專(zhuān)利名稱(chēng)：Lfa－1拮抗劑化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與CD11/CD18粘附受體結(jié)合，尤其是淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)的新化合物，以及含所述化合物的藥物組合物，能用來(lái)治療LFA-1介導(dǎo)的疾病。
背景技術(shù)：
炎癥人外周血主要由血紅細(xì)胞、血小板以及白細(xì)胞(white blood cells orleukocytes)組成。白細(xì)胞又細(xì)分為嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(主要為B細(xì)胞和T細(xì)胞亞型)、單核細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞有時(shí)也被稱(chēng)為“粒細(xì)胞”，或“多形核(PMN)粒細(xì)胞”，因?yàn)樗鼈兗?xì)胞質(zhì)和多個(gè)核的顆粒外觀。粒細(xì)胞和單核細(xì)胞經(jīng)常被歸類(lèi)為“吞噬細(xì)胞”，因?yàn)樗鼈兡芡淌苫驍z取微生物和一般被稱(chēng)為“抗原”的異物(foreign mater)。單核細(xì)胞也被這樣稱(chēng)呼是因?yàn)樗鼈兙薮蟮膯魏艘约八鼈儠?huì)轉(zhuǎn)變成巨噬細(xì)胞。吞噬細(xì)胞在保護(hù)機(jī)體抵抗各種感染，并與淋巴細(xì)胞一起在炎癥疾病中發(fā)揮重要作用。嗜中性粒細(xì)胞是人外周血中最常見(jiàn)的白細(xì)胞，其次是淋巴細(xì)胞。在一微升正常人外周血中，含有約6,000個(gè)白細(xì)胞，其中有約4,000個(gè)嗜中性粒細(xì)胞，1500個(gè)淋巴細(xì)胞，250個(gè)單核細(xì)胞，150個(gè)嗜曙紅細(xì)胞以及25個(gè)嗜堿細(xì)胞。
在炎癥反應(yīng)的過(guò)程中，外周血中的白細(xì)胞通過(guò)一系列的細(xì)胞間相互作用集中到炎癥或損傷部位(見(jiàn)

圖1)。免疫功能的引發(fā)和維持是由細(xì)胞間的相互粘附作用以及白細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的相互作用導(dǎo)致的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)。炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要步驟就是白細(xì)胞粘附到血管內(nèi)皮細(xì)胞，從循環(huán)系統(tǒng)中向炎癥部位遷移(圖1)。T淋巴細(xì)胞的免疫識(shí)別需要T細(xì)胞受體與抗原(與主要的組織相容性復(fù)合物體結(jié)合)之間的相互作用以及能促進(jìn)T細(xì)胞在抗原呈遞細(xì)胞上的附著和T細(xì)胞激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的黏附受體的參與。淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)被確定為主要的整合素，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞粘附及激活，從而引起正常的免疫應(yīng)答和幾種病理狀態(tài)(Springer，T.A.，Nature 346425-434(1990))。細(xì)胞間粘附分子(ICAM)-1，-2，-3，是免疫球蛋白超家族的成員，并是內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞以及其他細(xì)胞類(lèi)型上LFA-1的配體。LFA-1與ICAMs的結(jié)合，引發(fā)一系列的淋巴細(xì)胞功能，包括輔助T細(xì)胞接觸抗原呈遞細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生淋巴因子，T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞溶解，自然殺死癌細(xì)胞，以及通過(guò)T細(xì)胞與B細(xì)胞相互作用產(chǎn)生免疫球蛋白。因此，淋巴細(xì)胞功能的很多方面參與了LFA-1整合素與其ICAM配體的相互作用。許多炎癥疾病都直接涉及到這種LFA-1ICAM介導(dǎo)相互作用，包括移植排斥、皮炎、牛皮癬、哮喘和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
淋巴細(xì)胞上的LFA-1(CD11a/CD18)在慢性炎癥和免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而白細(xì)胞整合素家族的其他成員(CD11b/CD18，CD11c/CD18和CD11d/CD18)對(duì)其他白細(xì)胞，如粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，也發(fā)揮重要作用，尤其是在對(duì)感染劑的早期應(yīng)答以及在急性炎癥反應(yīng)中。
多形核白細(xì)胞來(lái)源于嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞系，它作為機(jī)體的第一道防御屏障其基本功能是感知炎癥刺激并穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞執(zhí)行清除功能。整合素Mac-1(CD11b/CD18)被激活后，在這些細(xì)胞上的表達(dá)迅速上調(diào)，并與其多重配體結(jié)合，從而釋放氧自由基、蛋白酶和磷脂酶。在某些慢性炎癥狀態(tài)下，這種集中受到不適當(dāng)?shù)恼{(diào)控，導(dǎo)致顯著的細(xì)胞和組織損傷。(Harlan，J.M.，Acta Med Scand Suppl.，715123(1987)；Weiss，S.，New England J.ofMed.，320365(1989))。
LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18)粘附受體分子的(CD11/CD18)家族包括四種密切相關(guān)的細(xì)胞表面糖蛋白LFA-1(CD11a/CD18)，Mac-1(CD11b/CD18)，p150.95(CD11c/CD18)和(CD11d/CD18)。除了巨噬細(xì)胞的一個(gè)亞群之外，LFA-1存在于所有成熟的白細(xì)胞的表面，并被認(rèn)為是主要的淋巴整合素。Mac-1、p150.95和CD11d/CD18的表達(dá)主要僅限于骨髓譜系細(xì)胞(包括嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞)。功能研究表明LFA-1與數(shù)種配體相互作用，包括ICAM-1(Rothlein等，J.Immunol.1371270-1274(1986))、ICAM-2(Staunton等，Nature 339361-364(1989))、ICAM-3(Fawcett等，Nature 360481-484(1992)；Vezeux等，Nature 360485-488，(1992)；de Fougerolles and Springer，J.Exp.Med.175185-190(1990))以及前腦胞(Telencephalin)(Tian等，J.Immunol.158928-936(1997))。
CD11/CD18家族與調(diào)節(jié)細(xì)胞相互粘附作用大整合素受體家族在結(jié)構(gòu)和遺傳特性上相互關(guān)聯(lián)，所述細(xì)胞粘附作用包括胚形成，對(duì)細(xì)胞外底物的粘附，以及細(xì)胞分化(Hynes，R.O.，Cell 48549-554(1987)；Kishimoto等，Adv.Immunol.46149-182(1989)；Kishimoto等，Cell 48681-690(1987)；Ruoslahti等，Science 238491-497(1987))。
整合素是一類(lèi)跨膜異型二聚體，包括非共價(jià)結(jié)合的α亞基和β亞基。β亞基通常能與一個(gè)以上的α亞基結(jié)合，并且那些有一個(gè)共同的β亞基的異型二聚體被歸類(lèi)為整合素群的一個(gè)亞家族(Larson and Springer，″Structure andfunction ofleukocyte integrins，″Immunol.Rev.114181-217(1990))。
研究發(fā)現(xiàn)CD11/CD18家族的整合素分子及其細(xì)胞配體介導(dǎo)了多種細(xì)胞間相互作用，尤其是在炎癥反應(yīng)中。這些蛋白被證明在免疫系統(tǒng)的粘附功能中發(fā)揮極其重要的作用。(Kishimoto等，Adv.Immunol.46149-182(1989))。研究發(fā)現(xiàn)抗LFA-1的單克隆抗體能阻斷白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附(Dustin等，J.cell.Biol.107321-331(1988)；Smith等，J.Clin.Invest.832008-2017(1989))并抑制T細(xì)胞的激活(Kuypers等，Res.Immunol.，140461(1989))，以及抗原特異性CTL殺傷所需共軛物的形成(Kishimoto等，Adv.Immunol.46149-182(1989))，T細(xì)胞增殖(Davignon等，J.Immunol.127590-595(1981))和NK細(xì)胞殺傷作用(Krensky等，J.Immunol.131611-616(1983))。
ICAMsICAM-1(CD54)為細(xì)胞表面粘附受體，是免疫球蛋白超家族一個(gè)成員(Rothlein等，J.Immunol.1371270-1274(1986)；Staunton等，Cell 52925-933(1988))。這個(gè)超家族的成員的特征是有一個(gè)或多個(gè)Ig同源區(qū)，每個(gè)同源區(qū)含有一個(gè)二硫橋環(huán)，該環(huán)含有排列在兩個(gè)片層的多個(gè)反平行β折疊。已經(jīng)確定三個(gè)同源區(qū)類(lèi)型，每一類(lèi)型都具有其典型長(zhǎng)度和處在形成二硫鍵的半胱氨酸之間的氨基酸殘基共有序列(Williams，A.F.等Ann Rev.Immunol.6381-405(1988)；Hunkapillar，T.等Adv.Immunol.441-63(1989))。ICAM-1在多種造血和非造血細(xì)胞上表達(dá)，并且，在各種炎癥介質(zhì)的作用下，在炎癥部位表達(dá)上調(diào)(Dustin等，J.Immunol.，137256-254(1986))。ICAM-1是一種分子量為90,000-110,000道爾頓的糖蛋白，在未受刺激的內(nèi)皮細(xì)胞上具有低的信使RNA水平，和中等的表面表達(dá)水平。LPS、IL-1和TNF能極大地上調(diào)ICAM-1的mRNA水平和表面表達(dá)水平，大約18-24小時(shí)表達(dá)達(dá)到最高水平(Dustin等，J.Cell.Biol.107321-331(1988)；Staunton等，Cell52925-933(1988))。ICAM-1具有五個(gè)細(xì)胞外Ig類(lèi)似結(jié)構(gòu)域(分別指定為1，2，3，4和5結(jié)構(gòu)域D1，D2，D3，D4和D5)和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在Staunton等(Cell 52925-933(1988))中闡述了這些結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和序列。
ICAM-1最初被定義為L(zhǎng)FA-1的反受體(counter-receptor)(Springer等，Ann.Rev.Immunol，5223-252(1987)；Marlincell 51813-819(1987)；Simmons等，Nature 331624-627(1988)；Staunton Nature 33961-64(1989)；Staunton等，Cell 52925-933(1988))。已經(jīng)知道LFA-1/ICAM-1相互作用在淋巴細(xì)胞(Dustin等，J.Cell.Biol.107321-331(1988)；Mentzer等，J.Cell.Physiol.126285-290(1986))，單核細(xì)胞(Amaout等，J.Cell Physiol.137305(1988)；Mentzer等，J.Cell.Physiol.130410-415(1987)；te Velde等，Immunology61261-267(1987))，和嗜中性粒細(xì)胞(Lo等，J.Immunol.143(10)3325-3329(1989)；Smith等，J.Clin.Invest.832008-2017(1989))對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附中至少起部分作用。通過(guò)對(duì)ICAM-1的功能抑制性單克隆抗體的研究，發(fā)現(xiàn)了另外的LFA-1配體，ICAM-2和ICAM-3(Simmons，Cancer Surveys 24，CellAdhesion and Cancer，1995)，它們介導(dǎo)了淋巴細(xì)胞對(duì)其他白細(xì)胞以及非造血細(xì)胞的粘附。LFA-1和ICAM-2的相互作用被認(rèn)為介導(dǎo)了自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell)的活性(Helander等，Nature 382265-267(1996))，而ICAM-3結(jié)合被認(rèn)為在淋巴細(xì)胞的激活和免疫應(yīng)答的引發(fā)中起作用(Simmons，ibid)。這些配體在正常和異常的免疫應(yīng)答中的精確作用有待進(jìn)一步闡述。
T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病功能抑制性單克隆抗體表明LFA-1在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷、T輔助淋巴細(xì)胞的應(yīng)答、自然殺傷作用、和抗體依賴(lài)性殺傷中起重要作用(Springer等，Ann.Rev.Immunol 5223-252(1987))。LFA-1抗體能阻斷對(duì)靶細(xì)胞的粘附、激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟。
許多疾病都是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的，人們也在從各種途徑尋求這些疾病的治療方法。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)就是其中一種。當(dāng)前對(duì)RA的治療方法包括臥床休養(yǎng)，熱敷，以及藥物。水楊酸鹽是目前較好的治療藥物，尤其當(dāng)其他替代藥物例如免疫抑制劑、腎上腺皮質(zhì)類(lèi)固醇引起比潛伏的疾病自身更嚴(yán)重的病癥時(shí)。還可以用非類(lèi)固醇類(lèi)抗炎藥物來(lái)治療，其中一些對(duì)RA患者具有很好解熱鎮(zhèn)痛和抗炎效果。這些藥物包括環(huán)孢菌素、消炎痛、保泰松、苯乙酸衍生物，例如布洛芬與非諾洛芬、萘乙酸類(lèi)(萘普生)，吡咯烷酸(pyrrole-alkanoic acid)(tometin)，吲哚乙酸(蘇林大)，鹵代鄰氨基苯甲酸(甲氯滅酸鈉)，吡羅昔康，和二氟苯水楊酸。其他用來(lái)治療RA的藥物包括抗瘧藥，例如氯喹，金鹽與青霉胺。這些替代藥物經(jīng)常產(chǎn)生嚴(yán)重的副反應(yīng)，包括視網(wǎng)膜損傷以及腎臟和骨髓毒性。免疫抑制劑，如氨甲喋呤，因毒性太大只被用于治療嚴(yán)重和頑固的RA。皮質(zhì)激素也具有不良副反應(yīng)(例如，白內(nèi)障，骨質(zhì)疏松癥，和Cushing氏疾病綜合征)從而使許多RA患者不能忍受。
另一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是宿主對(duì)移植物的排斥反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃团R床應(yīng)用中，為了延長(zhǎng)同種異體移植和異種移植物的存活，或?yàn)榱吮苊馑拗鲗?duì)移植物的排斥的嘗試，都主要集中在對(duì)宿主/受體免疫器官的抑制。這種療法的目的是預(yù)防性免疫抑制和/或?qū)σ浦才懦獾闹委煛ｎA(yù)防性免疫抑制中所用藥物包括細(xì)胞毒性藥物，抗代謝藥，皮質(zhì)激素類(lèi)，和抗淋巴細(xì)胞血清。非特異性免疫抑制劑在預(yù)防性免疫抑制中有特殊效果(硫唑嘌呤，溴隱亭，甲基強(qiáng)的松龍(methylprednisdone)，強(qiáng)的松，和最近用到的環(huán)孢菌素A)，它們極大地提高了臨床移植的成功率。類(lèi)固醇的聯(lián)合用藥例如氫化潑尼松，或氫化潑尼松與硫唑嘌呤聯(lián)合應(yīng)用降低了腎移植后環(huán)孢菌素A的腎毒性。另外，在抗淋巴細(xì)胞球蛋白之后給藥環(huán)孢菌素A已經(jīng)使腎成功移植。在另一個(gè)待評(píng)價(jià)的方案中，受者在移植前接受全身淋巴照射，移植后使用最小的免疫抑制。
對(duì)排斥反應(yīng)的治療已經(jīng)使用類(lèi)固醇，2-氨基-6-芳基-5-取代嘧啶，異種抗淋巴細(xì)胞球蛋白，以及抗各種白細(xì)胞的單克隆抗體，包括OKT-3。一般性參見(jiàn)J.Pediatrics，1111004-1007(1987)，詳細(xì)參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào)4,665,077)。
免疫抑制藥物引起的主要并發(fā)癥是感染。而且，全身免疫抑制通常伴隨不良毒性反應(yīng)(例如，腎移植后使用環(huán)孢菌素A引起的中毒性腎損害)和造血干細(xì)胞水平降低。免疫抑制藥物還會(huì)引起肥胖、傷口難以愈合、類(lèi)固醇高血糖癥、類(lèi)固醇精神病、白血球減少癥、胃腸道出血、淋巴瘤、以及高血壓。
針對(duì)這些并發(fā)癥，移植免疫學(xué)家一直在探求抗原特異性地抑制免疫應(yīng)答的方法(只喪失對(duì)供體同種抗原的應(yīng)答)。此外，自體免疫性疾病方面的醫(yī)生也在致力于尋找抑制自體免疫應(yīng)答的方法，所述方法只失去對(duì)自體抗原的應(yīng)答。一般通過(guò)調(diào)節(jié)要被移植組織的抗原性或介導(dǎo)排斥反應(yīng)的特異性細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)特異性免疫抑制。某些情況下，免疫或耐受的誘發(fā)主要取決于抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的方式。
