專利名稱：聚乙二醇修飾的干擾素組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療肝炎病毒感染的抗病毒藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
C型肝炎病毒(HCV)感染是美國(guó)最普遍的慢性血液傳播感染。雖然新的感染人數(shù)下降了，但慢性感染的負(fù)擔(dān)相當(dāng)大，疾病控制中心估計(jì)在美國(guó)有三千九百萬(1.8％)感染者。慢性肝病在美國(guó)成年人的死亡原因中排名第十，每年導(dǎo)致大約25,000人死亡，或占總死亡人數(shù)的約1％。研究表明，40％的慢性肝病與HCV有關(guān)，估計(jì)每年導(dǎo)致8,000到10,000人死亡。HCV相關(guān)的終末期肝病是成年肝移植患者中最頻繁的指征。
干擾素-α(IFN-α)治療是治療C型肝炎病毒感染的選擇之一。然而，約50％的患者未能達(dá)到持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答。因?yàn)镮FN-α的血清半衰期為8到8.5個(gè)小時(shí)，要維持較高的血清水平就要反復(fù)給藥IFN-α。例如，可接受的劑量方案是每周給藥IFN-α三次(TIW)，持續(xù)24-48周。已設(shè)想與如此反復(fù)給藥相關(guān)的藥物水平的峰和谷會(huì)在治療期間造成干擾素的嚴(yán)重副作用。
在本領(lǐng)域中需要一種具有IFN-α的優(yōu)異抗病毒活性的藥學(xué)制劑，它有期望的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，可降低給藥方案的頻率，在血液中維持足夠高的藥物濃度而同時(shí)可以降低病毒負(fù)荷)。
引用的文獻(xiàn)美國(guó)專利號(hào)，5,252,714；5,382,657；5,539,063；5,559,213；5,672,662；5,747,646；5,766,581；5,792,834；5,795,569；5,798,232；5,824,784；5,834,594；5,849,860；5,928,636；5,951,974；5,595,732；5,981,709；5,985,265；6,005,075；6,180,096；6,250,469；6,277,830。PCT公布號(hào)WO 99/37779。Chamov等.(1994)Bioconj.Chem.5133-140；Harris等.(2001)Clin.Pharmacokinet.40539-551；Reddy(2000)Ann.Pharmacother.34915-923；Bailon等.(2001)Bioconj.Chem.12195-202；Reddy等.(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54571-586。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了連接到具有平均分子量約30kD的線形聚乙二醇(PEG)分子的干擾素-α(IFN-α)和含有同樣部分的組合物。本發(fā)明還提供了用主題PEG-修飾的IFN-α治療病毒感染的方法。


圖1描述了共有干擾素IFN-αcon1的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2是描述命名為PEG-Alfacon的聚乙二醇化(pegylated)的共有干擾素-α進(jìn)行體積排阻色譜的色譜圖。
圖3是描述命名為PEG-Alfacon的PEG化的共有干擾素-α的SDS-PAGE電泳(還原性和非還原性)分析的結(jié)果的照片。
圖4是描述PEG-Alfacon、CIFN(Infergen)和兩個(gè)化合物的混合物的反相HPLC色譜的色譜圖。
圖5是描述用PEG化的干擾素-α類似物(IM-001，IM-003，IM-005和IM-006)，Pegasys和PEG-Intron對(duì)大鼠皮下注射給藥的血清濃度-時(shí)間曲線圖。
圖6是用PEG-Alfacon(制備號(hào)IM-006)對(duì)大鼠皮下注射給藥的血清濃度-時(shí)間曲線的半對(duì)數(shù)圖。
圖7是用PEG-Alfacon對(duì)獼猴進(jìn)行皮下(Sub-Q)給藥的藥代動(dòng)力學(xué)分布的半對(duì)數(shù)圖。
圖8是以A549細(xì)胞/EMCV測(cè)定測(cè)量的Infergen、PEG-Alfacon-1、PEG-Intron和Pegasys的抗病毒活性的對(duì)數(shù)圖，活性以每毫克國(guó)際單位的活性表示，使之符合世界衛(wèi)生組織(WHO)提供的人類白細(xì)胞衍生的干擾素-α的參考標(biāo)準(zhǔn)。圖8描述了A549細(xì)胞所得結(jié)果進(jìn)行的分析。
圖9是以HeLa細(xì)胞/EMCV測(cè)定測(cè)量的Infergen、PEG-Alfacon-1、PEG-Intron和Pegasys的抗病毒活性的對(duì)數(shù)圖，活性以每毫克國(guó)際單位的活性表示，使之符合世界衛(wèi)生組織(WHO)提供的人類白細(xì)胞衍生的干擾素-α的參考標(biāo)準(zhǔn)。圖9描述了用HeLa細(xì)胞所得結(jié)果進(jìn)行的分析。
圖10是以ME180細(xì)胞/EMCV試驗(yàn)測(cè)量的Infergen、PEG-Alfacon-1、PEG-Intron和Pegasys的抗病毒活性的對(duì)數(shù)圖，活性以每毫克國(guó)際單位的活性表示，使之符合世界衛(wèi)生組織(WHO)提供的人類白細(xì)胞衍生的干擾素-α的參考標(biāo)準(zhǔn)。圖10描述了用ME180細(xì)胞所得結(jié)果進(jìn)行的分析。
圖11描述了六個(gè)受試者/組的平均PEG-alfacon血清藥代動(dòng)力學(xué)分布。
圖12A和B描述了以劑量組的劑量校正Cmax(pg/ml；圖12A)和AUC0-最終(pg*h/ml；圖12B)對(duì)體重指數(shù)(BMI)值作的圖。
圖13描述了4-6個(gè)受試者的平均藥代動(dòng)力學(xué)分布和相應(yīng)的用1-區(qū)室模型得到的配合曲線。
圖14A-14G描述了各種劑量方案的模擬血清藥代動(dòng)力學(xué)分布。在圖14A-14G中的每組使用不同的適合于1-區(qū)室模型的數(shù)據(jù)表。圖14A描述了每10天給藥60μg的劑量方案的模擬血清藥代動(dòng)力學(xué)分布。圖14B描述了每10天給藥100μg的劑量方案的模擬血清藥代動(dòng)力學(xué)分布。圖14C描述了每10天給藥150μg的劑量方案的模擬血清藥代動(dòng)力學(xué)分布。圖14D描述了每10天給藥200μg的劑量方案的模擬血清藥代動(dòng)力學(xué)分布。圖14E描述了每7天給藥100μg的劑量方案的模擬血清藥代動(dòng)力學(xué)分布。圖14F描述了每7天給藥150μg的劑量方案的模擬血清藥代動(dòng)力學(xué)分布。圖14G描述了每7天給藥200μg的劑量方案的模擬血清藥代動(dòng)力學(xué)分布。
圖15描述了6個(gè)受試者/劑量組的血清2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的平均百分率(％)的變化。每個(gè)劑量組接受的皮下PEG-alfacon的劑量圖符號(hào)中確定。以15μg皮下Infergen干擾素alfacon-1治療組在圖符號(hào)中確定為“對(duì)照”。
圖16描述了以基線(預(yù)處理)值百分率表示，測(cè)量和預(yù)測(cè)的OAS血清值的百分率(％)變化，它來自使用最小應(yīng)答固定在在0的Emax模型對(duì)平均血清分布的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)(PK-PD)建模。
發(fā)明特征本發(fā)明的特征在于單PEG化的共有干擾素(CIFN)分子由單個(gè)CIFN多肽和單個(gè)聚乙二醇(PEG)部分組成，其中聚乙二醇部分是線形、分子量約30kD并直接或間接地通過一穩(wěn)定的共價(jià)鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或CIFN多肽中的賴氨酸殘基。
在一些實(shí)施方案中，PEG部分既可連接到CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基也可連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基上。在其它實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成，從而在PEG部分和CIFN多肽之間形成水解穩(wěn)定的連接。
在一些實(shí)施方案中，PEG部分連接到CIFN多肽中的N-末端殘基。在其它實(shí)施方案中，PEG部分連接到CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基。在另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽的N-末端殘基的α-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，PEG部分連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基上。在其它實(shí)施方案中，PEG部分連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基。在另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的賴氨酸基的ε-氨基之間的酰胺鍵。還有其它一些實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分的丙酰基與CIFN多肽中的賴氨酸基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，PEG部分與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基相連。在其它實(shí)施方案中，PEG部分與CIFN多肽增加表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基相連。在另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在其它實(shí)施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基的ε-氨基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在其它實(shí)施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸的ε-氨基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸相連lys121，lys134，lys135和lys165。在其它實(shí)施方案中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸的ε-氨基相連lys121，lys134，lys135和lys165。在另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在上述的單PEG化的CIFN分子方面，本發(fā)明考慮了每個(gè)這樣的分子的實(shí)施方案，其中CIFN多肽是選自干擾素-α-con1，干擾素-α-con2和干擾素-α-con3，CIFN多肽的氨基酸序列披露于美國(guó)專利號(hào)4,695,623。
本發(fā)明的特征也在于含有一群?jiǎn)蜳EG化的共有干擾素(CIFN)分子的組合物，其中這群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個(gè)CIFN多肽和單個(gè)PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD并直接或間接地通過共價(jià)鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或賴氨酸殘基。在其它實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個(gè)CIFN多肽和單個(gè)PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD并直接或間接地通過共價(jià)鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或表面暴露的賴氨酸殘基。在其它實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙酰基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個(gè)CIFN多肽和單個(gè)PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD并直接或間接地通過共價(jià)鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或選自下列的賴氨酸殘基lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在其它實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙酰基與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個(gè)CIFN多肽和單個(gè)PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD并直接或間接地通過共價(jià)鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或選自下列的賴氨酸殘基lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在其它實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種分子組成，其中每種分子由單個(gè)CIFN多肽和單個(gè)PEG部分組成，其中PEG部分為線形、分子量約30kD并直接或間接地通過共價(jià)鍵連接到CIFN多肽中的N-末端殘基或選自下列的賴氨酸殘基lys121，lys134，lys135和lys165。在其它實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分連接到CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基。在其它實(shí)施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分連接到CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基上。在另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中的N-末端殘基的α-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽的N-末端殘基的α-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基。在其它實(shí)施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基上。在另外的實(shí)施方案中，在該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽的賴氨酸殘基的ε-氨基上之間的酰胺鍵。還有其它一些實(shí)施方案中，在該群分子中每一類分子的連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，在該群分子中每一類分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基相連。在其它實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽這中表面暴露的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在其它實(shí)施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸的ε-氨基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在更另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在其它實(shí)施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基的ε-氨基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。還有其它一些實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在一些實(shí)施方案中，該群分子由一種或多種單PEG化的CIFN組成，其中PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165。在其它實(shí)施方案中，在該群分子的每一種分子中，PEG部分與CIFN多肽中選自下列的賴氨酸殘基的ε-氨基相連lys121，lys134，lys135和lys165。在另外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。還有其它一些實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的連接包括在PEG部分的丙?；cCIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。