一種腫瘤細胞免疫治療用高細胞毒活性cik細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腫瘤細胞免疫治療用高細胞毒活性CIK細胞，該CIK細胞通過如下步驟制備：(1)取患者外周血，收集外周血單個核細胞部分；(2)將步驟(1)收集的外周血單個核細胞部分離心，棄去上清液，獲得單個核細胞；(3)取單個核細胞按照1×106/mL細胞，加入含500～2000IU/mLγ干擾素和80～120ng/mL化合物(Ⅰ)的完全培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)；完全培養(yǎng)基包括含體積百分比為10％FBS的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液；(4)步驟(3)的細胞培養(yǎng)20～28小時后，加入50～1000ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500～2000IU/mL重組人IL?2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔2～3天傳代培養(yǎng)一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)時間為13～21天，獲得CIK細胞。該CIK細胞可用于腫瘤細胞免疫治療。
【專利說明】
一種腫瘤細胞免疫治療用高細胞毒活性CIK細胞
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于細胞免疫領(lǐng)域，具體涉及一種用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性 CIK細胞以及制備該高細胞毒活性CIK細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫治療作為腫瘤綜合治療的第四種模式，越來越受到重視。腫瘤免疫治療主要 包括腫瘤疫苗治療、細胞因子治療、過繼性細胞免疫治療及單克隆抗體免疫治療等。腫瘤疫 苗是利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，增強機體 的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復(fù)發(fā)。用于抗腫瘤研究的細胞因子主要有干擾素類、 白細胞介素類、集落刺激因子類等，其中以IFN-α、IL-2、粒-巨噬細胞集落刺激因子為多。過 繼性細胞免疫包括淋巴細胞因子活化的殺傷細胞、自然殺傷細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、DC-CIK等。單克隆抗體免疫療法的現(xiàn)有研究結(jié)果表明，腫瘤分子靶向治療具有較好的安全性和 有效性，如小分子表皮生長因子受體(EGFR)、酪氨酸激酶抑制劑、抗EGFR單克隆抗體、抗血 管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體以及其他分子靶向治療藥物，已在臨床中取得較好的療效。
[0003] 目前用于腫瘤細胞免疫治療的免疫活性細胞主要有腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、 樹突狀細胞(DC)以及細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(CIK)等。CIK細胞是一種殺傷力強的免疫活 性細胞，其主要效應(yīng)細胞的表面標志為CD3+CD56+，與其他過繼性免疫治療細胞相比，具有增 殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等優(yōu)點。但是，腫瘤病人免疫功能受損，免疫細胞功能減 弱，因此，來源于腫瘤病人外周血制備的CIK細胞殺傷腫瘤能力低下，影響CIK細胞療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性CIK細胞以及 制備該高細胞毒活性CIK細胞的方法，該CIK細胞具有很強的增殖力，⑶3 +、⑶8+和⑶3+⑶56+ 細胞的比例高，并且對腫瘤治療效果優(yōu)異。
[0005] 上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] -種用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性CIK細胞，通過如下步驟制備：（1)取 患者外周血，收集外周血的單個核細胞部分；（2)將步驟（1)收集的外周血的單個核細胞部 分離心，棄去上清液，獲得單個核細胞；（3)取單個核細胞按照I X 106/mL細胞，加入含500~ 2000IU/mLy干擾素和80~120ng/mL如下結(jié)構(gòu)所示化合物（I)的完全培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)培 養(yǎng);其中，完全培養(yǎng)基，包括含體積百分比為I〇 %FBS的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液；（4)步驟(3) 的細胞培養(yǎng)20~28小時后，加入50~1000ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500~2000IU/mL重組 人IL-2,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為13~21天， 獲得高細胞毒活性CIK細胞;化合物(I)結(jié)構(gòu)為：