在兩個(gè)鼠科動(dòng)物模型系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)移植前預(yù)處理過(guò)的同種異體移植組織能跨越MHC屏障礙而被長(zhǎng)期接受，預(yù)處理是通過(guò)在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)。Lafferty等，Transplantation，22138-149(1976)；Bowen等，Lancet，2585-586(1979)。有假設(shè)認(rèn)為這種處理導(dǎo)致了客體淋巴細(xì)胞的耗竭，從而引起組織免疫原性所必需的刺激細(xì)胞群的缺失。參見(jiàn)Lafferty等，Annu.Rev.Immunol.，1143(1983)。Lafferty等，Science，188259-261(1975)(thyroid held in organ culture)，以及Gores等，J.Immunol.，1371482-1485(1986)和Faustman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，785156-5159(1981)(islet cells treated with murine anti-Ia antiseraand complement before transplantation)。另外，從用淋巴細(xì)胞毒性藥物和γ射線(xiàn)預(yù)處理的供體動(dòng)物上取得的甲狀腺，進(jìn)行十天的體外培養(yǎng)后，不會(huì)被任何正常的同種異體的受者所排斥(Gose和Bach，J.Exp.Med.，1491254-1259(1979))。所用這些技術(shù)都涉及供者淋巴細(xì)胞的消耗和清除。
在某些模型例如血管和腎臟移植中，II類(lèi)匹配與延長(zhǎng)的同種異體移植存活之間存在著關(guān)聯(lián)性，而皮膚移植中則不存在此類(lèi)關(guān)聯(lián)(Pescovitz等，J.Exp.Med.，1601495-1508(1984)；Conti等，Transplant.Proc.，19652-654(1987))。所以，供者-受者HLA匹配已經(jīng)被應(yīng)用。此外，還發(fā)現(xiàn)移植前輸血也有效果(Opelz等，Transplant.Proc.，4253(1973)；Persijn等，Transplant.Proc.，23396(1979))。聯(lián)合應(yīng)用移植前輸血、供者-受者HLA匹配、和移植后免疫抑制治療(環(huán)孢菌素A)，極大改善了移植存活率，并且發(fā)現(xiàn)其效果是累加的(Opelz等，Transplant.Proc.，172179(1985))。
移植反應(yīng)還可用作用于MHC抗原的免疫受體的抗體減輕(Bluestone等，Immunol.Rev.905-27(1986))。而且，抗移植抗體的存在能延長(zhǎng)移植物的存活，該抗體能誘發(fā)機(jī)體反應(yīng)，而該反應(yīng)反過(guò)來(lái)能產(chǎn)生特異性免疫抑制(Lancaster等，Nature，315336-337(1985))。機(jī)體對(duì)MHC抗原的免疫反應(yīng)能通過(guò)作為器官移植的準(zhǔn)備階段的骨髓移植來(lái)特異性調(diào)節(jié)。因此，抗T細(xì)胞單克隆抗體被用來(lái)消耗供者骨髓移植物中的成熟T細(xì)胞，使骨髓移植時(shí)不會(huì)出現(xiàn)移植物抗宿主(graft-versus-host)疾病(Mueller-Ruchholtz等，Transplant Proc.，8537-541(1976))。此外，為骨髓移植保留的部分宿主淋巴細(xì)胞解決了在完全的同種異體的移植中出現(xiàn)的免疫功能不全的問(wèn)題。
如圖1所示，淋巴細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮的粘附是炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。依據(jù)T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的激活狀態(tài)，現(xiàn)在至少有三種已知的淋巴細(xì)胞粘附到內(nèi)皮的途徑。T細(xì)胞的免疫識(shí)別需要T細(xì)胞受體和粘附受體的參與，它們能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的附著和轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)信號(hào)。淋巴細(xì)胞功能相關(guān)(LFA)抗原-1(LFA-1，CD11a/CD18，αLβ2其中αL為CD11a，β2為CD18)被確定為參與導(dǎo)致幾種病理癥狀的細(xì)胞相互粘附作用中的淋巴細(xì)胞上的主要整合素受體。ICAM-1，內(nèi)皮細(xì)胞免疫球蛋白類(lèi)粘附分子，是一個(gè)已知的LFA-1配體，并與移植排斥，牛皮癬，和關(guān)節(jié)炎直接相關(guān)。
LFA-1對(duì)于許多白細(xì)胞的功能來(lái)說(shuō)是必需的，包括輔助T細(xì)胞對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的應(yīng)答中淋巴因子的產(chǎn)生，殺傷T細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞溶解，以及通過(guò)T細(xì)胞/B細(xì)胞相互作用產(chǎn)生免疫球蛋白。T細(xì)胞和B細(xì)胞上的抗原受體的激活使得LFA-1以更高的親和力與其配體結(jié)合。
最初對(duì)LFA-1功能的認(rèn)識(shí)和研究是由直接抗LFA-1的單克隆抗體(MAbs)引起的(Davignon等，J.Immunol.，127590(1981))。LFA-1只存在于白細(xì)胞上(Krenskey等，J.Immunol.，131611(1983))，而ICAM-1分布在激活的白細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞，以及內(nèi)皮細(xì)胞上(Dustin等，J.Immunol.137245(1986))。
以前曾對(duì)抗CD11a MAbs對(duì)許多T細(xì)胞依賴(lài)的免疫功能的影響進(jìn)行了體外研究和對(duì)少數(shù)幾種免疫應(yīng)答的體內(nèi)效果進(jìn)行研究。在體外，抗CD11aMAbs抑制T細(xì)胞激活(Kuypers等，Res.Immunol.，140461(1989))，T細(xì)胞依賴(lài)的B細(xì)胞增殖和分化(Davignon等，supra；Fischer等，J.Immunol.，1363198(1986))，細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞引起的靶細(xì)胞溶解(Krensky等，supra)，免疫共軛物的形成(Sanders等，J.Immunol.，1372395(1986)；Mentzer等，J.Immunol.，1359(1985))，T細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮的粘附(Lo等，J.Immunol.，1433325(1989))。而且，發(fā)現(xiàn)直接抗CD11b/CD18的抗體5C6能防止巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的胰島內(nèi)(intra-islet)浸潤(rùn)，并能抑制小鼠胰島素依賴(lài)型糖尿病的發(fā)展(Hutchings等，Nature，348639(1990))。
體外研究發(fā)現(xiàn)，LFA-1ICAM-1相互作用對(duì)于優(yōu)化T細(xì)胞功能是必需的，以及抗CD11a MAbs誘發(fā)對(duì)蛋白抗原的耐受(Benjamin等，Eur.J.Immunol.，181079(1988))并延長(zhǎng)小鼠腫瘤移植存活(Heagy等，Transplantation，37520-523(1984))，這些發(fā)現(xiàn)是檢測(cè)MAbs對(duì)這些分子的作用從而避免人體移植排斥作用的基礎(chǔ)。
在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。例如，猴子中實(shí)驗(yàn)表明，直接抗ICAM-1的MAb能避免或甚至逆轉(zhuǎn)腎臟移植排斥(Cosimi等，″Immunosuppression ofCynomolgus Recipients of Renal Allografts by R6.5，a Monoclonal Antibody toIntercellular Adhesion Molecule-1，″in Springer等(eds.)，Leukocyte AdhesionMolecules New YorkSpringer，(1988)，p.274；Cosimi等，J.Immunology，1444604-4612(1990))。而且，對(duì)獼猴進(jìn)行體內(nèi)給藥抗CD11a MAb延長(zhǎng)了皮膚同種異體移植的存活(Berlin等，Transplantation，53840-849(1992))。
首次成功地將大鼠的抗鼠科動(dòng)物CD111a抗體(25-3；IgG1)用于患有遺傳疾病的兒童以避免骨髓不匹配單倍同一性(haploidentical)移植的排斥反應(yīng)的報(bào)導(dǎo)，參見(jiàn)Fischer等，Lancet，21058(1986)。只觀察到最小的副反應(yīng)。還可參見(jiàn)Fischer等，Blood，77249(1991)；van Dijken等，Transplantation，49882(1990)；和Perez等，Bone Marrow Transplantation，4379(1989)。此外，抗體25-3能有效控制人中類(lèi)固醇耐受的急性移植物抗宿主疾病(Stoppa等，Transplant.Int.，43-7(1991))。
然而，在另一個(gè)試點(diǎn)研究中，對(duì)患有白血病的成人移植中使用這種Mab(Maraninchi等，Bone-marrow-Transplant，4147-150(1989))，或使用直接抗LFA-1不可變鏈的抗CD18 MAb，(Baumae等，Transplantation，47472(1989))卻得不到可重復(fù)的上述結(jié)果。而且，大鼠抗鼠科動(dòng)物CD11a MAb，25-3，并不能控制在人的腎臟移植中急性排斥反應(yīng)的進(jìn)程(LeMauff等，Transplantation，52291(1991))。
關(guān)于對(duì)人類(lèi)移植中使用單克隆抗體的評(píng)論，參見(jiàn)Dantal和Soulillou的文章，Current Opinion in Immunology，3740-747(1991)。一個(gè)稍早的報(bào)導(dǎo)中曾提到用抗LFA-1或抗ICAM-1 Mabs短暫治療能稍微延長(zhǎng)了小鼠中原發(fā)性血管化異位心臟(primarilly vascularized heterotopic heart)同種異體移植的存活(Isobe等，Science，2551125(1992))。在該模型中要想得到長(zhǎng)期的移植存活，必須用兩種Mabs聯(lián)合治療。
獨(dú)立地，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用抗LFA-1 MAb治療有效地延長(zhǎng)了異位(ear-pinnae)非原發(fā)性血管化小鼠心臟移植的存活，給藥方案為每天以最大劑量4mg/kg/每天給藥，然后每星期給藥一次(Nakakura等，J.Heart Lung Transplant.，11223(1992))。非原發(fā)性血管化心臟同種異體移植比原發(fā)性血管化心臟同種異體移植更具有免疫原性，并且對(duì)用MAbs而引起的移植存活延長(zhǎng)更具有抗性，(Warren等，Transplant.Proc.，5717(1973)；Trager等，Transplantation，44447587(1989))。后一參考文獻(xiàn)討論了使用高初始劑量和低后續(xù)劑量的L3T4抗體的治療。
Yednock等(Nature，35663-66(1992))敘述了另一項(xiàng)用與Nakakura等(supra)用到的相似抗體治療嚙齒動(dòng)物硬化癥類(lèi)(sclerosis-type)疾病的研究。其他的關(guān)于用抗LFA-1抗體，和ICAM-1，ICAM-2，ICAM-3及其抗體來(lái)治療LFA-1-介導(dǎo)的疾病的專(zhuān)利公開(kāi)還包括WO 91/18011(11/28/91公開(kāi))，WO91/16928(11/14/91公開(kāi))，WO 91/16927(11/14/91公開(kāi))，加拿大專(zhuān)利申請(qǐng)2,008,368(6/13/91公開(kāi))，WO 90/03400，WO 90/15076(12/13/90公開(kāi))，WO90/10652(9/20/90公開(kāi))，EP 387,668(9/19/90公開(kāi))，WO 90/08187(7/26/90公開(kāi))，WO 90/13281，WO 90/13316，WO 90/13281，WO 93/06864，WO93/21953，WO 93/13210，WO 94/11400，EP 379,904(8/1/90公開(kāi))，EP 346,078(12/13/89公開(kāi))，美國(guó)專(zhuān)利5,002,869，美國(guó)專(zhuān)利5,071,964，美國(guó)專(zhuān)利5,209,928，美國(guó)專(zhuān)利5,223,396，美國(guó)專(zhuān)利5,235,049，美國(guó)專(zhuān)利5,284,931，美國(guó)專(zhuān)利5,288,854，美國(guó)專(zhuān)利5,354,659，澳大利亞專(zhuān)利申請(qǐng)15518/88(11/10/88公開(kāi))，EP 289,949(11/9/88公開(kāi))，和EP 303,692(2/22/89公開(kāi))，EP365,837，EP 314,863，EP 319,815，EP 468,257，EP 362,526，EP 362,531，EP 438,310。
關(guān)于使用LFA-1，和ICAM肽片斷以及拮抗劑的專(zhuān)利公開(kāi)包括美國(guó)專(zhuān)利5,149,780，美國(guó)專(zhuān)利5,288,854，美國(guó)專(zhuān)利5,340,800，美國(guó)專(zhuān)利5,424,399，美國(guó)專(zhuān)利5,470,953，WO 90/03400，WO 90/133 16，WO 90/10652，WO 91/19511，WO 92/03473，WO 94/11400，WO 95/28170，JP 4193895，EP 314,863，EP 362,526和EP 362,531。
成功地使用抗LFA-1或抗ICAM-1抗體，LFA-1或ICAM-1肽、片斷或肽拮抗劑的上述方案比常規(guī)免疫抑制藥物療法有了改進(jìn)。這些研究表明LFA-1和ICAM-1非常適合作為拮抗作用的靶標(biāo)。更好地治療LFA-1介導(dǎo)的疾病，包括自體免疫性疾病、移植物對(duì)宿主或宿主對(duì)移植物的排斥、T細(xì)胞炎性反應(yīng)，并將副反應(yīng)降至最小以及維持對(duì)自身的或外來(lái)抗原的特異耐受是本領(lǐng)域的一項(xiàng)重要任務(wù)。另外，還需要找到一種拮抗LFA-1ICAM-1相互作用的非肽拮抗劑。
白蛋白是一種大量存在的血漿蛋白，負(fù)責(zé)脂肪酸的運(yùn)送。然而，白蛋白也結(jié)合并干擾許多藥物化合物的藥代動(dòng)力學(xué)。因此，任何藥物與血清血漿蛋白例如白蛋白的結(jié)合特性是其藥理特性的一個(gè)重要方面。與血漿蛋白有高親和力的藥物化合物，僅以少量存在于血清中與其靶組織、細(xì)胞或蛋白作用。例如，一個(gè)給藥后99％與血漿蛋白結(jié)合的化合物，其血漿中能與其靶標(biāo)作用的濃度，只有98％與血漿蛋白結(jié)合的化合物的一半。因此人們非常希望找到一種具有低血清血漿蛋白親和力的LFA拮抗化合物。
發(fā)明簡(jiǎn)介本發(fā)明一方面提供式(I)新化合物 其中Cy為非芳香族碳環(huán)或雜環(huán)，可被羥基、巰基、硫烷基、鹵素、氧代、硫代、氨基、氨基烷基、脒基、胍基、硝基、烷基、烷氧基或者?；芜x取代；X為二價(jià)烴鏈，可被羥基、巰基、鹵素、氨基、氨基烷基、硝基、氧代或硫代任選取代并可任選被N、O、S、SO或SO2斷開(kāi)；Y為碳環(huán)或雜環(huán)，可被羥基、巰基、鹵素、氧代、硫代、烴、鹵代烴、氨基、脒基、胍基、氰基、硝基、烷氧基或者?；芜x取代；L為單鍵或二價(jià)烴，可被羥基、鹵素、氧代或硫代任選取代并可任選被N、O、S、SO或SO2替代一個(gè)或多個(gè)碳原子；或烴上3個(gè)碳原子被氨基酸殘基替換。
R1為H、羥基、氨基，或可被氨基、碳環(huán)或雜環(huán)任選取代的O-碳環(huán)或烷氧基；R2-5獨(dú)立為氫、羥基、巰基、鹵素、氰基、氨基、脒基、胍基、硝基或烷氧基；或R3和R4一起形成一個(gè)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)，可被羥基、鹵素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基或烷氧基任選取代；R6為H或可被碳環(huán)或雜環(huán)任選取代的烴鏈；前提條件當(dāng)Y為苯基時(shí)，R2，R4和R5為H，R3為Cl，且R1為OH，則X為除環(huán)己基以外的基團(tuán)。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明化合物以及可藥用的載體的藥物組合物。
本發(fā)明還提供一種治療哺乳動(dòng)物中由LFA-1介導(dǎo)疾病或病理狀態(tài)的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效劑量的本發(fā)明化合物。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供具有通式(I)的新化合物 其中Cy，X，Y，L和R1-6如上述定義。由于取代基Cy為非芳香環(huán)，與其他在這部分為芳香環(huán)的化合物相比，本發(fā)明化合物具有較低的血漿蛋白親和力。
