專利名稱：一種聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中的各組分分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法。

背景技術(shù)：
干擾素(Interferon，IFN)由英國(guó)科學(xué)家Isaacs和LinderMann于1957年發(fā)現(xiàn)，是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其中α干擾素臨床上主要用于治療乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病，也用于一些腫瘤化療藥物的聯(lián)合用藥。
蛋白及多肽類藥物的缺陷在于易被酶水解和被腎臟清除，臨床半衰期短，需要多次注射以保持藥效濃度。蛋白及多肽經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾以后，所得蛋白PEG偶聯(lián)物具有不易被酶水解、免疫原性降低、熱穩(wěn)定性提高以及不易被腎小球代謝等特征。自1977年Abuchowski A等首次將PEG偶聯(lián)劑用于修飾蛋白質(zhì)以來，蛋白質(zhì)PEG修飾技術(shù)迅速發(fā)展，PEG蛋白藥物也陸續(xù)上市已有包括PEG化的腺苷脫氨酶(PEG-ADA)；PEG化IFNα-2b(PEG-INTRONTM)；PEG化IFNα-2a(PEGASYSTM)；PEG化G-CSF(NEULASTATM)等40多種PEG化蛋白及多肽藥物用于臨床治療，同未修飾的蛋白藥物相比較，PEG化蛋白在療效和安全性等各方面具有極大的治療優(yōu)勢(shì)。
PEG修飾蛋白質(zhì)過程中，通常以單PEG化IFNα-2b的得率及PEG修飾多聚體和二聚體生成量作為主要考核指標(biāo)，以對(duì)反應(yīng)條件的進(jìn)行優(yōu)化。為了減少PEG修飾多聚體和二聚體的生成，以有利于下游純化工作，必須控制一定的反應(yīng)條件，這樣就有一定量的游離蛋白未與PEG偶聯(lián)。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)記載，在PEG修飾IFNα-2b的反應(yīng)中，往往約有30％～50％的IFNα-2b未與PEG偶聯(lián)，而IFNα-2b作為重組蛋白產(chǎn)品，生產(chǎn)條件苛刻，工藝復(fù)雜且價(jià)格昂貴，因此有必要對(duì)未被修飾的IFNα-2b進(jìn)行回收利用。
目前已有多種層析技術(shù)可運(yùn)用于蛋白質(zhì)的分離純化，其中離子交換層析技術(shù)是運(yùn)用最為廣泛的一種，其原理在于混合物中各種分子由于酸堿性、極性、大小以及形狀等差異，與層析介質(zhì)“手臂”通過庫(kù)倫引力/斥力發(fā)生相互作用，其結(jié)果是有的組分分子與層析介質(zhì)“手臂”不吸附或弱吸附，而有的組分分子與層析介質(zhì)“手臂”強(qiáng)吸附，隨后再通過控制洗脫條件，以實(shí)現(xiàn)各組分的柱口分離。當(dāng)介質(zhì)“手臂”所帶電荷為陰離子時(shí)，其反離子為陽離子，被稱為陽離子交換層析；當(dāng)介質(zhì)“手臂”所帶電荷為陽離子時(shí)，其反離子為陰離子，被稱為陰離子交換層析。
蛋白質(zhì)是由多個(gè)氨基酸組成的高分子量化合物，其極性強(qiáng)弱主要取決于組成氨基酸的種類，極性氨基酸(帶電荷或不帶電荷)的多寡將影響蛋白質(zhì)的極性，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)親水或疏水的變化；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為親水性時(shí)，所帶電荷種類則會(huì)影響蛋白質(zhì)的酸堿性當(dāng)所帶堿性氨基酸(如Lys、Arg)較多時(shí)，蛋白質(zhì)通常呈堿性；所帶酸性氨基酸(Asp、Glu)較多時(shí)，蛋白質(zhì)通常呈酸性。蛋白質(zhì)的酸堿性可以通過等電點(diǎn)PI來測(cè)定，蛋白質(zhì)PI是蛋白質(zhì)呈中性時(shí)的pH值，即蛋白質(zhì)凈電荷為零時(shí)的pH值。當(dāng)溶液的pH值低于蛋白質(zhì)PI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，可與陽離子交換介質(zhì)吸附；相反，若當(dāng)溶液的pH值高于蛋白質(zhì)PI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，可與陰離子交換介質(zhì)吸附。