[0007]
[0008] 進一步地，步驟（1)所述收集外周血的單個核細胞部分的方法為：（a)患者外周血 中，加入1~1.5倍體積的不含血清的細胞培養(yǎng)液或pH7.2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；其中， 細胞培養(yǎng)液包括:RPMI1640培養(yǎng)液和頂DM培養(yǎng)液；（b)將步驟(a)獲得的血液稀釋液加入到 淋巴細胞分離液的界面上；（c)1500~2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15~20分鐘，收集中間層，獲得單 個核細胞。
[0009] 進一步地，步驟（1)中所述收集外周血的單個核細胞部分的方法為:患者經(jīng)采用血 細胞分離機上的淋巴細胞采集程序，單采集患者的外周血單個核細胞。
[0010] 進一步地，步驟⑵中，離心的轉(zhuǎn)速為1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為7~10分 鐘。
[0011] 進一步地，步驟(4)所述繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2~3天用含500~2000IU/mL重組人IL-2 的完全培養(yǎng)基或含500~2000IU/mL重組人IL-2和100~500IU/mL重組人IL-I的完全培養(yǎng)基 傳代培養(yǎng)。
[0012] 上述化合物(I)在制備高細胞毒活性的CIK細胞中的應(yīng)用。
[0013] 上述用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性CIK細胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用。
[0014] 有益效果：
[0015] 本發(fā)明提供了一種用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性CIK細胞以及制備該高 細胞毒活性CIK細胞的方法，該CIK細胞具有很強的增殖力，CD3+、⑶8+和⑶3+⑶56+細胞的比 例高，并且對腫瘤治療效果優(yōu)異，可用于腫瘤的細胞免疫治療。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容。以下實施例中，所用的原料或 試劑除特別說明外，均為市售可得。所述患者指需要進行CIK細胞免疫治療的患者，如癌癥 患者。另外，以下實施例中，涉及的完全培養(yǎng)基為含10 % (體積百分比)FBS的RPMI 1640培養(yǎng) 液;冷凍保護劑是含10 % (體積百分比）DMSO的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基是由70 % (體積百分 比)RPMI1640培養(yǎng)液和20% (體積百分比)FBS(胎牛血清)所構(gòu)成?；衔铮↖)自制。
[0017] 實施例1: CIK細胞的誘導(dǎo)制備和檢測
[0018] 一、CIK細胞的誘導(dǎo)制備
[0019] (1)取患者外周血30mL加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液（Invitrogen公司），充分混 勻。
[0020] (2)將步驟（1)獲得的倍比稀釋的外周血60mL，加入到30mL淋巴細胞分離液(上海 華精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破壞界面），以2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20 分鐘，取中間層一富含淋巴細胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細胞進行細胞計數(shù) 及苔盼蘭活細胞計數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細胞達99 %。
[0021 ] (3)將步驟(2)獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄 上清液，沉淀為單個核細胞。
[0022] (4)加入完全培養(yǎng)基，細胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個核細胞濃度為I X 106/mL。
[0023] (5)按照I X IO6AiL細胞，加入γ -IFN(Pepr〇teCh公司）和化合物（I)使其濃度分別 為1000 IU/mL和100ng/mL，置37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0024] (6)步驟(5)的細胞培養(yǎng)24小時后，在培養(yǎng)的細胞中，加入500ng/mL抗人CD3單克隆 抗體(Biolegend公司）和1000IU/mL重組人IL-2(Peprotech公司），置37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱 中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細胞。CIK細胞鑒定方法:細胞數(shù)量擴增，⑶3+CD56+雙陽性標 志細胞數(shù)量升高，殺傷腫瘤細胞能力增強(非MHC限制性）。
