一種從富含多糖多酚類的植物材料中提取rna的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種植物RNA的提取方法。該方法是將植物材料在液氮中充分研磨至粉末狀后加入提取buffer A，充分反應(yīng)后，加入提取buffer B，混勻反應(yīng)后用異丙醇沉淀分離出RNA，最后用乙醇洗滌并溶于RNase-free的水中。本發(fā)明方法不需使用DEPC，無須昂貴的提取試劑盒，不需使用酚、氯仿等有毒的刺激性試劑，而且操作簡便易行，提取時(shí)間短，全程不超過30分鐘，所提RNA與試劑盒相比完整性好，濃度更高。更適合用TRIZOL一般提不出來的多酚類植物的RNA提取。所提取的RNA純度、濃度足以用于RNA反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR和Nothern blot雜交實(shí)驗(yàn)。
【專利說明】-種從富含多糖多齡類的植物材料中提取RNA的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從富含多糖多酷類的植物材料中提取 RNA的方法，特別涉及一種利用新的提取液配方快速、簡便地從富含多糖多酷類的植物的葉 片、根、莖、花、果實(shí)、種子中提取RNA的新方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 從植物組織中提取RNA是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。要進(jìn)行 Ncxrthern雜交分析，純化mRNA W用于體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分 子生物學(xué)研究，都需要高質(zhì)量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順 利進(jìn)行上述研究的關(guān)鍵所在。
[0003] 從文獻(xiàn)報(bào)道上看，有許多富含多糖多酷類的植物就是由于未能有效地分離純化其 組織中的RNA，而阻礙了其分子生物學(xué)方面研究的進(jìn)展。一般認(rèn)為在該些植物組織中，或 富含酷類化合物，或富含多糖，或含有某些尚無法確定的次級(jí)代謝產(chǎn)物，或RNase的活性較 高。在完整的細(xì)胞內(nèi)該些物質(zhì)在空間上與核酸是分離的，但當(dāng)組織被研磨，細(xì)胞破碎后，該 些物質(zhì)就會(huì)與RNA相互作用。酷類化合物被氧化后會(huì)與RNA不可逆地結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性 喪失及在用苯酷、氯仿抽提時(shí)RNA的丟失，或形成不溶性復(fù)合物；而多糖會(huì)形成難溶的膠狀 物，與RNA共沉淀下來；聰類化合物和RNase會(huì)分別造成RNA的化學(xué)降解和酶解。對(duì)于該些 植物材料，用常規(guī)的RNA提取方法（如脈法、苯酷法和十六焼基H甲基漠化胺法等）難W提 取出其RNA。如L 6 pez-G 6 mez等在用常規(guī)的方法提取芒果果實(shí)的RNA時(shí)未能成功，他們 的結(jié)果分為H種情況；提出的RNA已被降解；RNA的得率很低；得到的RNA不能進(jìn)行體外翻 譯。他們認(rèn)為在果實(shí)成熟時(shí)各種酶的活性增強(qiáng)，其中也包含RNase,不溶性的淀粉轉(zhuǎn)化為可 溶性的多糖，芒果果實(shí)細(xì)胞壁中特殊的成份，W及果實(shí)中高含量的多酷化合物都是干擾RNA 提取的因素。Tesniere等在用苯酷法和脈法提取葡萄果實(shí)的RNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)RNA與某種未知 化合物凝聚成不溶性的復(fù)合物，并且該種未知化合物在230nm和270nm處有強(qiáng)的光吸收，從 而干擾了 RNA紫外吸收的測(cè)定。因此能否有效地去除多糖、酷類化合物、和RNase干擾是提 取高質(zhì)量植物RNA成敗的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速簡便的從富含 多糖多酷類的植物材料中提取RNA的方法。該方法不需使用DEPC，無須昂貴的提取試劑盒， 不需使用酷、氯仿等有毒的刺激性試劑，而且操作簡便易行，提取時(shí)間短，全程不超過30分 鐘，所提RNA完整性好，濃度高。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種從富含多糖多酷類的植物材料中提取RNA的方法，包括W下操作步驟：