術(shù)語(yǔ)“非芳香族”是指不具有芳香性的碳環(huán)或雜環(huán)。要具有芳香性，環(huán)必須在一個(gè)平面上，每個(gè)環(huán)原子具有垂直于環(huán)平面的p-軌道，并要滿(mǎn)足休克爾定律環(huán)的π電子數(shù)為(4n+2)，其中n為整數(shù)(即π電子數(shù)為2，6，10或14)。而這里所述的非芳香環(huán)則不滿(mǎn)足其中一個(gè)或全部的芳香性的標(biāo)準(zhǔn)。
此處的術(shù)語(yǔ)“烷氧基”包括飽和的，如O-烷基，以及不飽和的，如O-烯基和O-炔基等基團(tuán)。烷氧基的實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。
術(shù)語(yǔ)“氨基”是指伯(-NH2)，仲(-NHR)，叔(-N(R)2)或季(-N+(R)4)胺，其中R為烴鏈、羥基、碳環(huán)、雜環(huán)或烴鏈，被碳環(huán)或雜環(huán)取代。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然的和非天然的α-，β-，D-和L-氨基酸殘基。非天然的氨基酸包括那些具有不是天然存在側(cè)鏈的氨基酸。
“羧基”在這里是指游離酸-COOH及其酯例如烷基，芳基和芳烷基酯。優(yōu)選的酯為甲基，乙基，丙基，丁基，異丁基酯，仲丁基酯和叔丁基酯。
術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)”是指一、二或三環(huán)碳環(huán)或4-16元環(huán)(包括橋環(huán))，為飽和的，不飽和的或部分不飽和的包括芳香(芳基)環(huán)(除非特指為非芳香的)。優(yōu)選的非芳香碳環(huán)包括環(huán)丙基，環(huán)丙烯基，環(huán)丁基，環(huán)丁烯基，環(huán)戊基，環(huán)戊烯基，環(huán)己基和環(huán)己烯基。優(yōu)選的芳香碳環(huán)包括苯基和萘基。
術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”是指具有5-16環(huán)原子的單環(huán)，雙環(huán)或三環(huán)，其中至少一個(gè)環(huán)原子為雜原子(即N，O和S和SO，或SO2)。該環(huán)可為飽和的，不飽和的或部分不飽和的，也可以是芳香環(huán)(除非特指為非芳香環(huán))。雜環(huán)的實(shí)例包括哌啶，哌嗪，吡啶，吡嗪，嘧啶，噠嗪，嗎啉，吡喃，吡咯，呋喃，噻吩(噻吩基)，咪唑，吡唑，噻唑，異噻唑，二噻唑，噁唑，異噁唑，二噁唑，噻二唑，噁二唑，四唑，三唑，噻三唑，噁三唑，噻二唑，噁二唑，嘌呤和其與苯稠合的衍生物。
術(shù)語(yǔ)“烴鏈”是指飽和的，不飽和的，直鏈的或支鏈的碳鏈如烷基，鏈烯基以及炔基。優(yōu)選的烴鏈由1-12碳原子組成，更優(yōu)選由1-6個(gè)碳原子組成，最優(yōu)選1-4個(gè)碳原子組成，如甲基，乙基，丙基，丁基，烯丙基。
“可被任選取代的”的表述是指，除非另行說(shuō)明，一個(gè)或多個(gè)特定的取代基通過(guò)共價(jià)鍵連接到被取代基團(tuán)上。當(dāng)為多個(gè)取代基時(shí)，這些取代基可以為相同或不同的基團(tuán)。
Cy為非芳香碳環(huán)或雜環(huán)，可任選被羥基(-OH)，巰基(-SH)，硫烷基，鹵素(例如，F(xiàn)，Cl，Br，I)，氧代(＝O)，硫代(＝S)，氨基，氨基烷基，脒基(-C(NH)-NH2)，胍基(-NH2-C(NH)-NH2)，硝基，烷基或烷氧基取代。在一個(gè)特選的實(shí)施方案中，Cy為3-5元環(huán)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Cy為可被羥基，巰基，鹵素(優(yōu)選為F或Cl)，氧代(＝O)，硫代(＝S)，氨基，脒基，胍基，硝基，烷基或烷氧基任選取代的5-或6-元非芳香雜環(huán)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，Cy為可被羥基，氧代，硫代，Cl，C1-4烷基(優(yōu)選為甲基)，或C1-4烷酰基(優(yōu)選為乙?；?，丙?；蚨□；?任選取代的5元非芳香雜環(huán)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該非芳香雜環(huán)包含一個(gè)或多個(gè)雜原子(N，O或S)，并可被羥基，氧代，巰基，硫代，甲基，乙?；?，丙酰基或丁基任選取代。在特選的實(shí)施方案中，該非芳香雜環(huán)包含至少一個(gè)可被甲基或乙?；芜x取代的氮原子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該非芳香雜環(huán)選自哌啶，哌嗪，嗎啉，四氫呋喃，四氫噻吩，噁唑烷，噻唑烷，可被羥基，氧代，巰基，硫代，烷基或烷氧基任選取代。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，Cy為非芳香雜環(huán)，選自四氫呋喃-2-基，噻唑烷基-5-基，噻唑烷基-2-酮-5-基，和噻唑烷基-2-硫酮-5-基，環(huán)丙吡咯烷(cyclopropapyrrolidine)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Cy為可被羥基，巰基，鹵素，氧代，硫代，氨基，脒基，胍基，烷基，烷氧基或者?；芜x取代的3-6元碳環(huán)。在特選的實(shí)施方案中，該碳環(huán)為飽和的或部分不飽和的。在特選的實(shí)施方案中，Cy碳環(huán)選自環(huán)丙基，環(huán)丙烯基，環(huán)丁基，環(huán)丁烯基，環(huán)戊基，環(huán)戊烯基，環(huán)己基，環(huán)己烯基。
X為C1-5二價(jià)烴連接基團(tuán)(linker)，該基團(tuán)任選地一個(gè)或多個(gè)碳原子被N，O，S，SO或SO2替代，并可被羥基，巰基，鹵素，氨基，氨基烷基，硝基，氧代或硫代任選取代。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，X至少含有一個(gè)碳原子。替換取代之后會(huì)在烴鏈中或任意一端或兩端形成酰胺成分(-NRC(O)-或-C(O)NR-)。另外的成分包括磺酰胺(-NRSO2-或-SO2NR)，?；?，硫醚，胺。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，X為-CH2-NR6-C(O)-，其中其羰基-C(O)-部分與Cy相鄰(如共價(jià)結(jié)合)，并且R6為烷基如甲基，更優(yōu)選為氫。
Y為碳環(huán)或雜環(huán)，可任選被羥基，巰基，鹵素，氧代，硫代，烴，鹵代烴，氨基，脒基，胍基，氰基，硝基，烷氧基或?；〈Ｔ谔剡x的實(shí)施方案中，Y為芳基或雜芳基可被鹵素或羥基任選取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，Y為苯基，呋喃-2-基，噻吩-2-基，鹵素(優(yōu)選為Cl)或羥基取代的苯，優(yōu)選為間位取代。
L為二價(jià)烴，該烴任選地一個(gè)或多個(gè)碳原子被N，O，S，SO或SO2替代，并可被羥基，鹵素，氧代，或硫代任選取代；或烴上的三個(gè)碳原子被氨基酸殘基替代。優(yōu)選地，L的長(zhǎng)度為少于10個(gè)原子，更優(yōu)選5個(gè)或更少，最優(yōu)選5或3個(gè)原子。在特選的實(shí)施方案中，L選自-CH＝CH-C(O)-NR6-CH2-，-CH2-NR6-C(O)-，-C(O)-NR6-CH2-，-CH(OH)-(CH2)2-，-(CH2)2-CH(OH)-，-(CH2)3-，-C(O)-NR6-CH(R7)-C(O)-NR6-，-NR6-C(O)-CH(R7)-NR6-C(O)-，-CH(OH)-CH2-O-和-CH(OH)-CF2-CH2-，其中每個(gè)R6獨(dú)立為H或烷基，R7為氨基酸側(cè)鏈。優(yōu)選的氨基酸側(cè)鏈包括非天然存在的側(cè)鏈，例如苯基，或天然的側(cè)鏈。優(yōu)選的側(cè)鏈為Phe，Tyr，Ala，Gln和Asn上的側(cè)鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，L為-CH＝CH-C(O)-NR6-CH2-，其中-CH＝CH-基團(tuán)與Y相鄰(如共價(jià)連接)。在另一個(gè)優(yōu)選的方案中，L為-CH2-NR6-C(O)-，其中亞甲基(-CH2-)與Y連接。
R1為H，OH，氨基，可被氨基、碳環(huán)或雜環(huán)任選取代的O-碳環(huán)或烷氧基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1為H，苯基，或C1-4烷氧基，可被碳環(huán)，例如苯基，任選取代。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1為H。在另一個(gè)特選的方案中，R1為甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基，異丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，苯氧基或芐氧基。再另一個(gè)特選的方案中，R1為NH2。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1為乙氧基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中R1為異丁氧基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1為氨基取代的烷氧基，例如2-氨基乙氧基，N-嗎啉基乙氧基，N，N-二烷氨基乙氧基，季銨羥基烷氧基(例如，三甲基銨羥基乙氧基)。
R2-5獨(dú)立為H，羥基，巰基，鹵素，氰基，氨基，脒基，胍基，硝基或烷氧基；或R3和R4合在一起形成一個(gè)稠合的碳環(huán)或雜環(huán)，可被羥基、鹵素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基或烷氧基任選取代。在特選的實(shí)施方案中，R2和R3獨(dú)立為H，F(xiàn)，Cl，Br或I。在另一個(gè)特選的實(shí)施方案中，R4和R5都為H。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2，R3中的一個(gè)為鹵素而另外一個(gè)為氫或鹵素。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3為Cl而R2，R4和R5分別為H。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2和R3都為Cl而R4和R5都為H。
R6為H或可被碳環(huán)或雜環(huán)任選取代的烴鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R6為H或烷基，如甲基，乙基，丙基，丁基，異丁基，仲丁基或叔丁基。在特選的實(shí)施方案中，R6為H。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物具有通式(Ia)-(If)，
其中Cy，Y，L和R1-6如前定義。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，式(Ia)-(If)化合物中用星號(hào)(*)標(biāo)注的碳原子為手性碳原子。在特選的實(shí)施方案中，該碳原子具有R-構(gòu)型。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該碳原子具有S-構(gòu)型。
本發(fā)明的特選化合物包括



及其鹽，溶劑化物，水合物，酯。
應(yīng)該意識(shí)到本發(fā)明化合物會(huì)并入手性中心，因此存在幾何異構(gòu)體和立體異構(gòu)體。所有這些預(yù)期的異構(gòu)體，無(wú)論是以純的異構(gòu)體形式或其混合物以及外消旋體，都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。立體異構(gòu)化合物可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如色譜法，如手性HPLC，或結(jié)晶法進(jìn)行分離。
“可藥用”鹽包括酸和堿加成鹽。可藥用酸加成鹽是指那些保留了游離堿的生物活性和特性的鹽，沒(méi)有不受歡迎的生物學(xué)或其他活性，與無(wú)機(jī)酸形成的，該無(wú)機(jī)酸可以是鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，碳酸，磷酸等；和有機(jī)酸，選自脂肪族的，脂環(huán)族的，芳香族的，芳香脂肪族，雜環(huán)類(lèi)，羧基類(lèi)，和磺酸基類(lèi)的有機(jī)酸，例如甲酸，乙酸，丙酸，羥基乙酸，葡糖酸，乳酸，丙酮酸，草酸，蘋(píng)果酸，馬來(lái)酸，丙二酸，琥珀酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，天冬氨酸，抗壞血酸，谷氨酸，鄰氨基苯甲酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，embonic acid，苯乙酸，甲磺酸，乙磺酸，對(duì)甲苯磺酸，水楊酸等。
可藥用堿加成鹽包括無(wú)機(jī)堿的加成鹽，例如鈉，鉀，鋰，銨，鈣，鎂，鐵，鋅，銅，錳，鋁鹽等。優(yōu)選的為銨，鉀，鈉，鈣和鎂鹽。可藥用有機(jī)無(wú)毒性堿加成鹽包括伯，仲，叔胺，取代胺包括天然的取代胺，環(huán)胺以及堿性離子交換樹(shù)脂，例如異丙基胺，三甲基胺，二乙胺，三乙胺，三丙基胺，乙醇胺，2-二乙基氨基乙醇，三甲基胺(trimethamine)，二環(huán)己胺，賴(lài)氨酸，精氨酸，組氨酸，咖啡因，普魯卡因，hydrabamine，膽堿，甜菜堿，乙二胺，葡糖胺，甲基葡糖胺，可可堿，嘌呤，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶，聚胺樹(shù)脂等的加成鹽。特別優(yōu)選的有機(jī)無(wú)毒性堿為異丙基胺，二乙胺，乙醇胺，三甲基胺，二環(huán)乙基胺，膽堿，和咖啡堿。
本發(fā)明化合物可以通過(guò)現(xiàn)有有機(jī)合成技術(shù)用市售原料和試劑或用從市場(chǎng)可得原料制備得到的原料試劑來(lái)制備。許多標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)技術(shù)以及工藝，參見(jiàn)March，J.，“Advanced Organic Chemistry”McGraw-Hill，New York，1977；和Collman，J.，“Principles and Applications of Organotransition MetalChemistry”University Science，Mill Valley，1987；和Larock，R.，“Comprehensive Organic Tansformations”Verlag，New York，1989。應(yīng)該意識(shí)到除了上述這些步驟，根據(jù)化合物上的特殊取代基，還必須用一些適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)和脫保護(hù)步驟。文獻(xiàn)Greene和Wuts(Protective Groups in OrganicChemistry，2d edition，John Wiley and Sons，1991)敘述了大量的保護(hù)基團(tuán)，以及詳細(xì)的加保護(hù)和脫保護(hù)方法。例如，適當(dāng)?shù)陌被Ｗo(hù)基包括叔丁基羰基(Boc)，芴基甲基羰基(Fmoc)，2-三甲基甲硅基乙氧基羰基(Teoc)，1-甲基-1-(4-聯(lián)苯基)乙氧基羰基(Bpoc)，烯丙氧基羰基(Alloc)，和芐氧基羰基(Cbz)。羧基可用芴基甲基，或烷基酯如甲基或乙基，或鏈烯基酯例如烯丙酯保護(hù)。羥基可用三苯甲基，單甲氧基三苯甲基，二甲氧基三苯甲基，以及三甲氧基三苯甲基進(jìn)行保護(hù)。
化合物也可以用美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/6446,330(2000年9月14日提交)中闡述的有機(jī)合成方法進(jìn)行制備，其全文在此引用作為參考文獻(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，化合物可按照反應(yīng)流程1來(lái)制備。
流程1
如流程1所示，保護(hù)市售甘氨酸氨基酸殘基的氨基(如，fmoc)和羧基(Pr)或固定在固體支持物。用適當(dāng)?shù)脑噭被Ｗo(hù)基脫去，并與二苯基酮亞胺反應(yīng)，然后用(iii)鹵素-X-Cy烷化α碳得到中間產(chǎn)物(vi)。亞胺(vi)轉(zhuǎn)變成游離胺(v)，然后與中間產(chǎn)物(vi)結(jié)合得到本發(fā)明化合物，該化合物可以任選地對(duì)羧基位置脫保護(hù)產(chǎn)生游離酸(vii)。根據(jù)取代基R1的定義，該游離酸可以被酯化或酰胺化。
在特定的技術(shù)方案中，本發(fā)明的式(Ib)化合物可按照流程2制備。
流程2
如流程2所示，市售或用市售原料合成的原始化合物(i)，與N-羥基甲基鄰苯二甲酰胺反應(yīng)而得到中間產(chǎn)物(ii)，將該產(chǎn)物與肼反應(yīng)而產(chǎn)生游離胺(iii)。該胺通過(guò)與Boc2O和碳酸氫鈉反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)Boc保護(hù)(iv)，然后與三氟甲磺酸酐(triflic anhydride)反應(yīng)得到中間化合物(v)。通過(guò)與醋酸鈀(II)和1，3-雙(二苯基膦丙烷(dppp)反應(yīng)，隨后又與二異丙基乙基胺(DIPEA)反應(yīng)，該三氟甲磺酸酯(triflate)中間化合物(v)被轉(zhuǎn)變成甲酯中間化合物(vi)。用TFA脫去(vi)的Boc基團(tuán)，然后與羧酸(vii)反應(yīng)從而得到中間化合物(viii)。在流程2的優(yōu)選方案中，中間化合物(vii)Y-L-C(O)OH為呋喃丙烯酸或噻吩丙烯酸。用LiOH脫去(viii)的甲酯產(chǎn)生游離酸，該游離酸與N-Boc保護(hù)的二氨基丙酸/酯(x)反應(yīng)以得到中間化合物(xi)。用TFA脫去(xi)的Boc基團(tuán)，然后與羧基取代的非芳香環(huán)(xii)反應(yīng)而得到本發(fā)明最終化合物(Ib)。