[0025]其中，單個核細胞中加入γ -IFN和化合物（I)，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第1天），光鏡 觀察發(fā)現(xiàn)，細胞活化透亮，折光性強。在單個核細胞中加入抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞聚集，并且有很多小集落開始形成，細 胞明顯增大。
[0026] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細胞傳代。按照1份CIK細胞原液，加入3份含1000IU/mL重 組人IL-2的完全培養(yǎng)基。同時，取樣檢測CIK細胞擴增倍數(shù)，流式細胞儀檢測⑶3、⑶56、⑶4、 CD8陽性細胞數(shù)，檢測CIK細胞殺傷K562腫瘤細胞活性。
[0027] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天終 止培養(yǎng)。以上方法均在嚴格無菌環(huán)境內(nèi)進行。
[0028] 其中，在誘導(dǎo)第7天時，肉眼下即可觀察到白色斑點，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細胞集落明 顯增多、增大，大集落成黑團，看不清細胞形態(tài)，周邊游離細胞飽滿折光性好，大小形態(tài)各 異。
[0029] 二、按照以上方法進行誘導(dǎo)制備CIK細胞的相應(yīng)檢測結(jié)果
[0030] 1、檢測CIK細胞擴增倍數(shù)
[0031] 檢測方法為：按IX IO6單個核細胞/孔，接種在24孔板內(nèi)，按照上述方法進行誘導(dǎo) 制備CIK細胞和細胞換液，第7天開始換成25平方厘米細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，對誘導(dǎo)的第0、4、7、 10、13、16、19天，取ImL樣本，通過血細胞計數(shù)儀（日本光電公司，MEK-6410P)，進行CIK細胞 擴增倍數(shù)檢測，取5次試驗結(jié)果的平均值，繪制生長曲線。從生長曲線可以看出，CIK細胞在 誘導(dǎo)培養(yǎng)的第4天開始增值，第7天到第16天進入快速增長期，16天后增殖速度趨緩，第19天 CIK細胞最高增殖632倍，最低281倍，平均增殖472.2倍。
[0032] 2、CIK細胞的殺傷K562腫瘤細胞活性的檢測
[0033]患者外周血單個核細胞誘導(dǎo)制備的CIK細胞的殺傷K562腫瘤細胞活性的檢測方法 為:取對數(shù)生長的K562腫瘤細胞，用含有體積百分比為10%FBS的頂DM培養(yǎng)液，調(diào)整細胞數(shù) 為5 X 104/mL，每孔IOOyU鋪于96孔板中，每組設(shè)4個復(fù)孔。取第7、10、13、16、19天CIK細胞， 及未經(jīng)培養(yǎng)的單個核細胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整誘導(dǎo)的CIK細胞數(shù)為I X 106/mL，取IOOyL加入 96孔板中，效靶比（即CIK細胞:K562腫瘤細胞)20:1，設(shè)空白對照組、效應(yīng)細胞對照組和靶細 胞對照組，置37 °C、5 %CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時后，加入20yL CCK-8(日本同仁化學(xué)研究所 產(chǎn)品），繼續(xù)孵育5小時，顯黃色，采用Thermofisher公司mult iscanFC酶聯(lián)儀，雙波長，參比 波長620mm、檢測波長450mm檢測OD值。取4次試驗結(jié)果的平均值，繪制殺傷率曲線。
[0034]殺傷率的計算公式為:殺傷率（％ ) = [ 1 -(效靶細胞組OD值-效應(yīng)細胞組OD值)/(靶 細胞組OD值-空白對照組OD值）]X 100 %。其中，
[0035] 效靶細胞組OD值為：CIK細胞和K562靶細胞組檢測的波長450nm0D值一波長 620nm0D 值。
[0036] 效應(yīng)細胞組OD值為:單純CIK細胞檢測的波長450nm0D值一波長620nm0D值。
[0037] 靶細胞組OD值為:K562靶細胞組檢測的波長450nm0D值一波長620nm0D值。
[0038]空白對照組0D值為：完全培養(yǎng)基和10 % FBS的IMDM培養(yǎng)液混合后，檢測的波長 450nm0D 值一波長620nm0D 值。
[0039] 從殺傷率曲線可知，單個核細胞經(jīng)過1-19天的誘導(dǎo)，第7天，CIK細胞殺傷靶細胞 K562活性最高，平均達96.3%，此后逐步下降，第19天最低，平均83%。
[0040] 3、流式細胞儀進行誘導(dǎo)的CIK細胞檢測
[0041] 采用流式細胞儀(BD公司FACS Calibur)，對誘導(dǎo)前的外周血單個核細胞和誘導(dǎo)后 的第19天進行⑶3、⑶4、⑶8、⑶3CD56檢測。結(jié)果:誘導(dǎo)CIK細胞前，外周血單個核細胞的⑶3+ 為52 · 84%，CD4+為36 · 58%，CD8+為24 · 98 %，CD3+CD56+為 1 · 35 % ;誘導(dǎo)CIK細胞的第 19天， CD3+為98 · 91 %，CD4+為 1 · 56 %，CD8+為91 · 37 %，CD3+CD56+為63 · 72 %。
[0042] 4、CIK細胞表型測定