蛋白質(zhì)經(jīng)PEG修飾以后，與離子交換介質(zhì)的吸附能力大大降低，PEG分子的屏蔽作用是最主要的原因，線性的PEG分子纏繞在蛋白質(zhì)周圍，使得帶電荷殘基無法與介質(zhì)“手臂”靠近。此時(shí)，為了保證PEG修飾蛋白的充分吸附，需要將加樣緩沖液的pH值更遠(yuǎn)離PI，當(dāng)層析介質(zhì)為陽離子型時(shí)，可降低加樣緩沖液的pH以使殘基質(zhì)子化程度提高，增加蛋白質(zhì)正電荷數(shù)目，加強(qiáng)蛋白與介質(zhì)的吸附能力；同樣，層析介質(zhì)為陰離子型時(shí)，可增加加樣緩沖液的pH以使殘基去質(zhì)子化程度提高，增加蛋白質(zhì)負(fù)電荷數(shù)目。
基于以上理論，采用常規(guī)方法(姜忠義，高蓉，許松偉等，藥物蛋白的聚乙二醇修飾，中國(guó)藥學(xué)雜志；37(6)409～414)純化PEG修飾蛋白時(shí)，一般用低pH或高pH緩沖液稀釋反應(yīng)液，將稀釋液上陽離子或陰離子交換柱，使PEG修飾蛋白及未修飾蛋白均被吸附，利用二者吸附能力的差異，采用NaCl濃度梯度洗脫方式，以獲取PEG修飾蛋白。
在上述過程中，由于PEG的位阻作用，為了將PEG修飾蛋白充分吸附，加樣緩沖液的pH值通常遠(yuǎn)離PI，因此使得未修飾蛋白往往吸附得相當(dāng)牢固，需要高濃度鹽才能洗脫。然而采用高濃度鹽洗脫時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致蛋白變性沉淀，同時(shí)采用高濃度鹽洗脫時(shí)，一些雜質(zhì)如變性蛋白、內(nèi)毒素、反應(yīng)副產(chǎn)物或PEG修飾劑水解脫落基團(tuán)也會(huì)一同被洗脫，從而導(dǎo)致回收蛋白的純度、比活及內(nèi)毒素水平均受影響，這種方法所回收得到的蛋白，往往因沒有利用價(jià)值而被舍棄，不但提高了PEG化蛋白的生產(chǎn)成本，也造成了相當(dāng)程度的浪費(fèi)。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種自PEG修飾IFN反應(yīng)液中回收IFN的方法，本方法不影響PEG化IFN的收率以及純度，同時(shí)從反應(yīng)液中所回收的IFN的各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)應(yīng)與對(duì)照品保持一致，能夠重復(fù)利用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明包括如下步驟 a、將聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液用酸或堿調(diào)至pH值位于5.0～8.0之間； b、將上述所得反應(yīng)液置換到等pH加樣緩沖液，調(diào)節(jié)加樣緩沖液離子強(qiáng)度，再經(jīng)離子交換層析，使聚乙二醇修飾干擾素穿透，而游離干擾素被吸附； c、將上述離子交換層析柱充分平衡后，采用濃度為0～200毫摩爾/升的NaCl溶液洗脫，所得洗脫峰即為回收的游離干擾素。
由于PEG的位阻作用，PEG修飾IFN同未經(jīng)修飾的IFN相比，二者與離子交換層析介質(zhì)的吸附能力存在很大的差異，此時(shí)通過控制加樣緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度，可以使PEG修飾IFN以穿透峰流出，而未修飾蛋白則被吸附；與前述的常規(guī)方法相比較，本方法中加樣緩沖液pH值更接近于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，因此未修飾IFN經(jīng)低鹽即可洗脫，從而可以保證回收的IFN的質(zhì)量。
所述的步驟a中聚乙二醇的分子量為20～40KD，酸為HAc，堿為NaOH。
可以有效實(shí)施本發(fā)明的加樣緩沖液的pH值范圍很寬，這主要取決于PEG修飾劑的分子量大小及加樣緩沖液的種類和離子強(qiáng)度，如使用陰離子交換介質(zhì)時(shí)，加樣緩沖液的pH值范圍包括7.0～8.0；使用陽離子交換介質(zhì)時(shí)，所述加樣緩沖液的pH值范圍包括5.0～5.8，優(yōu)選5.0～5.6。
