專利名稱：一種制備β－內(nèi)酰胺抗生素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景本發(fā)明涉及了一種制備β-內(nèi)酰胺抗生素的方法。
β-內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素類和頭孢菌素類抗生素均含有很多化合物，且有它們各自的活性特點(diǎn)。通常，β-內(nèi)酰胺抗生素含有一個(gè)母核，即所謂β-內(nèi)酰胺母核，該母核以其初級(jí)氨基基團(tuán)通過(guò)一個(gè)線性酰胺鍵與所謂的側(cè)鏈連接。
β-內(nèi)酰胺母核在半合成青霉素和頭孢菌素抗生素的制備過(guò)程中是一種非常重要的中間體。這些半合成青霉素類和頭孢菌素類的制備路線大多是從發(fā)酵產(chǎn)物如青霉素G、青霉素V和頭孢菌素C開(kāi)始，它們可轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的β-內(nèi)酰胺母核，例如K.Matsumoto在Bioprocess.Techn.(1993,16:67-88)、J.G.Shewale和H.Sivaraman在生物化學(xué)方法(Process Biochemistry,1989,8月146-154)、T.A.Savidge在工業(yè)抗生素的生物技術(shù)Biotechnology of Industrial Antibiotics)E.J.Vandamme編)Marcel Dekker(紐約，1984)或J.G.Shewale等在國(guó)際生物化學(xué)方法(Process Biochemistry International,1990,6月97-103)中所公開(kāi)的一種方法。
被用作好幾種抗生素前體物質(zhì)的β-內(nèi)酰胺母核的實(shí)例有6-氨基青霉烷酸(penicillanic acid)(6-APA)、7-氨基頭孢烷酸(cephalosporanic acid)(7-ACA)、3-氯-7-氨基去乙酸基去甲基頭孢烷酸(7-ACCA)、7-氨基去乙?；^孢烷酸(7-ADAC)和7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(7-ADCA)。
β-內(nèi)酰胺母核通過(guò)偶聯(lián)一個(gè)合適的側(cè)鏈而轉(zhuǎn)化成預(yù)期的抗生素，如除了其它之外的EP0 339 751、JP53005185和CH 640 240中所述。通過(guò)側(cè)鏈和β-內(nèi)酰胺母核的不同組合，可以獲得許多不同的青霉素類和頭孢菌素類抗生素，它們均有其各自的活性特點(diǎn)。
例如，D-(-)-苯基甘氨酸或其合適的衍生物(如一種酰胺或酯)可以被結(jié)合到7-ACA、7-ACCA、7-ADCA和6-APA的任何一種上而分別形成頭孢菌素Ⅲ、頭孢克羅、頭孢氨芐或氨芐西林。其它經(jīng)?？捎米鱾?cè)鏈的例子有D-(-)-4-羥基苯基甘氨酸、2-氰基乙酸和2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧基亞氨基乙酸。
已知酶促制備β-內(nèi)酰胺抗生素的方法均涉及β-內(nèi)酰胺母核的制備及隨之將其偶連到一種合適的側(cè)鏈上。可參考的酶促合成方法有T.A.Savidge，工業(yè)抗生素生物技術(shù)(E.J.Vandamme編)Marcel Dekker，紐約1984；J.G.Shewale等人，國(guó)際生物化學(xué)方法，1990 6月97-103；E.J.Vandamme，應(yīng)用微生物學(xué)進(jìn)展(Advances in AppliedMicrobiology),21,(1977),89-123和E.J.Vandamme,EnzymeMicrob.Technol.,5,(1983):403-416。另外，在EP0 532 341、EP0 540 210、WO93/08287、WO95/04148和WO95/04149中也公開(kāi)一些新的路線，這些路線報(bào)道了7-ADCA和7-ACA的直接發(fā)酵生產(chǎn)。