在額外的實(shí)施方案中，該群分子中每一種分子的酰胺鍵是由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中選擇的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發(fā)明考慮了以下分子群的實(shí)施方案即該分子群由第一個(gè)和第二個(gè)單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個(gè)CIFN多肽中的N-末端殘基相連，而第二個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個(gè)CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連，并且其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發(fā)明考慮了以下分子群的實(shí)施方案即該分子群由第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個(gè)CIFN多肽中的N-末端殘基相連，第二個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個(gè)CIFN多肽中的第一個(gè)賴氨酸殘基相連，第三個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第三個(gè)CIFN多肽中的第二個(gè)賴氨酸殘基相連，其中第一個(gè)、第二個(gè)和第三個(gè)CIFN多肽可以相同或不同，而第二個(gè)CIFN多肽中連接點(diǎn)的位置與第三個(gè)CIFN多肽中連接點(diǎn)的位置不相同。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發(fā)明考慮了以下分子群的實(shí)施方案即該分子群由第一個(gè)、第二個(gè)、第三個(gè)和第四個(gè)單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個(gè)CIFN多肽中的N-末端殘基相連，第二個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個(gè)CIFN多肽中的第一個(gè)賴氨酸殘基相連，第三個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第三個(gè)CIFN多肽中的第二個(gè)賴氨酸殘基相連，第四個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第四個(gè)CIFN多肽中的第三個(gè)賴氨酸殘基相連，其中第一個(gè)、第二個(gè)、第三個(gè)和第四個(gè)CIFN多肽可與任何其它CIFN多肽相同或不同，而在第二個(gè)、第三個(gè)和第四個(gè)CIFN多肽中連接點(diǎn)的位置也與任何其它CIFN多肽中的連接點(diǎn)的位置不相同。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發(fā)明考慮了以下分子群的實(shí)施方案即該分子群由第一個(gè)、第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)和第五個(gè)單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個(gè)CIFN多肽中的N-末端殘基相連，第二個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個(gè)CIFN多肽中的第一個(gè)賴氨酸殘基相連，第三個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第三個(gè)CIFN多肽中的第二個(gè)賴氨酸殘基相連，第四個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第四個(gè)CIFN多肽中的第三個(gè)賴氨酸殘基相連，第五個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第五個(gè)CIFN多肽中的第四個(gè)賴氨酸殘基相連，其中第一個(gè)、第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)和第五個(gè)CIFN多肽可與任何其它CIFN多肽相同或不同，而在第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)和第五個(gè)CIFN多肽中連接點(diǎn)的位置也與任何其它CIFN多肽的連接點(diǎn)的位置不相同。
在上述的每一種由包含與CIFN多肽的N-末端殘基或賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發(fā)明考慮了以下分子群的實(shí)施方案即該分子群由第一個(gè)、第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)、第五個(gè)和第六個(gè)單PEG化的CIFN分子組成，其中第一個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第一個(gè)CIFN多肽中的N-末端殘基相連，第二個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第二個(gè)CIFN多肽中的第一個(gè)賴氨酸殘基相連，第三個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第三個(gè)CIFN多肽中的第二個(gè)賴氨酸殘基相連，第四個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第四個(gè)CIFN多肽中的第三個(gè)賴氨酸殘基相連，第五個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第五個(gè)CIFN多肽中的第四個(gè)賴氨酸殘基相連，第六個(gè)單PEG化的CIFN分子所含的PEG部分與第六個(gè)CIFN多肽中的第五個(gè)賴氨酸殘基相連，其中第一個(gè)、第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)、第五個(gè)和第六個(gè)CIFN多肽可與任何其它CIFN多肽相同或不同，而在第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)、第五個(gè)和第六個(gè)CIFN多肽中連接點(diǎn)的位置也與任何其它CIFN多肽的連接點(diǎn)的位置不相同。
在上述的每一中包含與CIFN多肽的賴氨酸殘基相連的PEG部分的單聚乙二醇化CIFN分子組成的分子群方面，本發(fā)明考慮的實(shí)施方案的特征在于許多種類的單聚乙二醇化、賴氨酸衍生的CIFN分子，其中每一種的特征在于連接點(diǎn)與其它任何種類的連接點(diǎn)不相同，該方式與上述包括單聚乙二醇化、N-末端衍生的CIFN分子的群體的實(shí)施方案類似。尤其是本發(fā)明的實(shí)施方案的特征在于許多種類的單聚乙二醇化、賴氨酸衍生的CIFN分子可通過修改與上述包括單聚乙二醇化、N-末端衍生的CIFN分子的群體有關(guān)的實(shí)施方案，去除其中所含的N-末端衍生種類得到。
在上述的每一種單聚乙二醇化CIFN分子群體方面，本發(fā)明考慮的實(shí)施方案在于每個(gè)分子群體中的分子含有選自干擾素α-con1、干擾素α-con2和干擾素α-con3的CIFN多肽。
本發(fā)明另外的特征在于用CIFN多肽與線形、分子量約為30kD的α-甲氧基、ω-丙?；垡叶嫉溺牾啺孵?mPEGspa)反應(yīng)的方法產(chǎn)生的產(chǎn)物，其中反應(yīng)物最初以CIFN∶mPEGspa的摩爾比為約1∶1到1∶5存在，反應(yīng)在pH約7到9進(jìn)行，然后回收反應(yīng)的單PEG化的CIFN產(chǎn)物。在一實(shí)施方案中，反應(yīng)物最初以CIFN∶mPEGspa的摩爾比為約1∶3存在，反應(yīng)在pH約8進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明產(chǎn)品由需要毒理學(xué)和臨床研究的、放大的方法生產(chǎn)，反應(yīng)物最初以CIFN∶mPEGspa的摩爾比為約1∶2存在，反應(yīng)在pH約8.0進(jìn)行。
在上述的產(chǎn)物生產(chǎn)方法方面，本發(fā)明考慮的實(shí)施例在于CIFN反應(yīng)物是選自干擾素α-con1、干擾素α-con2和干擾素α-con3。
在一些方面，本發(fā)明的單PEG化的CIFN分子或群體表現(xiàn)出比批準(zhǔn)的治療慢性丙型肝炎的市場(chǎng)產(chǎn)品PEGASAYSPEG-干擾素-α2a至少大10倍的抗病毒活性。在其它方面，本發(fā)明的單PEG化的CIFN分子或群體表現(xiàn)出與INFERGEN的Alfacon-1大致相同的抗病毒活性。
本發(fā)明額外的特征在于含有上述的這種分子的任何單PEG化的CIFN分子或分子群體的藥學(xué)組合物和藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中，該藥學(xué)組合物包含本發(fā)明單PEG化的CIFN分子或群體的量可在患者中有效地治療病毒疾病。在其它實(shí)施方案中，該藥學(xué)組合物包含本發(fā)明單PEG化的CIFN分子或群體的量可在患者中有效地治療肝炎病毒疾病。在其它實(shí)施方案中，該藥學(xué)組合物包含的本發(fā)明單PEG化的CIFN分子或群體的量可在患者中有效地治療丙型肝炎病毒(HCV)疾病。
定義用于文中的術(shù)語“治療”“治療的”等指獲得所需要的藥理或生理學(xué)效果。按照完全或部分阻止疾病或癥狀，該效果是預(yù)防性的和/或按照部分或完全治愈疾病和/或可歸因于疾病的負(fù)作用，該效果是治療性的。用在文中的“治療”包含在哺乳動(dòng)物，特別是在人中治療疾病，并且包括(a)阻止疾病或在易患疾病但尚未診斷出現(xiàn)的疾病癥狀(例如包括與原發(fā)性疾病相關(guān)或由其導(dǎo)致的疾病(如可導(dǎo)致慢性HCV感染的肝纖維變性))；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；和(c)緩解疾病，即導(dǎo)致疾病消退。
術(shù)語“個(gè)體”、“宿主”、“受試者”和“患者”可在文中互換使用，并指哺乳動(dòng)物，包括但不限于靈長(zhǎng)類動(dòng)物(包括猿和人)。
用在文中的術(shù)語“藥代動(dòng)力學(xué)分布”指在向受試者給予IFN-α后，將IFN-α的血清濃度對(duì)時(shí)間作圖得到的曲線分布?！扒€下的面積”或“AUC”指在向受試者給予IFN-α后，將IFN-α的血清濃度對(duì)時(shí)間作圖產(chǎn)生的曲線下的積分面積。
術(shù)語“肝炎病毒感染”指甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒中一種或多種的感染，血液傳播的肝炎病毒感染是尤其令人感興趣的，特別是丙型肝炎病毒感染。
在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，要了解的是本發(fā)明并不限于所描述的特定的實(shí)施方案，這種實(shí)施方案當(dāng)然是可以變化的。還需要了解的是既然本發(fā)明的范圍僅受附加的權(quán)利要求限制，用在文中的術(shù)語僅是為了描述特定的實(shí)施方案而非限制性的。
在提供值的范圍的地方，應(yīng)了解在該范圍上下限之間的每個(gè)插入值(除非文中另有明確規(guī)定，該插入值到下限單位的十分之一)和在所述范圍中任何其它規(guī)定的值或插入值均包括在本發(fā)明內(nèi)。以在規(guī)定的范圍內(nèi)任何具體的排它性限制為條件，這些小范圍的上下限可以獨(dú)立地包括在該小范圍內(nèi)并包括于本發(fā)明。在規(guī)定的范圍包括限制的一個(gè)或兩個(gè)時(shí)，排除包括限制的一個(gè)或兩個(gè)的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。
除非另有定義，所有文中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的意思相同。雖然任何類似或等同于于文中所描述的方法和材料均可用于實(shí)踐和測(cè)試本發(fā)明，優(yōu)選的方法和材料是現(xiàn)在描述的。文中提及的所有出版物均納入本文作為參考來披露和描述與所引用的出版物有關(guān)的方法和/或材料。
必須注意的是，除非文中另有明確規(guī)定，用在文中和附加的權(quán)利要求中的單數(shù)形式“一個(gè)”、“和”與“該”均包括復(fù)數(shù)對(duì)象。因此，例如“一修飾的IFN-α多肽”包括許多這種多肽，“一PEG分子”包括參考一個(gè)或多個(gè)PEG分子和本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的其等效物等等。
文中提供討論的出版物僅是因?yàn)槠涔_早于本申請(qǐng)的提交日。不應(yīng)認(rèn)為由于在先發(fā)明而使本發(fā)明不具資格先于這種出版物。此外，所提供的出版物日期可能與實(shí)際發(fā)表日期不符，這需要獨(dú)立地證實(shí)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供線形聚乙二醇(PEG)修飾的IFN-α。特別是本發(fā)明提供與單個(gè)PEG分子相連的IFN-α多肽(即，IFN-α多肽是“單PEG化的”)。本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α的藥代動(dòng)力學(xué)分布是其有效地治療病毒感染，特別是肝炎病毒感染。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療肝炎病毒感染的方法。這些方法一般包括向感染或易于感染肝炎病毒的個(gè)人施用加有效量的PEG-修飾的IFN-α。
PEG-修飾的IFN-α本發(fā)明提供用平均分子量小于約40kD的聚乙二醇(PEG)分子修飾的IFN-α。本發(fā)明特別提供與小于約40kD的PEG單分子相連的IFN-α多肽，與約30kD的PEG分子相連是尤其有興趣的，更特別是線形30kD的PEG分子與IFN-α相連，與CIFN相連也是特別令人感興趣的。
IFN-α用在文中的術(shù)語“干擾素-α”指抑制病毒復(fù)制、細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的相關(guān)多肽的一族。術(shù)語“IFN-α”包括天然產(chǎn)生、非天然產(chǎn)生IFN-α多肽和保留親本天然產(chǎn)生或非天然產(chǎn)生IFN-α的抗病毒活性的天然產(chǎn)生、非天然產(chǎn)生IFN-α類似物。
合適的α干擾素包括，但不限于天然產(chǎn)生的IFN-α(包括，但不限于自然存在的IFN-α2a、IFN-α2b)；重組干擾素-α2b，例如獲得自Schering公司(Kenilworth，N.J.)的IntronA干擾素；重組干擾素-α2a，例如獲得自Hoffmann-La Roche(Nutley，N.J.)的Roferon干擾素；重組干擾素-α2c，例如獲得自Boehringer IngelheimPharmaceutical，Inc.(Ridgefield，Coma.)的Beroforα2干擾素；干擾素-αn1，即天然α干擾素的純化混合物，例如獲得自Sumitomo(Japan)的Sumiferon或Glaxo-Wellcome Ltd.，London，Great Britain的WellferonS干擾素α-n1(INS)；和由Interferon Sciences生產(chǎn)獲得自Purdue Frederick Co.，Norwalk，Conn.商品名為Alferon的天然α干擾素的干擾素α-n3混合物。
用在文中的術(shù)語“IFN-α”也包括共有IFN-α。用在文中的術(shù)語“共有IFN-α”指非天然產(chǎn)生的多肽，包括對(duì)所有天然產(chǎn)生的人白細(xì)胞IFN-α亞型序列而言常見的那些氨基酸殘基和包括主要出現(xiàn)在一個(gè)或多個(gè)不存在對(duì)于所有亞型常見的氨基酸的位置的氨基酸，只要該多肽在不存在對(duì)所有亞型常見的氨基酸的位置排斥任何不存在于至少一種天然產(chǎn)生的亞型中的氨基酸殘基。對(duì)所有天然產(chǎn)生的人白細(xì)胞IFN-α亞型序列常見的氨基酸殘基(“常見氨基酸殘基”)和主要出現(xiàn)在非常見殘基的氨基酸殘基(“共有氨基酸殘基”)是本領(lǐng)域已知的。圖1為IFN-αcon1的氨基酸序列。因此，共有干擾素是全合成的I型干擾素，它是通過掃描幾個(gè)干擾素-α非等位亞型并將最頻繁觀察到的氨基酸安排在各位置而開發(fā)的。
共有IFN-α(也指“CIFN”、“IFN-con”和“IFN-αcon”)包括，但不限于命名為IFN-con1(有時(shí)指“CIFN-αcon1”、“IFN-αcon1”或“IFN-con1”或“αcon”)，IFN-con2和IFN-con3(見美國(guó)專利號(hào)4,695,623和4,897,471)和Infergen(Amegen，ThousandOaks，Calif.)的氨基酸序列。共有干擾素一般通過確定天然產(chǎn)生的干擾素α的共有序列來限定。在一些實(shí)施方案中，PEG-修飾的CIFN，特別是Infergen是特別有興趣的。
IFN-α多肽可用任何已知的方法生產(chǎn)。編碼IFN-con的DNA序列可由上述專利或其它標(biāo)準(zhǔn)方法合成。在許多實(shí)施方案中，IFN-α多肽是轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入細(xì)菌宿主例如大腸桿菌或真核宿主細(xì)胞(例如，酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO細(xì)胞等)的制造DNA序列的表達(dá)產(chǎn)品。在這些實(shí)施方案中，IFN-α是“重組IFN-α”。當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌宿主細(xì)胞時(shí)，IFN-α修飾為含有N-末端甲硫氨酸。在大腸桿菌中生產(chǎn)的IFN-α一般通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的過程純化，IFN-con1的純化一般描述于Klein等((1988)J.Chromatog.454205-215)。