在另一特定方案中，本發(fā)明式(Ic)化合物可按照流程3制備。
流程3
如所示流程3，羧酸鹽原料(i)與胺試劑(ii)Y-L-NHR6偶合從而得到中間化合物(iii)，該化合物與(iv)反應(yīng)從而得到本發(fā)明化合物(v)。在流程3的優(yōu)選方案中，Y-L-為可被羥基、鹵素、烷基和烷氧基任選取代的芐基。更優(yōu)選Y-L-為3-羥基-芐基。
在另一特定方案中，本發(fā)明式(Id)化合物可按照流程4制備。
流程4
如所示流程4，從流程2中制備的起始化合物(i)，被轉(zhuǎn)化成碘代中間化合物(ii)，然后與炔(iii)反應(yīng)得到中間化合物(iv)。炔(iii)是通過(guò)將Y-COOH與Br-C≡CH在THF中反應(yīng)而制得。中間化合物(iv)通過(guò)與Rh/Al2O3在氫氣氛中反應(yīng)被轉(zhuǎn)變成烷烴(v)，酯基團(tuán)是通過(guò)與LiI在吡啶中反應(yīng)被轉(zhuǎn)變成游離酸從而得到(vi)。中間化合物(vi)與氨基酸(vii)反應(yīng)而得到本發(fā)明化合物(viii)。在流程4的特選方案中，Y為可被烷基、羥基或鹵素任選取代的苯基。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，Y為3-氯-苯基或3-羥基-苯基。
在另一特定方案中，本發(fā)明式(Ie)化合物可按照流程5制備。
流程5 如所示流程5，起始化合物(i)與三氟甲磺酸酐和2，6-二甲基吡啶反應(yīng)得到中間化合物(ii)，該化合物通過(guò)與乙酸鈀(II)、1，3-雙(二苯基膦)丙烷(dppp)反應(yīng)，隨后又與二異丙基乙基胺(DIPEA)在DMF和甲醇中反應(yīng)而被轉(zhuǎn)化成甲酯(iii)。該酯(iii)與CrO3在乙酸和乙酸酐中反應(yīng)而得到醛(iv)，該乙醛與格利雅試劑溴化乙炔基鎂在THF中反應(yīng)而得到炔中間化合物(v)。碘試劑(vi)Y-I與(v)反應(yīng)得到中間化合物(vii)，該化合物通過(guò)與Rh/Al2O3在氫氣氛下反應(yīng)被轉(zhuǎn)化成烷烴(viii)。在吡啶中，用LiI將甲酯轉(zhuǎn)化成游離酸(ix)，該游離酸與氨基酸殘基(x)偶合從而得到本發(fā)明化合物(xi)。在流程5的優(yōu)選方案中，Y為可被羥基、鹵素、烷基和烷氧基任選取代的苯基。在更優(yōu)選的方案中，Y為3-羥基-苯基或3-氯-苯基。
本發(fā)明化合物對(duì)LFA-1的結(jié)合優(yōu)于對(duì)Mac-1的結(jié)合。因此，本發(fā)明一方面提供一種抑制LFA-1與ICAMs(細(xì)胞粘附分子)結(jié)合的方法，包括使LFA-1與式(I)化合物相接觸。該方法可以基于溶液和基于細(xì)胞的分析方法，在體內(nèi)和體外實(shí)施。其中，在已知的配體(putative ligand)的存在下(例如ICAM-1)，將本發(fā)明化合物作用于LFA-1。本發(fā)明化合物可以被標(biāo)記，例如用放射性同位素標(biāo)記，或用熒光基團(tuán)標(biāo)記例如熒光素黃異硫氰酸酯(FITC)，以利于檢測(cè)配體的結(jié)合或減少。因此，本發(fā)明化合物在診斷和檢驗(yàn)方面具有應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明化合物在治療或預(yù)防LFA-1活性介導(dǎo)的疾病或癥狀方面具有應(yīng)用價(jià)值。因此本發(fā)明一方面提供一種治療哺乳動(dòng)物中(如人)，由LFA-1介導(dǎo)的疾病和癥狀的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物施用有效劑量的化合物?！逵行┝俊迨侵冈诮o藥后能降低LFA-1活性的一定數(shù)量的化合物；或指在給藥后預(yù)防、抑制、或降低LFA-1介導(dǎo)的疾病或癥狀的嚴(yán)重程度所必須的一定數(shù)量的化合物。
本發(fā)明化合物或其組合物能治療的疾病包括牛皮癬；與炎性腸病有關(guān)的反應(yīng)(例如Crohn氏疾病和潰瘍性結(jié)腸炎)，皮炎，腦膜炎，腦炎，眼色素層炎(uveitis)，過(guò)敏性癥狀例如濕疹和哮喘，有關(guān)T細(xì)胞滲入的疾病和慢性炎癥反應(yīng)，皮膚過(guò)敏性反應(yīng)(包括毒葉藤(poison ivy)和毒葛(poison cak)；動(dòng)脈粥樣硬化，自身免疫性疾病例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡，糖尿病，多發(fā)性硬化癥，Reynaud氏綜合癥，自身免疫性甲狀腺炎，實(shí)驗(yàn)的自身免疫性腦脊髓炎，Siorgen氏綜合癥，青少年糖尿病，由細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的與遲發(fā)過(guò)敏性有關(guān)的免疫反應(yīng)，典型地存在于肺結(jié)核，肉樣瘤病，多發(fā)性肌炎，肉芽腫病和脈管炎；惡性貧血；與白血球滲出有關(guān)的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病；敗血病或外傷繼發(fā)的多器官損傷綜合癥；自身免疫溶血性貧血；重癥肌無(wú)力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾?。桓鞣N移植，包括移植物抗宿主或宿主抗移植物的疾病，HIV和鼻病毒感染，肺纖維化，脫發(fā)癥，硬化病(scletedoma)，子宮內(nèi)膜異位，白癜風(fēng)，由嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的缺血性再灌注(reperfusion)損傷例如急性心肌梗塞，PTCA后的再狹窄，入侵性(Invasive)過(guò)程例如心肺搭橋(bgpass)手術(shù)，腦水腫，中風(fēng)，腦外傷，出血性休克，燒傷，缺血性腎病，多器官衰竭，傷口愈合和瘢痕形成，動(dòng)脈粥樣硬化。
化合物的實(shí)際給藥量和給藥途徑取決于特定的疾病或癥狀以及其他因素，例如患者的身材大小，年齡，性別以及種族，并且用常規(guī)分析來(lái)確定。一般說(shuō)來(lái)，靜脈給藥的劑量按病人體重約0.01-1000mg/kg/每天，優(yōu)選為0.1到20mg/kg，更優(yōu)選0.3到15mg/kg?？梢砸悦刻旖o藥一次和多次的方式持續(xù)給藥幾天或幾星期或幾年，也可以每星期給藥數(shù)次的方式持續(xù)給藥幾星期和幾年?？紤]特定藥物的血漿生物利用度的同時(shí)，其他途徑的給藥劑量以能達(dá)到與上述的靜脈給藥相似的血漿濃度為準(zhǔn)。
在本發(fā)明的方法中，化合物可以口服(包括從口腔，舌下，吸入)，從鼻腔給藥，直腸給藥，陰道給藥，靜脈給藥(包括動(dòng)脈內(nèi)給藥)，真皮內(nèi)給藥，皮下給藥，肌內(nèi)注射以及局部給藥?；衔锟梢耘c本領(lǐng)域的常規(guī)試劑例如載體、稀釋劑、增稠劑，輔劑等一起被制備成適合給藥的組合物。因此，本發(fā)明另一方面提供包含式(I)化合物的藥物組合物，含有可藥用載體、賦形劑或輔劑，還可能包括附加的活性成分例如抗炎藥，如NSAIDs。
劑型包括溶液，粉末，片劑，膠囊，明膠膠囊，栓劑，局部軟膏劑，乳膏，吸入式氣霧劑。非腸道外給藥的劑型包括含有緩沖劑、稀釋劑和其他適當(dāng)添加劑的無(wú)菌水溶液。還可使用適合非腸道外給藥，且不會(huì)與本發(fā)明化合物發(fā)生有害反應(yīng)的可藥用有機(jī)或無(wú)機(jī)載體物質(zhì)。合適的可藥用載體包括，但不限于，水，鹽溶液，酒精，聚乙二醇，凝膠，乳糖，直鏈淀粉，硬脂酸鎂，滑石，硅酸，粘性石蠟，羥甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等。這些劑型都進(jìn)行滅菌，需要的時(shí)候，與輔劑混合，例如，不與本發(fā)明化合物發(fā)生有害反應(yīng)的潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖液、著色香料和/或芳香物質(zhì)等。混懸水溶液可含有能增強(qiáng)粘性的物質(zhì)包括，例如，羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇和/或右旋糖酐。任選地，混懸劑還含有穩(wěn)定劑。
本發(fā)明化合物具有很高的口服生物利用度。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物通過(guò)口服給藥?？诜o藥的組合物包括粉末或顆粒，水或非水介質(zhì)的混懸液或溶液，膠囊，單元小袋劑，錠劑(troches)，片劑或SECs(柔軟有彈性的膠囊或囊片(caplets))。在這些劑型中，可根據(jù)需要添加增稠劑，芳香劑，稀釋劑，乳化劑，分散助劑，載體，載體物質(zhì)或粘合劑?？捎眠@些劑型有效地將化合物輸送到消化道，更好地暴露于粘膜。因此，這些劑型由能有效地保護(hù)化合物防止被胃里過(guò)高的pH破壞，或隨時(shí)間持續(xù)釋放化合物的材料組成，以促進(jìn)組合物更有效地分布到特定的粘膜上。本領(lǐng)域已知的腸包衣抗酸片劑、膠囊和囊片；腸溶膜典型包括乙酸酯鄰苯二甲酸酯(acetate phthalate)，丙二醇和脫水山梨糖醇單油酸酯(sorbitanmonoleate)。
本領(lǐng)域有許多制備食物給藥(alimentary delivery)劑型的方法。一般參見(jiàn)，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro編輯，MackPublishing CO.，Easton，PA，1990。本發(fā)明劑型可以通過(guò)已知的方法利用惰性的、無(wú)毒的、可藥用的賦形劑或溶劑轉(zhuǎn)變成慣用的劑型，例如片劑，包衣片，丸劑，顆粒，氣霧劑，糖漿劑，乳劑，混懸液以及溶液。在所有的情況下，該藥用活性化合物的濃度應(yīng)該占混合物總重量的約0.1％至約99％，也就是說(shuō)足夠地能達(dá)到所希望的劑量范圍的濃度。該劑型可以通過(guò)下列方法制備，例如，用溶劑和/或賦形劑稀釋化合物，適當(dāng)情況下用乳化劑和/或分散劑，以及，例如，當(dāng)水作為稀釋劑時(shí)，適當(dāng)情況下用有機(jī)溶劑作為輔助溶劑。
制備組合物時(shí)還可添加粘合劑(例如，預(yù)凝膠玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石或硅石)；分散劑(例如，淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。片劑可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包衣。適當(dāng)情況下，還可添加芳香劑，著色劑和/或甜味劑。
本發(fā)明適合口服給藥的劑型可以以分散單元的形式，例如膠囊，扁囊劑(cachets)或片劑，其中每個(gè)單元含有預(yù)定數(shù)量的活性組分；以粉末或顆粒的形式；以水的或非水的溶液或混懸液的形式；或以水包油乳劑或油包水液體乳劑的形式出現(xiàn)。片劑可通過(guò)壓片或模壓的方法制得，其中可任選地添加一種或多種附加成分。壓片是通過(guò)壓片機(jī)來(lái)完成，其中以自由流動(dòng)形式，例如粉末或顆粒中的活性組分任選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或或分散劑混合。模制的片劑是在合適的儀器里模壓用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的化合物粉末狀混合物而制得。片劑可以任選地被包衣或做刻痕標(biāo)記(scored)，也能配制成活性組分的緩釋或控釋配方。
實(shí)施例在實(shí)施例中用到了下列縮略語(yǔ)Boc＝叔丁氧基羰基；Boc2O＝叔丁氧基羰基酐；DMA＝二甲基乙酰胺；DMF＝二甲基甲酰胺；Hobt＝1-羥基苯三唑；TFA＝三氟乙酸；DCM＝二氯甲烷；MeOH＝甲醇；HOAc＝乙酸；HCl＝鹽酸；H2SO4＝硫酸；乙腈；Na2·EDTA＝乙二胺四乙酸鈉；TBAF＝氟化四丁基銨；EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；TEA＝三乙胺；Mg2SO4＝硫酸鎂；TES＝三乙基硅烷；Et2O＝乙醚；BBr3＝三溴化硼實(shí)施例1 化合物16，17，38-40，46-50的合成
在一個(gè)圓底燒瓶中懸吊一個(gè)攪拌器，然后往燒瓶里注入濃硫酸(水體積的2.7倍)和水，用乙醇/冰浴冷卻到約-5℃。一旦冷卻，在劇烈攪拌下加入1當(dāng)量2，6-二氯苯酚和1當(dāng)量N-(羥甲基)鄰苯二甲酰亞胺。在低溫下反應(yīng)4小時(shí)，然后溫?zé)嶂潦覝爻掷m(xù)攪拌過(guò)夜。一般情況下，反應(yīng)會(huì)進(jìn)行到圓底燒瓶里只有固體階段。此時(shí)將乙酸乙酯和水加入并攪拌。大塊固體打碎后，將沉淀過(guò)濾并用乙酸乙酯和水洗滌。產(chǎn)物真空干燥過(guò)夜后，不需要進(jìn)一步純化即可使用。
將1當(dāng)量干燥后的產(chǎn)物與甲醇(每克起始物加22.5毫升)加入到裝有水冷凝器與攪拌棒的圓底燒瓶中。加入1.2當(dāng)量肼一水合物，然后將混合物回流4小時(shí)。冷卻至室溫后，小心加入濃鹽酸(每克起始物加4.5毫升)。加完濃鹽酸后，將混合物回流過(guò)夜(大于8小時(shí))。反應(yīng)冷卻至0℃，過(guò)濾除去沉淀的副反應(yīng)產(chǎn)物。然后將濾液真空濃縮。
將粗胺殘余物溶解在3∶2 THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，混合物攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)物濃縮，將殘余物在水和乙醚中分配。用乙醚萃取水層，合并有機(jī)層，用硫酸鎂干燥，真空濃縮成固體。從熱的甲醇和水中重結(jié)晶得到純的產(chǎn)物。
在圓底燒瓶里，將1當(dāng)量的Boc保護(hù)的胺和1.5當(dāng)量的2，6-二甲基吡啶溶解于DCM中，必要時(shí)可稍微加熱。一旦這些起始原料完全溶解，在氮?dú)庀?，用干?乙醇浴將其冷卻到-78℃。一旦冷卻，加入2.5當(dāng)量的三氟甲磺酸酐，攪拌下，反應(yīng)溫度緩慢回升到室溫。通常在4小時(shí)內(nèi)，用薄層色譜法實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)。一旦完成，將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和水中分配。有機(jī)層用0.1N硫酸、飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次，然后用硫酸鎂干燥，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用DCM洗脫，得到純的三氟甲磺酸酯。
在高壓Parr容器的玻璃套(glass insert)中，將1當(dāng)量三氟甲磺酸酯溶解于DMF和甲醇。然后將起始原料在一氧化碳下攪拌脫氣10分鐘。加入0.15當(dāng)量醋酸鈀(II)和0.15當(dāng)量的1，3-雙(二苯基膦)丙烷，再在一氧化碳下攪拌脫氣10分鐘，攪拌過(guò)程中，加入2.5當(dāng)量二異丙基乙基胺。合適地組裝好容器后，用300psi一氧化碳?xì)怏w充氣，加熱至70℃，攪拌過(guò)夜。將容器冷卻后排氣。轉(zhuǎn)移混合物到圓底燒瓶中，然后真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用1％丙酮和1％TEA的DCM溶液洗脫，得到純的甲酯。
將Boc保護(hù)的胺溶解在TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯，再次真空濃縮。將胺的TFA鹽溶解于乙醚，用10％的碳酸鉀水溶液洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。
1當(dāng)量的游離堿性胺，3當(dāng)量的呋喃丙烯酸，3當(dāng)量的EDC和1當(dāng)量的Hobt溶解于DMA中。將反應(yīng)物進(jìn)行室溫?cái)嚢瑁⑶矣帽由V法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油在乙醚中懸浮，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇DCM液洗脫，得到純的甲酯。
將2.3當(dāng)量碘化鋰加入到1當(dāng)量的甲酯的吡啶溶液，并將此混合物回流加熱8小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和1N鹽酸中分配。水層用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)層，并用1M碳酸氫鈉洗滌，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。將殘余物溶解于NMM中，然后將溶液真空濃縮。將殘留物用DCM溶解，然后用1N鹽酸洗滌三次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，并真空濃縮，得到足夠高純度的苯甲酸，不需要繼續(xù)純化，就可以使用。
1當(dāng)量的酸和2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯，2當(dāng)量的EDC，1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇DCM液洗脫，得到純的甲酯。
Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯并重新真空濃縮。1當(dāng)量的這種胺，2當(dāng)量的適合的市售羧酸(化合物16，N-乙?；?D-脯氨酸；化合物17，N-乙?；?L-脯氨酸；化合物38，(-)-2-氧代-4-噻唑烷羧酸；化合物39，1-環(huán)己烯-1-羧酸；化合物40，(4R)-(-)-2-硫代(thioxo)-4-噻唑烷羧酸；化合物45，環(huán)丁烷羧酸；化合物46，環(huán)戊烷羧酸；化合物47，環(huán)己烷羧酸；化合物48，3，4-二氫-2，2-二甲基-4-氧代-2H-吡喃-6-羧酸；化合物49，1，3-二硫戊環(huán)-2-羧酸乙酯(用3當(dāng)量LiOH·H2O的THF/水(3/1)溶液皂化2當(dāng)量的這種乙基酯。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。用1M的鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化即可直接使用)；化合物50，環(huán)丙烷羧酸；化合物51，四氫-2-糠酸)、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚，用0.1 N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇DCM液洗脫，得到純的甲酯。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例2 化合物1-15，41，43的合成