可以有效實(shí)施本發(fā)明的加樣緩沖液的種類很多，就陰離子交換層析而言，理論上可以使用pH值在6.0～8.5之間的具有緩沖能力的緩沖液，優(yōu)選pH值在7.0～7.5之間的具有緩沖能力的磷酸鹽緩沖液、Tris-鹽酸、巴比妥鈉-鹽酸等緩沖液。就陽離子交換層析而言，理論上可以使用pH值在4.0～6.0之間的具有緩沖能力的緩沖液，優(yōu)選pH值在5.0～5.6之間的具有緩沖能力的醋酸-醋酸鈉、磷酸氫二鈉-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉等緩沖液。
所述的步驟b中，將聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液置換到等pH加樣緩沖液，調(diào)節(jié)加樣緩沖液離子強(qiáng)度時(shí)可以采用如下兩種方法改變加樣緩沖液組分的濃度或者向加樣緩沖液中另外加入中性鹽。
可以有效實(shí)施本發(fā)明的加樣緩沖液離子強(qiáng)度取決于加樣緩沖液的種類，包括緩沖液離子解離程度，反離子交換蛋白質(zhì)能力的強(qiáng)弱。本發(fā)明加樣緩沖液中組分的濃度范圍選擇為2～50毫摩爾/升(mM)，優(yōu)選20～40mM。一般情況下，由于PEG修飾蛋白與未修飾蛋白的性質(zhì)差異較大，通過調(diào)節(jié)緩沖液組分的濃度即可達(dá)到分離目的，但也可以通過加入中性鹽以增加離子強(qiáng)度來達(dá)到分離目的，所述的中性鹽比如NaCl和/或KCl，NaCl和/或KCl的濃度范圍選擇為0～50mM，優(yōu)選2～20mM。
本發(fā)明的回收方法尤其適用于自聚乙二醇修飾干擾素α-2b反應(yīng)液中回收干擾素α-2b。
本發(fā)明中的回收干擾素的方法同常規(guī)方法相比，具有以下不同點(diǎn)及優(yōu)勢(shì) 1.本發(fā)明收集的穿透峰可用HAc或NaOH調(diào)pH，增加蛋白表面殘基質(zhì)子化或去質(zhì)子化程度，然后再經(jīng)陽離子或陰離子交換層析，并用鹽梯度洗脫，以獲取主要含單PEG化IFN的目標(biāo)峰，同常規(guī)純化方法相比，本發(fā)明的回收方法不影響PEG化IFN的純化收率及純度。
2.本發(fā)明收集穿透峰以后，用低鹽即可洗脫，所得洗脫峰即為回收IFN，回收得到的IFN的比活、純度、內(nèi)毒素等質(zhì)控指標(biāo)均能與對(duì)照品保持一致，且能夠重復(fù)利用。
3.現(xiàn)有技術(shù)中，多位點(diǎn)PEG修飾蛋白與單位點(diǎn)PEG修飾蛋白的分離是PEG修飾蛋白技術(shù)的難點(diǎn)之一，離子交換介質(zhì)載量是影響PEG修飾蛋白純化的重要原因之一。本發(fā)明的方法中，通過步驟b中的穿透峰將游離干擾素去除后，調(diào)節(jié)pH后重新上樣，相對(duì)于常規(guī)方法，其加樣量更小，因此，更有利于提高PEG修飾蛋白的分離效果。



圖1A、1B分別為實(shí)施例一中SDS-PAGE電泳檢測(cè)的碘染色圖和考馬斯亮藍(lán)染色圖； 圖1C為實(shí)施例一中SEHPLC鑒定回收IFNα-2b純度的鑒定結(jié)果圖； 圖2A、2B分別為實(shí)施例二中SDS-PAGE電泳檢測(cè)的碘染色圖和考馬斯亮藍(lán)染色圖； 圖2C為實(shí)施例二中SEHPLC鑒定回收IFNα-2b純度的鑒定結(jié)果圖； 圖3A、3B分別為實(shí)施例四中SDS-PAGE電泳檢測(cè)的碘染色圖和考馬斯亮藍(lán)染色圖； 圖3C為實(shí)施例四中SEHPLC鑒定回收IFNα-2b純度的鑒定結(jié)果圖； 圖4A、4B分別為實(shí)施例五中SDS-PAGE電泳檢測(cè)的碘染色圖和考馬斯亮藍(lán)染色圖； 圖4C為實(shí)施例五中SEHPLC鑒定回收IFNα-2b純度的鑒定結(jié)果圖； 附圖中標(biāo)記符號(hào)的含義如下 1-A液(反應(yīng)液)；2-E液(穿透峰)；3-低分子量Mark； 4-洗脫峰(回收IFNα-2b)；5-對(duì)照品IFNα-2b