[0043] 用pH7.4的I XI3BS調(diào)整細胞密度至I X IOfVmL，加入到流式細胞檢測管中，200yL/ 管，分別加入不同熒光標記的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗體(BD公司），置 暗處，4°C標記20分鐘，ρΗ7.4的I X PBS洗滌2次，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，1 %甲醛固定后， 用流式細胞儀檢測。取5次試驗結(jié)果的平均值，結(jié)果見表1。從表1可以看出，隨著誘導(dǎo)時間的 延長，CIK主要效應(yīng)細胞CD3 + CD56 +雙陽性細胞所占比例大幅上升，第19天達到均數(shù)為 58.8%，范圍為52·3%-65·3%。
[0044] 表1單個核細胞誘導(dǎo)CIK細胞表型的變化(X土S，％ )
[0046]實施例2: CIK細胞的誘導(dǎo)制備
[0047] (1)取患者外周血30mL加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液（Invitrogen公司），充分混 勻。
[0048] (2)將步驟（1)獲得的倍比稀釋的外周血60mL，加入到30mL淋巴細胞分離液(上海 華精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破壞界面），以1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心20 分鐘，取中間層一富含淋巴細胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細胞進行細胞計數(shù) 及苔盼蘭活細胞計數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細胞達99 %。
[0049] (3)將步驟(2)獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心7分鐘，棄上 清液，沉淀為單個核細胞。
[0050] (4)加入完全培養(yǎng)基，細胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個核細胞濃度為I X 106/mL。 [00511 (5)按照I X IO6AiL細胞，加入γ -IFN(Pepr0teCh公司）和化合物（I)使其濃度分別 為500IU/mL和80ng/mL，置37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0052] (6)步驟(5)的細胞培養(yǎng)20小時后，在培養(yǎng)的細胞中，加入50ng/mL抗人CD3單克隆 抗體(Biolegend公司）和500IU/mL重組人IL-2(Peprotech公司），置37°C、5 %CO2培養(yǎng)箱中， 繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細胞。CIK細胞鑒定方法:細胞數(shù)量擴增，⑶3+⑶56+雙陽性標志 細胞數(shù)量升高，殺傷腫瘤細胞能力增強(非MHC限制性）。
[0053]其中，單個核細胞中加入γ -IFN和化合物（I)，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第1天），光鏡 觀察發(fā)現(xiàn)，細胞活化透亮，折光性強。在單個核細胞中加入抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞聚集，并且有很多小集落開始形成，細 胞明顯增大。
[0054] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細胞傳代。按照1份CIK細胞原液，加入3份含500 IU/mL重組 人IL-2的完全培養(yǎng)基。同時，取樣檢測CIK細胞擴增倍數(shù)，流式細胞儀檢測⑶3、⑶56、CD4、 CD8陽性細胞數(shù)，檢測CIK細胞殺傷K562腫瘤細胞活性。
[0055] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天終 止培養(yǎng)。以上方法均在嚴格無菌環(huán)境內(nèi)進行。
[0056] 本實施例獲得CIK細胞具有和實施例1近似的生物學(xué)性質(zhì)和生物活性。
[0057]實施例3: CIK細胞的誘導(dǎo)制備和檢測
[0058] (1)取患者外周血30mL加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液（Invitrogen公司），充分混 勻。
[0059] (2)將步驟（1)獲得的倍比稀釋的外周血60mL，加入到30mL淋巴細胞分離液(上海 華精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破壞界面），以2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15 分鐘，取中間層一富含淋巴細胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細胞進行細胞計數(shù) 及苔盼蘭活細胞計數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細胞達99 %。
[0060] (3)將步驟(2)獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心7分鐘，棄上 清液，沉淀為單個核細胞。