細(xì)菌產(chǎn)生的IFN-α可含有與N-末端氨基酸殘基有關(guān)的同種型的混合物。例如，純化的IFN-con可含有與N-末端甲硫氨酸狀況有關(guān)的同種型的混合物。例如，在一些實(shí)施方案中，IFN-con含有N-末端甲硫氨酰IFN-con，N末端未封閉的脫甲硫氨酰IFN-con和具有封閉的N末端的脫甲硫氨酰IFN-con的混合物。含有甲硫氨酰IFN-con1，脫甲硫氨酰IFN-con1和具有封閉的N末端的脫甲硫氨酰IFN-con1的混合物的純化的IFN-con1作為一非限制性例子，Klein等((1990)Arch.Biochemistry &Biophys.276531-537)。此外，IFN-con可含有特定的、分離的同種型。IFN-con的同種型可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的技術(shù)，例如等電聚焦來相互分離。
需要了解的是文中描述的IFN-α含有一種或多種修飾的氨基酸殘基，例如糖基化，化學(xué)修飾等。
連接位點(diǎn)PEG既可直接偶合(即，無連接基團(tuán))，也可通過一接頭(如下所詳述的)偶合到IFN-α多肽上的氨基基團(tuán)。
在一些實(shí)施方案中，PEG化的IFN-α是在IFN-α多肽的氨基末端(N-末端)或接近氨基末端PEG化的，例如，PEG部分結(jié)合到IFN-α多肽的從氨基酸1到氨基酸4的氨基酸殘基上，或從氨基酸5到約10。
在其它的實(shí)施方案中，PEG化的IFN-α是在氨基酸殘基從約10到28PEG化的。
在其它的實(shí)施方案中，PEG化的IFN-α是在氨基酸殘基從100到114PEG化的。
在感興趣的特定實(shí)施方案中，當(dāng)IFN-α是CIFN時(shí)，PEG分子連接到CIFN多肽的NH2末端氨基酸殘基。在這些實(shí)施方案中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
在一些實(shí)施方案中，PEG化的IFN-α含有在賴氨酸殘基的ε-氨基PEG化的CIFN。圖1是顯示了賴氨酸殘基的位置的示范性的IFN-α的氨基酸序列。
PEG部分一般連接到表面暴露的賴氨酸(“l(fā)ys”)殘基。賴氨酸是否暴露于表面可用任何已知的方法確定。一般而言，親水性分析(例如，Kyte-Doolittle和Hoppe-Woods分析)和/或用合適的計(jì)算機(jī)程序?qū)Ρ砻嫘纬蓞^(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)(例如，Emini表面形成概率分析)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。合適的計(jì)算機(jī)程序包括PeptideStructure等。此外，由于在NMR圖譜中特定官能團(tuán)的質(zhì)子的化學(xué)位移，NMR研究可鑒定表面可接近的殘基和它們是如何受包括的“移位試劑”的影響。在其它情況中，殘基與溶劑或環(huán)境的不可接近性或可接近性可由熒光來評(píng)估。還有在其它的情況中，可接近賴氨酸的表面暴露情況可由其與水溶性試劑(例如，三硝基苯磺酸酯或TNBS)的化學(xué)反應(yīng)性來確認(rèn)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供PEG-修飾的CIFN，其中PEG部分與選自下列的賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在這些實(shí)施方案中，PEG部分是平均分子量約30kD的線形PEG部分。
在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供PEG-修飾的CIFN，其中PEG部分與選自下列的賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在這些實(shí)施方案中，PEG部分是平均分子量約30kD的線形PEG部分。
在其它的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供PEG-修飾的CIFN，其中PEG部分與選自下列的賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165。在這些實(shí)施方案中，PEG部分是平均分子量約30kD的線形PEG部分。
IFN-α的群體本發(fā)明進(jìn)一步提供含有單PEG化的IFNα分子群體的組合物，其中該群體由一種或多種上述的單PEG化的IFNα分子組成。如上所述，本發(fā)明的PEG修飾的IFNα在每個(gè)IFN-α多肽分子中含有單個(gè)PEG分子。在一些實(shí)施方案中，一主題組合物含有修飾的IFN-α多肽群體，各具有連接到多肽的單個(gè)氨基酸殘基的單個(gè)PEG分子。
在這些實(shí)施方案中，該群體含有在與第一個(gè)氨基酸殘基上的PEG分子相連的第一個(gè)IFN-α多肽和至少一個(gè)在第二個(gè)氨基酸殘基上的PEG分子相連的第二個(gè)IFN-α多肽的混合物，其中第一個(gè)和第二個(gè)IFN-α多肽可以相同或不同，并且在第一個(gè)IFN-α多肽的氨基酸序列中的第一個(gè)氨基酸殘基的位置不同于在第二個(gè)IFN-α多肽的氨基酸序列中的第二個(gè)氨基酸殘基的位置。含有在其氨基末端連接有線形PEG分子的PEG-修飾的IFN-α多肽群體和在其賴氨酸殘基上連接有PEG分子的IFN-α多肽的主題組合物可作為非限制性例子。
總體上，一給定的修飾的IFN-α種類代表在一群體中的所有單PEG化的IFNα多肽分子群中約占0.5％到99.5％，例如一給定的修飾的IFN-α種類代表在一群體中所有單PEG化的IFN-α多肽分子群約占0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％。在一些實(shí)施方案中，主題組合物含有單PEG化的IFN-α多肽群體，該群體含有至少約70％、80％、90％、95％或至少99％IFN-α多肽在同一部位連接PEG，例如在N-末端氨基酸。
在感興趣的特殊實(shí)施方案中，主題組合物含有單PEG化的CIFN分子群，群體由一種或多種分子組成，其中每種分子是單個(gè)CIFN多肽直接或間接地共價(jià)連接到分子量約30kD的單個(gè)線形PEG部分，并且既可以連接到CIFN多肽中的賴氨酸殘基又可連接到CIFN多肽的N-末端氨基酸殘基。
在許多實(shí)施方案中，與PEG相連的氨基酸殘基是N-末端氨基酸殘基。在其它實(shí)施方案中，PEG部分是連接(直接或通過接頭)到表面暴露的賴氨酸殘基。在另外的實(shí)施方案中，PEG部分是連接(直接或通過接頭)到選自下列的CIFN多肽的賴氨酸殘基lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，PEG部分是連接(直接或通過連接物)到選自下列的CIFN多肽的賴氨酸殘基上lys50，lys71，lys134，lys135和lys165。在另外的的實(shí)施方案中，PEG部分是連接(直接或通過接頭)到選自下列的CIFN多肽的賴氨酸殘基lys121，lys134，lys135和lys165。
作為例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽的N-末端氨基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽的第一個(gè)賴氨酸殘基相連，其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)例子，主題組合物含有的單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽的N-末端氨基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽的第一個(gè)表面暴露的賴氨酸殘基相連，其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與CIFN多肽的暴露于表面的賴氨酸殘基相連，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽的N-末端氨基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽的選自下列之一的第一個(gè)賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進(jìn)一步含有具有PEG部分的第三種單PEG化的CIFN多肽與第三個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第二個(gè)賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，而第三個(gè)CIFN多肽可以與第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽相同或不相同，其中第三個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第二個(gè)賴氨酸殘基的位置與第二個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第一個(gè)賴氨酸殘基的位置不同。主題組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽的N-末端氨基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第一個(gè)賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進(jìn)一步含有具有PEG部分的第三種單PEG化的CIFN多肽與第三個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第二個(gè)賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，而第三個(gè)CIFN多肽可以與第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽相同或不相同，其中第三個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第二個(gè)賴氨酸殘基的位置與第二個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第一個(gè)賴氨酸殘基的位置不相同。主題組合物可進(jìn)一步含有至少一個(gè)額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽的N-末端氨基酸殘基相連，而具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第一個(gè)賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165，其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同。主題組合物可進(jìn)一步含有具有PEG部分的第三種單PEG化的CIFN多肽與第三個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第二個(gè)賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165，而第三個(gè)CIFN多肽可以與第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽相同或不相同，其中第三個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第二個(gè)賴氨酸殘基的位置與第二個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第一個(gè)賴氨酸殘基的位置不相同。主題組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys121，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽中的第一個(gè)賴氨酸殘基相連，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽中的第二個(gè)賴氨酸殘基相連，第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同，其中在第一個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第一個(gè)賴氨酸的位置與第二個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第二個(gè)賴氨酸的位置不向同。主題組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN與CIFN多肽的賴氨酸殘基相連，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第一個(gè)賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第二個(gè)賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同，并且在第二個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第二個(gè)賴氨酸殘基的位置與第一個(gè)CIFN多肽中的第一個(gè)賴氨酸殘基的位置不相同。組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第一個(gè)賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第二個(gè)賴氨酸殘基相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同，并且在第二個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第二個(gè)賴氨酸殘基的位置與第一個(gè)CIFN多肽中的第一個(gè)賴氨酸殘基的位置不相同。組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys31，lys50，lys71，lys84，lys121，lys122，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第一個(gè)賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第二個(gè)賴氨酸殘基相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同，并且在第二個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第二個(gè)賴氨酸殘基的位置與第一個(gè)CIFN多肽中的第一個(gè)賴氨酸殘基的位置不相同。組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys50，lys71，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)非限制性例子，主題組合物含有的單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第一個(gè)賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽中的選自下列之一的第二個(gè)賴氨酸殘基相連lys121，lys134，lys135和lys165，其中第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同，并且在第二個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中的第二個(gè)賴氨酸殘基的位置與第一個(gè)CIFN多肽中的第一個(gè)賴氨酸殘基的位置不相同。組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN多肽與選自下列之一的賴氨酸相連lys121，lys134，lys135和lys165，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
作為另一個(gè)非限制性例子，主題組合物含有單PEG化CIFN多肽分子群由第一種和第二種單PEG化的CIFN多肽組成，其中具有PEG部分的第一種單PEG化的CIFN多肽與第一個(gè)CIFN多肽中表面暴露的第一個(gè)賴氨酸殘基相連，具有PEG部分的第二種單PEG化的CIFN多肽與第二個(gè)CIFN多肽中表面暴露的第二個(gè)賴氨酸殘基相連，第一個(gè)和第二個(gè)CIFN多肽可以相同或不同，其中在第一個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中暴露于表面的第一個(gè)賴氨酸的位置與第二個(gè)CIFN多肽的氨基酸序列中暴露于表面的第二個(gè)賴氨酸的位置不相同。對(duì)象組合物可進(jìn)一步含有至少一種額外的具有PEG部分的單PEG化的CIFN與CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基相連，其中在每種額外的單PEG化的CIFN多肽中連接位點(diǎn)的位置與任何其它種類的連接位點(diǎn)的位置不相同。該例子的所有種類中，PEG部分是具有平均分子量約30kD的線形PEG部分。
連接基團(tuán)在一些實(shí)施方案中，PEG經(jīng)由連接基團(tuán)與IFN-α相連。連接基團(tuán)是任何生物相容的連接基團(tuán)，其中“生物相容”表明該混合物或基團(tuán)基本上是無毒的并可在體內(nèi)使用而不給受試者造成明顯的不良應(yīng)答，例如損傷、患病、疾病、不期望的免疫應(yīng)答或死亡。PEG可通過，例如醚鍵、酯鍵、硫醚鍵或酰胺鍵與連接基團(tuán)相連。合適的生物相容連接基團(tuán)包括，但不限于酯基團(tuán)，酰胺基團(tuán)，亞胺基團(tuán)，氨基甲酸基團(tuán)，羧基，羥基，糖類，琥珀酰亞胺基團(tuán)(包括，例如琥珀酰亞胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亞胺丙酸活化酯(SPA)、琥珀酰亞胺丁酸(SBA)、琥珀酰亞胺羧甲酸酯(SCM)、琥珀酰亞胺琥珀酰胺(SSA)或N-羥基琥珀酰亞胺(NHS))，環(huán)氧化物基團(tuán)，氧羰基咪唑基團(tuán)(包括例如碳酰二咪唑(CDI))，硝基苯基團(tuán)(包括，例如硝基苯碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))，甲苯磺酸酯(trysylate)基團(tuán)，醛基，異氰酸酯基團(tuán)，乙烯砜基團(tuán)，酪氨酸基團(tuán)，半胱氨酸基團(tuán)，組氨酸基團(tuán)或伯胺。