具體實(shí)施例方式 以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明 實(shí)施例一采用陰離子介質(zhì)Q-sepharose回收IFNα-2b 1、PEG修飾IFNα-2b反應(yīng)液的制備 IFNα-2b原液加硼酸緩沖液，調(diào)pH值至7.0～9.0之間，按投料比2.0～3.0∶1加入mPEG-NHS(分子量20KD)，室溫反應(yīng)2hrs，制成A液。
2、IFNα-2b的回收及單PEG化IFNα-2b的純化 2.1、相關(guān)工作液的配制 B液(加樣緩沖液)磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉)，pH7.5，20mM。
C液(置換處理后的反應(yīng)液)用B液充分置換A液(透析或超濾)，得到C液。
D液(IFN洗脫液)向B液中加入NaCl，NaCl終濃度為100mM。
E液(PEG-IFN純化工作液)Tris-HCl緩沖液，pH8.5，20mM。
2.2、IFNα-2b的回收 Q-sepharose處理再生后，以B液為工作液，充分平衡Q-sepharose；取一定量C液，經(jīng)Q-sepharose，收集穿透峰(F)，Q-sepharose仍用B液平衡，并用D洗脫，收集洗脫峰(G)，G即為回收IFN。
2.3、單PEG化IFNα-2b的純化 Q-sepharose處理再生后，以E液為工作液，充分平衡Q-sepharose；取一定量F，并用NaOH調(diào)pH至8.5，上樣，以E液為工作液，平衡后，0～200mM NaCl梯度洗脫，收集主要含單PEG化IFNα-2b的目標(biāo)峰。濃縮后用Sephacryl S-300層析收集單PEG化IFNα-2b，流動(dòng)相為生理鹽水。
3、回收IFNα-2b質(zhì)控指標(biāo)鑒定 3.1、活性鑒定 采用微量病毒抑制(WISH/VSV)法。
3.2、SDS-PAGE電泳檢測(cè) 12％分離膠，5％濃縮膠，利用凝膠系統(tǒng)掃描純度，分別用考馬斯亮藍(lán)染色和碘染色，檢測(cè)結(jié)果分別參見附圖1A和1B，因碘染色的特異性針對(duì)PEG，故附圖1A中的3、4、5未經(jīng)染色。
3.3、SEHPLC鑒定回收IFNα-2b純度。
鑒定條件為中國(guó)藥典方法，鑒定結(jié)果參見附圖1C。
3.4、內(nèi)毒素水平檢測(cè) 采用鱟試劑檢測(cè)法，其內(nèi)毒素水平能與對(duì)照品保持一致。
3.5、異常毒性檢測(cè) 小鼠異常毒性試驗(yàn)見表1 表1Q-sepharose回收IFNα-2b各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 以上各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，同對(duì)照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國(guó)藥典規(guī)定。
實(shí)施例二采用陰離子介質(zhì)Q-sepharose回收IFNα-2b B液(加樣緩沖液)Tris-鹽酸作為加樣緩沖液，pH8.0，50mM； D液(IFN洗脫液)向B液中加入NaCl，NaCl終濃度為20mM。
其余條件同實(shí)施例一。
檢測(cè)與鑒定結(jié)果分別參見附圖2A、2B、2C，因碘染色的特異性針對(duì)PEG，故附圖2A中的3、4、5未經(jīng)染色。
各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，同對(duì)照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國(guó)藥典規(guī)定。
實(shí)施例三采用陰離子介質(zhì)Q-sepharose回收IFNα-2b 1、PEG修飾IFNα-2b反應(yīng)液的制備 IFNα-2b原液加硼酸緩沖液，調(diào)pH值至7.0～9.0之間，按投料比2.0～3.0∶1加入mPEG-NHS(分子量40KD)，室溫反應(yīng)2hrs，制成A液。
其余條件同實(shí)施例一。
各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，同對(duì)照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國(guó)藥典規(guī)定。
