專利名稱：：從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取總rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取和純化總RNA的方法。
背景技術(shù)：
：RNA的提取是分子生物學(xué)的基本內(nèi)容之一，高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行基因克隆、基因表達(dá)、基因功能分析等研究的必要前提。RT-PCR、Northern、real-timePCR、cDNA文庫構(gòu)建等分子生物學(xué)研究的開展首先必須獲得純度高、完整性好的總RNA。植物組織特別是高等植物組織細(xì)胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性，使得植物組織RNA的提取比其他生物材料更加困難。對(duì)于梨屬、柑橘屬、中草藥的多種植物而言，分離純化組織中的RNA難度較大，因而嚴(yán)重阻礙了其分子生物學(xué)研究的進(jìn)展。富含酚類化合物和多糖類物質(zhì)，或含有大量己知和尚未確定的次生代謝產(chǎn)物，或內(nèi)源RNase含量較高是這些植物RNA提取的主要障礙。很多植物組織含有大量的多酚和多糖類物質(zhì)，酚類化合物在勻漿時(shí)極易被氧化成醌類物質(zhì)，與RNA不可逆地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA相似，在提取過程中能與RNA共沉淀，很難將他們分開。在植物果實(shí)的發(fā)育過程中，包括RNase在內(nèi)的各種水解酶大量積累，同時(shí)富集多種次生代謝物質(zhì)。這些都會(huì)嚴(yán)重影響到RNA提取的質(zhì)量和數(shù)量。目前，已經(jīng)發(fā)展了許多RNA的提取方法，如異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(一步法)、十二垸基硫酸鈉(SodiumDodecylSulfate，SDS)法、十六烷基三甲基溴化銨(CetyltrimethylammoniumBromide,CTAB)法和熱硼酸法等。這些方法中核心試劑分別為異硫氰酸胍、SDS、CTAB和硼酸。異硫氰酸胍能迅速破碎細(xì)胞，作為強(qiáng)變性劑使核酸-蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并有效解離核蛋白與核酸的復(fù)合體，最終釋放出核酸。SDS是一種離子去污劑，能從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖。CTAB作為離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使RNA游離出來。熱硼酸法的原理是將硼酸緩沖體系、蛋白酶K消化蛋白和LiCl選擇性沉淀RNA等步驟偶聯(lián)在一起。各種總RNA提取方法的步驟基本相似，首先徹底破碎植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，接著使核蛋白復(fù)合體中的蛋白質(zhì)充分變性，實(shí)現(xiàn)核蛋白與核酸的分離；同時(shí)抑制內(nèi)源和外源RNA酶的活性，防止RNA多糖等物質(zhì)分離，最后檢測(cè)RNA的質(zhì)量。Qiagen公司的RNeasyPlantMiniKit和Invitrogen公司的Trizol是提取植物RNA的最常用試劑盒，對(duì)于擬南芥、煙草、水稻等模式植物，使用總RNA提取試劑盒方便快捷。然而對(duì)于富含多糖多酚類物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)的植物而言，RNeasyPlantMiniKit和Trizol等試劑盒不能有效地分離和純化其總RNA。近年來，有關(guān)從富含多糖多酚類物質(zhì)和次生代謝物質(zhì)植物中抽提RNA的方法己有較多的報(bào)道。Hu等(AsimpleprotocolforRNAisolationfromfruittreescontaininghighlevelsofpolysaccharidesandpolyphenolcompounds.PlantMolecularBiologyReporter,2002,20:69a-69§)報(bào)道用改良的CTAB法從蘋果、桃和獼猴桃的果實(shí)中提取總RNA。