在許多實(shí)施方案中，PEG是與IFN-α多肽上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)的單甲氧基PEG分子。通過還原性烷基化用單甲氧基PEG修飾多肽的方法是本領(lǐng)域已知的。見，例如，Chamow等(1994)Bioconj.Chem.5133-140。
在非限制性例子中，PEG經(jīng)SPA連接基團(tuán)與IFN-α相連。PEG的SPA酯和制備相同物質(zhì)的方法描述于美國(guó)專利號(hào)5,672,662。SPA連接在IFN-α多肽上提供游離胺基團(tuán)的連接。
例如，PEG分子通過包括酰胺鍵的連接共價(jià)相連，該酰胺鍵在PEG部分的丙?；虸FN-α多肽中的表面暴露的賴氨酸殘基的ε氨基之間。該鍵，例如可以通過PEG的α甲氧基、ω丙酸活化酯(mPEGspa)的形成。
作為非限制性例子，單PEG化CIFN有約30kD的線形PEG部分通過共價(jià)鍵連接到CIFN多肽，其中共價(jià)連接是在PEG部分的丙酰基和CIFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε氨基之間的酰胺鍵，其中表面暴露的賴氨酸殘基是選自下列l(wèi)ys50，lys71，lys134，lys135和lys165，酰胺鍵是通過PEG的α甲氧基、ω丙酸活化酯的縮合形成的。
作為另一個(gè)非限制性例子，單PEG化CIFN有約30kD的線形PEG部分通過共價(jià)鍵連接到CIFN多肽，其中共價(jià)鍵是在PEG部分的丙?；虲IFN多肽中表面暴露的賴氨酸殘基的ε氨基之間的酰胺鍵，其中表面暴露的賴氨酸殘基是選自下列l(wèi)ys121，lys134，lys135和lys165，酰胺鍵是通過PEG的α甲氧基、ω丙酸活化酯的縮合形成的。
將PEG分子連接到IFN-α多肽的方法是本領(lǐng)域已知的，并且可使用任何已知的方法。見，例如Park等，Anticancer Res.，1373-376(1981)；Zaplipsky和Lee，《聚乙二醇化學(xué)生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用》(Polyethylene GlycolChemistryBiotechnical and Biomedical Applications)，J.M.Harris編.，Plenum出版社，NY，21章(1992)和美國(guó)專利號(hào)5,985,265。
聚乙二醇聚乙二醇于室溫溶于水，其通用結(jié)構(gòu)式為R-O-(CH2-CH2O)n-R，其中R是氫或保護(hù)基團(tuán)(例如烷基或烷醇基團(tuán))，n是從1到1000的整數(shù)。R是保護(hù)基團(tuán)，其一般有1到8個(gè)碳。
在許多實(shí)施方案中，PEG有至少一個(gè)羥基(例如末端羥基)，該羥基經(jīng)修飾產(chǎn)生與氨基反應(yīng)的功能性基團(tuán)，例如，賴氨酸殘基的ε氨基、多肽N-末端的游離氨基或任何其它的氨基，例如天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸或組氨酸的氨基。
在其它的實(shí)施方案中，PEG衍生以致它能與IFN-α多肽中的游離羧基反應(yīng)，例如IFN-α多肽的羧基末端的游離羧基。合適的與IFN-α的羧基末端的游離羧基反應(yīng)的PEG衍生物包括，但不限于PEG-胺和PEG的肼衍生物(例如，PEG-NH-NH2)。
在其它實(shí)施方案中，PEG衍生以致它含有末端硫代羧酸基團(tuán)-COSH，該基團(tuán)可選擇性地與氨基反應(yīng)產(chǎn)生酰胺衍生物。由于硫代酸的反應(yīng)性質(zhì)，可以獲得某些氨基而跳過其它氨基的選擇性。例如，在適當(dāng)?shù)膒H條件下，-SH在與N-末端氨基反應(yīng)中表現(xiàn)出充分的離去基團(tuán)能力使得賴氨酸殘基中的ε氨基被質(zhì)子化并維持非親核性。另一方面，在合適的pH條件下進(jìn)行的反應(yīng)可以選擇性地使一些可接近的賴氨酸殘基反應(yīng)。
在其它的實(shí)施方案中，PEG包括反應(yīng)性酯，例如在PEG鏈的末端的N-羥基琥珀酰亞胺。這種含有N-羥基琥珀酰亞胺的PEG分子在特定的pH條件下(例如，中性pH6.5-7.5)與選擇的氨基反應(yīng)。例如，可在中性pH條件下選擇性地修飾N-末端氨基。然而，如果試劑的反應(yīng)性是極端的，可接近的賴氨酸-NH2基團(tuán)也可反應(yīng)。
在其它的實(shí)施方案中，PEG在其鏈的末端含有充足活性的N-羥基琥珀酰亞胺酯，由于在PEG鏈的末端和酯之間有合適的間隔物(例如丙?；?使得該酯不能快速水解并在特定的pH條件下(從中性到堿性，即pH7.0-9.0)更加選擇性地反應(yīng)。例如，多肽鏈中的某些賴氨酸的ε氨基可用N-羥基琥珀酰亞胺丙酸酯活化的PEG選擇性地修飾。選擇使用具體的方法以產(chǎn)生確定的組合物和活性的產(chǎn)物。
PEG可直接或通過一接頭與IFN-α多肽接合。在一些實(shí)施方案中，向IFN-α多肽加入接頭以形成接頭修飾的IFN-α多肽。這樣的接頭可提供各種功能度(例如，反應(yīng)基團(tuán)例如巰基、氨基或羧基)將PEG試劑偶合到接頭修飾的IFN-α多肽。
在一些實(shí)施方案中，接合到IFN-α多肽的PEG是線形的。在其它的實(shí)施方案中，接合到IFN-α多肽的PEG是支鏈的。支鏈的PEG衍生物例如那些描述于美國(guó)專利號(hào)5,643,575，“star-PEG’s”和多臂PEG’s例如描述于Shearwater Polymers，Inc.目錄“聚乙二醇衍生物1997-1998”(Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998)。Star PEGs在技術(shù)上的描述包括，例如，美國(guó)專利號(hào)6,046,305。
在特別感興趣的實(shí)施方案中，接合到IFN-α多肽的PEG是線形的。
本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α多肽含有分子量低于40kD的單個(gè)PEG分子。在文中使用并且是本領(lǐng)域熟知的“30kDa”PEG的平均分子量為30kDa。一般使用平均分子量約為2kDa到30kDa的PEG。例如，線形PEG分子的分子量約為20kD到40kD，22kD到28kD，24kD到36kD，26kD到34kD或28kD到32kD。在特定的實(shí)施方案中，PEG的分子量約為30kD并且是線形的。
PEG分子的分子量可使用合適的分子量標(biāo)記由凝膠過濾柱層析來確定，或通過MALDI-TOF質(zhì)譜來確定。
PEG修飾的IFN-α本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α的分子量低于與支鏈的40kDaPEG的單個(gè)分子相連的IFN-α2a的分子量。Pegasys是與支鏈的40kDaPEG單個(gè)分子相連的示范性的IFN-α2a(Reddy等(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54571-586)。PEG修飾的IFN-α多肽的分子量小于Pegasys的分子量，約為5kDa到20kDa，6kDa到15kDa，8kDa到12kDa或7kDa到10kDa。在許多實(shí)施方案中，PEG修飾的IFN-α多肽的分子量小于Pegasys的分子量，約為8kDa到12kDa。
PEG修飾的IFN-α的分子量是否小于Pegasys的分子量可用測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)準(zhǔn)方法方便地確定。這樣的方法包括，但不限于高效液相色譜(HPLC)，反相HPLC，體積排阻色譜，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，HPLC體積排阻色譜(SEC)，HPLC/SEC/激光掃描和基質(zhì)輔助的激光吸收離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)。要確定PEG修飾的IFN-α的分子量是否低于Pegasys的分子量，優(yōu)選使二者在同樣的條件下經(jīng)體積排阻HPLC。
本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α多肽的分子量小于約60kDa，一般約為40kDa到55kDa或45kDa到50kDa。在一些實(shí)施方案中，PEG修飾的IFN-α多肽的分子量約為50kDa，例如約從48kDa到52kDa。
制備PEG-IFN-α結(jié)合物如上所述，PEG部分可直接或通過一接頭連接到N-末端或接近N-末端的氨基酸殘基，或在內(nèi)部(例如，在表面暴露的賴氨酸殘基)。接合可在溶液或固相中進(jìn)行。
將PEG部分連接IFN-α多肽的N-末端或接近N-末端的氨基酸殘基的方法是本領(lǐng)域已知的。見美國(guó)專利號(hào)5,985,265。
在一些實(shí)施方案中，使用了選擇性獲得N-末端化學(xué)修飾的IFN-α的已知方法。例如，通過還原性烷基化進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾的方法是可用的，該方法利用不同類型的伯胺基團(tuán)(賴氨酸對(duì)N-末端)的差別反應(yīng)性在特定的蛋白質(zhì)中衍生。在合適的反應(yīng)條件下，用含有聚合物的羰基基團(tuán)在N-末端達(dá)到基本上選擇性衍生的蛋白質(zhì)。反應(yīng)在利用賴氨酸的ε-氨基和蛋白質(zhì)的N-末端的α-氨基之間的pKa差別的pH條件下進(jìn)行。通過這種選擇性衍生作用可以控制PEG部分與IFN-α的連接聚合物的接合主要發(fā)生在IFN-α的N-末端且其它反應(yīng)基團(tuán)(例如，賴氨酸側(cè)鏈氨基基團(tuán))不發(fā)生顯著的修飾作用。
如果需要，可用任何已知的方法將PEG化的IFN-α和未PEG化的IFN-α分開，這些方法包括，但不限于離子交換色譜，體積排阻色譜和其聯(lián)合使用。例如，當(dāng)PEG-IFN-α結(jié)合物是單PEG化的IFN-α，產(chǎn)物首先用離子交換色譜分離得到具有電荷特征的單PEG化物質(zhì)的物質(zhì)(其它具有相同表觀電荷的多PEG化物質(zhì)也可能存在)，然后使用體積排阻色譜分離單PEG化物質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，修飾的IFN-α通過將IFN-α多肽與α-甲氧基、ω-丙?；垡叶?mPEgspa)的琥珀酰亞胺酯反應(yīng)來制備。一般而言，用IFN-α和mPEGspa的摩爾比約為1∶1到1∶5進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)通常在pH約為7到9的溶液中進(jìn)行。
在特定的實(shí)施方案中，CIFN與分子量約為30kDa的線形mPEGspa反應(yīng)，其中用CIFN∶mPEGspa的摩爾比約為1∶1到1∶5進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)的pH約為7到9。在一特定的實(shí)施方案中，CIFN∶mPEGspa的摩爾比約為1∶2并且反應(yīng)的pH約為8。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的修飾的CIFN是通過將CIFN與分子量約為30kDa的線形α-甲氧基、ω-丙?；垡叶?mPEgspa)的琥珀酰亞胺酯反應(yīng)的方法生產(chǎn)的，其中用CIFN∶mPEGspa的摩爾比約為1∶1到1∶5進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)的pH約為7到9。在一特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的修飾的CIFN是通過將CIFN與線形、分子量約為30kDa的α-甲氧基、ω-丙?；垡叶?mPEgspa)的琥珀酰亞胺酯反應(yīng)的方法生產(chǎn)的，其中用CIFN∶mPEGspa比率約為1∶3進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)的pH約為8。
PEG修飾的IFN-α的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α多肽具有至少約8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、15小時(shí)、17小時(shí)、20小時(shí)或25小時(shí)或更長(zhǎng)的血清半衰期(例如平均血清滯留時(shí)間)。
PEG修飾的IFN-α的血清清除率與未修飾的IFN-α的血清清除率相比降低了，例如，PEG修飾的IFN-α的血清清除率比具有相同的氨基酸序列的未修飾的IFN-α的血清清除率至少低約20％、50％、75％或90％。
本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α在曲線的面積(AUV；以hr×mg/ml表示)示于圖5、6或7。
在許多實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α多肽具有和與分子量為40kDa的支鏈PEG分子相連的干擾素-α2a基本上相似的藥代動(dòng)力學(xué)分布。因此，例如，在48周期間將本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α以180μg劑量每周給藥一次產(chǎn)生與在48周期間將Pegasys以180μg劑量每周給藥一次相同的藥代動(dòng)力學(xué)分布。
PEG修飾的IFN-α的抗病毒和抗增殖性質(zhì)在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α多肽(或含有PEG化的IFN-α多肽的IFN多肽的主題群體)表現(xiàn)出比PEGASYSPeg-干擾素-α2a大至少5倍的抗病毒活性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的單PEG化的IFN-α分子或群體表現(xiàn)出比PEGASYSPeg-干擾素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗病毒活性。在一些實(shí)施方案中，單PEG化的CIFN分子或群體表現(xiàn)出比PEGASYSPeg-干擾素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗病毒活性。比較抗病毒活性的基礎(chǔ)可是任何已知的測(cè)定，包括，但不限于實(shí)施例1所描述的MDBK/VSV測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α多肽(或含有PEG化的IFN-α多肽的IFN多肽的主題群體)保留至少5％、7％、10％、12％、15％、20％或更多的親本(非PEG化的)IFN-α多肽的抗病毒活性。在一些實(shí)施方案中，PEG-Alfacon1分子保留至少5％、7％、10％、12％、15％、20％或更多的INFERGENAlfa-1的抗病毒活性。比較抗病毒活性的基礎(chǔ)可以是任何已知的測(cè)定，包括，但不限于實(shí)施例1所描述的MDBK/VSV測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α多肽(或含有PEG化的IFN-α多肽的IFN多肽的主題群體)表現(xiàn)出比PEGASYSPeg-干擾素-α2a大至少5倍的抗增殖活性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的單PEG化的IFN-α分子或群體表現(xiàn)出比PEGASYSPeg-干擾素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗增殖活性。在一些實(shí)施方案中，單PEG化的CIFN分子或群體對(duì)象表現(xiàn)出比PEGASYSPeg-干擾素-α2a大至少5倍、10倍、15倍或20倍的抗增殖活性。比較抗增殖活性的基礎(chǔ)可是任何已知的測(cè)定，包括，但不限于實(shí)施例1所描述的Daudi細(xì)胞測(cè)定。
制劑上述組合物可用熟知的試劑和方法配制。組合物可以具有藥學(xué)上可接受的賦形劑的制劑提供。種類繁多的藥學(xué)上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域已知的且無需在此詳細(xì)討論。各種出版物詳細(xì)描述了藥學(xué)上可接受的賦形劑，包括，例如A.Gennaro(2000)《雷明頓藥劑學(xué)的科學(xué)與實(shí)踐》(RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy)，第二十版，Lipplncott，Williams和Wilkins；《藥物劑型和給藥體系》(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)(1999)H.C.Ansel等編.，第七版.，Lippincott，Williams&Wilkins；和《藥用輔料手冊(cè)》(Handbook ofPharmaceutical Excipients)(2000)A.H.Kibbe等編.，第三版.Amer.Pharmaceutical Assoc。
藥學(xué)上可接受的賦形劑(例如載體、佐劑、運(yùn)載體或稀釋劑)是方便地公開可用的。此外，藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)整劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑等是方便地公開可用的。
在一些實(shí)施方案中，PEG化的IFN-α配制在水性緩沖液中。合適的水性緩沖液包括，但不限于乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖液，其強(qiáng)度從5mM到10mM不等。在一些實(shí)施方案中，水性緩沖液包括用作等滲溶液的試劑。這種試劑包括，但不限于氯化鈉和糖，例如甘露醇、右旋糖、蔗糖等。在一些實(shí)施方案中，水性緩沖液可進(jìn)一步包括非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯20或80。制劑可任選進(jìn)一步包括防腐劑。合適的防腐劑包括，但不限于苯甲醇、苯酚、氯丁醇、苯扎氯胺等。在許多情況下，制劑保存于2-8℃。制劑也可凍干，在這種情況下制劑一般包括防凍劑，例如蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等。凍干的制劑即使在環(huán)境溫度中也可保存更長(zhǎng)的時(shí)期。