這些方法的一個(gè)缺點(diǎn)是側(cè)鏈的偶連反應(yīng)起始于β-內(nèi)酰胺母核，而該母核必須在偶連反應(yīng)之前就被分離。在分離β-內(nèi)酰胺母核時(shí)通常應(yīng)用結(jié)晶的方法進(jìn)行，這可損失高達(dá)10％的理論產(chǎn)量。由于β-內(nèi)酰胺母核的兩性特點(diǎn)，它易溶于任意pH值的水溶性體系中，因而所產(chǎn)的β-內(nèi)酰胺母核有大部分損失在結(jié)晶母液中。
本發(fā)明克服了上述缺點(diǎn)，即引入側(cè)鏈的反應(yīng)中起始于一種不同的物質(zhì)而非β-內(nèi)酰胺母核。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種制備β-內(nèi)酰胺抗生素的方法，其中引入側(cè)鏈的反應(yīng)中起始于一種不同的物質(zhì)而非β-內(nèi)酰胺母核。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種制備β-內(nèi)酰胺抗生素的方法，該方法可以很方便地與已知起始于一些發(fā)酵產(chǎn)物如青霉素G或頭孢菌素C的酶促方法組合起來(lái)。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供一種制備β-內(nèi)酰胺抗生素的方法，該方法是一種清潔、有效、經(jīng)濟(jì)易行的方法，換句話說(shuō)，該方法不導(dǎo)致廢水問(wèn)題或涉及昂貴的化學(xué)物質(zhì)。
上述目標(biāo)的要求能在一種制備β-內(nèi)酰胺抗生素的方法中得以滿足，其中N-取代的β-內(nèi)酰胺，有如分子式(Ⅰ)所示的通式結(jié)構(gòu)
其中R0是H或C1-3烷氧基；Y是CH2、O、S或是S的一種氧化形式；Z是
其中R1是H，羥基，鹵素，C1-3烷氧基，選擇性地取代的選擇性地含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的、飽和或不飽和的、支鏈或直鏈的C1-5烷基，優(yōu)選地是甲基，選擇性地取代的、選擇性地含一個(gè)或多個(gè)雜原子的C5-8環(huán)烷基，選擇性地取代的芳基或芳雜環(huán)，或選擇性地取代的芐基；且X是(CH2)m-A-(CH2)n，其中m和n相同或不同，且應(yīng)為0、1、2、3或4的整數(shù)之一，且A是CH=CH、C≡C、CHB、C=O、選擇性地取代的N、O、S或S的選擇性地氧化形式，同時(shí)B是H、鹵素、羥基、C1-3烷氧基或選擇性地取代的甲基，或者該N-取代的β-內(nèi)酰胺的一種鹽的形式，其與至少一種二羧酸?；D(zhuǎn)移酶或其同工酶接觸，在至少一種青霉素?；D(zhuǎn)移酶或其同工酶存在下與一種前體物質(zhì)反應(yīng)以得到β-內(nèi)酰胺抗生素的一種側(cè)鏈。
令人驚奇的是，通過(guò)β-內(nèi)酰胺抗生素側(cè)鏈的引入可有效地制備β-內(nèi)酰胺類抗生素。引入側(cè)鏈的反應(yīng)是從一種N-取代的β-內(nèi)酰胺開(kāi)始的，且應(yīng)用了兩種具有不同底物的酶。本發(fā)明方法中在應(yīng)用第二個(gè)酶之前不需要回收中間產(chǎn)物，即第一個(gè)酶促反應(yīng)的產(chǎn)物。
因?yàn)镹-取代的β-內(nèi)酰胺也可從發(fā)酵產(chǎn)物中獲得，如青霉素G、青霉素V、頭孢菌素C、己二?；?7-ADCA、3-羧基乙基硫代丙?；?7-ADCA、2-羧基乙基硫代乙?；?7-ADCA、3-羧基乙基硫代丙?；?7-ADCA、己二酰基-7-ACA、3-羧基乙基硫代丙酰基-7-ACA、2-羧基乙基硫代乙?；?7-ACA和3-羧基乙基硫代丙?；?7-ACA，本發(fā)明的一個(gè)較大優(yōu)點(diǎn)在于可以通過(guò)酶促反應(yīng)從這些發(fā)酵產(chǎn)物開(kāi)始制備β-內(nèi)酰胺抗生素，而不必分離β-內(nèi)酰胺母核中間體，這樣的分離會(huì)損失大量發(fā)酵產(chǎn)物。
如本發(fā)明的方法是一種潔凈的且高度特異性的方法。這意味著沒(méi)有或幾乎沒(méi)有副產(chǎn)物產(chǎn)生因而不會(huì)導(dǎo)致廢水和/或純化問(wèn)題。而且，如本發(fā)明的方法不需要應(yīng)用復(fù)雜而昂貴的試劑，因?yàn)橥ǔ＿@些試劑具有敏感性而很難處理。