[0007] (1)取富含多糖多酷類的植物材料0. 5?Ig,放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研鉢中，加入液氮 充分研磨至粉末狀，加入500 y L?1000 y L提取bufferA，旋潤振蕩后，室溫條件下平放；
[0008] (2)再加入150?300 Ji L提取bufferB，充分顛倒混勻；離也，轉(zhuǎn)移上清至另一離 也管中；
[0009] (3)向上清中加入上清0.7?1.0倍體積的異丙醇，充分混勻；離也，棄上清，保留 沉淀；
[0010] (4)沉淀用 500 ?1000 y L 含 20ug/ml面asel 的水（RNase-free)溶解，37°C處理 5 ?IOmin ;
[0011] (5)重復(fù)步驟（3)，所得沉淀用800 y L?1000 y L體積百分比濃度70 %的己醇洗 涂，用移液器吸去多余的己醇，室溫干燥，得到RNA沉淀；
[001引 做用30 y L TE溶液（RNase-free)溶解所得的RNA沉淀，于-2(TC保存，備用； [001引 所述提取bufferA由W下組分組成；IOOmM的抑值為8. 0的Tris-肥1，50mM的pH 值為 8. 0 的邸TA, 500mM 的 NaCl，W及每 IOOml bufferA 中含有 2 克 SDS，每 IOOml bufferA 中含有2mie-琉基己醇；
[0014] 所述提取buffer B為濃度為5M的醋酸鐘（KAC)。
[0015] 步驟（2)所述提取buffer B在使用之前于4攝氏度保存。
[0016] 步驟（1)所述旋潤振蕩的時(shí)間為20?30砂；所述平放的時(shí)間為5?lOmin。
[0017] 步驟（2)所述混勻的時(shí)間為20?30砂；所述離也是W 10000?120(K)巧m的轉(zhuǎn)速 離也5?lOmin。
[001引 步驟（3)所述離也是W 10000?1200化pm的轉(zhuǎn)速離也5?lOmin。
[001引步驟妨所述洗涂的次數(shù)為2?3次；所述室溫干燥的時(shí)間為5?lOmin。
[0020] 所述富含多糖多酷類的植物材料包括花生、蝴蝶蘭、大蕉香蕉等蕉類、蘋果、巧 橘、、禮桃、李子、葡萄、棉花、草霉、龍眼、慕枝、番茄果實(shí)、茄子、楊樹、擬南芥種子、玻蘿蜜、 馬蹄金、早熟禾、高羊茅、云杉、松樹、紫極、花揪、白禪、山毛棒、海棠花、械械、紫羅蘭、毛爪 草、下香、月季、天竺葵、仙客來、菊花、牽牛花、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉格等。
[0021] 為了使提取過程最為穩(wěn)定和高效，本發(fā)明方法中的W下步驟十分關(guān)鍵：
[002引 （1)為保證所提取的RNA的得率，在材料處理上，要求材料的起始量不少于0. 5克， 不多于1克，（材料過少影響RNA總量，材料過多影響RNA得率）并在步驟（1)中作到充分 研磨至粉末狀，并充分旋潤振蕩。
[0023] (2)為保證所提取的RNA的完整度，要求材料取出后立刻放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研鉢 中，并在研磨過程中注意加入液氮保持材料粉末處于凍干狀態(tài)，避免液化。
[0024] (3)為了保證所提取的RNA的純度，要求在步驟（2)中加入提取buffer B后充分 顛倒混勻，在轉(zhuǎn)移上清液時(shí)注意勿帶出沉淀雜質(zhì)。
[00巧]本發(fā)明的工作原理：
[0026]將富含多糖多酷類的植物材料在液氮中充分研磨的基礎(chǔ)上結(jié)合使用高濃度SDS， 使植物細(xì)胞有效破碎，并有效地使核蛋白復(fù)合體變性；高濃度的目-琉基己醇和十二焼基 賴酸軸的聯(lián)合使用，促使核蛋白復(fù)合體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液 中；而低抑值的高鹽溶液5M Kac使RNA與變性的蛋白質(zhì)分離，再用異丙醇沉淀；異丙醇沉 淀核酸時(shí)，由于500ml化Cl及SMKac等高濃度鹽的存在，使大量多糖存在于溶液中，從而可 達(dá)到去多糖的作用；接著采用面asel溶液處理純化RNA，并用異丙醇進(jìn)行二次沉淀，隨后用 己醇洗涂沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，從而獲得純凈完整的高濃度總RNA ; 本發(fā)明中采用的目-琉基己醇是著名的RNA酶抑制劑加上整個(gè)操作都在液氮中進(jìn)行，能顯 著抑制RNA的降解，并防止多酷的褐變；另外50mM邸TA也在一定程度上抑制了核酸水解酶 的作用。