在主題方法中，活性藥物可以任何可導(dǎo)致所期望的治療效果的方便方式向宿主給藥。因此，藥劑可摻入各種用于治療性給藥的制劑中。更特別的是，本發(fā)明的藥劑可與合適的、藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或稀釋劑聯(lián)合配制入藥學(xué)組合物，并可制成固體、半固體、液體或氣體形式，例如片劑、膠囊、粉劑、顆粒、軟膏劑、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑和氣溶膠。
給藥可以各種方式實(shí)現(xiàn)，包括口服、含服、直腸、腸胃外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮、氣管內(nèi)等。
在藥物劑型中，藥劑可以其藥學(xué)上可接受的鹽形式給藥，或者也可單獨(dú)使用或與其它的藥學(xué)活性化合物關(guān)聯(lián)使用和聯(lián)合使用。以下的方法和賦形劑僅是例子而非限制。
對(duì)口服制劑而言，藥物可以單獨(dú)使用或與合適的添加劑聯(lián)合使用來制成片劑、粉劑、顆?；蚰z囊，例如，常規(guī)的添加劑(例如蔗糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉)；粘合劑(例如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠)；崩解劑(例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉)；潤(rùn)滑劑(例如滑石粉或硬脂酸鎂)；如果需要可以與稀釋劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、防腐劑和矯味劑聯(lián)合使用。
將藥劑溶解、懸浮或乳化于水性或非水性溶劑中配制成用于注射的制劑，這些溶劑為，例如植物油或其它類似的油、合成的脂肪族酸甘油酯、高級(jí)脂肪酸或丙二醇的酯；如果需要可與常規(guī)的添加劑，例如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑聯(lián)合使用。
此外，將藥物與各種基質(zhì)(base)，例如乳化基質(zhì)或水溶性基質(zhì)混合制成栓劑。本發(fā)明的化合物經(jīng)栓劑進(jìn)行直腸給藥。栓劑可以包括載體，例如可可奶油、carbowax(聚乙二醇制劑的商品名)和聚乙二醇，這些載體在體溫下溶解，而在室溫下是固化的。
也可提供用于口服或直腸給藥的單位劑型，例如糖漿、酏劑和混懸劑，其中每個(gè)劑量單位(例如茶匙、湯匙、片劑或栓劑)含有預(yù)定量的組合物，而組合物中含有一種或多種抑制劑。類似地用于注射或靜脈內(nèi)給藥的單位劑型可含有組合物中的抑制劑作為無菌水、常規(guī)的鹽水或其它藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體中的溶液。
用在文中的術(shù)語“單位劑型”指適用于人和動(dòng)物受試者的單一劑量的物理上離散單位，每個(gè)單位含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物，其量經(jīng)計(jì)算可充分地與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、運(yùn)載體或載體結(jié)合產(chǎn)生所期望的效果。本發(fā)明新穎的單位劑型的規(guī)格取決于所采用的特定的化合物、欲達(dá)到的效果和宿主中每個(gè)化合物相關(guān)的藥效學(xué)。
主題PEG修飾的IFN-α的有效劑量約為每劑量50μg到300μg、或90μg到180μg。主題PEG修飾的IFN-α的有效劑量約為每劑量0.5μg/公斤體重到3.5μg/公斤體重。
治療肝炎病毒感染的方法本發(fā)明提供治療肝炎病毒感染的方法。方法一般包括向個(gè)體施加有效劑量的本發(fā)明PEG修飾的IFN-α多肽。
在一些實(shí)施方案中，主題PEG修飾的IFN-α的“有效量”是指一段時(shí)期內(nèi)有效地達(dá)到在個(gè)體的血清中病毒滴定度降低1.5-log、2-log、2.5-log、3-log、3.5-log、4-log、4.5-log或5-log，該時(shí)期指在開始劑量方案之后的約12到48小時(shí)、約48小時(shí)到3天、約3到7天、約7天到2周、約2到4周、約4到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
慢性丙型肝炎患者一般具有105-107基因組拷貝/ml水平的循環(huán)病毒。主題PEG修飾的IFN-α的有效量是有效地將HCV滴定度降至約5×104到105、約104到5×104或約5×103到104基因組拷貝/ml血清的量。
在一些實(shí)施方案中，主題PEG修飾的IFN-α的有效量是在開始劑量方案之后的12到48小時(shí)或16到24小時(shí)的時(shí)期內(nèi)可有效地將HCV滴定度降至約5×104到105、約104到5×104或5×103到104基因組拷貝/ml血清的量。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α的有效量是將病毒的滴定度降至檢測(cè)不到的水平的量，例如降至約1000到5000、約500到1000或約100到500基因組拷貝/ml血清。在一些實(shí)施方案中，主題PEG修飾的IFN-α多肽的有效量是將病毒的滴定度降至低于100基因組拷貝/ml血清的量。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α的有效量是達(dá)到維持病毒應(yīng)答的量，例如在停止治療之后的至少約1、2、3、4、5個(gè)月或更優(yōu)選至少6個(gè)月時(shí)間在患者的血清內(nèi)無可檢測(cè)到的HCV RNA(例如，低于約500、400、200或100基因組拷貝/ml血清)。
本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α提供了PEG修飾的IFN-α在血清中的血清濃度。本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α的血清濃度維持約24到48小時(shí)、約2到4天、約4到7天、約1到2周、約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
在一些實(shí)施方案中，主題PEG修飾的IFN-α提供PEG修飾的IFN-α的血清濃度為或接近患者可耐受的最大水平。所達(dá)到的血清濃度約為10到1000、約10到500、約20到250、約30到100或約50到75國(guó)際單位(IU)/ml。血清濃度維持約24到48小時(shí)、約2到4天、約4到7天、約1到2周、約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α以有效達(dá)到并維持主題PEG修飾的IFN-α的血清濃度的劑量給藥，該濃度為最大耐受劑量(MTD)的約65％到70％、約70％到75％、約75％到80％、約80％到85％、約85％到90％、約90％到95％或約95％到100％。因此，從劑量方案開始的約6到12小時(shí)、約12到24小時(shí)或24到48小時(shí)內(nèi)，達(dá)到的主題PEG修飾的IFN-α的血清濃度為最大耐受劑量(MTD)的約65％到70％、約70％到75％、約75％到80％、約80％到85％、約85％到90％、約90％到95％或約95％到100％。所達(dá)到的血清濃度可維持約7天到2周、約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
PEG修飾的IFN-α的給藥劑量范圍為約50μg到300μg，例如約50μg到70μg、約70μg到90μg、約90μg到100μg、約100μg到120μg、約120μg到150μg、約150μg到170μg、約170μg到200μg、約200μg到230μg、約230μg到270μg或約270μg到300μg。
如上所述，PEG修飾的IFN-α的給藥量以微克表示。此外，劑量也可以單位或國(guó)際單位(IU)活性來表示。體外測(cè)定單位或IU作為干擾素抑制合適的病毒(例如，心內(nèi)膜心肌炎病毒(EMC)、皰疹性口炎病毒和Semliki森林病毒)在感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞系(例如，人類肺癌細(xì)胞系，A549；HEP/C等)后的細(xì)胞病變效應(yīng)的能力?？共《净钚砸匀鏦HO提供的人干擾素α為參考標(biāo)準(zhǔn)來測(cè)定。這些方法在許多參考文獻(xiàn)中詳述，包括下列的Familletti，P.C.，Rubinstein，S和Pestka，S.(1981)“一種方便和快速地用于干擾素的細(xì)胞病變效應(yīng)測(cè)定方法”(A convenient and rapid cytopathic effectinhibition assay for interferon)，Methods in Enzymol，第78卷(S.Pestka編)，Academic Press，New York，第387-394頁。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療肝炎病毒感染的方法，該方法包括施用有效量的主題PEG修飾的IFN-α來降低病毒負(fù)荷。
本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α可以每日給藥、一周兩次、一周一次、每?jī)芍芤淮位蛎恐苋谓o藥進(jìn)行約24小時(shí)到48小時(shí)、約2到4天、約4到7天、約1到2周、約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α可以每周一次給藥頻率進(jìn)行約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的PEG修飾的IFN-α可以每周約45μg到270μg或約180μg或約120μg的劑量皮下給藥約2到4周、約4到6周、約6到8周、約8到12周、約12到16周、約16到24周或約24到48周。每周的劑量可以用快速灌注劑注射給藥或用泵控制的連續(xù)輸注系統(tǒng)給藥。
在一些實(shí)施方案中，主題PEG修飾的IFN-α以聯(lián)合治療的方式給藥，例如，施用另一種抗病毒藥劑或其它的治療劑(1)基本上是同時(shí)和以不同的制劑給藥；(2)基本上是同時(shí)和以同一制劑給藥；(3)以不同的制劑在不同的時(shí)間給藥。以下將詳細(xì)討論聯(lián)合治療。
聯(lián)合治療在一些實(shí)施方案中，提供聯(lián)合治療的方法包括施用本發(fā)明的組合物和一種額外的治療劑(例如IFN-γ和/或利巴韋林)。
在一些實(shí)施方案中，額外的治療劑可以在PEG修飾的IFN-α治療的全程給藥，治療開始和結(jié)束階段相符。在其它的實(shí)施方案中，額外的治療劑可以在與PEG修飾的IFN-α治療相重疊的時(shí)間給藥，例如用額外的治療劑治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之前開始并在PEG修飾的IFN-α治療結(jié)束之前結(jié)束；用額外的治療劑治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之后開始并在PEG修飾的IFN-α治療結(jié)束之后結(jié)束；用額外的治療劑的治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之后開始并在PEG修飾的IFN-α治療結(jié)束之前結(jié)束或用額外的治療劑治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之前開始并在PEG修飾的IFN-α治療結(jié)束之后結(jié)束。
在其它的實(shí)施方案中，額外的治療劑治療在PEG修飾的IFN-α治療開始之前施用并在PEG修飾的IFN-α治療開始之時(shí)結(jié)束，例如，額外的治療劑用在“引發(fā)”劑量方案中。
利巴韋林和其它的抗病毒藥物利巴韋林，l-β-D-核糖呋喃基-lH-1，2，4-三唑-3-氨甲酰(獲得自ICNPharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，Calif.)描述于Merck索引，化合物號(hào)8199，第十一版。其生產(chǎn)和制劑描述于美國(guó)專利號(hào)4,211,771。本發(fā)明也考慮了使用利巴韋林的衍生物(見，例如美國(guó)專利號(hào)6,277,830)。利巴韋林口服的劑量約為每天400、約800或約1200mg。
其它的抗病毒劑可以在本發(fā)明治療方法中給藥。例如，抑制肌苷單磷酸脫氫酶(IMPDH)的化合物可能具有潛在的直接施加抗病毒的活性，這種化合物可與文中所述的IFN-α組合物聯(lián)合給藥。有效抑制丙型肝炎N53蛋白酶的藥物可與文中所述的IFN-α組合物聯(lián)合給藥。丙型肝炎NS3蛋白酶抑制劑可抑制病毒的復(fù)制。其它藥物，例如HCV NS3解螺旋酶的抑制劑也是用于聯(lián)合治療的有吸引力的藥物，并且也考慮了用在文中所述的聯(lián)合治療。核酶(例如HeptazymeTM)和硫代磷酸寡核苷酸是與HCV蛋白質(zhì)序列互補(bǔ)的并且抑制病毒核心蛋白的表達(dá)，二者也適合用于文中所述的聯(lián)合治療。此外，利巴韋林的合適的類似物，包括對(duì)映異構(gòu)體和免疫增強(qiáng)劑例如Zadaxin也適用于文中所述的聯(lián)合治療。
確定療效主題方法是否有效治療肝炎病毒感染，特別是HCV感染可通過測(cè)量病毒負(fù)荷或測(cè)量與HCV感染相關(guān)的參數(shù)來確定，該參數(shù)包括，但不限于肝纖維變性。
病毒負(fù)荷可通過測(cè)量血清中病毒的滴定度或水平來測(cè)定。這些方法包括，但不限于定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和分支DNA(bDNA)測(cè)試。例如，已開發(fā)了用于測(cè)定HCVRNA的病毒負(fù)荷(滴定度)的定量測(cè)定。許多這樣的測(cè)定是可市售的，包括定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)(Amplicor HCV MonitorTM，Roche Molecular Systems，New Jersey)；和分支DNA(脫氧核糖核酸)信號(hào)擴(kuò)增測(cè)定(QuantiplexTMHCV RNA測(cè)定(bDNA)，ChironCorp.，Emeryville，California)。見，例如Gretch等(1995)Ann.Intern.Med.123321-329。
如上所注明的，主題方法是否有效治療肝炎病毒感染，例如HCV感染中可通過測(cè)量與肝炎病毒感染相關(guān)的參數(shù)來確定，例如肝纖維變性。肝纖維變性的降低通過分析肝活檢樣品來測(cè)定。肝活檢的分析包括對(duì)兩種主要成分的評(píng)價(jià)以“級(jí)”評(píng)價(jià)的炎癥壞死(necroinflammation)作為測(cè)定嚴(yán)重性和正在進(jìn)行的疾病活性，和以“階段”評(píng)價(jià)的纖維病變的損傷和實(shí)質(zhì)或血管重塑作為長(zhǎng)期疾病進(jìn)展的反映。見，例如Brunt(2000)Hepatol.31241-246；和METAVIR(1994)Hepatology.2015-20。以肝活檢分析為基礎(chǔ)給予評(píng)分。許多標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)分系統(tǒng)提供定量評(píng)價(jià)纖維變性的程度和嚴(yán)重性。這些包括METAVIR，Knodell，Scheuer，Ludwig和Ishak評(píng)分系統(tǒng)。
肝纖維變性的血清標(biāo)記也可作為主題治療方法的效果的指示來測(cè)定。肝纖維變性的血清標(biāo)記包括，但不限于透明質(zhì)酸鹽，N-末端前膠原III肽，IV型膠原的7S結(jié)構(gòu)域，C-末端前膠原I肽和層粘連蛋白。其它肝纖維變性的生化標(biāo)記包括α-2-巨球蛋白，觸珠蛋白，γ球蛋白，載脂蛋白A和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。
作為非限制性例子，用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法測(cè)量血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平?？傮w上，ALT水平低于每ml血清約45國(guó)際單位認(rèn)為是正常的。在一些實(shí)施方案中，IFNα的有效量是將ALT水平降至低于約45IU/ml血清的有效量。
適合治療的受試者臨床診斷為感染肝炎病毒(例如HAV、HBV、HCV、δ等)，特別是HCV的個(gè)體適合用本發(fā)明的方法治療。感染HCV的個(gè)體在其血液中鑒定出HCV RNA和/或在其血清中鑒定出抗HCV抗體。這樣的個(gè)體包括未經(jīng)治療的個(gè)體(例如，以前未治療過HCV的個(gè)體，特別是未接受過基于IFN-α或利巴韋林治療的個(gè)體)和之前治療HCV失敗的個(gè)體(“治療失敗”患者)。治療失敗患者包括無應(yīng)答者(例如，以前治療HCV未明顯或充分降低HCV滴定度的個(gè)體，特別是以前用IFN-α的單一形式進(jìn)行的IFN-α單藥治療)；和復(fù)發(fā)者(例如，以前治療過HCV的個(gè)體(特別是以前用IFN-α的單一形式進(jìn)行的IFN-α單藥治療)，其HCV滴定度顯著降低了，接著又增加了)。
在感興趣的特定實(shí)施方案中，個(gè)體的HCV滴定度至少約為105、5×105或106HCV基因組拷貝/ml血清?；颊呖筛腥救魏蜨CV基因型(基因型1、包括1a和1b、2、3、4、6、7、8、9等和亞型(例如，2a、2b、3a等))，特別是難于治療的基因型，例如HCV基因型1和特定的HCV亞型和準(zhǔn)種(quasispecies)。