在一個(gè)圓底燒瓶中懸吊一個(gè)高效攪拌器，然后往燒瓶里注入濃硫酸(水體積的2.7倍)和水，用乙醇/冰浴冷卻到約-5℃。一旦冷卻，在劇烈攪拌下加入1當(dāng)量的2，6-二氯苯酚和1當(dāng)量的N-(羥甲基)鄰苯二甲酰亞胺。在低溫下反應(yīng)4小時(shí)，然后溫?zé)嶂潦覝爻掷m(xù)攪拌過(guò)夜。通常反應(yīng)會(huì)進(jìn)行到圓底燒瓶里只有固體的階段。此時(shí)將乙酸乙酯和水加入并攪拌。大塊的固體破碎后，將沉淀過(guò)濾，并用乙酸乙酯和水洗滌。產(chǎn)物真空干燥過(guò)夜后，不需要進(jìn)一步純化即可使用。
將1當(dāng)量的干燥后的產(chǎn)物與甲醇(每克起始物加22.5毫升)加入到裝有水冷凝器與攪拌棒的圓底燒瓶中。加入1.2當(dāng)量肼的一水合物，然后將混合物回流4小時(shí)。冷卻至室溫后，小心加入濃鹽酸(每克起始物加4.5毫升)。加完濃鹽酸后，將混合物回流過(guò)夜(大于8小時(shí))。反應(yīng)冷卻至0℃，過(guò)濾除去沉淀的副反應(yīng)產(chǎn)物。然后將濾液真空濃縮。
將粗胺殘余物溶解在3∶2 THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，混合物攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)物濃縮，將殘余物在水和乙醚中分配。用乙醚萃取水層，合并有機(jī)層，用硫酸鎂干燥，真空濃縮成固體。從熱的甲醇和水中重結(jié)晶得到純的產(chǎn)物。
在圓底燒瓶里，將1當(dāng)量的Boc保護(hù)的胺和1.5當(dāng)量的2，6-二甲基吡啶溶解于DCM中，必要時(shí)可稍微加熱。一旦這些起始原料完全溶解，在氮?dú)庀?，用干?乙醇浴將其冷卻到-78℃。一旦冷卻，加入2.5當(dāng)量的三氟甲磺酸酐，攪拌下，反應(yīng)溫度緩慢回升到室溫。通常在4小時(shí)內(nèi)，用薄層色譜法實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)。一旦完成，將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和水中分配。有機(jī)層用0.1N硫酸、飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次，然后用硫酸鎂干燥，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用DCM洗脫，得到純的三氟甲磺酸酯。
在高壓Parr容器的玻璃套中，將1當(dāng)量三氟甲磺酸酯溶解于DMF和甲醇。然后將起始原料在一氧化碳下攪拌脫氣10分鐘。加入0.15當(dāng)量醋酸鈀(II)和0.15當(dāng)量的1，3-雙(二苯基膦)丙烷，再在一氧化碳下攪拌脫氣10分鐘，攪拌過(guò)程中，加入2.5當(dāng)量二異丙基乙基胺。合適地組裝好容器后，用300psi一氧化碳?xì)怏w充氣，加熱至70℃，攪拌過(guò)夜。將容器冷卻后排氣。轉(zhuǎn)移混合物到圓底燒瓶中，然后真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用1％丙酮和1％TEA的DCM溶液洗脫，得到純的甲酯。
將Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯并重新真空濃縮。將胺的TFA鹽溶解于乙醚，用10％的碳酸鉀水溶液洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。
1當(dāng)量的游離堿性胺，3當(dāng)量的呋喃丙烯酸，3當(dāng)量的EDC和1當(dāng)量的Hobt溶解于DMA中。將反應(yīng)物進(jìn)行室溫?cái)嚢璨⑶矣帽由V法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純的甲酯。
2.3當(dāng)量碘化鋰加入到1當(dāng)量的甲酯的吡啶溶液中，并將此混合物回流加熱8小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和1N鹽酸中分配。水層用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)層，并用1M碳酸氫鈉洗滌，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。將殘余物溶解于NMM中，然后將溶液真空濃縮。將殘留物用DCM溶解，然后用1N鹽酸洗滌三次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，并真空濃縮得到足夠高純度的苯甲酸，不需要繼續(xù)純化，就可以使用。
1當(dāng)量的酸，2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯，2當(dāng)量的EDC，1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM洗脫，得到純的甲酯。
Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯并重新真空濃縮。1當(dāng)量的這種胺，2當(dāng)量的適合的市售羧酸((N-Boc酸從市場(chǎng)上購(gòu)得。另外的酸是將購(gòu)得的游離胺通過(guò)下列步驟加上Boc保護(hù)基而得到將胺溶解于3∶2 THF/水溶液。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，然后將混合物攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液以除去THF，剩余水層用己烷進(jìn)行分配。然后，用1N鹽酸將水層酸化至pH2，再用乙酸乙酯分配兩次。合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化就可使用)化合物1 D，L-2-哌啶酸；化合物2，3-哌啶甲酸；化合物3，異哌啶甲酸；化合物4，N-Boc-L-脯氨酸；化合物5，N-Boc-D-脯氨酸；化合物6，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸；化合物7，N-Boc-L-焦谷氨酸；化合物8，N-Boc-D-焦谷氨酸；化合物9，L-2-哌啶酸；化合物10，D-順-4-羥基脯氨酸；化合物11，L-順-4-羥基脯氨酸；化合物12，D-羥基脯氨酸；化合物13，(2S，3S)-3-甲基吡咯烷-2-羧酸；化合物14，N-Boc-L-羥基脯氨酸；化合物15，Boc-D-噻唑烷-4-羧酸；化合物41，L-3-羥基脯氨酸；化合物43，反-3-氮雜雙環(huán)[3.1.0]-己烷-2-羧酸)、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9∶1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純的甲酯。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9∶1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。
恰當(dāng)?shù)?，將Boc保護(hù)的殘余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯并重新真空濃縮。得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例3 化合物18-21的合成
將1當(dāng)量的4-氨基-2，6-二氯苯酚溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量Boc2O，然后將反應(yīng)液攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液，殘余物分配于水和乙醚中。水層用乙醚萃取，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮得到固體。從乙醚/已烷中重結(jié)晶得到純的產(chǎn)物。
1當(dāng)量的苯酚溶解于含有2.6當(dāng)量2，6-二甲基吡啶的DCM中，將混合物冷卻至-78℃。加入1.25當(dāng)量的三氟甲磺酸酐，將反應(yīng)液溫?zé)嶂潦覝?，攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液，將殘余物在乙醚和水中分配。水層用乙醚萃取，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(9∶1已烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純的三氟甲磺酸酯。
一邊攪拌一邊將0.15當(dāng)量1，3-雙(二苯基膦)-丙烷和2.5當(dāng)量TEA加入到含有1當(dāng)量三氟甲磺酸酯的混合溶液中，該混合溶液為DMF/甲醇2/1混合液。向此溶液通入一氧化碳?xì)怏w，持續(xù)15分鐘，然后加入0.15當(dāng)量Pd(OAc)2，在70℃下攪拌5-7小時(shí)，攪拌是在一氧化碳?xì)怏w中進(jìn)行(利用充滿(mǎn)一氧化碳的氣球)。真空濃縮反應(yīng)液，將殘余物在乙醚和水中分配。水層用乙醚萃取兩次，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，通過(guò)硅膠塞(plug)過(guò)濾，然后真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(已烷/DCM/乙醚，9∶1∶0.02)進(jìn)行純化，從而得到純的甲酯。
將1當(dāng)量的Boc-苯胺溶解于甲醇中，并將該溶液用氯化氫飽和。將該溶液在50℃下加熱3小時(shí)，然后真空濃縮。得到的淡黃色固體在35％硫酸中加熱，直到完全溶解。加入冰水冷卻混合物，析出硫酸氫胺鹽沉淀。用冰浴冷卻反應(yīng)瓶，并劇烈攪拌混合物，滴加含有1.1當(dāng)量亞硝酸鈉水溶液。將溶液在0℃下攪拌1.5小時(shí)。加入10當(dāng)量KI的水溶液，然后迅速加入17當(dāng)量CuI。將反應(yīng)物室溫下攪拌14小時(shí)，用乙醚萃取3次。合并有機(jī)層，用1M碳酸氫鈉、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，然后真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(95∶5己烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純的芳基碘(aryl iodide)甲酯。
將1當(dāng)量3-氯苯甲醛的THF溶液冷卻至-78℃，加入1.1當(dāng)量0.5M溴化乙炔基鎂/THF。在室溫下攪拌反應(yīng)液3小時(shí)，用乙醚稀釋?zhuān)?0％檸檬酸洗滌兩次。合并水層，用乙醚再次萃取。合并有機(jī)層，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(4∶1至3∶2己烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純的炔。
1當(dāng)量的芳基碘甲酯溶解于乙酸乙酯中，向該溶液用吸液管持續(xù)通入氮?dú)?0分鐘進(jìn)行脫氣。加入1.25當(dāng)量的炔，然后加入0.02當(dāng)量的二氯雙(三苯基膦)鈀(II)、0.04當(dāng)量的CuI和5當(dāng)量的TEA。將反應(yīng)液攪拌14小時(shí)，用乙酸乙酯稀釋?zhuān)?％ Na2·EDTA、鹽水洗滌兩次，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(從乙醚到乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫)，從而得到純的芳基炔。
1當(dāng)量的芳基炔溶解于甲醇中，向該溶液用吸液管持續(xù)通人氮?dú)?0分鐘進(jìn)行脫氣。加入5％Rh/Al2O3，利用氣球?qū)錃馔ㄈ肴芤海瑢⑷芤涸跉錃夥障?利用氣球)進(jìn)行攪拌7小時(shí)，接著將反應(yīng)物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，然后真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(從乙醚到乙酸乙酯梯度洗脫)，從而得到純的產(chǎn)物。
2.3當(dāng)量的碘化鋰加入到1當(dāng)量的甲酯的吡啶溶液中，并將此混合物回流加熱8小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和1N鹽酸中分配。水層用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)層，并用1M碳酸氫鈉洗滌，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。將殘余物溶解于NMM中，然后將溶液真空濃縮。將殘留物用DCM溶解，然后用1N鹽酸洗滌三次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，并真空濃縮，得到足夠高純度的苯甲酸，不需要繼續(xù)純化。
1當(dāng)量的酸，2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯，2當(dāng)量的EDC，1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純的甲酯。
Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯并重新真空濃縮。1當(dāng)量的這種胺，2當(dāng)量的適合的市售羧酸((N-Boc酸從市場(chǎng)上購(gòu)得。其他酸是將購(gòu)得的游離胺通過(guò)下列步驟加上Boc保護(hù)基而得到將胺溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，然后將混合物攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液以除去THF，剩余水層用己烷進(jìn)行分配。然后，用1N鹽酸將水層酸化至pH2，再用乙酸乙酯分配兩次。合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化就可使用)實(shí)施例18，N-Boc-D-脯氨酸；實(shí)施例19，N-Boc-L-脯氨酸；實(shí)施例20，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸；實(shí)施例21，異哌啶甲酸；2當(dāng)量的EDC，1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純的甲酯。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚中，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。
Boc保護(hù)的殘余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯并重新真空濃縮。得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例4化合物22-25的合成
1當(dāng)量的4-氨基-2，6-二氯苯酚溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，然后將反應(yīng)液攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液，殘余物分配于水和乙醚中。水層用乙醚萃取，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮得到固體。從乙醚/己烷中重結(jié)晶得到純凈的產(chǎn)物。
1當(dāng)量的苯酚溶解于含有2.6當(dāng)量2，6-二甲基吡啶的DCM中，將混合物冷卻至-78℃。加入1.25當(dāng)量的三氟甲磺酸酐，將反應(yīng)液溫?zé)嶂潦覝?，攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液，將殘余物在乙醚和水中分配。水層用乙醚萃取，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(9∶1己烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純凈的三氟甲磺酸酯。
一邊攪拌一邊將0.15當(dāng)量1，3-雙(二苯基膦)-丙烷和2.5當(dāng)量的TEA加入到含有1當(dāng)量三氟甲磺酸酯的混合溶液中，該混合溶液為DMF/甲醇的2/1混合液。向此溶液通入一氧化碳?xì)怏w，持續(xù)15分鐘，然后加入0.15當(dāng)量的Pd(OAc)2，在70℃下攪拌5-7小時(shí)，攪拌是在一氧化碳?xì)怏w中進(jìn)行(利用充滿(mǎn)一氧化碳的氣球)。真空濃縮反應(yīng)液，將殘余物在乙醚和水中分配。水層用乙醚萃取兩次，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，通過(guò)硅膠塞過(guò)濾，然后真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(己烷/DCM/乙醚，9∶1∶0.02)，從而得到純凈的甲酯。
將1當(dāng)量的Boc-苯胺溶解于甲醇中，并將該溶液用氯化氫飽和。將該溶液在50℃下加熱3小時(shí)，然后真空濃縮。得到的淡黃色固體在35％硫酸中加熱，直到完全溶解。加入冰水冷卻混合物，析出硫酸氫胺沉淀。用冰浴冷卻反應(yīng)瓶，并劇烈攪拌混合物，滴加含有1.1當(dāng)量亞硝酸鈉的水溶液。將溶液在0℃下攪拌1.5小時(shí)。加入10當(dāng)量KI水溶液，然后迅速加入17當(dāng)量CuI。將反應(yīng)物室溫下攪拌14小時(shí)，用乙醚萃取3次。合并有機(jī)層，用1M碳酸氫鈉、鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，然后真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(95∶5己烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純凈的芳基碘甲酯。