令人驚奇的是，在如本發(fā)明的方法中沒(méi)有發(fā)生明顯的酶抑制效應(yīng)。直到現(xiàn)在，人們?nèi)匀徽J(rèn)為由于一種酶抑制效應(yīng)，在制備β-內(nèi)酰胺抗生素時(shí)使用一種或兩種酶以轉(zhuǎn)移?；遣豢赡艿?。在?；D(zhuǎn)移反應(yīng)過(guò)程中通常認(rèn)為可形成苯基乙酸或苯氧乙酸，這些酸對(duì)特定的酶來(lái)說(shuō)是抑制劑，如U.Schomer等人在應(yīng)用和環(huán)境微生物學(xué)(Applied and EnvironmentMicobiology),(2,1984:307-312)和A.L.Margolin等人在Biochim.Biophys.Acta,(1980),616:283-289中所述。
如本發(fā)明的方法中起始物質(zhì)是N-取代的β-內(nèi)酰胺，其具有如分子式(Ⅰ)所示的通式結(jié)構(gòu)或其鹽形式。在上面分子式(Ⅰ)各種符號(hào)定義中，S的一種氧化形式是指這樣一些基團(tuán)，如氧化硫和砜。通過(guò)選擇性的取代烷基、環(huán)烷基、芳香基、芳雜環(huán)和芐基，這樣含有如從1-3個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)被取代的基團(tuán)被制備。選擇性取代的氮原子包括伯、仲和叔氨基基團(tuán)，其可被如從1～3個(gè)碳原子的烷基取代。選擇性取代的甲基包括一個(gè)甲基和各種取代了的甲基基團(tuán)如-CHpDq，其中D是一種鹵素，且p和q是加和等于3的整數(shù)。
期望分子式(Ⅰ)包含N-取代的β-內(nèi)酰胺，而這些N-取代的β-內(nèi)酰胺是基于任何一種公開(kāi)于“頭孢菌素和青霉素，化學(xué)和生物學(xué)”，E.H.Flynn編，Academic出版社，1972,151-166和“β-內(nèi)酰胺有機(jī)化學(xué)”，G.I.Georg編，VCH,1992,89-96中的β-內(nèi)酰胺母核，此處引入作為參考。起始物優(yōu)選的是這樣一些物質(zhì)，其中R1是CH2-E或CH=CH-E基團(tuán)，其中E是H，羥基，鹵素，C1-3烷氧基，選擇性地取代的、選擇性地含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的、飽和或不飽和的、支鏈或直鏈的C1-5烷基，選擇性地取代的、選擇性地含一個(gè)或多個(gè)雜原子的C5-8環(huán)烷基，選擇性地取代的芳基或芳雜環(huán)，或選擇性地取代的芐基。
作為N-取代的β-內(nèi)酰胺起始物質(zhì)的合適的鹽包括任何無(wú)毒性的鹽，如一種堿金屬鹽(如鈉或鉀)，一種堿土金屬鹽(如鈣或鎂)，一種銨鹽，或一種有機(jī)堿鹽(如三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、二環(huán)己基胺，N,N’-二芐基二乙烯基二胺)。
具有分子式(Ⅰ)所示通式的作為N-取代的β-內(nèi)酰胺的起始物質(zhì)可以通過(guò)酶促反應(yīng)來(lái)制備，如在EP0 532 341、WO95/04148或WO95/04149中公開(kāi)的一種方法所述。優(yōu)選的起始物為N-戊二?；-琥珀?；?、N-己二?；-3-(羧甲基硫代)丙?；?、N-反式-β-氫化己二烯二?；?、N-庚二?；騈-3,3’-硫代二丙?；?內(nèi)酰胺或其鹽的形式。這樣一些基于二羧酸的起始物質(zhì)可以被那些本發(fā)明中所用的酶有效地轉(zhuǎn)化。
更優(yōu)選的起始物質(zhì)是N-取代的6-氨基青霉烷酸(6-APA)、N-取代的7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)、N-取代的3-氯-7-氨基去乙酸基去甲基頭孢烷酸(7-ACCA)、N-取代的7-氨基去乙?；^孢烷酸(7-ADAC)或N-取代的7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(7-ADCA)，這些N-取代的β-內(nèi)酰胺可產(chǎn)生最具有活性的β-內(nèi)酰胺抗生素。