HCV-陽性的個(gè)體(如上所述)也是感興趣的，這些個(gè)體是由于慢性HCV感染而表現(xiàn)出嚴(yán)重的纖維變性或早期肝硬化(非失代償性的A型Child’s-Pugh或輕一些)，或更晚期的肝硬化(失代償性的B或C類Child’s-Pugh)和盡管之前進(jìn)行過基于IFN-α療法的抗病毒治療但還是病毒血癥的，或不能耐受基于IFN-α的療法或?qū)@樣的療法有禁忌癥的個(gè)體。在感興趣的特定實(shí)施方案中，依照METAVIR評(píng)分系統(tǒng)具有3或4期肝纖維變性的HCV-陽性個(gè)體是適用本發(fā)明的方法治療的。在其它實(shí)施方案中，適用本發(fā)明方法治療的個(gè)體是臨床表現(xiàn)出失代償性肝硬化的患者，包括很晚期的肝硬化患者(包括那些等待肝移植的)。在其它的實(shí)施方案中，適用本發(fā)明方法治療的患者包括中度纖維變性的患者，其中包括那些早期纖維變性(在METAVIR，Ludwig和Scheuer評(píng)分系統(tǒng)中評(píng)為1和2期的；或在Ishak評(píng)分系統(tǒng)中評(píng)為1、2或3期的)的患者。
在某些實(shí)施方案中，用于治療HCV患者的特定的藥物治療方案按照患者所表現(xiàn)出來的某些疾病參數(shù)來選擇，例如初始病毒負(fù)荷，患者感染的HCV的基因型，患者的抗病毒治療史，肝臟組織學(xué)和/或患者肝纖維變性的期。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)通過Knodell評(píng)分3或4測(cè)定來鑒定具有晚期或嚴(yán)重期肝纖維變性的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)通過Knodell評(píng)分3或4測(cè)定來鑒定具有晚期或嚴(yán)重期肝纖維變性的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約40到50周，或約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型1感染并且初始病毒負(fù)荷大于2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型1感染并且初始病毒負(fù)荷大于2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約40到50周，或約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型1感染同時(shí)初始病毒負(fù)荷大于2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清并且通過Knodell評(píng)分0、1或2測(cè)定無肝纖維變性或早期肝纖維變性，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型1感染并且初始病毒負(fù)荷大于2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清并且通過Knodell評(píng)分0、1或2測(cè)定是無肝纖維變性或是早期階段，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約40到50周，或約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型1感染并且初始病毒負(fù)荷小于或等于2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到50周，或約24到48周，或約30到40周，或高至約20周，或高至約24周，或高至約30周，或高至約36周，或高至約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型1感染同時(shí)初始病毒負(fù)荷小于或等于2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到24周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型1感染同時(shí)初始病毒負(fù)荷小于或等于2百萬病毒基因組拷貝/ml患者血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到50周，或約24到48周，或約30到40周，或高至約20周，或高至約24周，或高至約30周，或高至約36周，或高至約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到24周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型2或3感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約至少24周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有HCV基因型4感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周，或約30周到1年，或約36到50周，或約40到48周，或至少約24周，或至少約30周，或至少約36周，或至少約40周，或至少約48周，或至少約60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有特征在于任何HCV基因型5、6、7、8和9的HCV感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約20到50周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定患者具有特征在于任何HCV基因型5、6、7、8和9的HCV感染，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥至少約24周和高至約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定未經(jīng)抗病毒治療的患者具有HCV基因型1感染，，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定未經(jīng)抗病毒治療的患者具有HCV基因型1感染，，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定未經(jīng)抗病毒治療的患者具有HCV基因型1感染，并且初始病毒負(fù)荷大于2百萬HCV RNA基因組/ml血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定未經(jīng)抗病毒治療的患者具有HCV基因型1感染，并且初始病毒負(fù)荷小于或等于2百萬HCV RNA基因組/ml血清，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定未經(jīng)抗病毒治療的患者具有HCV基因型2或3感染，，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約12到24周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定未經(jīng)抗病毒治療的患者具有HCV基因型4感染，，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定HCV感染并且抗病毒治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定HCV感染并且IFN-α治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定HCV感染并且用IFN-α2a或2b治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定HCV感染并且用PEGASYSpeg干擾素α-2a或PEG-INTRONpeg干擾素α-2b治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定HCV感染并且用共有干擾素治療早期階段失敗的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到60周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定基因型2或3HCV感染并且在對(duì)IFN-α治療早期階段應(yīng)答之后復(fù)發(fā)的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約24到48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定基因型1或4HCV感染并且在對(duì)IFN-α治療早期階段應(yīng)答之后復(fù)發(fā)的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48周。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療HCV感染的方法，包括步驟(1)鑒定HCV感染并且對(duì)IFN-α治療早期階段無應(yīng)答的患者，和(2)以治療有效量的主題PEG修飾的IFN-α向患者給藥約48到60周。
關(guān)于每個(gè)方法適合疾病參數(shù)和/或上述病人的其它特征，本發(fā)明也考慮了在所需的PEG修飾的IFN-α治療過程以有效量的利巴韋林向患者協(xié)同給藥。在一實(shí)施方案中，主題方法包括在所需的PEG修飾的IFN-α治療過程每天向患者給藥約800到1200mg利巴韋林，每天的劑量任選分為兩個(gè)劑量。在另一實(shí)施方案中，主題方法包括在所需的PEG修飾的IFN-α治療過程，如果患者體重小于75kg每天向患者給藥(a)1000mg利巴韋林，或如果患者體重大于或等于75kg則每天向患者給藥(b)1200mg利巴韋林，每天的劑量任選分為兩個(gè)劑量。
提供了具有單位劑量的主題PEG修飾的IFN-α(例如，口服或注射劑量)的試劑盒。除了含有單位劑量的容器，在這些試劑盒中有描述治療肝炎藥物的用途和附帶的益處的信息性包裝說明書。優(yōu)選的藥物和單位劑量如上所述。
在一些實(shí)施方案中，主題試劑盒包括含有溶液的容器和每周單位劑量給藥一次的說明書，該溶液含有單位劑量的主題PEG修飾的IFN-α和藥學(xué)上可接受的賦形劑。說明書可印在貼于容器的標(biāo)簽上或可以是容器附有的包裝說明書。
實(shí)施例提供以下的實(shí)施例是向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全披露和描述如何制造及使用本發(fā)明，而非限制發(fā)明人所認(rèn)為的其發(fā)明的范圍，也非表示以下的實(shí)驗(yàn)是所做的全部或僅有的實(shí)驗(yàn)。發(fā)明人保證所用數(shù)字(例如，量、溫度等)的精確性，但一些實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤和偏差應(yīng)該說明。除非另有說明，份是份(按重量計(jì)算)，分子量是平均分子量，溫度是攝氏溫度，壓力是大氣壓的或接近大氣壓。
實(shí)施例1PEG修飾的CIFN的制備及藥理學(xué)特性簡(jiǎn)述用超過2倍摩爾的線形30kDa MPEG(mSPA 30K PEG)的琥珀酰亞胺丙?；苌镉?0℃處理在含有100mM氯化鈉的20mM磷酸鈉緩沖液中的CIFN(其中約三分之一的蛋白質(zhì)作為N-封閉的變體，3mg/ml)1小時(shí)。原始混合物用SEC分析顯示單PEG化的產(chǎn)物在混合物中約占52％。主要組分在陽離子交換柱上純化得到97％或更高純度的單PEG化CIFN。該物質(zhì)(30K的MPEG-單PEG化CIFN)保留了親本CIFN顯著量的抗病毒活性。
按照美國(guó)專利號(hào)5,985,265中實(shí)施例3所描述的方法對(duì)CIFN進(jìn)行N-末端修飾得到N-末端單PEG化CIFN(30K的MPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN)，但其中是用30kD(線形)甲氧基聚乙二醇醛代替12kD(直鏈)甲氧基聚乙二醇醛。該物質(zhì)(30K的MPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN)保留了親本CIFN顯著量的抗病毒活性。與下述的?；磻?yīng)不同，N-末端的衍生需要超過8倍摩爾的甲氧基PEG-丙醛和氰基硼氫化鈉作為還原劑來實(shí)施pH4.0時(shí)的烷基化反應(yīng)。
當(dāng)在使用大量表達(dá)IFN受體的Daudi細(xì)胞的體外抗增殖活性模型中測(cè)試時(shí)，30KMPEG-單PEG化CIFN和30KMPEG-α-氨基-單PEG化CIFN分子顯示基本保留了親本分子(CIFN)的活性并且表現(xiàn)出比Peg-干擾素α-2a(Pegasys)高20-30倍的活性。評(píng)價(jià)了30KMPEG-單PEG化的CIFN和30KMPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN化合物在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性。兩種單PEG化的CIFN化合物出人意料地表現(xiàn)出與PEG化的干擾素α-2a(Pegasys)相似的循環(huán)分布。
材料與方法CIFN和PEGCIFN由Amgen生產(chǎn)并純化，收到的終產(chǎn)品作為具有分析證書的濃度為0.2mg/ml的藥物。所得到的琥珀酰亞胺丙?；籽趸鵓EG(線形30kD)產(chǎn)自Shearwater公司，Huntsville，AL，既是研究級(jí)(research grade)的也是GMP產(chǎn)品。
用于小規(guī)模生產(chǎn)PEG化的CIFN之一的典型方案如下0.2mg/ml的主體蛋白(～750mg)用膜面積為0.038cm2進(jìn)行超濾。然后產(chǎn)物滲濾入pH調(diào)至8.00的含有100mM氯化鈉的25mM磷酸鈉緩沖液。濃縮的物質(zhì)調(diào)整到蛋白質(zhì)濃度為3mg/ml。CIFN溶液然后在2mMHCl中與超過2摩爾的mSPA 30K PEG試劑混合并于21℃孵育1小時(shí)。加入超過試劑量3摩爾的甘氨酸終止反應(yīng)。然后將反應(yīng)混合物用pH4.5、50mM乙酸鈉稀釋10倍，并以2.0mg總蛋白/ml樹脂的量上Fractogel柱。柱首先用平衡緩沖液(50mM乙酸鈉，pH4.5)洗滌，接著用含有100mM氯化鈉的50mM乙酸緩沖液和含有250mM氯化鈉的乙酸緩沖液洗滌。單PEG化的產(chǎn)物經(jīng)超濾/滲濾(UF/DF)，用制劑緩沖液(含有100mM氯化鈉的25mM磷酸鈉，pH7.0)平衡，然后濃縮調(diào)整至填充-完成(fill-finish)活性所需要的量。
PEG修飾的IFN-α的生產(chǎn)產(chǎn)生了各種PEG修飾的CIFN制劑。這些具有30kDaPEG單PEG化的CIFN制劑用以下的產(chǎn)品代碼表示，例如IM-002或有時(shí)加一前綴，例如IM-396-002。
制劑1(IM-002)濃度為3.02mg/ml的純化的共有α-干擾素[通過用足夠量的100mM磷酸鈉緩沖液稀釋溶液A(含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩沖液)中的蛋白達(dá)到最終pH為6.5來制備]于環(huán)境溫度、pH6.5條件下用SPA-線形30kD的mPEG以摩爾比5∶1處理5.5小時(shí)。SEC色譜分析顯示單PEG化的產(chǎn)物混合物占原始混合物的47％。該實(shí)驗(yàn)在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行。反應(yīng)條件、產(chǎn)物的抗病毒活性和早期小規(guī)模材料的樣品概括于表1和2。早期小規(guī)模產(chǎn)物所得的初步抗增殖活性概括于表3。
制劑2(IM-003)濃度為2.73mg/ml的CIFN[通過用足夠量的50mM磷酸鈉二元溶液稀釋溶液A(含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩沖液)中的蛋白達(dá)到pH為7.4來制備]于環(huán)境溫度和PEG試劑以摩爾比1∶3攪拌3.5小時(shí)，然后置于2-8℃約15小時(shí)。產(chǎn)物分析顯示單PEG化的產(chǎn)物約占46％(表1)并且保留14.5％的抗病毒活性(表2)。該實(shí)驗(yàn)在生理?xiàng)l件下進(jìn)行并且產(chǎn)物保留顯著量的親本IFN活性。制劑2保留了CIFN分子60％的抗增殖活性。
制劑3(IM-004)在含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩沖液中，濃度為3.0mg/ml的CIFN于環(huán)境溫度用超過5倍摩爾的PEG試劑處理1.8小時(shí)。此反應(yīng)也可在生理pH條件下進(jìn)行產(chǎn)生占原始混合物47.1％產(chǎn)量的單PEG化化合物的混合物(表1)并且該物質(zhì)的抗病毒活性(表2)和抗增殖活性(表3)顯示該化合物也是可與上述的其它化合物相比的。
制劑4(IM-005)濃度為2.57mg/ml的CIFN[通過用足夠量的15mMNaOH溶液稀釋含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩沖液中的蛋白達(dá)到pH為8.0來制備]]于2-8℃、pH8.0±0.2用超過3倍摩爾的PEG試劑處理約15小時(shí)。產(chǎn)物混合物的分析顯示單PEG化的化合物產(chǎn)量占47.0％并且產(chǎn)物保留了親本分子顯著量的抗病毒(CIFN的13.8％，見表2)和抗增殖活性(在早期實(shí)驗(yàn)中CIFN活性的150％，見表3)。該產(chǎn)物最優(yōu)化的反應(yīng)條件顯示通過使用摩爾比為1∶2的蛋白與試劑并且接合反應(yīng)在20度(“℃”)進(jìn)行1小時(shí)可得到相同的產(chǎn)物。產(chǎn)物的產(chǎn)量略有增加(47到52％)。
制劑5(IM-006；也稱為IM-396-006)濃度為2.55mg/ml的CIFN[通過用足夠量的20mMNaOH溶液稀釋含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩沖液中的蛋白達(dá)到pH為9.4來制備]]于2-8℃、pH9.4用超過3倍摩爾的PEG試劑處理3小時(shí)。單PEG化產(chǎn)物的產(chǎn)量為47.2％(表1)并且保留抗病毒(表2)和抗增殖活性(表3)與上述例子類似。
制劑6(IM-007)濃度為2.57mg/ml的CIFN[通過用足夠量的20mMNaOH溶液稀釋含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩沖液中的蛋白達(dá)到pH為8.8來制備]于2-8℃、pH8.8用超過3倍摩爾的PEG試劑處理6小時(shí)。該產(chǎn)物所得的結(jié)果見表1、2和3。