邊攪拌邊將1.3當(dāng)量DIPEA加入到由1當(dāng)量3-羥基苯甲酸、1.3當(dāng)量N，O-二甲基羥基胺鹽酸鹽、1.3當(dāng)量HOBt和1.3當(dāng)量EDC在DMF中形成的多相混合物中。在室溫下攪拌28小時(shí)直到所有的固體徹底溶解。濃縮該混合物，將殘余物在乙醚和水中分配。水層用乙醚萃取三次，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(乙醚)，從而得到純凈的hydroxamate。
1當(dāng)量hydroxamate，2.2當(dāng)量的叔丁基二甲基氯硅烷和3當(dāng)量的咪唑(imidizole)溶解于DMF，在室溫下攪拌。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化就可使用。
邊攪拌邊向1當(dāng)量的保護(hù)的hydroxamate的THF的-78℃溶液中，滴加1.2當(dāng)量的1.5MDIBAL的甲苯溶液。將反應(yīng)混合物在-78℃下再攪拌3小時(shí)，或直到薄層色譜法檢測(cè)到產(chǎn)品完全生成，只有微量的反應(yīng)物。通過(guò)將反應(yīng)液加入到裝有乙醚和0.35M硫酸氫鈉的分液漏斗中使反應(yīng)中止?；旌衔锓謱?。水層用乙醚萃取三次。合并有機(jī)層，用1N鹽酸和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次，然后用硫酸鎂干燥，通過(guò)硅膠塞過(guò)濾，真空濃縮。得到的醛不需要進(jìn)一步的純化。
將1當(dāng)量的保護(hù)的醛的THF溶液冷卻至-78℃，加入1.1當(dāng)量的0.5M溴化乙炔基鎂/THF。在室溫下攪拌反應(yīng)液3小時(shí)，用乙醚稀釋?zhuān)?0％檸檬酸洗滌兩次。合并水層，用乙醚再次萃取。合并有機(jī)層，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(4∶1至3∶2己烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純凈的炔。
1當(dāng)量的芳基碘甲酯溶解于乙酸乙酯中，向該溶液用吸液管持續(xù)導(dǎo)入氮?dú)?0分鐘進(jìn)行脫氣。加入1.25當(dāng)量的炔，然后加入0.02當(dāng)量的二氯雙(三苯基膦)鈀(II)，0.04當(dāng)量的CuI和5當(dāng)量的TEA，將反應(yīng)液攪拌14小時(shí)，用乙酸乙酯稀釋?zhuān)?％Na2·EDTA、鹽水洗滌兩次，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(從乙醚到乙酸乙酯梯度洗脫)，從而得到純凈的芳基炔。
1當(dāng)量的芳基炔溶解于甲醇中，向該溶液用吸液管持續(xù)通人氮?dú)?0分鐘進(jìn)行脫氣。加入5％Rh/Al2O3，利用氣球?qū)錃馔ㄈ肴芤海瑢⑷芤涸跉錃庀?利用氣球)攪拌7小時(shí)，接著將反應(yīng)物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，然后真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(從乙醚到乙酸乙酯梯度洗脫)，從而得到純凈的產(chǎn)物。
2.3當(dāng)量的碘化鋰加入到1當(dāng)量的甲酯的吡啶溶液中，并將此混合物加熱回流8小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和1N鹽酸中分配。水層用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)層，并用1M碳酸氫鈉洗滌，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。將殘余物溶解于NMM中，然后將溶液真空濃縮。將殘留物用DCM溶解，然后用1N鹽酸洗滌三次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，并真空濃縮，得到足夠高純度的苯甲酸，不需要繼續(xù)純化。
1當(dāng)量的酸、2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中并重新真空濃縮。1當(dāng)量的這種胺，2當(dāng)量的適合的市場(chǎng)可得的羧酸((N-Boc酸從市場(chǎng)上購(gòu)得。其他酸是將購(gòu)得的游離胺通過(guò)下列步驟加上Boc保護(hù)基而得到將胺溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量Boc2O，然后將混合物攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液以除去THF，剩余水層用己烷進(jìn)行分配。然后，用1N鹽酸將水層酸化至pH2，再用乙酸乙酯分配兩次。合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化就可使用。實(shí)施例22，N-Boc-L-脯氨酸；實(shí)施例23，N-Boc-D-脯氨酸；實(shí)施例24，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸；實(shí)施例25，D-羥基脯氨酸)、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚中，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。
Boc保護(hù)的硅基甲殘余物與3當(dāng)量的TBAF溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中并重新真空濃縮。得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例5 化合物26-28，31的合成
1當(dāng)量的2-氯對(duì)苯二酸二甲酯溶解于DCM中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰/丙酮浴冷卻到-5℃。用30分鐘滴加1當(dāng)量的BBr3的DCM溶液。將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝兀嚢?，直到用薄層色譜法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)檢測(cè)顯示反應(yīng)完全。將溶液傾倒在冰上，冰可能融化?；旌衔镌谝宜嵋阴ブ蟹峙?，真空濃縮。將產(chǎn)物溶于水，再加入飽和碳酸氫鈉，直到pH保持在8以上。該溶液用同等體積的DCM分配一次以除去未反應(yīng)的二酯。將該堿性溶液在0℃用濃鹽酸化至pH＝1-1.5，然后用同等體積的乙酸乙酯萃取沉淀兩次。有機(jī)層用鹽水分配一次，再用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。HPLC檢測(cè)到期望的位置異構(gòu)體(regioisomer)產(chǎn)物與非期望的異構(gòu)體產(chǎn)物之間的比例為7∶1。
該單酯溶解于DCM，轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)先稱(chēng)重的裝有攪拌棒的帕爾(Parr)燒瓶中。將燒瓶在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用干冰/乙醇浴冷卻至-5℃。一旦冷卻，攪拌時(shí)注入約30當(dāng)量的異丁烯到溶液中。加入2.1當(dāng)量的濃硫酸，用一個(gè)線(xiàn)拴住的橡皮塞封住燒瓶，攪拌時(shí)將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?。攪拌溶液直至澄?1-2天)。當(dāng)溶液變得澄清時(shí)，用冰浴將其冷卻至0℃。拔出塞子，用氮?dú)鈱⑦^(guò)量的異丁烯吹出。加入飽和碳酸氫鈉中和酸，然后將混合物真空濃縮，直到完全除去DCM。該溶液在乙酸乙酯中分配。有機(jī)層用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉分配兩次，用鹽水分配一次，用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化就可使用。
1當(dāng)量的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，將混合物小心用濃鹽酸化至pH2，然后真空濃縮以除去THF。水層用乙醚洗滌兩次，合并有機(jī)層，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。苯甲酸叔丁酯不用進(jìn)一步純化就可使用。
將1當(dāng)量的3-甲氧基苯基氰與乙醇、0.02當(dāng)量的鹽酸和10％(w/w)的10％碳鈀一起放入帕爾瓶中。該容器被放入帕爾振蕩器，充滿(mǎn)50psi氫氣，振蕩12小時(shí)。通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，并用乙醚按1∶10稀釋。放置過(guò)夜后，析出細(xì)白針狀晶體。將產(chǎn)物過(guò)濾，用乙醚洗滌，真空干燥。得到的胺鹽酸鹽不用進(jìn)一步純化就可使用。
用3當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA的DMA溶液將3當(dāng)量的苯甲酸叔丁基酯連接到1當(dāng)量的胺鹽酸鹽。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。產(chǎn)物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液純化得到純的叔丁酯。
將叔丁酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯，然后真空濃縮兩次。
將得到的化合物溶解于DCM中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰/丙酮浴冷卻到-5℃。用30分鐘滴加2當(dāng)量的BBr3的DCM溶液。將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?，攪拌直到用薄層色譜法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)檢測(cè)顯示反應(yīng)完全。將溶液傾倒在冰上，冰可能融化。混合物用乙酸乙酯分配兩次，合并有機(jī)層，用硫酸鎂干燥，濾液通過(guò)硅膠塞，然后真空濃縮，得到純凈的苯甲酸。
1當(dāng)量的苯甲酸、2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中并重新真空濃縮。1當(dāng)量的這種胺、2當(dāng)量的適合的市售羧酸((N-Boc酸從市場(chǎng)上購(gòu)得。其他酸是將購(gòu)得的游離胺通過(guò)下列步驟加上Boc保護(hù)基而得到將胺溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，然后將混合物攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液除去THF，剩余水層用己烷進(jìn)行分配。然后，用1N鹽酸將水層酸化至pH2，再用乙酸乙酯分配兩次。合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化就可使用。實(shí)施例26，環(huán)己烷羧酸；實(shí)施例27，異哌啶甲酸；實(shí)施例28，D，L-2-哌啶酸；實(shí)施例31，3-哌啶甲酸；)、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚中，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。
恰當(dāng)?shù)?，Boc保護(hù)的殘余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，然后真空再濃縮，得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例6 化合物29，30的合成
1當(dāng)量的2-氯對(duì)苯二酸二甲酯溶解于DCM中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰/丙酮浴冷卻到-5℃。用30分鐘滴加1當(dāng)量的BBr3下的DCM溶液。將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?，攪拌直到用薄層色譜法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)檢測(cè)顯示反應(yīng)完全。將溶液傾倒在冰上，冰可能融化?；旌衔镌谝宜嵋阴ブ蟹峙?，然后真空濃縮。將產(chǎn)物溶于水中，再加入飽和碳酸氫鈉，直到pH保持在8以上。該溶液用同等體積的DCM分配一次以除去未反應(yīng)的二酯。將該堿性溶液在0℃用濃鹽酸化至pH＝1-1.5，然后用同等體積的乙酸乙酯萃取沉淀兩次。有機(jī)層用鹽水分配一次，再用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。HPLC檢測(cè)到期望的位置異構(gòu)體(regioisomer)產(chǎn)物與非期望的異構(gòu)體產(chǎn)物之間的比例為7∶1。
該單酯溶解于DCM中，轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)先稱(chēng)重的裝有攪拌棒的帕爾燒瓶中。將燒瓶在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用干冰/乙醇浴冷卻至-5℃。一旦冷卻，在攪拌中注入約30當(dāng)量的異丁烯到溶液中。加入2.1當(dāng)量的濃硫酸，用一個(gè)線(xiàn)拴住的橡皮塞封住燒瓶，攪拌時(shí)將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?。攪拌溶液直至澄?1-2天)。當(dāng)溶液變得澄清時(shí)，用冰浴將其冷卻至0℃。拔出塞子，用氮?dú)鈱⑦^(guò)量的異丁烯吹出。加入飽和的碳酸氫鈉中和酸，然后將混合物真空濃縮，直到完全除去DCM。該溶液在乙酸乙酯中分配。有機(jī)層用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉分配兩次，用鹽水分配一次，用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化就可使用。
1當(dāng)量的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用濃鹽酸小心將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮除去THF。水層用乙醚洗滌兩次，合并有機(jī)層，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的苯甲酸叔丁基酯不用進(jìn)一步純化就可使用。
將1當(dāng)量的3-甲氧基苯基氰與乙醇、0.02當(dāng)量的鹽酸和10％(w/w)的10％碳鈀一起放入帕爾瓶中。該容器被放入帕爾振蕩器中，充滿(mǎn)50psi氫氣，振蕩12小時(shí)。通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，并用乙醚按1∶10稀釋。放置過(guò)夜后，析出細(xì)白針狀晶體。將產(chǎn)物過(guò)濾，用乙醚洗滌，真空干燥。得到的胺鹽酸鹽不用進(jìn)一步純化就可使用。
用3當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA的DMA溶液將3當(dāng)量的苯甲酸叔丁基酯連接到1當(dāng)量的胺鹽酸鹽上。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。產(chǎn)物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫純化得到純凈的叔丁酯。
將叔丁酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，然后真空濃縮兩次。
將得到的化合物溶解于DCM中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰/丙酮浴冷卻到-5℃。用30分鐘滴加2當(dāng)量的BBr3的DCM溶液。將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?，攪拌直到用薄層色譜法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)檢測(cè)顯示反應(yīng)完全。將溶液傾倒在冰上，冰可能融化?；旌衔镉靡宜嵋阴シ峙鋬纱危喜⒂袡C(jī)層，用硫酸鎂干燥。濾液通過(guò)硅膠塞，然后真空濃縮，得到純凈的苯甲酸。
1當(dāng)量的苯甲酸、2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物在室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的Boc甲酯。
1當(dāng)量的市售哌啶甲酸溶解于3∶2THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，然后將混合物攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液除去THF，水層用己烷分配。將水層用1N鹽酸酸化至pH2，然后用乙酸乙酯分配兩次。合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。得到的Boc保護(hù)的哌啶甲酸不用進(jìn)一步純化就可使用。
將Boc甲酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，然后重新真空濃縮。1當(dāng)量的這種胺、2當(dāng)量的得到的Boc保護(hù)的哌啶甲酸、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的產(chǎn)物。
