?。?取待測全血樣本、陰性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、陽性定量參考品各 200 yl，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑盒，按說明書操作，分提取各組樣品的 DNA作為模板； 2) PCR反應(yīng)體系： PCR 反應(yīng)液 29. 2 y L ; 酶系 0.8yL; DNA模板 20 y L ; 3) PCR反應(yīng)程序： 以A