在以上引用的所有情況中，PEG試劑立刻加入蛋白質(zhì)溶液并在Roto Mix的平臺(tái)上維持混合速率為60-70rpm。
PEG-Alfacon1的按比例擴(kuò)大生產(chǎn)在接下來需要提供毒理學(xué)和臨床研究(用約1g干擾素藥物開始)的工作中，對(duì)上述使用條件進(jìn)行略微修改來生產(chǎn)PEG-Alfacon1藥物。因此，CIFN先用超濾/滲濾步驟達(dá)到約3mg/ml蛋白濃度濃縮入反應(yīng)緩沖液(25mM磷酸鈉，100mM氯化鈉，pH8.0)。接合反應(yīng)使用摩爾比為2∶1的PEG試劑與蛋白質(zhì)于pH8.0進(jìn)行并于環(huán)境溫度孵育1小時(shí)。加入過量的甘氨酸終止反應(yīng)，然后在填充-完成之前使用陽離子交換色譜純化、陰離子交換并配制。這些步驟后得到純度＞90％的單PEG化產(chǎn)物(區(qū)域異構(gòu)體的混合物)。大量不同的產(chǎn)物的純度為93-97％。
陽離子交換色譜反應(yīng)產(chǎn)物的分離通過將混合物上樣于預(yù)先用pH4.5的乙酸緩沖液平衡的Fractogel柱實(shí)現(xiàn)。通過用不同鹽濃度的緩沖液洗滌分離產(chǎn)物。單PEG化的異構(gòu)體作為一個(gè)組分分離，然后產(chǎn)物使用含有100mM氯化鈉、pH7.0的25mM磷酸鈉緩沖液進(jìn)行超濾/滲濾。最終緩沖液交換和稀釋在預(yù)先用制劑緩沖液平衡的Q Sepharose柱上通過陰離子交換進(jìn)行。
聯(lián)合十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，反相高效液相色譜(RP-HPLC)和體積排阻色譜(SEC)分析單PEG化的產(chǎn)物混合物。
SDS-PAGE4-12％Bis-Tris NuPaGE丙烯酰胺凝膠用于進(jìn)行電泳。牛血清白蛋白連同分子量標(biāo)記用作標(biāo)準(zhǔn)品。條帶通過膠態(tài)藍(lán)染色法目測(cè)。在上樣于凝膠之前還原蛋白質(zhì)。與CIFN標(biāo)準(zhǔn)品相比，產(chǎn)物如高分子量條帶展開，表現(xiàn)出PEG化。
RP-HPLC分析用Phenomenex Synergi 4μMAX-RP柱。產(chǎn)物用各不相同的TFA-乙腈組合洗脫。檢測(cè)在214nm處的DAD1紫外(uv)吸光度和波長(zhǎng)為280nm的DAD2來目測(cè)個(gè)體峰。主峰對(duì)應(yīng)于單PEG化的產(chǎn)物并用作產(chǎn)物的參考峰特征。該方法用來描述上述制劑1-6。當(dāng)鑒定最佳的PEG化的產(chǎn)物用于進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)時(shí)，要修改HPLC分析方法。測(cè)試物注射在Zorbax 300 SB-C3柱(4.6×150mm，Agilent Technologies，Palo Alto，CA)上。使用兩種溶液作為流動(dòng)相(A0.1％的TFA水溶液；B含有0.1％TFA的80％乙腈溶液)。產(chǎn)物用兩種流動(dòng)相組成的梯度洗脫26分鐘。使用流速1.0mL/分鐘并且以214nm處的uv吸光度檢測(cè)樣品。PEG-Alfacon1作為主峰洗脫，保留時(shí)間為11.2分鐘(見圖4)。
SEC-HPLC用體積排阻HPLC方法進(jìn)行PEG化干擾素的鑒定、純度和強(qiáng)度分析。在早期鑒定制劑1-6中串聯(lián)使用Shodex KW-803和Shodex KW-804柱。柱在5mM磷酸鈉緩沖液，于pH7.25，以1ml/分鐘的流速展開。以214nm處的吸收檢測(cè)峰。以分子量和流體半徑為基礎(chǔ)判斷異構(gòu)體的混合物的峰分配，其中該混合物對(duì)應(yīng)于單PEG化產(chǎn)物以單峰洗脫。在PEG-Alfacon1的按比例擴(kuò)大生產(chǎn)期間，要修改該方法。制劑緩沖液中的產(chǎn)物注射在連接HP型1100HPLC系統(tǒng)的Superose 12HR 10/30柱上。流速調(diào)節(jié)至0.5ml/分鐘，并在214和280nm處通過紫外吸光度檢測(cè)產(chǎn)物。在這些條件下，PEG化的CIFN于19.5分鐘洗脫。
PEG化的產(chǎn)物的分子量用基質(zhì)輔助的激光吸收離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)進(jìn)一步分析。
產(chǎn)物的生物學(xué)特征以抗病毒測(cè)定、抗增殖活性測(cè)定和在大鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
30K MPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN除了用30kD的線形PEG試劑(活性醛)替代實(shí)施例3中特定的12kD的線形PEG試劑外，基本上按照美國(guó)專利號(hào)5,985,265的實(shí)施例3中所描述的方法用30kD線形單甲氧基聚乙二醇醛還原性烷基化CIFN。如美國(guó)專利號(hào)5,985,265所述，從烷基化反應(yīng)混合物中回收30K MPEG-α-氨基-單PEG化的CIFN并純化。該制劑(IM-001)以下稱為N-末端PEG-CIFN。
抗病毒試驗(yàn)Madin-Darby牛腎(MDBK)細(xì)胞用皰疹性口炎病毒(VSV)感染并用CIFN或Peg-Alfacon或N-末端PEG-CIFN治療?；钚砸砸种撇《緩?fù)制為基礎(chǔ)并以個(gè)體蛋白的摩爾濃度標(biāo)準(zhǔn)化。抑制百分率用以下公式計(jì)算抑制百分率＝(Test-VC)/(CC-VC)，其中Test表示在測(cè)試物存在時(shí)觀察到的細(xì)胞染色，VC表示在病毒而非測(cè)試物存在時(shí)的細(xì)胞染色，CC表示在無病毒情況下的細(xì)胞染色。當(dāng)用MDBK細(xì)胞系測(cè)試抗病毒活性時(shí)，Peg-Alfacon或N-末端PEG-CIFN表現(xiàn)出劑量依賴的對(duì)VSV病毒的抗病毒活性。類似的抗病毒活性也在用心內(nèi)膜心肌炎(EMC)病毒感染的人肺癌(A549)細(xì)胞中測(cè)定到。
抗增殖測(cè)定用預(yù)定濃度的CIFN或Peg-Alfacon或N-末端PEG-CIFN處理人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞或Daudi細(xì)胞3天，并用摻入氚化的胸腺嘧啶的方法測(cè)定細(xì)胞增殖。抑制百分率用以下公式計(jì)算抑制百分率＝1-(測(cè)試cpm/總cpm)]×100，其中測(cè)試每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)表示測(cè)試化合物在指示濃度時(shí)測(cè)量的值，總cpm表示無測(cè)試化合物時(shí)測(cè)量的細(xì)胞增殖的值。當(dāng)用Daudi細(xì)胞系測(cè)試抗增殖活性時(shí)，Peg-Alfacon和N-末端PEG-CIFN表現(xiàn)出劑量依賴抗增殖活性并且結(jié)果也顯示了單PEG化的異構(gòu)體混合物保留了顯著量的親本CIFN活性。
大鼠藥代動(dòng)力學(xué)在3只雄性Sprague-Dawley大鼠中研究PEG化CIFN產(chǎn)物的體內(nèi)清除率。PEG化的干擾素經(jīng)皮下途徑向大鼠給藥(20-250μg/kg)。1周后測(cè)量血清濃度。利用藥代動(dòng)力學(xué)分析確定Cmax、AUC和排除時(shí)間t1/2。用所有的單PEG化的CIFN混合物看到半衰期有顯著的增加。因此，Peg-Alfacon和N-末端PEG-CIFN證明血漿暴露有顯著的增加。類似的研究也在獼猴中進(jìn)行，并在皮下注射Peg-Alfacon和N-末端PEG-CIFN10天后檢測(cè)了PK參數(shù)和2’-5’寡腺苷酸合成酶(OAS)的水平。OAS是α干擾素能效的代替標(biāo)記。
結(jié)果和討論P(yáng)EG-修飾的CIFN
表1.各種PEG化的CIFN分子的制備方法和產(chǎn)量的概略結(jié)

用含有250mM氯化鈉、pH4.5的50mM乙酸鈉緩沖液洗脫得到純度為97％或更高的作為混合物的PEG-Alfacon單PEG化產(chǎn)物。純度以SEC-HPLC和SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定。得到的數(shù)據(jù)示于圖2和3。反相HPLC分析(圖4)顯示純化的產(chǎn)物在保留時(shí)間12分鐘以單個(gè)主峰出現(xiàn)。PEG化CIFN的平均分子量用MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定。觀察到的52260的質(zhì)量與通過凝膠滲透色譜(GPC)連接一個(gè)分子的CIFN測(cè)量到的一個(gè)單位的名義30kdPEG(平均分子量為32700Da)一致。
抗病毒活性表2.PEG化的α干擾素的抗病毒活性

在使用MDBK/VSV系統(tǒng)進(jìn)行的細(xì)胞病變效應(yīng)抑制測(cè)定中，PEG化的CIFN產(chǎn)物(制劑號(hào)IM-002，IM-003，IM-004，IM-005，IM-006和IM-007中的任何一個(gè))和N-末端PEG-CIFN產(chǎn)物(制劑號(hào)IM-001)表現(xiàn)出約10％的親本分子(CIFN)的抗病毒活性。在這些產(chǎn)物中，IM-005選為先導(dǎo)選擇物(lead candidate)用于進(jìn)一步開發(fā)并命名為PEG-Alfacon?？共《净钚缘臏y(cè)量依賴于實(shí)際使用的細(xì)胞系和感染病毒的聯(lián)合。在使用A549/EMC病毒系統(tǒng)進(jìn)行的細(xì)胞病變效應(yīng)抑制測(cè)定中，PEG-Alfacon產(chǎn)物和N-末端PEG-CIFN產(chǎn)品表現(xiàn)出保留了略微小于10％的CIFN抗病毒活性。
當(dāng)在MDBK/VSV系統(tǒng)中測(cè)定時(shí)，Roferon干擾素-alfa2a表現(xiàn)出比Infergen-alfacon-1低5-10倍的抗病毒活性[Ozes ON等.J Interferon Res1255-59(1992)]。從上表2的數(shù)據(jù)推斷，明顯的是，當(dāng)在MDBK/VSV系統(tǒng)中測(cè)定時(shí)，Pegasyspeg-干擾素-alfa2a保留了約1.5-3.0％的Roferon干擾素-alfa2a(與Infergen或干擾素Alfacon-1的0.3％抗病毒活性比較)的抗病毒活性。因此，PEG化的共有干擾素分子保留親本干擾素分子(Infergen-alfacon-1)的抗病毒活性的百分率大于Pegasyspeg-干擾素-alfa2a保留親本干擾素分子(Roferon干擾素-alfa2a)的抗病毒活性的百分率約10倍。PEG-Alfacon的參考標(biāo)準(zhǔn)品(PEG化的CIFN或Infergen)與其它商業(yè)化產(chǎn)品例如PEG-Intron或PEGASYS(見下表4和5)在幾個(gè)細(xì)胞系中使用不同的感染病毒也進(jìn)行了類似的比較。得到的結(jié)果支持了上述PEG化的CIFN產(chǎn)物的早期抗病毒數(shù)據(jù)。以這些CPE測(cè)定系統(tǒng)為基礎(chǔ)，PEG-Alfacon與PEGASYS相比似乎具有優(yōu)異的抗病毒效力，并具有可與PEG-Intron相比的效力。因此可預(yù)期它用于治療慢性并型肝炎中有充足的抗病毒活性。
抗增殖活性表3.PEG化的α干擾素的抗增殖活性

另一個(gè)測(cè)量干擾素生物學(xué)活性指標(biāo)的抗增殖活性受PEG化的影響較小。PEG-alfacon產(chǎn)物表現(xiàn)出約40-150％親本分子(CIFN)的抗增殖活性。N-末端PEG-CIFN產(chǎn)物表現(xiàn)出約45％親本分子(CIFN)的抗增殖活性。然而在基于Daudi細(xì)胞的抗增殖測(cè)定中，PEG化的共有干擾素分子比PEGASYSPEG-干擾素-alfa2a高5-15倍的抗增殖活性。
藥代動(dòng)力學(xué)對(duì)各種合成的類似物的比較作為本發(fā)明的一部分在大鼠PK模型中評(píng)價(jià)并證明顯著較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間(圖5)。在圖5中，IM-001表示N-末端PEG-CIFN，IM-003、IM-005和IM-006分別表示PEG化的CIFN制劑2、4和5。圖6顯示命名為IM-006的這些類似物之一的血清濃度-時(shí)間分布的半對(duì)數(shù)圖。PEG化的共有干擾素分子表現(xiàn)出與PEG化的干擾素α-2a(Pegasys)很相似的藥代動(dòng)力學(xué)分布。因此，Cmax在24小時(shí)后達(dá)到，Cmax為633ng/ml。排除半衰期約為27小時(shí)，而CIFN的清除率t1/2值約為6小時(shí)。有趣地發(fā)現(xiàn)所有PEG化CIFN分子(即N-末端修飾的(IM-001)或內(nèi)部賴氨酸衍生的類似物(IM-003、IM-005和IM-006))均表現(xiàn)出很相似的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)分布。在獼猴中進(jìn)行的相似研究顯示PEG化的CIFN分子(IM-005)在血液中持續(xù)高達(dá)1周(圖7)并且在所有時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)血清均誘發(fā)2’-5’OAS活性。可觀察到血液中的藥效標(biāo)記上升了至少5天。在獼猴中Peg-Alfacon1末端排除的半衰期計(jì)算為約30小時(shí)。因此，由線形30kd的PEG試劑產(chǎn)生所得的PEG化的CIFN出人意料地得到體內(nèi)每周給藥一次所期望的PK特征。
實(shí)施例2PEG修飾的CIFN和其它PEG化的α-干擾素的抗病毒活性鑒定為全面表征本發(fā)明PEG化的CIFN在其它人細(xì)胞系中的抗病毒活性并與其它相似的產(chǎn)品作比較，在A549、HeLa和ME180細(xì)胞中使用相同的感染病毒(例如VSV和EMCV)進(jìn)行了篩選這種分子的實(shí)驗(yàn)。
材料和方法HeLa或ME180細(xì)胞生長(zhǎng)在DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了10％熱滅活的血清(小?；蛱阂曅枰?(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，UT)，L-谷氨酰胺(2mM)，鏈霉素(100μg/ml)和青霉素(100μ/ml)。細(xì)胞于37℃生長(zhǎng)在5％CO2加濕的孵育箱內(nèi)。在加入病毒之前用IFN處理HeLa或ME180細(xì)胞(在96-孔微滴定板中，2×104細(xì)胞/孔)24小時(shí)。皰疹性口炎病毒(VSV)或心內(nèi)膜心肌炎病毒(EMCV)以MOI為0.1加入，板再孵育48小時(shí)。在此時(shí)，用含0.5％結(jié)晶紫的20％(體積/體積)甲醇溶液對(duì)細(xì)胞單層染色。所有的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)抑制測(cè)定進(jìn)行雙份。抑制50％細(xì)胞病變效應(yīng)的IFN的量定義為IFN的一個(gè)單位。所有IFN的活性對(duì)照NIH標(biāo)準(zhǔn)人IFN-α(Namalwa/Sendai)(Ga23-901-532)測(cè)量。
A549/EMCV CPE測(cè)定按照文獻(xiàn)描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
結(jié)果在最初的篩選中，CIFN或Intergen與PEG-Alfacon1(也是稱為PEG-CIFN或PEG化的干擾素)在細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)抑制測(cè)定中用VSV在不同的細(xì)胞系中進(jìn)行比較。該項(xiàng)研究所得的結(jié)果示于表4。通過測(cè)試干擾素的活性與NIH標(biāo)準(zhǔn)品(GA23-902-530)進(jìn)行比較計(jì)算比活性。
表4IFN-Alfacon-1和PEG-Alfacon-1的抗病毒活性的比較

比較細(xì)胞系ME180和HeLa的比活性顯示Intergen或干擾素Alfacon-1對(duì)表4所有結(jié)果均有顯著較高的抗病毒活性(P＜0.01)。相反，當(dāng)使用A549細(xì)胞時(shí)，干擾素Alfacon-1和PEG-Alfacon-1的比活性很相似。
在不同的細(xì)胞系中比較了本發(fā)明產(chǎn)品與親本分子和其它市場(chǎng)產(chǎn)品的抗病毒活性。這些研究所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單向Anova統(tǒng)計(jì)學(xué)分析程序(one way Anovastatistical analysis program)分析。顯示于圖8-10的結(jié)果的圖示表明數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表5一概括了使用EMC病毒在A549、HeLa和ME180細(xì)胞系中進(jìn)行比較研究得到的比活性數(shù)據(jù)。
表5.平均抗病毒比活性