將Boc保護(hù)的產(chǎn)物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，然后真空濃縮兩次得到純凈的胺。1當(dāng)量的這種胺、2當(dāng)量的適當(dāng)?shù)氖惺鬯?實(shí)施例29；丙酸；實(shí)施例30，乙酸)、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的產(chǎn)物。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚中，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例7 化合物32-34的合成
1當(dāng)量的2-氯對(duì)苯二酸二甲酯溶解于DCM中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰/丙酮浴冷卻到-5℃。用30分鐘滴加1當(dāng)量的BBr3的DCM溶液。將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝兀瑪嚢柚钡接帽由V法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)檢測(cè)顯示反應(yīng)完全。將溶液傾倒在冰上，冰可能融化?；旌衔镌谝宜嵋阴ブ蟹峙?，真空濃縮。將產(chǎn)物溶于水，再加入飽和的碳酸氫鈉，直到pH保持在8以上。該溶液用同等體積的DCM分配一次以除去未反應(yīng)的二酯。將該堿性溶液在0℃用濃鹽酸化至pH＝1-1.5，然后用等體積的乙酸乙酯萃取沉淀兩次。有機(jī)層用鹽水分配一次，再用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。HPLC檢測(cè)到期望的位置異構(gòu)體(regioisomer)產(chǎn)物與非期望的異構(gòu)體產(chǎn)物之間的比例為7∶1。
該單酯溶解于DCM中，轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)先稱(chēng)重的裝有攪拌棒的帕爾燒瓶中。將燒瓶在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用干冰/乙醇浴冷卻至-5℃。一旦冷卻，攪拌時(shí)注入約30當(dāng)量的異丁烯到溶液中。加入2.1當(dāng)量的濃硫酸，用一個(gè)線(xiàn)拴住的橡皮塞封住燒瓶，攪拌時(shí)將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?。攪拌溶液直至澄?1-2天)。當(dāng)溶液變得澄清時(shí)，將其在冰浴中冷卻至0℃。拔出塞子，用氮?dú)鈱⑦^(guò)量的異丁烯吹出。加入飽和的碳酸氫鈉中和酸，然后將混合物真空濃縮，直到完全除去DCM。該溶液在乙酸乙酯中分配。有機(jī)層用稀鹽酸、飽和的碳酸氫鈉分配兩次，用鹽水分配一次，用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化就可使用。
將1當(dāng)量的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用濃鹽酸小心將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮除去THF。水層用乙醚洗滌兩次，合并有機(jī)層，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的苯甲酸叔丁酯不用進(jìn)一步純化就可使用。
將1當(dāng)量的3-甲氧基苯基氰與乙醇、0.02當(dāng)量的鹽酸和10％(w/w)的10％碳鈀一起放入帕爾瓶中。該容器被放入帕爾振蕩器上，充滿(mǎn)50psi氫氣，振蕩12小時(shí)。通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，并用乙醚按1∶10稀釋。放置過(guò)夜后，析出細(xì)白針狀晶體。將產(chǎn)物過(guò)濾，用乙醚洗滌，真空干燥。得到的胺鹽酸鹽不用進(jìn)一步純化就可使用。
用3當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA的DMA溶液將3當(dāng)量的苯甲酸叔丁基酯連接到1當(dāng)量的胺鹽酸鹽上。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。產(chǎn)物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫純化得到純凈的叔丁酯。
將叔丁酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，然后真空濃縮兩次。
將得到的化合物溶解于DCM中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下用冰/丙酮浴冷卻到-5℃。用30分鐘滴加2當(dāng)量的BBr3的DCM溶液。將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?，攪拌直到用薄層色譜法(DCM/2％乙酸/2％甲醇)檢測(cè)顯示反應(yīng)完全。將溶液傾倒在冰上，冰可能融化?；旌衔镉靡宜嵋阴シ峙鋬纱危喜⒂袡C(jī)層，用硫酸鎂干燥，濾液通過(guò)硅膠塞，然后真空濃縮，得到純凈的苯甲酸。
1當(dāng)量的苯甲酸、2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物在室溫下攪拌并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的Boc甲酯。
1當(dāng)量的市售異哌啶甲酸溶解于3∶2THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，然后將混合物攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液除去THF，水層用己烷分配。將水層用1N鹽酸酸化至pH2，然后用乙酸乙酯分配兩次。合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。得到的Boc保護(hù)的異哌啶甲酸不用進(jìn)一步純化就可使用。
Boc甲酯溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，然后重新真空濃縮。1當(dāng)量的這種胺、2當(dāng)量的得到的Boc保護(hù)的異哌啶甲酸、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的產(chǎn)物。
將Boc保護(hù)的產(chǎn)物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，然后真空濃縮兩次，得到純凈的胺。1當(dāng)量的這種胺、2當(dāng)量的適當(dāng)?shù)氖惺鬯?實(shí)施例32；丙酸；實(shí)施例33，丁酸；實(shí)施例34，乙酸)、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的產(chǎn)物。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚中，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例8 化合物36的合成
1當(dāng)量的2，6-二氯-4-甲基苯酚溶解于含有2.6當(dāng)量的2，6-二甲基吡啶的DCM中，將混合物冷卻至-78℃。加入1.25當(dāng)量的三氟甲磺酸酐，攪拌反應(yīng)液，溫?zé)嶂潦覝剡^(guò)夜。濃縮反應(yīng)液，將殘余物在乙醚和水中分配。水層用乙醚萃取，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(9∶1己烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純凈的三氟甲磺酸酯。
攪拌的同時(shí)將0.15當(dāng)量的1，3-雙(二苯基膦)-丙烷和2.5當(dāng)量的TEA加入到含有1當(dāng)量的三氟甲磺酸酯的混合溶液中，該混合溶液為2/1的DMF/甲醇混合液。向此溶液通入一氧化碳?xì)怏w，持續(xù)15分鐘。然后加入0.15當(dāng)量的Pd(OAc)2，在70℃下攪拌5-7小時(shí)，攪拌是在一氧化碳?xì)怏w中進(jìn)行(利用充滿(mǎn)一氧化碳的氣球)。真空濃縮反應(yīng)液，將殘余物在乙醚和水中分配。水層用乙醚萃取兩次，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，通過(guò)硅膠塞過(guò)濾，然后真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(己烷/DCM/乙醚，9∶1∶0.02)，從而得到純凈的甲苯基甲酯。
1當(dāng)量的甲苯基甲酯(tolyl methyl ester)溶解于乙酸酐和乙酸中，用冰-鹽浴(-5℃)冷卻，然后加入濃硫酸。滴加CrO3(2.6當(dāng)量的)的乙酸酐和乙酸溶液，將反應(yīng)液在-5℃攪拌3.5小時(shí)。將溶液傾入冰水中并攪拌30分鐘?；旌衔镉靡颐演腿∪巍：喜⒂袡C(jī)層，用飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮得到油狀物。向油狀物中加入甲苯，再將溶液真空濃縮。重復(fù)此步驟直到產(chǎn)生晶狀固體。將該固體溶解于甲醇和濃鹽酸中，然后加熱回流12小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮，殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(9∶1己烷/乙醚)，從而得到純凈的醛。
將1當(dāng)量的醛的THF溶液冷卻至-78℃，加入1.1當(dāng)量的0.5M溴化乙炔基鎂/THF。在室溫下攪拌反應(yīng)液3小時(shí)，用乙醚稀釋?zhuān)?0％檸檬酸洗滌兩次。合并水層，用乙醚再次萃取。合并有機(jī)層，用飽和的碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(4∶1至3∶2己烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純凈的炔。
1當(dāng)量的3-碘代苯酚、2.2當(dāng)量的叔丁基二甲基氯硅烷和3當(dāng)量的咪唑(imidizole)溶解于DMF中，在室溫下攪拌。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用飽和的碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。得到的產(chǎn)物不用進(jìn)一步純化就可使用。
1當(dāng)量的硅基碘化物溶解于乙酸乙酯中，向該溶液用吸液管持續(xù)通入氮?dú)?0分鐘進(jìn)行脫氣。加入1.25當(dāng)量的炔、然后加入0.02當(dāng)量的二氯雙(三苯基膦)鈀(II)、0.04當(dāng)量的CuI和5當(dāng)量的TEA。將反應(yīng)液攪拌14小時(shí)，用乙酸乙酯稀釋?zhuān)?％Na2·EDTA、鹽水洗滌兩次，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(從乙醚到乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫)，從而得到純凈的芳基炔。
1當(dāng)量的芳基炔溶解于甲醇中，向該溶液用吸液管持續(xù)通入氮?dú)?0分鐘進(jìn)行脫氣。加入5％Rh/Al2O3，利用氣球?qū)錃馔ㄈ肴芤?，將溶液在氫氣?利用氣球)進(jìn)行攪拌7小時(shí)，接著將反應(yīng)物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(從乙醚到乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫)，從而得到純凈的產(chǎn)物。
2.3當(dāng)量的碘化鋰加入到1當(dāng)量的甲酯的吡啶溶液中，并將此混合物加熱回流8小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和1N鹽酸中分配。水層用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)層，并用1M碳酸氫鈉洗滌，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。將殘余物溶解于NMM中，然后將溶液真空濃縮。將殘留物用DCM溶解，然后用1N鹽酸洗滌三次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，并真空濃縮，得到足夠高純度的苯甲酸，不需要繼續(xù)純化。
1當(dāng)量的酸、2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2當(dāng)量的EDC，1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中并重新真空濃縮。將1當(dāng)量的這種胺、2當(dāng)量的Boc-L-噻唑烷-4-羧酸、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚中，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。
Boc保護(hù)的硅基殘余物與3當(dāng)量的TBAF一起溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，并重新真空濃縮。得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例9化合物37的合成
1當(dāng)量的2，6-二氯-4-甲基苯酚溶解于含有2.6當(dāng)量的2，6-二甲基吡啶的DCM中，將混合物冷卻至-78℃。加入1.25當(dāng)量的三氟甲磺酸酐，將攪拌的反應(yīng)液溫?zé)嶂潦覝剡^(guò)夜。濃縮反應(yīng)液，將殘余物在乙醚和水中分配。水層用乙醚萃取，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(9∶1己烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純凈的三氟甲磺酸酯。
攪拌同時(shí)將0.15當(dāng)量的1，3-雙(二苯基膦)-丙烷和2.5當(dāng)量的TEA加入到含有1當(dāng)量的三氟甲磺酸酯的混合溶液中，該混合溶液為2/1的DMF/甲醇混合液。向此溶液通入一氧化碳?xì)怏w，持續(xù)15分鐘。然后加入0.15當(dāng)量的Pd(OAc)2，在70℃下攪拌5-7小時(shí)，攪拌在一氧化碳?xì)怏w中(利用充滿(mǎn)一氧化碳的氣球)進(jìn)行。真空濃縮反應(yīng)液，將殘余物在乙醚和水中分配。水層用乙醚萃取兩次，合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，通過(guò)硅膠塞過(guò)濾，然后真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(流動(dòng)相為己烷/DCM/乙醚，9∶1∶0.02)，從而得到純凈的甲苯基甲酯。
1當(dāng)量的甲苯基甲酯溶解于乙酸酐和乙酸中，在冰-鹽浴(-5℃)中冷卻，然后加入濃硫酸。滴加CrO3(2.6當(dāng)量的)的乙酸酐和乙酸溶液，將反應(yīng)液在-5℃攪拌3.5小時(shí)。將溶液傾入冰水中，并攪拌30分鐘?；旌衔镉靡一演腿∪?。合并有機(jī)層，用飽和的碳酸氫鈉和鹽水洗滌，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮得到油狀物。向油狀物中加入甲苯，再將溶液真空濃縮。重復(fù)此步驟直到產(chǎn)生晶狀固體。將該固體溶解于甲醇和濃鹽酸中，然后加熱回流12小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮，殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(9∶1己烷/乙醚)得到純凈的醛。
將1當(dāng)量的醛的THF溶液冷卻至-78℃，加入1.1當(dāng)量的0.5M溴化乙炔基鎂/THF。在室溫下攪拌反應(yīng)液3小時(shí)，用乙醚稀釋?zhuān)?0％檸檬酸洗滌兩次。合并水層，用乙醚再次萃取。合并有機(jī)層，用飽和的碳酸氫鈉水溶液洗滌兩次，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜(4∶1至3∶2己烷/乙醚)進(jìn)行純化，從而得到純凈的炔。
1當(dāng)量的1-氯-3-碘代苯溶解于乙酸乙酯中，向該溶液用吸液管持續(xù)通入氮?dú)?0分鐘進(jìn)行脫氣。加入1.25當(dāng)量的炔，然后加入0.02當(dāng)量的二氯雙(三苯基膦)鈀(II)、0.04當(dāng)量的CuI和5當(dāng)量的TEA。將反應(yīng)液攪拌14小時(shí)，用乙酸乙酯稀釋?zhuān)?％Na2·EDTA、鹽水洗滌兩次，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(從乙醚到乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫)，從而得到純凈的芳基炔。
1當(dāng)量的芳基炔溶解于甲醇中，向該溶液用吸液管持續(xù)通人氮?dú)?0分鐘進(jìn)行脫氣。加入5％Rh/Al2O3，利用氣球?qū)錃馔ㄈ肴芤褐?，將溶液在氫氣?利用氣球)進(jìn)行攪拌7小時(shí)，接著將反應(yīng)物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，真空濃縮。殘余物用硅膠快速色譜進(jìn)行純化(從乙醚到乙酸乙酯梯度洗脫)，得到純凈的產(chǎn)物。
2.3當(dāng)量的碘化鋰加入到1當(dāng)量的甲酯的吡啶溶液中，并將此混合物加熱回流8小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和1N鹽酸中分配。水層用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)層，并用1M碳酸氫鈉洗滌，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。將殘余物溶解于NMM中，然后將溶液真空濃縮。將殘留物用DCM溶解，然后用1N鹽酸洗滌三次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，并真空濃縮，得到足夠高純度的苯甲酸，不需要繼續(xù)純化。
1當(dāng)量的酸、2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