張今今等(葡萄總RNA提取方法的研究。果樹學(xué)報(bào)，2003，20:178-181)用改進(jìn)的SDS/酚法從葡萄成熟葉片和完熟果實(shí)的果皮中成功提取了總RNA。徐昌杰等(柑橘組織RNA提取方法研究。果樹學(xué)報(bào)，2004，21:136-140)用改良Bugos法從甜橙葉片、幼果、完熟果皮和汁囊組織中獲得了較高質(zhì)量的RNA。周波等(富含多糖草莓果實(shí)總RNA提取方法的改進(jìn)。生物技術(shù)通訊，2004，15:48-50)提取草莓果實(shí)的RNA時(shí)，用丙酮去除類黃酮類色素，用乙二醇丁醚去除多糖。Xu等(Ex加ctionofhighqualityofRNAandconstructionofasuppressionsubtractivehybridizationlibraryfromchestnutroserac6wgto'tratt).BiotechnolLett,2006，28:587-591)在CTAB裂解液中添加PVP和巰基乙醇，并使用該法從多酚多糖含量特別高的刺梨葉片中獲得了高質(zhì)量RNA。很多植物尤其是果實(shí)富含芳香族的酚類化合物、多糖類化合物和類黃酮等次生代謝產(chǎn)物，使得核酸的提取非常困難。特別是總RNA的提取，常規(guī)方法很難奏效。雖然有研究報(bào)道丙酮能除去部分類黃酮類色素，乙二醇丁醚或高濃度的LiCl長時(shí)間沉淀能去除部分多糖，然而這些方法對(duì)RNA提取及純化障礙物的處理效果并不是很理想。由于處理步驟多，整個(gè)抽提過程所需時(shí)間較長，將大大增加了RNA被降解的可能性。因此，發(fā)展一種應(yīng)用范圍廣、快速、成功率高的提取RNA方法對(duì)于提高實(shí)驗(yàn)效率非常必要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取和純化總RNA的方法，其通用性強(qiáng)，解決了從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中抽提高質(zhì)量RNA的難題。本發(fā)明的方法采用兩步法提取純化植物的總RNA。第一步異硫氰酸胍法獲得總RNA粗提沉淀，第二步采用DEPC處理過的ddH20溶解RNA沉淀，并用堿性的Tris飽和酚和氯仿純化RNA，最終獲得高質(zhì)量的總RNA。本發(fā)明在異硫氰酸胍裂解液中加入抗氧化劑p-巰基乙醇、酚類化合物螯合劑聚乙烯吡咯烷酮和RNase抑制劑十二烷基肌氨酸鈉，高效裂解植物細(xì)胞，釋放的RNA能進(jìn)入酸性水相。隨后的氯仿抽提步驟能去除基因組DNA、大部分蛋白和次生代謝物質(zhì)。經(jīng)異丙醇沉淀的粗提RNA用ddH20溶解后，借助堿性的Tris飽和酚抽提除去多糖類物質(zhì)、蛋白以及殘留的次生代謝物質(zhì)。本發(fā)明經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)，研究出通用性強(qiáng)的適于從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中抽提RNA的方法。它包括下述步驟(1)勻漿和裂解取l-2g富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織，用液氮研磨成粉，按組織材料的重量(g)和RNA抽提緩沖液的體積(mL)比為l:IO的比例加入與預(yù)冷的RNA抽提緩沖液，混勻后置于冰上5min，再加入3molL—1醋酸鈉(pH4.5-5.5)l-2mL，上下顛倒混勻；(2)氯仿抽提在步驟(1)得到的樣品混合液中加入氯仿11-22mL，劇烈震蕩將兩相混勻，冰上放置10min后于4。C12000g離心10min，取上清液到新的離心管中；(3)重復(fù)(2)中的氯仿抽提步驟1次；(4)異丙醇沉淀在上清液中加入10-20mL異丙醇，混勻后置于-20。C中放置30min，接著4。C12000g離心15min得到RNA沉淀物；(5)乙醇清洗和溶解用75%乙醇清洗沉淀2次，置于室溫干燥20min，用DEPC處理過的水l-2mL徹底溶解RNA沉淀；(6)酚抽提在RNA水溶液中加入Tris飽和酚(pH7.8-8.0)l-2mL，劇烈震蕩將兩相混勻，常溫12000g離心10min，取上清液到新離心管中；(7)氯仿抽提:在上清液中加入氯仿l-2mL，劇烈震蕩混勻后，常溫12000g離心10min，取上清液到新離心管中；(8)異丙醇沉淀在上清液中加入醋酸鈉0.1-0.2mL和異丙醇l-2mL，混勻后于-20。