從該實(shí)施例中的數(shù)據(jù)清楚地發(fā)現(xiàn)PEG-Alfacon1保留了親本Intergen分子顯著量的抗病毒活性。在頭對(duì)頭比較中，很明顯PEG-Alfacon1保留了可與PEG-Intron相比的活性水平并顯著高于Pegasys的活性水平。然而根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(圖5)，PEG-Alfacon1比PEG-Intron好得多并且藥物的末端排除半衰期可與Pegasys相比。因此在聯(lián)合抗病毒活性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，可期待PEG-Alfacon具有優(yōu)異的體內(nèi)活性。在A549、HeLa和ME180細(xì)胞系統(tǒng)(上述表4和5)中得到的Infergen(干擾素Alfacon-1)、PEG-alfacon-1、Pegasys(peg-干擾素-alfa2a)和PEG-Intron(peg-干擾素-alfa2b)的抗病毒活性測(cè)定數(shù)據(jù)與在MDBK細(xì)胞系統(tǒng)(上述表2)中得到的幾個(gè)PEG化的CIFN分子、Infergen(干擾素Alfacon-1)和Pegasys(peg-干擾素-alfa2a)的抗病毒活性測(cè)定數(shù)據(jù)一致。兩組數(shù)據(jù)均表明PEG-alfacon-1(和其它的PEG化的CIFN分子)表現(xiàn)出比Pegasyspeg-干擾素-alfa2a大至少10倍的抗病毒活性。此外，表2中的MDBK測(cè)定數(shù)據(jù)與表4和5中的A549和ME180數(shù)據(jù)表明PEG-alfacon-1保留了約10％的親本干擾素分子(CIFN)的抗病毒活性，而在以本文中和文獻(xiàn)中發(fā)表的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的相同測(cè)定系統(tǒng)中，Pegasyspeg-干擾素-alfa2a保留了約1.0％的親本干擾素分子的活性(即Roferon干擾素-alfa2a的活性)，這些數(shù)據(jù)重復(fù)顯示Infergen比Roferon活性大5-10倍。因此，PEG-alfacon-1保留親本干擾素分子的抗病毒活性(即Infergenalfacon-1的抗病毒活性)的百分率大于Pegasyspeg-干擾素-alfa2a保留親本干擾素分子的抗病毒活性(即Roferon干擾素-alfa2a的抗病毒活性)的百分率約10倍。
實(shí)施例3PEG-alfacon的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)分析以下概括了使用PEG-alfacon單劑量研究的結(jié)果對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的結(jié)果。檢測(cè)了單個(gè)和平均PK分布以及血清2’5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS)活性的平均PD分布。此外，使用PK分布模擬血清藥物分布為以10天間隔的多劑量PEG-Alfacon進(jìn)行預(yù)測(cè)。
藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)取自PEG-alfacon的單劑量，范圍發(fā)現(xiàn)臨床研究。6組健康的男性和女性志愿者以逐步上升的劑量設(shè)計(jì)給予單劑量皮下注射PEG-alfacon，其劑量范圍是15到210μg。選擇來自接受60μg和更高劑量的志愿者的樣品進(jìn)行該分析。最后處理組接受在增加階段鑒定為最高耐受劑量的210μg劑量。在兩個(gè)情況(120μg劑量組的受試者531和受試者532)中給藥前5分鐘獲得的樣品血清的PEG-alfacon基線值是可測(cè)量的?；€值從隨后的樣品中扣除以得到這兩個(gè)情況的基線校正值并且數(shù)據(jù)顯示有基線校正和無基線校正。
單個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行非區(qū)室和區(qū)室藥代動(dòng)力學(xué)分析。平均數(shù)據(jù)在市售的KineticTM軟件的幫助下進(jìn)行三個(gè)步驟的分析非區(qū)室藥代動(dòng)力學(xué)分析、區(qū)室藥代動(dòng)力學(xué)分析和區(qū)室藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)分析。
表6概括了對(duì)血清藥物濃度進(jìn)行非區(qū)室藥代動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果。在皮下給藥后36到72小時(shí)內(nèi)達(dá)到峰濃度，并且峰濃度隨劑量從60μg劑量給藥之后的平均665pg/ml增加到210μg劑量給藥之后的約3600pg/ml。平均分布示于圖11。表6顯示從單個(gè)分布計(jì)算得到的平均PK參數(shù)和從平均血清分布計(jì)算得到的PK參數(shù)?？傮w上，雖然每個(gè)組內(nèi)受試者之間有很大的差異并且這些差異不能方便地以性別、體重指數(shù)(BMI；kg/m2)或股與腹部注射位置不同比較來解釋，但方法之間有合理的一致。作為例子，受試者424在給藥90μg劑量后有可定量的值并且其它樣品測(cè)定檢測(cè)不到，而受試者425給予同樣劑量的PEG-alfacon后的樣品濃度均在6000pg/ml以上。
表6比較了用非區(qū)室方法計(jì)算得到的各劑量組的平均藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和相應(yīng)的對(duì)各劑量組的平均血清濃度進(jìn)行區(qū)室分析計(jì)算得到的參數(shù)。用非區(qū)室方法為受試者318、423、425、529和747計(jì)算參數(shù)的數(shù)據(jù)不充分。兩種方法得到的計(jì)算參數(shù)總體上與AUC參數(shù)值(反映一段時(shí)間后的總藥物暴露)和排除半衰期(t1/2)一致，這顯示了每個(gè)方法有相似的值。與單個(gè)最大濃度的平均值相比，平均數(shù)據(jù)的血清峰濃度傾向于略微低一點(diǎn)。在具有％CV的各組內(nèi)有很大的可變性，所有參數(shù)的范圍約為30到70％。
各劑量組的平均血清分布適合于使用市售的軟件的1-區(qū)室體模型。單個(gè)血清分布也適合于1-區(qū)室體模型。36個(gè)單個(gè)數(shù)據(jù)集的藥物分布的6個(gè)中，數(shù)據(jù)不足以進(jìn)行1-區(qū)室體模型的計(jì)算(受試者315、318、321、425、529和747)。
表6

*由單個(gè)血清分布±標(biāo)準(zhǔn)差[由平均血清分布計(jì)算得到]計(jì)算a使用受試者531和532的基線校正值計(jì)算期望藥物的劑量校正Cmax和AUC值依照線形動(dòng)力學(xué)是恒定的。如表7所示，兩組劑量校正的參數(shù)有很大的差異。在各劑量中無一致的趨勢(shì)，提示組內(nèi)的差異可以解釋來自與劑量成比例增加的偏差。
表7.由單個(gè)平均值和用非區(qū)室方法確定值的平均分布計(jì)算得到的劑量校正的Cmax和AUC參數(shù)劑量[μg]Cmax[pg/ml]AUC0-最終[pg/ml*h]60 1196490 161735120*252017150 171979180 131390210 172560平均60 10986平均90 121512平均120*181789平均150 162133平均180 121542平均210 142258*使用受試者531和532的基線校正值計(jì)算基線校正的AUC0-最終和Cmax值對(duì)體重指數(shù)(BMI)作圖來測(cè)定體重對(duì)從皮下注射的藥物吸收的潛在效果。結(jié)果示于圖12A和12B，表明藥物吸收與BMI變化無一致的趨勢(shì)。
平均血清濃度數(shù)據(jù)配合1-區(qū)室模型得到劑量從60到210μg的單劑量皮下給藥是合理曲線，如圖13所示平均分布。
模擬試驗(yàn)使用從配合曲線到多劑量方案之后的血清藥物分布模型計(jì)算得到的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。圖14A顯示了使用從各劑量組計(jì)算得到的平均參數(shù)模擬每10天給藥60μg的給藥方案所期望的血清情況。所有的模擬試驗(yàn)使用受試者531和532的基線校正值來計(jì)算120μg劑量組的平均參數(shù)?？傮w上，各模擬試驗(yàn)中有良好的一致性。在第一個(gè)給藥間隔期間達(dá)到穩(wěn)態(tài)并且谷水平跌至測(cè)定定量限制的300pg/ml以下?；?0μg劑量組的平均數(shù)據(jù)的模擬試驗(yàn)的峰濃度是由給與150μg PEG-alfacon劑量受試者的平均數(shù)據(jù)計(jì)算得到的模擬試驗(yàn)的峰濃度的約50％。因?yàn)樵谀M圖表中沒有明顯的與治療組(劑量)有關(guān)的變化，所以差異可歸因于治療組中的易變性。每10天和每7天給藥100、150和200μg劑量的額外模擬試驗(yàn)示于圖14B-G。這些圖譜顯示了隨著劑量增加所期望的變化模式。將給藥間隔縮短至7天有小的效果。
平均血清OAS應(yīng)答分布示于圖15，其中PD應(yīng)答以從基線的％變化顯示。在很多情況中，標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值是可比的，這反映了在每個(gè)治療組中有很大的易變性。
圖16顯示了PK/PD模型的結(jié)果。計(jì)算的EC50值(反應(yīng)導(dǎo)致50％最大效果的藥物的濃度)在劑量中變化很大。類似地，如表8所示，計(jì)算的Emax值隨劑量有很大的差別。
表8劑量(mcg)Emax(％OAS變化)EC50(pg/ml)60313127907932 27701120 7911046150 470202180 717591210 441212盡管參考實(shí)施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)該理解的是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可作出各種變化和等效物可替換而不脫離本發(fā)明的真正精神和范圍。此外，可以進(jìn)行許多修改使特定的情況、材料、物質(zhì)的組合物、方法、方法的步驟或步驟適合于本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有的這些修改均在附屬的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.包含單個(gè)CIFN多肽和單個(gè)聚乙二醇(PEG)部分的單PEG化的共有干擾素(CIFN)分子，其中，所述PEG部分是線形的、分子量約30kD并直接或間接地通過共價(jià)鍵與CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連。
2.如權(quán)利要求1所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述PEG部分與CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基相連。
3.如權(quán)利要求1所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基選自CIFN多肽的lys31、lys50、lys71、lys84、lys121、lys122、lys134、lys135和lys165。
4.如權(quán)利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys31。
5.如權(quán)利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys50。
6.如權(quán)利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys71。
7.如權(quán)利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys84。
8.如權(quán)利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys121。
9.如權(quán)利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys122。
10.如權(quán)利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys134。
11.如權(quán)利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys135。
12.如權(quán)利要求3所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述賴氨酸殘基是CIFN多肽的lys165。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述共價(jià)鍵包括PEG部分的丙?；虲IFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述共價(jià)鍵包括由PEG部分的α-甲氧基、ω-丙酸活化酯和CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成的酰胺鍵。
15.含有單PEG化的共有干擾素(CIFN)分子群體的組合物，其中，所述群體由兩種或多種分子組成，其中每個(gè)這樣的種類由單個(gè)CIFN多肽和單個(gè)PEG部分組成，且PEG部分是線形的、分子量約為30kD并直接或間接地通過共價(jià)鍵連接到CIFN多肽的賴氨酸殘基或CIFN多肽的N-末端殘基，前提是在至少第一個(gè)這樣的種類中PEG部分與CIFN多肽中的賴氨酸殘基共價(jià)相連，并且在第二個(gè)這樣的種類中PEG部分與CIFN多肽中的N-末端殘基共價(jià)相連。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，在第一個(gè)這樣種類中PEG部分與CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基共價(jià)連接。
17.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述群體由兩種或多種單PEG化的CIFN組成，其中的PEG部分與CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連，前提是在任何這樣的種類中連接點(diǎn)的位置不同于在任何其它種類中連接點(diǎn)的位置。
18.如權(quán)利要求15所述的組合物，其特征在于，所述賴氨酸殘基選自CIFN多肽的lys31、lys50、lys71、lys84、lys121、lys122、lys134、lys135和lys165。
19.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述在任何這樣的種類中的連接點(diǎn)的賴氨酸殘基選自CIFN多肽的lys31、lys50、lys71、lys84、lys121、lys122、lys134、lys135和lys165。
20.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述在任何這樣的種類中的連接點(diǎn)的賴氨酸殘基是CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基。
21.如權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述在第一個(gè)這樣的種類中的共價(jià)鍵包括PEG部分的丙酰基與CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰胺鍵，并且在第二個(gè)這樣的種類中的共價(jià)鍵包括PEG部分的丙酰基與CIFN多肽中的N-末端氨基酸殘基的α-氨基之間的酰胺鍵。
22.如權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述在第一個(gè)這樣的種類中的共價(jià)鍵包括由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽中的賴氨酸殘基的ε-氨基縮合形成的酰胺鍵，并且在第二個(gè)這樣的種類中的共價(jià)鍵包括由PEG部分的α-甲氧基，ω-丙酸活化酯與CIFN多肽的N-末端殘基的α-氨基縮合形成的酰胺鍵。
23.含有單PEG化的共有干擾素(CIFN)分子群體的組合物，其特征在于，所述群體由兩種或多種分子組成，其中每種這樣的分子由單個(gè)CIFN多肽和單個(gè)PEG部分組成，并且PEG部分是線形的、分子量約為30kD且直接或間接地通過共價(jià)鍵與CIFN多肽中的賴氨酸殘基相連，前提是任何這樣的種類中的連接點(diǎn)的位置與在任何其它這樣的種類中連接點(diǎn)的位置不相同。
24.如權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述任何這樣的種類中連接點(diǎn)的賴氨酸殘基選自CIFN多肽的lys31、lys50、lys71、lys84、lys121、lys122、lys134、lys135和lys165。
25.如權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述任何這樣的種類中連接點(diǎn)的賴氨酸殘基是CIFN多肽表面暴露的賴氨酸殘基。
26.如權(quán)利要求15-25中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述CIFN多肽是干擾素α-con1。
27.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的單PEG化的CIFN分子，其特征在于，所述CIFN多肽是干擾素α-con1。
28.由下述方法生產(chǎn)的產(chǎn)品(a)使共有干擾素(CIFN)與線形、分子量約為30kD的α-甲氧基、ω-丙?；垡叶嫉溺牾啺孵?mPEGspa)以CIFNmPEGspa的摩爾比約為1∶1到1∶5，于pH約7到9進(jìn)行反應(yīng)；和(b)回收步驟(a)的單PEG化的反應(yīng)產(chǎn)物。
29.如權(quán)利要求28所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述步驟(a)中CIFNmPEGspa的比值約為1∶3，pH約為8。
30.如權(quán)利要求28所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述步驟(a)中CIFNmPEGspa的比值約為1∶2，pH約為8.0。
全文摘要
本發(fā)明提供與具有名義分子量約30kD的線形聚乙二醇(PEG)分子相連的干擾素α(IFN－α)和含有相同成分的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用主題PEG修飾的IFN－α治療病毒感染的方法。
文檔編號(hào)C07K1/107GK1997666SQ200480008785
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2004年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月26日
發(fā)明者P·范瓦拉西拉, M·J·羅伯特, G·維索, S·A·查爾斯 申請(qǐng)人:印特繆恩股份有限公司