1當(dāng)量的市售D-羥基脯氨酸溶解于3∶2 THF/水溶液中。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，然后將混合物攪拌過(guò)夜。濃縮反應(yīng)液除去THF，水層用己烷分配。將水層用1N鹽酸酸化至pH2，然后用乙酸乙酯分配兩次。合并有機(jī)層，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。得到的N-Boc-D-羥基脯氨酸不用進(jìn)一步純化就可使用。
Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中。并重新真空濃縮。1當(dāng)量的這種胺、2當(dāng)量的Boc-D-羥基脯氨酸、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚中，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。Boc保護(hù)的硅基殘余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，并重新真空濃縮。得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例10 化合物35的合成
在一個(gè)圓底燒瓶中懸吊一個(gè)高效的攪拌器，然后往燒瓶里注入濃硫酸(水體積的2.7倍)和水，用乙醇/冰浴冷卻到約-5℃。一旦冷卻，在劇烈攪拌下加入1當(dāng)量的2，6-二氯苯酚和1當(dāng)量的N-(羥甲基)鄰苯二甲酰亞胺。在低溫下反應(yīng)4小時(shí)，然后溫?zé)嶂潦覝?，持續(xù)攪拌過(guò)夜。通常反應(yīng)會(huì)進(jìn)行到圓底燒瓶里只有固體的階段。此時(shí)將乙酸乙酯和水加入并攪拌。大塊的固體破碎后，將沉淀過(guò)濾，并用乙酸乙酯和水洗滌。產(chǎn)物真空干燥過(guò)夜后，不需要進(jìn)一步純化即可使用。
將1當(dāng)量的干燥后的產(chǎn)物與甲醇(每克起始物加22.5毫升)加入到裝有水冷凝器與攪拌棒的圓底燒瓶中。加入1.2當(dāng)量的肼一水合物，然后將混合物回流4小時(shí)。冷卻至室溫后，小心加入濃鹽酸(每克起始物加4.5毫升)。加完濃鹽酸后，將混合物回流過(guò)夜(大于8小時(shí))。反應(yīng)冷卻至0℃，過(guò)濾除去沉淀的副反應(yīng)產(chǎn)物。然后將濾液真空濃縮。
將粗胺殘余物在3∶2 THF/水溶液中溶解。加入1.1當(dāng)量的固體碳酸氫鈉和1.1當(dāng)量的Boc2O，混合物攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)物濃縮，將殘余物在水和乙醚中分配。用乙醚萃取水溶液，合并有機(jī)層，用硫酸鎂干燥，真空濃縮成固體。從熱的甲醇和水中重結(jié)晶得到純凈的產(chǎn)物。
在圓底燒瓶里，將1當(dāng)量的Boc保護(hù)的胺和1.5當(dāng)量的2，6-二甲基吡啶溶解于DCM中，必要時(shí)可稍微加熱。一旦這些起始原料完全溶解，在氮?dú)庀?，用干冰乙醇浴將其冷卻到-78℃。一旦冷卻，加入2.5當(dāng)量的三氟甲磺酸酐，攪拌下，反應(yīng)溫度緩慢回升到室溫。用薄層色譜法實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)，一般4小時(shí)內(nèi)反應(yīng)完畢。一旦完成，將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和水中分配。有機(jī)層用0.1N硫酸、飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次，然后用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用DCM洗脫，得到純凈的三氟甲磺酸酯。
在高壓Parr容器的玻璃套中，將1當(dāng)量的三氟甲磺酸酯溶解于DMF和甲醇中。然后將起始物在一氧化碳下攪拌脫氣10分鐘。加入0.15當(dāng)量的醋酸鈀(II)和0.15當(dāng)量的1，3-雙(二苯基膦)丙烷，再在一氧化碳下攪拌脫氣10分鐘，攪拌過(guò)程中，加入2.5當(dāng)量的二異丙基乙基胺。正確組裝好容器后，充滿(mǎn)300psi一氧化碳?xì)怏w，加熱至70℃，攪拌過(guò)夜。將容器冷卻排氣。轉(zhuǎn)移混合物到圓底燒瓶中，然后真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用1％丙酮和1％TEA的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，并重新真空濃縮。將胺的TFA鹽溶解于乙醚中，用碳酸鉀的10％水溶液洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。
1當(dāng)量的游離堿性胺、3當(dāng)量的呋喃丙烯酸、3當(dāng)量的EDC和1當(dāng)量的Hobt溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
2.3當(dāng)量的碘化鋰加入到1當(dāng)量的甲酯的吡啶溶液中，并將此混合物加熱回流8小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮，將殘余物在乙酸乙酯和1N鹽酸中分配。水層用乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)層，并用1M碳酸氫鈉洗滌，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。將殘余物溶解于NMM中，然后將溶液真空濃縮。將殘留物用DCM溶解，然后用1N鹽酸洗滌三次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，并真空濃縮，得到足夠高純度的苯甲酸，不需要繼續(xù)純化。
1當(dāng)量的酸、2當(dāng)量的市售β-Boc-二氨基丙酸甲酯、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
Boc保護(hù)的胺溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，然后重新真空濃縮。
將1.05當(dāng)量的碘甲烷和2.1當(dāng)量的碳酸鉀的DMF溶液加入到1當(dāng)量的這種胺中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)測(cè)。一旦反應(yīng)完成，用乙酸乙酯和水稀釋。將水層在乙酸乙酯中分配，合并有機(jī)層，用鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。
1當(dāng)量的這種胺、2當(dāng)量的Boc-L-噻唑烷-4-羧酸、2當(dāng)量的EDC、1當(dāng)量的Hobt和3當(dāng)量的DIPEA溶解于DMA中。將反應(yīng)物室溫下攪拌，并且用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控。一旦反應(yīng)完成，將混合物真空濃縮。將得到的油懸浮于乙醚中，用0.1N硫酸和飽和碳酸氫鈉洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。將殘余物在硅膠柱上用5％甲醇的DCM液洗脫，得到純凈的甲酯。
1當(dāng)量的得到的甲酯溶解于THF/水(3/1)中，加入3當(dāng)量的LiOH·H2O。用薄層色譜法(DCM/甲醇，9/1)監(jiān)控反應(yīng)。一旦反應(yīng)完成，用1M鹽酸將混合物酸化至pH2，然后真空濃縮。將得到的固體懸浮于乙醚中，用0.1M鹽酸洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。將有機(jī)層用硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾，真空濃縮。
將殘余物溶解于TFA的DCM溶液(1∶1)中。20分鐘后，將反應(yīng)物真空濃縮。將得到的油溶解于甲苯中，然后重新真空濃縮。得到的酸用反相HPLC進(jìn)行純化，并用電噴霧質(zhì)譜確證，然后凍干成粉末。
實(shí)施例11 PLM2抗體捕獲LFA-1ICAM-1分析抗人體CD18的非功能抑制性單克隆抗體PLM-2(如Hildreth等，Molecular Immunology，Vol.26，No.9，pp.883-895，1989所述)，用PBS稀釋至5μg/ml，并以100μl/孔包被96-孔平底培養(yǎng)板，4℃保持過(guò)夜。在室溫下，將培養(yǎng)板用在分析緩沖液(0.02M Hepes，0.15M NaCl，和1mM MnCl2)中的0.5％BSA封閉1小時(shí)。用50mM Tis pH7.5，0.1M NaCl，0.05％Tween20和1mM MnCl2沖洗培養(yǎng)板。用分析緩沖液，將純化的全長(zhǎng)重組人LFA-1蛋白稀釋至2μg/ml，按100μl/孔加入到培養(yǎng)板中，在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。洗板三次。每孔加入50μl兩倍終濃度的溶在分析緩沖液中經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋了的抑制劑，37℃培養(yǎng)30分鐘。每孔加入50μl、用分析緩沖液中稀釋至161ng/ml(終濃度為80ng/ml)的純化的重組人的5結(jié)構(gòu)域ICAM-Ig，在37℃培養(yǎng)2小時(shí)。沖洗培養(yǎng)板，室溫下用山羊抗HuIgG(Fc)-HRP檢測(cè)結(jié)合的ICAM-Ig1小時(shí)。沖洗培養(yǎng)板，室溫下每孔用100μlTMB底物顯色5-10分鐘。每孔用100μl H3PO4(1M)停止顯色，在讀板儀下450nM處讀取。PLM2的分析結(jié)果如下表1-4所示。
實(shí)施例12 血清/血漿蛋白結(jié)合受試化合物的結(jié)合是按照Borga等(Journal of Pharmacokinetics &Biopharmaceutics，1997，25(1)63-77)和Godolphin等(Therapeutic drugmonitoring，1983，5319-23)所闡述的步驟進(jìn)行的。室溫下，雙份10μl受試化合物原液(1μg/μL)攙入到1mL緩沖液或用二氧化碳調(diào)到pH7.4的血清/血漿中。樣品裝在瓶里，在裝有振蕩器的37℃水浴中培養(yǎng)15分鐘進(jìn)行平衡。保留200μl摻入緩沖液的樣品作為濾前液。800μl摻入緩沖液的樣品和1ml的血清摻入的樣品在超濾離心儀(Amicon Inc.)中37℃下，1500g離心30分鐘。用LC/MS-MS分析濾前液和濾后液，測(cè)定受試化合物與血清/血漿蛋白的結(jié)合百分比，從扣除(accounting for)由緩沖液對(duì)照得到的非特異性結(jié)合的濾前液和濾后液的數(shù)值得到。
在取代基Cy處含有非芳香環(huán)的本發(fā)明化合物具有很低的血清血漿蛋白結(jié)合特性，有利于維持與治療相關(guān)的血清水平。如表1-4所示，相對(duì)于在取代基Cy處含有非芳香環(huán)的本發(fā)明化合物，含有芳香環(huán)的參照化合物一直顯示較高的血漿蛋白結(jié)合百分率。
表1

表2

表3
表4
權(quán)利要求
1.具有通式(I)的化合物，及其鹽、溶劑化物、水合物。 其中Cy為非芳香族碳環(huán)或雜環(huán)，可被羥基、巰基、硫烷基、鹵素、氧代、硫代、氨基、氨基烷基、脒基、胍基、硝基、烷基、烷氧基或者?；芜x取代；X為二價(jià)烴鏈，可被羥基、巰基、鹵素、氨基、氨基烷基、硝基、氧代或硫代任選取代并可任選被N，O，S，SO或SO2斷開(kāi)；Y為碳環(huán)或雜環(huán)，可被羥基、巰基、鹵素、氧代、硫代、硫烷基、氨基、氨基烷基、碳環(huán)或雜環(huán)基、烴基、鹵代烴基、氨基、脒基、胍基、氰基、硝基、烷氧基或者?；芜x取代；L為單鍵或可被羥基、鹵素、氧代或硫代任選取代并可任選被N、O、S、SO或SO2或氨基酸殘基斷開(kāi)的少于3至5個(gè)原子的二價(jià)烴鏈；R1為H，羥基，氨基，O-碳環(huán)或烷氧基，所述基團(tuán)可被氨基、碳環(huán)或雜環(huán)任選取代；R2-5獨(dú)立為H，羥基，巰基，鹵素，氰基，氨基，脒基，胍基，硝基或烷氧基；或R3和R4合在一起形成稠合碳環(huán)或雜環(huán)，可被羥基、鹵素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基或烷氧基任選取代；R6為H或可被碳環(huán)或雜環(huán)任選取代的烴鏈；前提條件是當(dāng)Y為苯基時(shí)，R2、R4和R5為H，R3為Cl，且R1為OH，則X為除環(huán)己基以外的基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Cy為5或6元非芳香族雜環(huán)，可被羥基、巰基、硫烷基、鹵素、氧代、硫代、氨基、氨基烷基、脒基、胍基、硝基、烷基、烷氧基或?；芜x取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的化合物，其中所述雜環(huán)包括一個(gè)或兩個(gè)雜原子并可被羥基、氧代、巰基、硫代、烷基或烷?；芜x取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的化合物，其中所述雜環(huán)選自哌啶、哌嗪、嗎啉、四氫呋喃、四氫噻吩、噁唑烷，環(huán)丙基吡咯烷和噻唑烷，可被羥基、氧代、巰基、硫代、烷基或烷?；芜x取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中所述雜環(huán)選自哌啶、哌嗪、嗎啉、四氫呋喃、四氫噻吩、噁唑烷，噻唑烷，可被羥基、氧代、巰基、硫代、烷基或烷?；芜x取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Cy為3-6元碳環(huán)，可被羥基、巰基、鹵素、氧代、硫代、氨基、脒基、胍基、烷基、烷氧基或?；芜x取代。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的化合物，其中所述碳環(huán)為部分不飽和。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的化合物，其中Cy為環(huán)丙基，環(huán)丙烯基，環(huán)丁基，環(huán)丁烯基，環(huán)戊基，環(huán)戊烯基，環(huán)己基和環(huán)己烯基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X為C1-5二價(jià)烴，任選其中一個(gè)或多個(gè)碳原子被N，O，S，SO或SO2替代，且該烴可被羥基、氧代或硫代任選取代。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中X為-CH2-NR6-C(O)-，其中羰基部分-C(O)-與Cy共價(jià)連接，且R6為H或烷基。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Y為可被羥基或鹵素任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，其中Y為呋喃-2-基，噻吩-2-基或苯基，其中所述苯基可被鹵素或羥基任選取代。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中L為二價(jià)烴，其中一個(gè)或多個(gè)碳原子被N，O，S，SO或SO2任選替代，且該烴可被羥基、鹵素、氧代或硫代任選取代；或該烴的三個(gè)碳原子被氨基酸殘基替代。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的化合物，其中L為-CH＝CH-C(O)-NR6-CH2-，-CH2-NR6-C(O)-，-C(O)-N6-CH2-，-CH(OH)-(CH2)2-，-(CH2)2-CH(OH)-，-(CH2)3-，-C(O)-NR6-CH(R7)-C(O)-NR6-，-NR6-C(O)-CH(R7)-NR6-C(O)-，-CH(OH)-CH2-O-或-CH(OH)-CF2-CH2-，其中每個(gè)R6獨(dú)立為H或烷基，且R7為氨基酸側(cè)鏈。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的化合物，其中R1為H、OH、氨基，以及O-碳環(huán)或烷氧基，所述基團(tuán)可被碳環(huán)任選取代。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的化合物，其中R1為H或C1-4烷氧基。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R2和R3中至少一個(gè)為鹵素，且另一個(gè)為H或鹵素。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，其中R2和R3都為Cl。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的化合物，其中R4和R5都為H。
20.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1的化合物、可藥用的輔藥、稀釋劑或載體。
21.一種抑制LFA-1與蛋白配體結(jié)合的方法，包括將LFA-1與權(quán)利要求1的化合物相接觸。
22.一種治療哺乳動(dòng)物中由LFA-1介導(dǎo)疾病和狀態(tài)的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述疾病或狀態(tài)為關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，器官移植排斥，哮喘，和腸道炎性疾病。
23.一種抑制哺乳動(dòng)物的炎性疾病和狀態(tài)的方法，包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的權(quán)利要求1的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有下列通式(I)的新化合物，其中Cy，X，Y，L和R
文檔編號(hào)A61K31/198GK1592746SQ01821797
公開(kāi)日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2001年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月28日
發(fā)明者丹尼爾·J·伯迪克, 托馬斯·R·加德克, 小詹姆斯·C·馬斯特斯, 戴維·奧雷, 馬克·E·雷諾茲, 馬克·S·斯坦利 申請(qǐng)人:杰南技術(shù)公司