專利名稱：脂質(zhì)體異體、自體腫瘤疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制品的制備方法，即為腫瘤細(xì)胞抗原疫苗的制備方法。
應(yīng)用腫瘤疫苗誘導(dǎo)腫瘤宿主產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，以主動免疫治療腫瘤是目前腫瘤生物治療有效的方法之一，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。我們已開展了自體腫瘤疫苗的研究并已取得一定進(jìn)展(論著“疫苗主動免疫療法的實(shí)驗(yàn)研究”發(fā)表在《中國人獸共患病雜志》1996；12(3)30)。在動物實(shí)驗(yàn)取得成功的基礎(chǔ)上，我們開展了自體疫苗臨床應(yīng)用的研究，分別對惡黑、平滑肌肉瘤、肺癌、食管癌和肝癌等300余例多種腫瘤進(jìn)行了研究，觀察到自體疫苗具有安全、無毒副反應(yīng)、抑瘤效果明顯的特點(diǎn)。
自體疫苗的制備方法文獻(xiàn)已有報(bào)道，國內(nèi)已申報(bào)專利的腫瘤疫苗制備方法有兩家(專利號分別為97105061.9和93112060.8)。
專利號97105061.9公開的方法是取自體腫瘤組織石蠟包埋切片，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)大蒜素、蘆薈提取液處理后加卡介苗佐劑及醛類固定劑。這種制備的自體疫苗方法有以下不足(1)自體疫苗材料來源受限和可能含有抑制免疫反應(yīng)的成分；(2)石蠟包埋組織，經(jīng)酒精、二甲苯及石蠟處理，醛類固定，其抗原成分受到破壞，而且抗原受醛類封閉，減弱了抗原性，該法所制備的疫苗未經(jīng)抗原蛋白測定，其量很難估計(jì)；(3)所加卡介苗或PPD作為佐劑作用時間短，增強(qiáng)抗原性的作用弱；(4)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示治療組與對照組腫瘤重量近似，只有轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目和動物存活天數(shù)有差異，并未經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，很難確切地評價(jià)其抑瘤效果。
專利號93112060.8公開的方法是采用自體新鮮癌組織制成單細(xì)胞懸液，與β-欖香烯、新城雞瘟病毒相混和并加入醛類固定劑，用絲烈霉素、紫外線滅活，制成細(xì)胞水平的自體疫苗。其不足之處有(1)上述自體疫苗材料受限，只能用于自體；(2)所用中成藥成份功能不明確；(3)完整瘤細(xì)胞用醛類處理抗原被封閉，抗原性減弱；(4)動物實(shí)驗(yàn)缺乏抑瘤率，僅用動物存活數(shù)來評價(jià)抑瘤效果是不夠的。
本發(fā)明目的是公開一種脂質(zhì)體異體、自體疫苗的制備方法。該方法制備疫苗的材料取自于人體癌組織的新鮮標(biāo)本，其最大特點(diǎn)是腫瘤疫苗除應(yīng)用于自體外，并可應(yīng)用于相同器官、相同組織學(xué)類型的異體腫瘤患者的治療，克服自體疫苗材料來源的限制，具有安全、無毒副反應(yīng)，作用持久和高效等特點(diǎn)。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取下列步驟來實(shí)現(xiàn)(1)取人體腫瘤新鮮標(biāo)本，制成瘤細(xì)胞懸液；(2)采用液氮反復(fù)凍融使瘤細(xì)胞碎裂與滅活，去除脂性物質(zhì)；(3)用梯度離心、透析、超速離心去除細(xì)胞核與大的胞漿顆粒，保證獲取高純度、高濃度的腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原(TAA)；(4)用Lowry’s法檢測上清液抗原蛋白濃度合格；(5)用質(zhì)脂體作為異體疫苗的載體與佐劑包裹制成疫苗。
本發(fā)明的更具體的實(shí)現(xiàn)步驟如下(1)取人新鮮腫瘤組織去除外膜和壞死組織后剪碎，按1g組織加3～5ml生理鹽水的比例在組織研磨器中研磨成組織勻漿，再經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾成瘤細(xì)胞懸液；(2)瘤細(xì)胞懸液用臺盼蘭拒染法觀察活瘤細(xì)胞數(shù)在92％以上；(3)將瘤細(xì)胞懸液于液氮中反復(fù)凍融，使瘤細(xì)胞碎裂并滅活，去除脂性物質(zhì)；(4)用2.5％(V/V)正丁醇PBS液(PH7.4)重新懸浮，震蕩均勻；(5)將上液經(jīng)500×g(4℃)離心，取上清液再經(jīng)2000×g(4℃)離心取上清液；(6)將上清液透析50～100h(4℃，100V)；(7)透析液經(jīng)200000×g(4℃)超速離心，上清液即為制備的TAA(腫瘤相關(guān)抗原)；(8)用Lowry’s法檢測上清液抗原蛋白濃度合格；(9)將脂質(zhì)體制成稀釋液(按脂質(zhì)體∶甲醇∶氯仿以一定的比例混合搖勻成脂質(zhì)體稀釋液)；(10)將脂質(zhì)體稀釋液與TAA按1∶2～3的比例震蕩混合后，即為脂質(zhì)體包裹的疫苗。