[0061 ] (4)加入完全培養(yǎng)基，細胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個核細胞濃度為I X IO6AiL。 [0062] (5)按照I X IO6AiL細胞，加入γ -IFN(Pepr〇teCh公司）和化合物（I)使其濃度分別 為2000IU/mL和120ng/mL，置37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0063] (6)步驟(5)的細胞培養(yǎng)28小時后，在培養(yǎng)的細胞中，加入1000ng/mL抗人CD3單克 隆抗體(Biolegend 公司）和 2000IU/mL 重組人 IL-2(Peprotech 公司），置 37°C、5%C02 培養(yǎng)箱 中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細胞。CIK細胞鑒定方法:細胞數(shù)量擴增，⑶3+CD56+雙陽性標 志細胞數(shù)量升高，殺傷腫瘤細胞能力增強(非MHC限制性）。
[0064]其中，單個核細胞中加入γ -IFN和化合物（I)，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第1天），光鏡 觀察發(fā)現(xiàn)，細胞活化透亮，折光性強。在單個核細胞中加入抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞聚集，并且有很多小集落開始形成，細 胞明顯增大。
[0065] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細胞傳代。按照1份CIK細胞原液，加入3份含2000IU/mL重 組人IL-2和300IU/mL重組人IL-I的完全培養(yǎng)基。同時，取樣檢測CIK細胞擴增倍數(shù)，流式細 胞儀檢測⑶3、⑶56、⑶4、⑶8陽性細胞數(shù)，檢測CIK細胞殺傷K562腫瘤細胞活性。
[0066] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天終 止培養(yǎng)。以上方法均在嚴格無菌環(huán)境內(nèi)進行。
[0067] 本實施例獲得CIK細胞具有和實施例1近似的生物學(xué)性質(zhì)和生物活性。
[0068] 實施例4:實施例1的對比實例，不添加化合物(I)
[0069] (1)取患者外周血30mL加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液（Invitrogen公司），充分混 勻。
[0070] (2)將步驟（1)獲得的倍比稀釋的外周血60mL，加入到30mL淋巴細胞分離液(上海 華精生物高科技有限公司）（比重1.077)的界面上(不要破壞界面），以2000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20 分鐘，取中間層一富含淋巴細胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細胞進行細胞計數(shù) 及苔盼蘭活細胞計數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細胞達99 %。
[0071 ] (3)將步驟(2)獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄 上清液，沉淀為單個核細胞。
[0072] (4)加入完全培養(yǎng)基，細胞計數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個核細胞濃度為I X 106/mL。
[0073] (5)按照IXlOfVmL細胞，加入 y-IFN(Peprotech公司）使其濃度為 1000IU/mL，置 37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0074] (6)步驟(5)的細胞培養(yǎng)24小時后，在培養(yǎng)的細胞中，加入500ng/mL抗人CD3單克隆 抗體(Biolegend公司）和1000IU/mL重組人IL-2(Peprotech公司），置37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱 中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細胞。其中，單個核細胞中加入γ -IFN，經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘 導(dǎo)第1天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞折光性一般。在單個核細胞中加入抗人CD3單克隆抗體和重 組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時后(誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細胞有一定程度的聚集，零零散散 有小集落開始形成，細胞略有增大。
[0075] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細胞傳代。按照1份CIK細胞原液，加入3份含1000IU/mL重 組人IL-2的完全培養(yǎng)基。同時，取樣檢測CIK細胞擴增倍數(shù)，流式細胞儀檢測⑶3、⑶56、⑶4、 CD8陽性細胞數(shù)，檢測CIK細胞殺傷K562腫瘤細胞活性。