C放置30min，4°C12000g離心15min得到純化的RNA沉淀物；(9)乙醇清洗和溶解用75%乙醇清洗RNA沉淀2次，在室溫干燥20min后用100-20(VLDEPC處理過的ddH20徹底溶解，得到的高質(zhì)量RNA。其中所述的RNA抽提緩沖液組成成分為4molL—1異硫氰酸胍，25mmolL—1檸檬酸鈉，0.5%(w/v)十二垸基肌氨酸鈉，2%(w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K40)，使用前每lOOmL抽提緩沖液加入0.5mLp-巰基乙醇；所述的75X(v/v)乙醇是由7.5份無水乙醇和2.5份DEPC處理過的ddH20配置；所述的DEPC處理過的ddH20為0.1份DEPC加入99.9份ddH20中渦旋混勻再經(jīng)高溫高壓滅菌的純水。所述的Tris飽和酚溶液其pH值為7.8-8.0，含8-羥基喹啉和巰基乙醇；所用的植物材料是新鮮、健康的幼嫩材料。針對(duì)傳統(tǒng)的異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法(一步法)不適于多糖、多酚以及次生代謝物質(zhì)含量豐富的植物組織提取總RNA，本發(fā)明將此方法一分為二，并進(jìn)行了多方面的改進(jìn)在RNA抽提緩沖液中加入了可溶性的聚乙烯吡咯垸酮(PVP，K40)，水溶性PVP能與酚類物質(zhì)充分結(jié)合，并形成螯合物，進(jìn)而通過氯仿抽提除去酚類物質(zhì)，有效地防止其與RNA的結(jié)合。此外，在RNA裂解液中加入強(qiáng)還原劑P-巰基乙醇，能提供還原條件，使得多酚類物質(zhì)不易被氧化，P-巰基乙醇與PVP協(xié)同作用，有效抑制了酚類物質(zhì)的阻礙。RNA提取和純化過程中均采用異丙醇沉淀RNA,—方面減少了操作溶液的體積，還有利于選擇性沉淀RNA，進(jìn)一步去除多糖污染。本發(fā)明在獲得RNA粗提沉淀之前通過氯仿的抽提能有效減少溶液中次生代謝物質(zhì)的含量。本發(fā)明在獲得RNA粗提物之后用DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀，再利用堿性的Tris飽和酚純化RNA，去除多糖和殘余的蛋白，提高了RNA的質(zhì)量。堿性Tris飽和酚中含有8羥基喹啉，能抑制RNase活性。用酚、氯仿進(jìn)行長時(shí)間的劇烈震蕩抽提，可以徹底變性RNase，并通過離心將之除去，防止了可能存在的RNase再復(fù)性降解RNA。本發(fā)明通用性強(qiáng)，適用于富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物。已經(jīng)利用本發(fā)明從云南紅皮梨的葉片、已著色果皮、未著色果皮，葡萄的葉片、幼果果皮、果肉，草莓幼果、成熟果實(shí)以及新疆紫草的愈傷組織中成功抽提出高質(zhì)量的RNA。本發(fā)明不需要購買試劑盒和昂貴的分子生物學(xué)試劑，所使用的藥品多數(shù)為價(jià)格低廉的國產(chǎn)試劑，因此整個(gè)RNA提取及純化過程花費(fèi)的成本低。RNA提取及純化方法簡單易行，且耗時(shí)少，在8小時(shí)內(nèi)即可完成全部實(shí)驗(yàn)，并獲得高質(zhì)量的RNA。本發(fā)明的方法快速、經(jīng)濟(jì)、高效、通用性強(qiáng)，適用于富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)植物的分子生物學(xué)操作。利用本方法得到的RNA樣品純度高、完整性好，能在-8(TC超低溫冰箱中長期保存而不出現(xiàn)降解。圖1為云南紅皮梨的幼嫩葉片(紅色)、已著色果皮、未著色果皮總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖(濃度為1.2%，緩沖液為1XTAE)。泳道l:葉片總RNA;泳道2:著色果皮RNA;泳道3:為著色果皮總RNA。圖2為從云南紅皮梨果皮總RNA中分離的mRNA。泳道1:mRNA;泳道2:分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3為云南紅皮梨果皮花青素合成相關(guān)基因的RT-PCR分析。