在根據(jù)本發(fā)明方法中與N-取代的β-內(nèi)酰胺接觸的一種合適的二羧酸?；D(zhuǎn)移酶是一種從許多天然產(chǎn)生的微生物(如真菌和細(xì)菌)中分離獲得的酶?？梢酝ㄟ^(guò)監(jiān)測(cè)一些合適底物的水解情況來(lái)篩選這樣的具有期望的二羧酸特異性的酶的微生物。這樣一些合適底物可以是如一些發(fā)色團(tuán)，如琥珀?；?、戊二?；?或己二?；?對(duì)-硝基苯胺。相應(yīng)的N-取代的β-內(nèi)酰胺水解也可以用作鑒別所需要的酶。已發(fā)現(xiàn)這些酶所依賴的適宜pH范圍在約是6(優(yōu)選的約是7)到約是9(優(yōu)選的約是8)之間。
已發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生二羧酸?；D(zhuǎn)移酶的生物有產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)，節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)，無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)，黑曲霉屬(Aspergillus)，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。尤其是下列微生物種類可以產(chǎn)生極為合適的二羧酸酰基轉(zhuǎn)移酶木糖氧化產(chǎn)堿菌(Achromobacter xylosooxidans)，粘節(jié)桿菌(Arthrobacter viscosis)，節(jié)桿菌CA128，芽孢桿菌CA78，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)ATCC53667，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus laterosporus)J1，擬青霉(Paecilomyces)C2106，缺陷假單胞菌(Pseudomonas diminuta)N176，缺陷假單胞菌V22，少動(dòng)假單胞菌(Pseudomonas paucimobilis)，缺陷假單胞菌BL072，假單胞菌菌株C427，假單胞菌SE83，假單胞菌SE495，卵狀假單胞菌(Pseudomonasovalis)ATCC950，叢毛單胞菌屬(Comamonas sp)SY77，假單胞菌GK16，假單孢菌SY-77-1，假單胞菌A14，泡囊假單胞菌(Pseudomonasvesicularis)B965，丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)，惡臭假單胞菌(Ps putida)ATCC17390，銅綠假單胞菌(Ps aeroginosa)NCTC10701，普通變形菌(Proteus vulgaris)ATCC9634，莓實(shí)假單胞菌(Ps fragi)DSM3881和枯草芽孢桿菌(B.Subtilus)IFO3025。
可以任何合適的方式從這些微生物中獲得二羧酸?；D(zhuǎn)移酶，例如如在US4,774,179中所述從假單胞菌SE83菌株獲取該酶的方法。一些酶如SE83或SY77二羧酸?；D(zhuǎn)移酶的基因可以表達(dá)在不同的適宜的宿主中，如大腸桿菌(E.coli)。如Matsuda等人在細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriology),1987,169:5818-5820中和US5,457,032分別對(duì)SE83菌株SY77菌株所述。
從上述來(lái)源分離獲得的酶通常稱作戊二?；；D(zhuǎn)移酶。但是該酶的側(cè)鏈特異性并不局限于戊二酰基側(cè)鏈，而也可適用于更小和更大的二羧酸側(cè)鏈。一些二羧酸?；D(zhuǎn)移酶也表達(dá)出γ-戊二?；D(zhuǎn)肽酶活性，故而它們有時(shí)也被歸于γ-戊二?；D(zhuǎn)肽酶類。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，一種合適的與N-取代的β-內(nèi)酰胺接觸的合適的青霉素?；D(zhuǎn)移酶是一種從許多天然產(chǎn)生的微生物(如真菌和細(xì)菌)中分離獲得的酶。在類似于期望的一種二羧酸酰基轉(zhuǎn)移酶的監(jiān)測(cè)測(cè)試中可篩選到產(chǎn)生期望的特異性的酶的微生物。這些酶所存在的適宜PH范圍約是4(優(yōu)選的約是5)到約是7(優(yōu)選的約是6)之間。