與現(xiàn)有的腫瘤疫苗制備方法對比，本發(fā)明具有如下實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)1、異體疫苗，克服了自體疫苗材料受限的困難，可以一瘤多用，為臨床應(yīng)用提體供了依據(jù)。
2、脂質(zhì)體是國際公認(rèn)的無毒高效的佐劑，包裹的腫瘤疫苗容易被吞噬細(xì)胞吞噬，將增強(qiáng)的抗原信息體傳遞給TH細(xì)胞，誘發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫與體液免疫殺傷瘤細(xì)胞，且其作用釋放緩慢持久。
3、疫苗的提取方法先進(jìn)、科學(xué)，所提取的瘤細(xì)胞相關(guān)抗原的純度與濃度高，并經(jīng)抗原蛋白測定，保證高效可靠。
下面列舉本發(fā)明的脂質(zhì)體異體疫苗和脂質(zhì)體自體疫苗的具體應(yīng)用兩例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例1人乳腺低分化腺癌新鮮標(biāo)本制備為脂質(zhì)體疫苗用于治療動物腫瘤。(脂質(zhì)體異體疫苗治療應(yīng)用實(shí)例)(1)人乳腺癌手術(shù)切除新鮮標(biāo)本在無菌條件下稱其重量，剝除其表面脂肪等非腫瘤組織，切成約1mm2大小的碎塊。
(2)將腫瘤碎塊放入組織研磨器中，按1g組織加4ml生理鹽水研磨成組織勻漿，再經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾成瘤細(xì)胞懸液。
(3)瘤細(xì)胞懸液用臺盼蘭拒染法觀察活瘤細(xì)胞數(shù)在95％以上；(4)將瘤細(xì)胞懸液用Hank’s液洗滌3次，然后在液氮中反復(fù)凍融3次，使瘤細(xì)胞碎裂與滅活，去除脂性物質(zhì)；(5)用2.5％(V/V)正丁醇PBS液(PH7.4)重新懸浮，室溫下輕震蕩20min。
(6)懸浮液經(jīng)500×g(4℃)離心10min，取上清液再經(jīng)2000×g(4℃)離心20min，取上清液。
(7)上清液抽提透析72h(100V)。
(8)透析液經(jīng)200000×g(4℃)超速離心1h，取上清液即為腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。
(9)用Lowry’s法測定疫苗中抗原蛋白含量，并調(diào)整蛋白濃度為1mg/ml。
(10)將脂質(zhì)體制成稀釋液(按脂質(zhì)體∶甲醇∶氯仿以1.5ml∶2ml∶5ml的比例混合搖勻成脂質(zhì)體稀釋液)；(11)將上述脂質(zhì)體稀釋液進(jìn)行脂質(zhì)體包裹成為疫苗。
(12)應(yīng)用將上述脂質(zhì)體異體疫苗0.2ml注入荷小鼠左腋部皮下已生長乳腺癌(Scc891)的Balb/c小鼠右腋部皮下。然后每隔5天同樣注射疫苗2次，共3次，第16天活殺動物觀察疫苗抑瘤效果和各臟器有無病變及毒副作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表一實(shí)施例2小鼠乳腺癌細(xì)胞株脂質(zhì)體包裹疫苗及用于治療動物腫瘤。(脂質(zhì)體自體疫苗治療應(yīng)用)(1)取小鼠自發(fā)性乳腺癌細(xì)胞株(Scc891)細(xì)胞懸液，細(xì)胞含量1×107/ml。
(2)瘤細(xì)胞懸液用臺盼蘭拒染法觀察活瘤細(xì)胞數(shù)在95％以上；(3)瘤細(xì)胞懸液用Hank’s液洗滌3次，使瘤細(xì)胞碎裂與滅活，去除脂性物質(zhì)；(4)用2.5％(V/V)正丁醇PBS液(PH7.4)重新懸浮，室溫下輕震蕩20min。
(5)懸浮液經(jīng)500×g(4℃)離心10min，取上清液再經(jīng)2000×g(4℃)離心20min，取上清液。
(6)上清液抽提透析72h(100V)。
(7)透析液經(jīng)200000×g(4℃)超速離心1h，取上清液即為去細(xì)胞核性細(xì)胞膜抗原(TAA)。
(8)用Lowry’s法測定抗原蛋白含量合格，并調(diào)整蛋白濃度為1mg/ml。
(9)將脂質(zhì)體制成稀釋液(按脂質(zhì)體∶甲醇∶氯仿以1.5ml∶2ml∶5ml的比例混合搖勻成脂質(zhì)體稀釋液)；(10)將上述脂質(zhì)體稀釋液進(jìn)行脂質(zhì)體包裹成為疫苗。
(11)應(yīng)用將脂質(zhì)體自體疫苗0.2ml注入荷小鼠左腋部皮下已生長乳腺癌(Scc891)的Balb/c小鼠右腋部皮下，每隔5天同樣注射疫苗2次，共3次，第16天活殺動物觀察疫苗抑瘤效果和各臟器有無毒副作用損害。