[0027] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有的技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0028] (1)本發(fā)明方法不需要DEPC等處理，無須昂貴的提取試劑盒，不需使用酷、氯仿等 有毒的刺激性試劑，更適合多酷類植物的RNA提取，如，花生、香蕉、蘋果等用TRIZ化一般提 不出來的富含多糖多酷類的植物的RNA提??；
[0029] (2)本發(fā)明方法操作簡便易行，提取時(shí)間短，全程不超過30分鐘，所提RNA與試劑 盒相比完整性好，濃度更高，足W用于RNA反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR和Nothern blot雜交實(shí)驗(yàn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明富含多糖多酷類的植物RNA的提取方法分別用于提取不同植物不同 組織器官的總RNA的電泳圖，其中l(wèi)ane a為蝴蝶蘭總RNA，Lane b為香蕉莖總RNA，lane C 為花生芙果總RNA，lane d為采用Qiagen RNA Mini Kit提取的蝴蝶蘭葉片RNA，lane e為 采用 Qiagen RNA Mini Kit 提取的香蕉莖 RNA，lane f 為采用 Qiagen RNA Mini Kit 提取 的花生芙果RNA。
[003。 圖2為本發(fā)明植物RNA的提取方法提取的香蕉莖總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到的CDM 圖，其中Lane a為香蕉莖總RNA反轉(zhuǎn)錄所得dscDNA，采用TaKaRa RNAPCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，Lane b Marker,從上至下條帶大小分別為；5K, 3K, 2K,化,0. 75K, 0. 5K, 0. 25K. 0.化。
[0032] 圖3為W采用本發(fā)明富含多糖多酷類的植物RNA的提取方法提取的花生芙果總 RNA為模板，W AMRPR10基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中M:DL2000 DNA Marker ;lane 1為無RNA模板的陰性對(duì)照；lane 2為W含ARAhPRlO基因序列的質(zhì)粒DNA為 模板的陽性對(duì)照；lane 3為W所提RNA為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出的AhARPRlO基因編碼區(qū)序 列。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于 此。
[0034] 實(shí)施例1 ;蝴蝶蘭葉片總RNA的提取
[00巧](1)取新鮮的蝴蝶蘭葉片Ig,放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研鉢中，加入液氮充分研磨至 粉末狀，立即加入IOOOy L提取bufferA，旋潤振蕩30砂后，室溫平放IOmin ;所述提取 bufferA由W下組分組成：
[0036] pH 化.為 8.0 約 Tris-HCl IOOmM pH 伯;為 8,0 的 EDTA SOmM NaCI SOOmM SDS 2% (w/v,化巧于2克SDS溶解巧I嘶mlbii瓶rA中） 雜基藝醇 2% (v/v,輛巧于2mlP-琉基乙醇溶解在IOOm化UfferA中）
[0037] (2)再加入300 U L buffe巧(4攝氏度保存），充分顛倒混勻30砂，12000巧m離也 5min，轉(zhuǎn)移上清到另一離也管中；所述提取buffer B為濃度為5M的KAC(醋酸鐘）；
[003引 做向上清中加入上清1倍體積的異丙醇，充分混勻，1200化pm離也5min，棄上清， 保留沉淀；
[0039] (4)沉淀用 1000 U L 含 20ug/ml面asel 的水（RNase-free)溶解，37°C 處理 10 分 鐘；
[0040] (5)重復(fù)步驟（3)，所得沉淀用1000 y L體積百分比濃度70 %己醇洗涂兩次，用移 液器吸去多余的己醇，室溫干燥3分鐘；
[00川 （6)用30U1TE溶液（RNase-free)溶解所得的RNA沉淀，得到RNA溶液，于-2(TC 保存，備用。另吸取化IRNA溶液，進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖Ia所示。