已發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生青霉素?；D(zhuǎn)移酶的微生物有醋桿菌屬(Acetobacter)，氣單胞菌屬(Aeromonas)，產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)，芽孢桿菌屬，頭孢屬(Cephalosporium)，埃希氏菌屬(Escherichia)，Aphanocladium，黃桿菌屬(Flavobacterium)，克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)，不動(dòng)菌屬(Mycoplana)，精朊桿菌屬(Protaminobacter)，普羅威登斯菌屬(Providentia)，假單胞菌屬或黃單胞菌屬(Xanthomonas)等種類。從Acetobacter pasteurioanum，糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)、大腸桿菌、雷氏普羅威登斯菌(Providentia rettgeri)和柑橘黃單胞菌(Xanthomonas citrii)中獲得的酶已經(jīng)證明適用于本發(fā)明的方法。文獻(xiàn)中青霉素?；D(zhuǎn)移酶也被認(rèn)為是青霉素酰胺酶。
二羧酸?；D(zhuǎn)移酶和青霉素?；D(zhuǎn)移酶不但可以游離酶形式應(yīng)用，而且適用于任何固定化酶形式，例如已在EP0 222 462和WO97/04086中描述。進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法時(shí)，兩種酶可以固定化在一種載體上，也可以固定化在不同的載體上。另外，可以應(yīng)用一種或兩種酶的同工酶，其中這些酶的性質(zhì)如pH依賴性、熱穩(wěn)定性或特異性活性可因?yàn)榛瘜W(xué)修飾或交聯(lián)而被影響，但在本發(fā)明方法所涉及的酶中，它們的活性盡管在數(shù)量上發(fā)生了改變，但在本質(zhì)上并沒(méi)有發(fā)生顯著改變。同樣，可以應(yīng)用同工酶如可以通過(guò)經(jīng)典的方法或DNA重組方法獲得的一些突變體或其它一些衍生物，酶生物活性部分或雜合體。作為本領(lǐng)域技術(shù)人員普通知識(shí)的一部分，在有些情況下本發(fā)明方法可有益地進(jìn)行化學(xué)或其它修飾。
在如本發(fā)明的方法中，用于制備β-內(nèi)酰胺抗生素側(cè)鏈的前體物質(zhì)可以是任何能被上述青霉素?；D(zhuǎn)移酶所識(shí)別的化合物，并且這些化合物可導(dǎo)致產(chǎn)生該類β-內(nèi)酰胺抗生素。優(yōu)選地，所用底物選自下述基團(tuán)D-(-)-苯基甘氨酸，D-(-)-4-羥基苯基甘氨酸，D-(-)-2,5-二氫化苯基甘氨酸，2-噻吩基乙酸，2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧基亞氨基乙酸，α-(4-吡啶基硫代)乙酸，3-噻吩丙二酸或2-氰基乙酸及它們的衍生物，因?yàn)橛蛇@些底物產(chǎn)生具有高度活性的β-內(nèi)酰胺抗生素。這些底物的合適衍生物是酯或酰胺，其中側(cè)鏈分子是通過(guò)一種酯或酰胺鍵連接到一個(gè)C1-C3的烷基基團(tuán)上。
在如本發(fā)明的方法中，二羧酸?；D(zhuǎn)移酶、β-內(nèi)酰胺抗生素側(cè)鏈前體物質(zhì)和青霉素?；D(zhuǎn)移酶可以一起或分別添加到N-取代的β-內(nèi)酰胺起始物質(zhì)中。優(yōu)選地，這些酶一起添加到N-取代的β-內(nèi)酰胺和其側(cè)鏈前體物質(zhì)中。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用了一種對(duì)那些一次或兩次出現(xiàn)在反應(yīng)混合物中的任何中間體都不需進(jìn)行分離和/或純化的方法。這樣就沒(méi)有產(chǎn)物在分離或純化過(guò)程中損失。