圖4為葡萄幼嫩葉片、幼果果皮、果肉總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖(濃度為1.2%，緩沖液為1XTAE)。泳道l:葉片總RNA;泳道2:幼果果皮總RNA;泳道3:果肉總RNA。圖5為草莓未成熟果實(shí)、成熟果實(shí)總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖(濃度為1.2%，緩沖液為1XTAE)。泳道l:幼嫩果實(shí)總RNA;泳道2:成熟果實(shí)總RNA。圖6為新疆紫草紅色愈傷組織以及灰白色愈傷組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖(濃度為1.2%，緩沖液為1XTAE)。泳道l:紅色愈傷組織總RNA;泳道2:灰白色愈傷組織總RNA。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:云南紅皮梨的幼嫩葉片(紅色)、己著色果皮、未著色果皮總RNA提取^:其應(yīng)用(1)取液氮速凍的云南紅皮梨幼嫩葉片(紅色)、已著色果皮、未著色果皮各l克，用液氮將其研磨成粉末；快速將樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，并加入10mL預(yù)冷的RNA抽提緩沖液，混勻置于冰上5min，再加入pH4.5的3molL"醋酸鈉lmL，上下顛倒混勻；(2)接著加入llmL氯仿，劇烈震蕩將兩相混勻，冰上放置10min后于4°C12000g離心10min,取上清液到新的離心管中；(3)重復(fù)(2)中的氯仿抽提步驟1次；(4)在上清液中加入10mL異丙醇，混勻后置于-20。C30min,接著4。C12000g離心15min獲得RNA沉淀；(5)用75%乙醇清洗沉淀2次，在室溫干燥20min后用lmLDEPC處理過的ddH20徹底溶解；(6)在RNA水溶液中加入Tris飽和酚(pH8.0)lmL，劇烈震蕩將兩相混勻，常溫12000g離心10min，取上清到新離心管中；(7)在上清液中加入lmL氯仿，劇烈震蕩混勻后，常溫12000g離心10min，取上清液；(8)在上清液中加入O.lmL的醋酸鈉和lmL異丙醇，混勻后于-20。C放置30min，4°C12000g離心15min得到純化的RNA沉淀；(9)用75。/。乙醇清洗RNA沉淀2次，在室溫干燥20min后用10(^LDEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀，得到的高質(zhì)量的RNA。其中所述的RNA抽提緩沖液組成成分為4molL—1異硫氰酸胍，25mmolL'1擰檬酸鈉，0.5%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉，2%(w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K40)，使用前每100mL抽提緩沖液加入0.5mLP-巰基乙醇；所述的75X(v/v)乙醇是由7.5份無水乙醇和2.5份DEPC處理過的ddH20配置；所述的DEPC處理過的ddH20為0.1份DEPC加入99.9份ddH20中渦旋混勻再經(jīng)高溫高壓滅菌的純水。所述的Tris飽和酚溶液的pH值為7.8-8.0，含8-羥基喹啉和巰基乙醇。應(yīng)用本實(shí)施例，得到云南紅皮梨幼嫩葉片、已著色果皮、未著色果皮RNA樣品總量分別為420微克、250微克、220微克，產(chǎn)率分別為420微克/克(總RNA量/樣品量)、250微克/克、220微克/克。質(zhì)量檢測(cè)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(附圖1)表明RNA完整性好，在紫外分光光度儀上測(cè)定260nm與280nm吸光度比值八260/28()為1.8~1.9，完全滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需要。從云南紅皮梨果皮總RNA中分離mRNAmRNA的分離采用Qiagen公司的OligotexmRNAMidiKits進(jìn)行。取200嗎云南紅梨果皮的總RNA(溶解于250uLDEPC處理過的ddH20中)，加入250|xLOBBbuffer和15pLOligotexSuspension,吸打混勻后7CTC溫育3min以打破RNA的次級(jí)結(jié)構(gòu)，接著室溫靜置10min。