通過嚴(yán)格的動物實(shí)驗(yàn)證明其脂質(zhì)體異體疫苗及脂質(zhì)體自體疫苗的抑制效果和安全性。本疫苗經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)證明脂質(zhì)體異體與自體疫苗均有非常顯著的抑瘤效果(P＜0.01)。每組10只動物均有5只動物無腫瘤生長，抑瘤率分別為73％與68％，且無毒副反應(yīng)，結(jié)果見表一
表一組別 動物數(shù)(只) 腫瘤重量(×±SD) 抑瘤率％(1)對照組10 1.12±0.42(2)脂質(zhì)體自體疫苗組 10 0.30±0.35 73.22(3)脂質(zhì)體異體疫苗組 10 0.36±0.45 67.86說明1、3組瘤體重量統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果分別(1)-(2)P＜0.01 (1)-(3)P＜0.01 (2)-(3)P＞0.052、對照組10只動物均有腫瘤生長。
3、治療組每組均有5只(50％)末見腫瘤生長，動物全成活。
4、治療組組織切片顯示腫瘤組織周圍有多量淋巴浸潤包繞(免疫組化染色證明為T淋巴細(xì)胞，UCHL-1陽性)。
5、治療組動物的脾臟脾小體較對照組有明顯的增生。
6、治療組動物的心、肝、腎、肺等主要臟器未見明顯病理改變。
注對照組右側(cè)腋部皮下注射PBS液0.2ml，每隔5天同樣注射2次共3次。
權(quán)利要求
1.脂質(zhì)體異體、自體腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于采用下述制備步驟(1)取人體腫瘤新鮮標(biāo)本，制成瘤細(xì)胞懸液；(2)采用液氮反復(fù)凍融使瘤細(xì)胞碎裂與滅活，去除脂性物質(zhì)；(3)梯度離心，透析，超速離心去除細(xì)胞核與大的胞漿顆粒，保證獲取高純度，高濃度的腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原(TAA)；(4)用Lowry’s檢測上清液抗原蛋白濃度含量合格；(5)用脂質(zhì)體作為疫苗的載體與佐劑包裹成為疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體異體、自體腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于采取下述更具體的制備步驟(1)取人新鮮腫瘤組織去除外膜和壞死組織后剪碎，按1g組織加3～5ml生理鹽水的比例在組織研磨器中研磨成組織勻漿，再經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾成瘤細(xì)胞懸液；(2)瘤細(xì)胞懸液用臺盼蘭拒染法觀察活瘤細(xì)胞數(shù)在92％以上；(3)將瘤細(xì)胞懸液于液氮中反復(fù)凍融，使瘤細(xì)胞碎裂并滅活，去除脂性物質(zhì)；(4)用2.5％(V/V)正丁醇PBS液(PH7.4)重新懸浮，震蕩均勻；(5)將上液經(jīng)500×g(4℃)離心，取上清液再經(jīng)2000×g(4℃)離心取上清液；(6)將上清液透析50～100h(4℃，100V)；(7)透析液經(jīng)200000×g(4℃)超速離心上清液即為制備的TAA(腫瘤相關(guān)抗原)；(8)用Lowry’s檢測上清液抗原蛋白濃度含量合格；(9)將脂質(zhì)體制成稀釋液(按脂質(zhì)體∶甲醇∶氯仿以一定的比例混合搖勻成脂質(zhì)體稀釋液)；(10)將脂質(zhì)體稀釋液與TAA按1∶2～3的比例震蕩混合后，即為脂質(zhì)體包裹的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明的主要過程是:(1)取人體腫瘤新鮮標(biāo)本制成瘤細(xì)胞懸液;(2)凍融法瘤細(xì)胞碎裂與滅活;(3)正丁醇懸浮去除脂性物質(zhì);(4)離心法去除細(xì)胞核;(5)Lowry's法檢測上清液合格;(6)脂質(zhì)體作為載體與佐劑包裹制成疫苗。本發(fā)明的顯著特點(diǎn):(1)異體腫瘤疫苗的材料不受限制;(2)腫瘤疫苗的提取方法先進(jìn)、科學(xué)、高效、安全、無毒副反應(yīng);(3)脂質(zhì)體包裹疫苗可明顯增強(qiáng)疫苗的抗原性,誘導(dǎo)腫瘤宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫,作用釋放緩慢持久。
文檔編號A61K39/00GK1340361SQ0011736
公開日2002年3月20日 申請日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月25日
發(fā)明者甘岫云 申請人:廣州市腫瘤醫(yī)院, 甘岫云