在本發(fā)明的一個(gè)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用了一種所謂的“一罐法”(one-pot process)。所謂“一罐法”是指整個(gè)操作過(guò)程都在一個(gè)反應(yīng)罐中完成的方法。換言之，根據(jù)本發(fā)明方法，基本上大多數(shù)反應(yīng)物都沒(méi)有在任何按本發(fā)明的方法進(jìn)行的反應(yīng)過(guò)程中被移出反應(yīng)罐之外。這種實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
如本發(fā)明的方法中所應(yīng)用的條件取決于許多參數(shù)，特別是反應(yīng)物種類、反應(yīng)物濃度、反應(yīng)時(shí)間、滴定劑、溫度、pH、酶濃度和酶的形態(tài)。如果是要使用特定的二羧酸酰基轉(zhuǎn)移酶和青霉素?；D(zhuǎn)移酶將特定的N-取代β-內(nèi)酰胺轉(zhuǎn)化成特定的β-內(nèi)酰胺抗生素，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以恰當(dāng)?shù)剡x擇優(yōu)化的反應(yīng)條件。
然而，在本發(fā)明方法中已發(fā)現(xiàn)最適反應(yīng)溫度在0-80℃之間，優(yōu)選地在10-50℃之間。依本發(fā)明制備β-內(nèi)酰胺抗生素的最適pH值在4.5-9.0之間。基于這一點(diǎn)，我們需注意高度優(yōu)選如本發(fā)明的方法在水溶液體系中進(jìn)行，因此可克服導(dǎo)致廢液?jiǎn)栴}的有機(jī)溶劑的使用。而且，已經(jīng)證明二羧酸?；D(zhuǎn)移酶和青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶在水溶性體系中催化該轉(zhuǎn)化反應(yīng)最有效。
通常，在每步中每公斤反應(yīng)混合物中反應(yīng)試劑的量范圍在0.01(優(yōu)選地為0.5)和3摩爾(優(yōu)選地為2摩爾)之間。
選擇合適的酶濃度使總反應(yīng)時(shí)間不超過(guò)4小時(shí)。要使10毫摩爾底物在1小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，大概需要用500-3000個(gè)酶反應(yīng)單位，其中一個(gè)酶反應(yīng)單位定義為在實(shí)際操作的條件下1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1微摩爾底物成為產(chǎn)物所需要的酶量。通常，為在1小時(shí)轉(zhuǎn)化特定數(shù)量的底物，酶濃度優(yōu)選地為50-300KU/mol之間。然而，為彌補(bǔ)在反應(yīng)過(guò)程中所損失的活性通常應(yīng)用超大劑量的酶。
合適的滴定劑是無(wú)機(jī)酸和無(wú)機(jī)堿，如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化銨等，或有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、琥珀酸、己二酸、戊二酸等。根據(jù)反應(yīng)的規(guī)模和滴定劑的溶解性，滴定劑濃度在0.01-8M之間變化。
當(dāng)然本發(fā)明也包括通過(guò)上述公開(kāi)的方法獲得的一種β-內(nèi)酰胺抗生素。
現(xiàn)在通過(guò)下述非限制性的實(shí)施例來(lái)闡述本發(fā)明。
實(shí)施例定義和方法酶活性青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶活性的定義如下一個(gè)單位(U)對(duì)應(yīng)于在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘水解1微摩爾青霉素G所需的酶量，標(biāo)準(zhǔn)條件是指100g/l青霉素G鉀鹽，0.05M磷酸鉀緩沖液，pH8.0,28℃。
權(quán)利要求
1．一種制備β-內(nèi)酰胺抗生素的方法，其中一種N-取代的β-內(nèi)酰胺具有如分子式(Ⅰ)所示的通式結(jié)構(gòu)
其中R0是H或C1-3烷氧基；Y是CH2、O、S、或S的一種氧化形式；Z是