[0076] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天終 止培養(yǎng)。以上方法均在嚴格無菌環(huán)境內(nèi)進行。
[0077] 該實施例制備的CIK細胞的相應(yīng)檢測結(jié)果表明：
[0078] (I)CIK細胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第4天開始增值，第7天到第16天進入快速增長期，16天 后增殖速度趨緩，第19天CIK細胞最高增殖313倍，最低35倍，平均增殖174倍，顯著低于實施 例1制備方法制備的CIK細胞。
[0079] (2)單個核細胞經(jīng)過1-19天的誘導(dǎo)，第7天，CIK細胞殺傷靶細胞K562活性最高，平 均達54.1 % (范圍54.1 ±3.3%)，此后逐步下降，第19天最低，平均36% (范圍36±7.5%)， 對靶細胞K562的殺傷率明顯不及實施例1。
[0080] (3)采用流式細胞儀(BD公司FACS Calibur)，對誘導(dǎo)前的外周血單個核細胞和誘 導(dǎo)后的第19天進行003、004、008、0030056檢測。結(jié)果:誘導(dǎo)(：11(細胞前，外周血單個核細胞的 CD3+為52.84%，CD4+為36.58%，CD8+為24.98%，CD3+CD56 +為 1.35% ;誘導(dǎo)CIK細胞的第 19 天，CD3+為68 · 81 %，CD4+為2 · 03%，CD8+為44 · 77%，CD3+CD56+為22 · 54%，顯著不及實施例 1。 [0081 ] (4)用pH7 · 4的I XI3BS調(diào)整細胞密度至I X IO6AiL，加入到流式細胞檢測管中，200μ L/管，分別加入不同熒光標記的抗人CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-PE抗體(BD公司）， 置暗處，4°C標記20分鐘，ρΗ7.4的I XI3BS洗滌2次，1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，1 %甲醛固定 后，用流式細胞儀檢測。結(jié)果表明隨著誘導(dǎo)時間的延長，CIK主要效應(yīng)細胞CD3+CD56+雙陽性 細胞所占比例上升不明顯。
[0082]對比實施例4和實施例1可發(fā)現(xiàn)，化合物（I)可協(xié)同γ干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生高純度、高增 殖力、高細胞毒活性的CIK細胞。
[0083]上述實例中，收集外周血的單個核細胞部分的方法也可以為:采用COBE Spectra 型血細胞分離機(Gambro BC公司）上的淋巴細胞采集程序，單采正常人外周血單個核細胞 30mL〇
[0084]實施例5:化合物(I)的分離制備和結(jié)構(gòu)確證
[0085]分離方法：（a)將酸棗仁(2kg)粉碎，用70%乙醇熱回流提?。?5LX 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用DlOl型大孔樹脂除雜，先用20%乙醇洗脫9個柱體積，再用65%乙醇洗脫 10個柱體積，收集65%洗脫液，減壓濃縮得65%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中65%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為65:1 (9個柱體積）、35:1 (10個柱體積）、15:1 (8 個柱體積)和7:1(8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4 用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為12:1(6個柱體積）、7:1(7個柱體積)和1:1(6個柱 體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為58 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集11~15個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)(純度大于98% )
[0086] 結(jié)構(gòu)確證:HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z 219.1564,結(jié)合核磁特征可得分子式為 C15H22O，不飽和度為5。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ΡΡπι，CDCl 3，500MHz):Η-2α(2.56，ddd，J = 14.4， 8·4,6·0Ηζ)，Η-2β(1·88，πι)，Η-3α(2·23，πι)，Η-3β(1·99，πι)，Η-6α(2·21，πι)，Η-6β(1·89，πι)， H-7a(1.44，m)，H-8a(1.79，m)，H-80(1.78，m)，H-9a(1.56，m)，H-90(1.97，m)，H-12(1.15， 8)，!1-13(1.45,8)，!1-14(1.18,8)，!1-15(1.87,8) ;核磁共振碳譜數(shù)據(jù)心（卯111，〇0(：13， 125MHz):92.7(C，1-C)，29.6(CH2,2-C)，37.3(CH2,3-C)，125.3(C，4-C)，136.5(C，5-C)，35.2 (CH2,6-C)，36.4(CH，7-C)，38.1(CH2,8-C)，26.7(CH2,9-C)，76.9(C，10-C)，75.3(C，11-C)， 28.5(CH 3，12-C)，30.5(CH3，13-C)，25.8(CH3，14-C)，34.5(CH3，15-C)?