[0042] 為了將本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果與常規(guī)RNA提取方法進(jìn)行比較，本發(fā)明人同時(shí)采 用了 Qiagen RNA Mini Kit對(duì)W上H種植物材料RNA進(jìn)行提取，具體方法是，分別取蝴蝶蘭 葉片、香蕉莖、花生芙果材料各0. 5g，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研鉢中，加入液氮充分研磨至粉末 狀，立即按照Qiagen RNA Mini Kit方法進(jìn)行提取，結(jié)果如圖1中d-f所示。
[004引從圖1可W看出，采用本發(fā)明所提取的蝴蝶蘭葉片RNA電泳條帶明亮，清晰，無因 RNA降解而形成的彌散條帶，而且RNA得率高，明顯優(yōu)于采用QiagenRNA Mini Kit試劑盒提 取的蝴蝶蘭葉片RNA (圖Id)
[0044] 實(shí)施例2 ;香蕉莖總RNA提取用于RNA反轉(zhuǎn)錄
[0045] (1)選取新鮮而且生長狀況良好的香蕉莖〇.5g，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研鉢中，加入 液氮充分研磨至粉末狀，立即加入SOOul提取bufferA，旋潤振蕩20砂后，室溫平放5min ;
[0046] 所述提取bufferA由W下組分組成：
[0047] pH 値為 8.0 的 Tris-HCl IOOmM pH 值為 8.0 的 EDTA SOmM NaCl SWmM SDS 2% (w/v，相當(dāng)T- 2克SDS溶解布1㈱m化UfiferA中） P -琉摧乙醇 2?/〇 (v/v，相當(dāng)子2樹! P -琉鞋乙Il溶解巧I㈱m化uflferA中）
[0048] (2)再加入150 U L buffe巧(4攝氏度保存），充分顛倒混勻20砂，12000巧m離也 lOmin，轉(zhuǎn)移上清到另一離也管中；所述提取buffer B為濃度為5M的KAC(醋酸鐘）；
[0049] (3)向上清中加入上清0. 7倍體積的異丙醇，充分混勻，12000巧m離也5min，棄上 清，保留沉淀；
[0050] (4)沉淀用 500 y L 含 20ug/ml面asel 的水（RNase-free)溶解，37°C 處理 5 分鐘；
[0051] (5)重復(fù)步驟（3)，所得沉淀用800 y L體積百分比濃度70 %己醇洗涂兩次，用移液 器吸去多余的己醇，室溫干燥3分鐘；
[0052] (6)用30U1TE溶液（RNase-free)溶解所得的RNA沉淀，得到RNA溶液，于-2(TC 保存，備用。
[0053] 取5 U 1 RNA溶液，采用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，女口 圖1及圖2所示。從圖1中的b可W看出，采用本發(fā)明所提取的RNA電泳條帶明亮，清晰， 無因RNA降解而形成的彌散條帶，而且RNA得率高，明顯優(yōu)于采用Qiagen RNA Mini Kit試 劑盒提取的香蕉莖RNA(圖1中的e所示）。從圖2可見，使用本發(fā)明方法提取的RNA進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄后，得到了高質(zhì)量的cDNA，從而再次證明本發(fā)明方法提供的RNA完全能夠滿足進(jìn)行 一下步分子生物學(xué)研究的要求。
[0054] 實(shí)施例3 ;花生芙果總RNA提取用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)
[005引 （1)選取新鮮而且生長狀況良好的花生嫩芙果，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研鉢中，加入液 氮充分研磨至粉末狀，立即加入750ul提取bufferA，旋潤振蕩25砂后，室溫平放7. 5min ;
[0056] 所述提取bufferA由W下組分組成：
[0057] pH 化;為 8.0 的 Tris-HCI IOOmM pH fit為 8.0 的 EDTA SOmM
[0058] NaCI SOOmM SDS 2% (w/v,巧嗎于 2 克 SDS 濟(jì)解化 IOOmlbufferA 中） P -II基乙醇 2% (v/v,袖叫于2m!目-琉基乙醇溶解在IOOm化UfiferA中）
[0059] (2)再加入150 U L buffe巧(4攝氏度保存），充分顛倒混勻25砂，12000巧m離也 7. 5min，轉(zhuǎn)移上清到另一離也管中；所述提取buffer B為濃度為5M的KAC(醋酸鐘）
[0060] 做向上清中加入上清0. 8倍體積的異丙醇，充分混勻，12000巧m離也5min，棄上 清，保留沉淀；
[0061] (4)沉淀用 750y L 含 20ug/ml 面 asel 的水（RNase-free)溶解，37°C 處理 7. 5 分 鐘；
[006引 妨重復(fù)步驟（3)，所得沉淀用900 y L體積百分比濃度70 %己醇洗涂兩次，用移液 器吸去多余的己醇，室溫干燥3分鐘；