其中，R1是H，羥基，鹵素，C1-3烷氧基，選擇性地取代的、選擇性地含有一個(gè)或多個(gè)雜原子、飽和或不飽和的、支鏈或直鏈的C1-5烷基，優(yōu)選為甲基，選擇性地取代的、選擇性地含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的C5-8環(huán)烷基，選擇性地取代的芳基或芳雜環(huán)，或選擇性地取代的芐基；且X是(CH2)m-A-(CH2)n，其中m和n相同或不同，且應(yīng)為0、1、2、3或4的整數(shù)之一，且A是CH=CH、C≡C、CHB、C=O、選擇性地取代的N、O、S或S的選擇性地氧化形式，同時(shí)B是H、鹵素、羥基、C1-3烷氧基或選擇性地取代的甲基，或者該N-取代的β-內(nèi)酰胺的鹽的形式，其與至少一種二羧酸?；D(zhuǎn)移酶或其同工酶接觸，并且在至少一種青霉素?；D(zhuǎn)移酶或其同工酶存在下與一種前體物質(zhì)反應(yīng)以得到β-內(nèi)酰胺抗生素的一種側(cè)鏈。
2．如權(quán)利要求1的一種方法，其中沒(méi)有中間體產(chǎn)物被分離和/或純化。
3．如權(quán)利要求2的一種方法，該方法按“一罐法”進(jìn)行。
4．如上述任何一個(gè)權(quán)利要求的一種方法，其中該N-取代的β-內(nèi)酰胺為N-戊二酰基、N-琥珀酰基、N-己二?；-3-(羧甲基硫代)丙?；-反式-β-氫化己二烯二?；?、N-庚二酰基或N-3,3’-硫代二丙?；?內(nèi)酰胺，或這些物質(zhì)的鹽的形式。
5．如上述任何一個(gè)權(quán)利要求的一種方法，其中該N-取代的β-內(nèi)酰胺為N-取代的6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)、3-氯-7-氨基去乙酸基去甲基頭孢烷酸(7-ACCA)、7-氨基去乙?；^孢烷酸(7-ADAC)、7-氨基去乙酸基頭孢烷酸(7-ADCA)，或者它們的鹽的形式。
6．如上述任何一個(gè)權(quán)利要求的一種方法，其中該β-內(nèi)酰胺抗生素的側(cè)鏈前體物質(zhì)為D-(-)-苯基甘氨酸、D-(-)-4-羥基苯基甘氨酸、D-(-)-2,5-二氫化苯基甘氨酸、2-噻吩基乙酸、2-(2-氨基-4-噻唑基)-2-甲氧基亞氨基乙酸、α-(4-吡啶基硫代)乙酸、3-噻吩丙二酸或2-氰基乙酸，或者它們的酰胺或酯的形式。
7．如上述任何一個(gè)權(quán)利要求的一種方法，其中二羧酸?；D(zhuǎn)移酶獲自產(chǎn)堿菌屬、節(jié)桿菌屬、無(wú)色桿菌屬、黑曲霉屬、不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬或假單胞菌屬的菌株。
8．如上述任何一個(gè)權(quán)利要求的一種方法，其中青霉素?；D(zhuǎn)移酶獲自醋桿菌屬、氣單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、Aphanocladium、芽孢桿菌屬、頭孢屬、埃希氏菌屬、黃桿菌屬、克呂沃爾氏菌屬、不動(dòng)菌屬、精朊桿菌屬、普羅威登斯菌屬、假單胞菌屬或黃單胞菌屬的菌株。
9．如上述任何一個(gè)權(quán)利要求的一種方法，其中通過(guò)一種酶學(xué)方法由一種發(fā)酵產(chǎn)物起始得到該N-取代的β-內(nèi)酰胺。
10．如權(quán)利要求9的一種方法，其中發(fā)酵產(chǎn)物可以是青霉素G、青霉素V、頭孢菌素C、己二?；?7-ADCA、3-羧基乙基硫代丙?；?7-ADCA、2-羧基乙基硫代乙酰基-7-ADCA和3-羧基乙基硫代丙?；?7-ADCA、己二?；?7-ACA、3-羧基乙基硫代丙?；?7ACA，2-羧基乙基硫代乙酰基-7-ACA和3-羧基乙基硫代丙酰基-7-ACA。
11．二羧酸酰基轉(zhuǎn)移酶和青霉素?；D(zhuǎn)移酶使一種N-取代的β-內(nèi)酰胺轉(zhuǎn)化為一種β-內(nèi)酰胺抗生素的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備β－內(nèi)酰胺抗生素的方法,其中一種N－取代的β－內(nèi)酰胺具有如分子式(Ⅰ)所示的通式結(jié)構(gòu),其中R
文檔編號(hào)C12P37/02GK1224471SQ98800522
公開(kāi)日1999年7月28日 申請(qǐng)日期1998年4月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月22日
發(fā)明者T·范德多斯, E·德弗魯姆, J·C·卡普 申請(qǐng)人:吉斯特-布羅卡迪斯有限公司