實(shí)施例四采用陽離子介質(zhì)SP-sepharose回收IFNα-2b 1、PEG修飾IFNα-2b反應(yīng)液的制備 IFNα-2b原液加硼酸緩沖液，調(diào)pH值至7.0～9.0之間，按投料比2.0～3.0∶1加入mPEG-NHS(分子量20KD)，室溫反應(yīng)2hrs，制成A液。
2、IFNα-2b的回收及單PEG化IFNα-2b的純化 2.1、相關(guān)工作液的配制 B液(加樣緩沖液)醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH5.6，40mM。
C液(置換處理后的反應(yīng)液)用B液充分置換A液(透析或超濾)，得到C液。
D液(IFN洗脫液)向B液中加入NaCl，NaCl終濃度為150mM。
E液(PEG-IFN純化工作液)醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH4.0，20mM。
2.2、IFNα-2b的回收 SP-sepharose處理再生后，以B液為工作液，充分平衡SP-sepharose；取一定量C液，經(jīng)SP-sepharose，收集穿透峰(F)，SP-sepharose仍用B液平衡，并用D洗脫，收集洗脫峰(G)，G即為回收IFN。
2.3、單PEG化IFNα-2b的純化 SP-sepharose處理再生后，以E液為工作液，充分平衡SP-sepharose；取一定量F，并用HAC調(diào)pH至4.0，上樣，以E液為工作液，平衡后，0～200mM NaCl梯度洗脫，收集主要含單PEG化IFNα-2b的目標(biāo)峰。濃縮后用Sephacryl S-300層析收集單PEG化IFNα-2b，流動(dòng)相為生理鹽水。
3、回收IFNα-2b質(zhì)控指標(biāo)鑒定 鑒定方法同實(shí)施例一，檢測(cè)與鑒定結(jié)果分別參見附圖3A、3B、3C，因碘染色的特異性針對(duì)PEG，故附圖3A中的3、4、5未經(jīng)染色。
小鼠異常毒性試驗(yàn)見表2 表2SP-sepharose回收IFNα-2b各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 以上各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，同對(duì)照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國(guó)藥典規(guī)定。
實(shí)施例五采用陽離子介質(zhì)SP-sepharose回收IFNα-2b B液(加樣緩沖液)檸檬酸-檸檬酸鈉，pH5.0，10～20mM； D液(IFN洗脫液)向B液中加入KCl，KCl終濃度為20～30mM。
其余條件同實(shí)施例四。
檢測(cè)與鑒定結(jié)果分別參見附圖4A、4B、4C，因碘染色的特異性針對(duì)PEG，故附圖4A中的3、4、5未經(jīng)染色。
各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，同對(duì)照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國(guó)藥典規(guī)定。
實(shí)施例六采用陽離子介質(zhì)SP-sepharose回收IFNα-2b B液(加樣緩沖液)醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH5.8，10mM； D液(IFN洗脫液)向B液中加入NaCl，NaCl終濃度為10～15mM。
其余條件同實(shí)施例四。
各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，同對(duì)照品相比，本方法所回收IFNα-2b均能與其保持一致，且符合中國(guó)藥典規(guī)定。
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，包括如下步驟
a、將聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液用酸或堿調(diào)至pH值位于5.0～8.0之間；
b、將上述所得反應(yīng)液置換到等pH加樣緩沖液，調(diào)節(jié)加樣緩沖液離子強(qiáng)度，再經(jīng)離子交換層析，使聚乙二醇修飾干擾素穿透，而游離干擾素被吸附；