[006引 （6)用30ulTE溶液（RNase-free)溶解所得的RNA沉淀；，得到RNA溶液，于-2(TC 保存，備用。
[0064] 分別W花生ARAhPRlO基因序列設(shè)計(jì)正義引物；5' -ATGTTCCCAGGC A
[0065] CCACT-3,，反義引物；5, -CTCTGGTGGTGCTACACCT-3,；并吸取 2 y 1 RNA 溶液，采用 PrimeScript? One St巧RT-PCR Kit Ver. 2進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，所得花生芙果總RNA如圖1 中的C所示，RT-PCR結(jié)果如圖3所示。從圖1中的C可W看出，采用本發(fā)明所提取的花生 芙果RNA電泳條帶明亮，清晰，無因RNA降解而形成的彌散條帶，而且RNA得率高，明顯優(yōu)于 采用Qiagen RNA Mini Kit試劑盒提取的花生芙果RNA(圖1中的f)。從圖3可見，使用本 發(fā)明方法提取的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到了高特異性的目的ARAhPRlO基因片段，如圖3 中l(wèi)ane3所示，從而再次證明本發(fā)明方法提供的RNA完全能夠滿足進(jìn)行RT-PCR等分子生物 學(xué)研究的要求。
[0066] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種從富含多糖多酚類的植物材料中提取RNA的方法，其特征在于包括以下操作步 驟： (1) 取富含多糖多酚類的植物材料0. 5?lg，放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分 研磨至粉末狀，加入500 ii L?1000 ii L提取bufferA，旋渦振蕩后，室溫條件下平放； (2) 再加入150?300 y L提取bufferB，充分顛倒混勻；離心，轉(zhuǎn)移上清至另一離心管 中； (3) 向上清中加入上清0.7?1.0倍體積的異丙醇，充分混勻；離心，棄上清，保留沉 淀； (4) 沉淀用 500 ?1000 ii L 含 20ug/mlDNaseI 的水溶解，37°C處理 5 ?lOmin ; (5) 重復(fù)步驟（3)，所得沉淀用800 y L?1000 y L體積百分比濃度70 %的乙醇洗漆，用 移液器吸去多余的乙醇，室溫干燥，得到RNA沉淀； (6) 用30 y L TE溶液溶解所得的RNA沉淀，于-20°C保存，備用； 所述提取bufferA由以下組分組成：100mM的pH值為8. 0的Tris-HCl，50mM的pH值 為 8. 0 的 EDTA，500mM 的 NaCl，以及每 100ml bufferA 中含有 2 克 SDS，每 100ml bufferA 中含有2ml0-巰基乙醇； 所述提取buffer B為濃度為5M的醋酸鉀。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從富含多糖多酚類的植物材料中提取RNA的方法，其特 征在于：步驟（2)所述提取buffer B在使用之前于4攝氏度保存。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從富含多糖多酚類的植物材料中提取RNA的方法，其特 征在于：步驟（1)所述旋渦振蕩的時(shí)間為20?30秒；所述平放的時(shí)間為5?lOmin。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從富含多糖多酚類的植物材料中提取RNA的方法，其特 征在于：步驟（2)所述混勻的時(shí)間為20?30秒；所述離心是以10000?12000rpm的轉(zhuǎn)速 離心5?lOmin。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從富含多糖多酚類的植物材料中提取RNA的方法，其特 征在于：步驟（3)所述離心是以10000?12000rpm的轉(zhuǎn)速離心5?lOmin。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從富含多糖多酚類的植物材料中提取RNA的方法，其特 征在于：步驟（5)所述洗滌的次數(shù)為2?3次；所述室溫干燥的時(shí)間為5?lOmin。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104357439SQ201410710291
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】劉海燕, 梁炫強(qiáng) 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所