；衔锏臍渥V中顯示 該化合物有四個單峰甲基信號(知1.15,1.45,1.18和1.87)。該化合物的碳譜顯示15個碳信 號，其中有一組雙鍵碳信號，以及三個連氧碳信號。綜合高分辨質(zhì)譜以及核磁數(shù)據(jù)，該化合 物可能為一個倍半萜類化合物。HMBC譜中，H-15/C-5，H-15/C-4，H-3/C-4以及H-3/C-5的相 關(guān)信號說明C-5和C-4位之間為雙鍵。根據(jù)核磁數(shù)據(jù)可知C-I位連有一個羥基，C-IO和C-Il通 過氧橋連接。HMBC 譜中，H-15 與 C-5、C-4 和 C-3，H-14 與 C-10、C-9 和 C-l，H-6 與 C-7、C-8 和 C-4， H-12和H-13與C-7和C-Il的相關(guān)性驗證了上述推論。因此，該化合物是一個C-HKC-Il位形 成氧橋的愈創(chuàng)木烷型倍半萜。NOE差譜試驗中照射H-7可以發(fā)現(xiàn)H-14有明顯增益，表明C-IO 和C-Il位的氧橋為β構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁 數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值 基本一致。
[0087] 該化合物化學(xué)式及碳原子編號如下：
[0088]
：〇
[0089]上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性CIK細胞，其特征在于，通過如下步驟制 備：（1)取患者外周血，收集外周血的單個核細胞部分；（2)將步驟（1)收集的外周血的單個 核細胞部分離心，棄去上清液，獲得單個核細胞；（3)取單個核細胞按照1 X 106/mL細胞，加 入含500~2000IU/mLy干擾素和80~120ng/mL如下結(jié)構(gòu)所示化合物（I)的完全培養(yǎng)基，開 始誘導(dǎo)培養(yǎng);其中，完全培養(yǎng)基，包括含體積百分比為10%FBS的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液；（4) 步驟（3)的細胞培養(yǎng)20~28小時后，加入50~1000ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500~ 2000IU/mL重組人IL-2,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)的時 間為13~21天，獲得高細胞毒活性CIK細胞;化合物(I)結(jié)構(gòu)為：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高細胞毒活性CIK細胞，其特征在于，步驟(1)所述收集外周血 的單個核細胞部分的方法為：（a)患者外周血中，加入1~1.5倍體積的不含血清的細胞培養(yǎng) 液或pH7.2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；其中，細胞培養(yǎng)液包括:RPMI1640培養(yǎng)液和頂DM培養(yǎng) 液；（b)將步驟(a)獲得的血液稀釋液加入到淋巴細胞分離液的界面上；（c)1500~2500轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心15~20分鐘，收集中間層，獲得單個核細胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性CIK細胞，其特征在 于，步驟(1)中所述收集外周血的單個核細胞部分的方法為：患者經(jīng)采用血細胞分離機上的 淋巴細胞采集程序，單采集患者的外周血單個核細胞。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性CIK細胞，其特征在 于:步驟⑵中，離心的轉(zhuǎn)速為1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為7~10分鐘。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性CIK細胞，其特征在 于:步驟(4)所述繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2~3天用含500~2000IU/mL重組人IL-2的完全培養(yǎng)基或 含500~2000IU/mL重組人IL-2和100~500IU/mL重組人IL-1的完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備高細胞毒活性的CIK細胞中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1-5任一所述的用于腫瘤細胞免疫治療的高細胞毒活性CIK細胞在制備抗 腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/0783GK105861436SQ201610339156
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月21日
【發(fā)明人】楊浩
【申請人】楊浩