c、將上述離子交換層析柱充分平衡后，采用濃度為0～200毫摩爾/升的NaCl溶液洗脫，所得洗脫峰即為回收的游離干擾素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，其特征在于所述的干擾素為α-2b干擾素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，其特征在于所述的步驟a中聚乙二醇的分子量為20～40KD，酸為HAc，堿為NaOH。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，其特征在于所述的步驟b中，當(dāng)離子交換層析為陰離子交換層析時(shí)，步驟a中的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液的pH值調(diào)至7.0～8.0之間；若離子交換層析為陽離子交換層析時(shí)，步驟a中的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液的pH值調(diào)至5.0～5.8之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，其特征在于所述的步驟b中，當(dāng)離子交換層析為陰離子交換層析時(shí)，等pH加樣緩沖液為pH值位于7.0～7.5之間的磷酸鹽緩沖液或Tris-鹽酸或巴比妥鈉-鹽酸；若離子交換層析為陽離子交換層析時(shí)，加樣緩沖液為pH值位于5.0～5.6之間的醋酸-醋酸鈉或磷酸氫二鈉-檸檬酸或檸檬酸-檸檬酸鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，其特征在于所述的磷酸鹽緩沖液或Tris-鹽酸或巴比妥鈉-鹽酸的濃度為2～50毫摩爾/升，醋酸-醋酸鈉或磷酸氫二鈉-檸檬酸或檸檬酸-檸檬酸鈉的濃度為2～50毫摩爾/升。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，其特征在于所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液置換到等pH加樣緩沖液后，向緩沖液中加入中性鹽以調(diào)節(jié)加樣緩沖液的離子強(qiáng)度，中性鹽的濃度為0～50毫摩爾/升。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，其特征在于所述的所述的磷酸鹽緩沖液或Tris-鹽酸或巴比妥鈉-鹽酸的濃度為20～40毫摩爾/升，醋酸-醋酸鈉或磷酸氫二鈉-檸檬酸或檸檬酸-檸檬酸鈉的濃度為20～40毫摩爾/升。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，其特征在于所述的中性鹽為NaCl和/或KCl。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法，其特征在于所述的中性鹽的濃度為2～20毫摩爾/升。
全文摘要
本發(fā)明屬于聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中的各組分分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液中回收干擾素的方法。本發(fā)明包括如下步驟a、將聚乙二醇修飾干擾素反應(yīng)液用酸或堿調(diào)至pH值位于5.0～8.0之間；b、將上述所得反應(yīng)液置換到等pH加樣緩沖液，調(diào)節(jié)加樣緩沖液離子強(qiáng)度，再經(jīng)離子交換層析，使聚乙二醇修飾干擾素穿透，而游離干擾素被吸附；c、將上述離子交換層析柱處理再生后，低鹽洗脫，所得洗脫峰即為回收的游離干擾素。本發(fā)明中的方法不影響PEG化IFN的收率以及純度，同時(shí)從反應(yīng)液中所回收的IFN的各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)應(yīng)與對(duì)照品保持一致，能夠重復(fù)利用。
文檔編號(hào)C07K1/18GK101768205SQ20101011553
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2010年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者宋禮華, 許培, 戎隆富, 程婷, 鄔婧 申請(qǐng)人:安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司