專利名稱：細菌核糖體核糖核酸體外擴增－基因芯片的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種細菌核糖體核糖核酸體外擴增—基因芯片。
細菌感染是臨床上常見疾病，敗血癥是其典型的代表，早期診斷非常重要，可大大降低死亡率和并發(fā)癥。目前臨床上用于細菌鑒定的常用方法有血培養(yǎng)，免疫學和血清學檢測等。血培養(yǎng)需時長，培養(yǎng)陽性率低，而免疫學及血清學檢測敏感性及特異性均低。因此，臨床上缺乏一種快速、準確地診斷細菌感染的方法，給臨床的早期診斷帶來了困難。近幾年來，隨著分子診斷技術的發(fā)展和應用，感染性疾病的診斷也由傳統(tǒng)的表型特征的鑒定發(fā)展到分子水平的分析。PCR技術是近幾年來發(fā)展起來的一項分子生物學技術，為臨床提供了早期、快速、敏感的檢測手段。但一般PCR通常只檢測特定病原體，在病原體未明時，需用多種不同引物對不同的病原微生物進行PCR擴增，費時費力，使臨床檢測病原菌的PCR技術的應用受到限制。
本實用新型的目的是提供一種細菌核糖體核糖核酸體外擴增—基因芯片。
為了達到上述目的本實用新型采取下列措施細菌核糖體核糖核酸體外擴增—基因芯片，它是在固相載體上設有如下探針1)universal bacterial probe2)Gram-positve universal probe3)Gram-negative probe14)Gram-negative probe25)Bacteroides-Flavobacterium probe6)Haemophilus species probe7)Streptococcus pneumoniae probe8)Escherichia coil-enteric bacterium probe9)Listeria monocytogenes probe10)Streptococcus agalactiae probe11)Neisseria meningitidis probe12)Bacillus probe13)Corynebacterium probe14)Propionibacterium probe
15)Coagulase-negative Staphylococcus probeI16)Coagulase-negative Staphylococcus probeII17)Staphylococcus aureus probe本實用新型的優(yōu)點1)快速rRNA基因PCR擴增只需2小時，基因芯片，雜交也僅6～8小時，而常規(guī)的血培養(yǎng)至少3～5天?？s短了診斷時間。
2)特異rRNA基因分子生物學方法只檢出是否細菌等原核生物感染，與真菌、病毒及人基因組DNA無交叉反應。
3)敏感rRNA基因PCR最小檢出量達10-12g，相當于3個細菌，血培養(yǎng)需100個細菌以上，且只能檢出在常規(guī)培養(yǎng)基中能生長的細菌，對于需特殊培養(yǎng)(如L型細菌)，厭氧(如厭氧菌)，難以培養(yǎng)(如結核菌)或無法培養(yǎng)的細菌(如放線菌)，則只能用rRNA基因PCR解決。
4)準確rRNA基因PCR—基因芯片不僅能診斷細菌感染，還可區(qū)分系G+/G-感染，指導臨床用藥，并進一步設計對特異細菌的探針，制作芯片，診斷系何種細菌感染。
5)實用可檢測在正常情況下無菌的任何體液，包括血、腦脊液、腹水、胸水等，可診斷敗血癥，菌血癥，化膿性腦膜炎，結核性腦膜炎、胸膜炎、腹膜炎、肝硬化腹水等感染。
以下結合附圖
作詳細說明附圖是細菌核糖體核糖核酸體外擴增—基因芯片的結構示意圖。
細菌核糖體核糖核酸(ribosomal RNA，rRNA)按沉降系數(shù)分為3種，分別是5S、16S、23S rRNA。rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的染色體基因中。除細菌外，也存在于衣原體、支原體、立克次氏體、螺旋體、放線菌等原核生物中，但不存在于非原核生物如病毒、真菌等的體內。它的內部結構由保守區(qū)及可變區(qū)兩部分組成，保守區(qū)在長期的進化過程中，因不時突變在不同細菌間存在較大差異，兩者互相交替排列。
在保守區(qū)設計共同引物PCR進行PCR擴增—檢測細菌存在與否(PCR技術)。
在可變區(qū)設計探針(通用探針、革蘭氏陽性(G+)，革蘭氏陰性(G-)探針—區(qū)分細菌G+/G-菌(雜交，反相雜交)。在可變區(qū)設計針對特定細菌的探針，檢測特異細菌[(SSCP(單鏈構象多態(tài)性)，RFLP(限制性片段長度分析)，基因芯片等]。
本實用新型的制作方法1)引物5’端生物素修飾。采用β-氰乙基磷酸酰胺法將5’-Amino-link合成到引物5’端并純化。
2)寡核苷酸探針末端加尾采用TdT末端加尾法。
3)芯片陣列的設計及芯片制備。陣列設計采用計算機輔助設計，芯片材料采用玻璃片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜、凝膠或雜交膜，這些材料已被國外普遍采用并證明可行。低密度芯片制備采用探針合成后再用TLC點樣儀點于片基上的方法，探針連接采用氨基化探針與環(huán)氧活化的玻璃片共價或生物素—親和素非共價結合的方法。
權利要求1.一種細菌核糖體核糖核酸體外擴增一基因芯片，其特征在于在固相載體上設有如下探針1)universal bacterial probe2)Gram-positve universal probe3)Gram-negative probe14)Gram-negative probe25)Bacteroides-Flavobacterium probe6)Haemophilus species probe7)Streptococcus pneumoniae probe8)Escherichia coil-enteric bacterium probe9)Listeria monocytogenes probe10)Streptococcus agalactiae probe11)Neisseria meningitidis probe12)Bacillus probe13)Corynebacterium probe14)Propionibacterium probe15)Coagulase-negative Staphylococcus probe I16)Coagulase-negative Staphylococcus probe II17)Staphylococcus aureus probe
2.根據(jù)權利要求1所述的一種細菌核糖體核糖核酸體外擴增—基因芯片，其特征在于所說的固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜、凝膠。
專利摘要本實用新型公開了一種細菌核糖體核糖核酸體外擴增一基因芯片。它在固相載體上設有如下:1)universalbacterial probe,2)Gram-positve universal probe,3)Gram-negativeprobe 1,4)Gram-negative probe 2,5)Bacteroides-Flavobacteriumprobe,6)Haemophilus species probe,7)Streptococcuspneumoniae probe,8)Escherichia coli-enteric bacteriumprobe,9)Listeria monocytogenes probe等17種探針。本實用新型具有快速、特異、敏感、準確、實用等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK2474542SQ99256260

公開日2002年1月30日 申請日期1999年12月17日 優(yōu)先權日1999年12月17日
發(fā)明者尚世強, 俞錫林, 趙正言 申請人:浙江大學