MOOOg離心2min，棄上清，用lmLBufferOW2重懸Oligotex,14000g離心2min，棄上清，重復(fù)BufferOW2清洗步驟1次。加入lOO^L70。C溫育的bufferOEB，吸打3至4次徹底重懸Oligotex,14000g離心2min后取上清至新的離心管中。用1.2%的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所分離的mRNA，結(jié)果如附圖2所示，mRNA片段主要分布于400bp至4000bp之間，可見本發(fā)明所提供的方法能獲得高質(zhì)量的總RNA。云南紅皮梨果皮總RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和花青素合成相關(guān)基因的RT-PCR分析(1)RNA定量本實(shí)施例中用到的總RNA樣品有云南紅皮梨未接受光照果皮(白色)的RNA、分別接受2d、4d、6d、8d光照的果皮(紅色)。在紫外分光光度儀上測(cè)定5個(gè)RNA樣品的濃度，然后根據(jù)測(cè)定數(shù)據(jù)將各樣品的RNA濃度調(diào)整為0.5pg爾L。并通過lxTAE瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA濃度調(diào)整的準(zhǔn)確性。(2)逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成所用逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLVReverseTranscriptase(M-MLVRT，Promega公司產(chǎn)品)。反應(yīng)體系如下TotalRNA2嗎Oligo(dT)15primer0.5嗎加DEPC處理過的ddH20至總體積為15pL。70°C變性5min，立即置于冰上，冰浴10min之后依次加入下列成分M-MLV5xReactionBuffer5pLdNTP(1OmMeach)(P畫ega)1.25pLRNasinRibonucleaseInhibitor(Promega)1joLM-MLVRT(Promega)1DEPC處理過的ddH201.75混勻后于42°C反應(yīng)1.5h，取出置于70°C加熱5min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。再加入75TE，將第一鏈cDNA稀釋4倍，置于-20。C保存。(3)PCR取1^1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為PCR模板。PCR反應(yīng)體系(20nL)如下:ddH2015.9forwardprimer(5pM)0.5|iLreverseprimer(5pM)0.510xTaqbuffer2dNTP(10mMeach)0.4TaqDNAPolymerase(5U/|_iL)(TIANGEN)0.4模板1PCR反應(yīng)條件為94°C2min;94°C30s,X°C30s(根據(jù)各引物TM確定)，72°C40s，25cycles;72°C5min。以一對(duì)擴(kuò)增紅皮梨肌動(dòng)蛋白(actin)cDNA的引物進(jìn)行平行PCR反應(yīng)作為對(duì)照?；蛱禺愐镆姳韑。PCR結(jié)束之后，取8nL產(chǎn)物在1.2。/。TAE瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。結(jié)果見附圖3，表明采用本發(fā)明提取的總RNA質(zhì)量高，適于進(jìn)行RT-PCR等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。表1RT-PCR使用的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例2:葡萄幼嫩葉片、幼果果皮、果肉總RNA提取(1)取液氮速凍的葡萄葉片、幼果果皮、果肉各L2克，用液氮將其研磨成粉末；快速將各樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，并加入12mL預(yù)冷的RNA抽提緩沖液，混勻置于冰上5min，再加入pH4.5的3molU1醋酸鈉1.2mL，上下顛倒混勻；(2)接著加入13mL氯仿，劇烈震蕩將兩相混勻，冰上放置10min后于4°C12000g離心10min，取上清液到新的離心管中；(3)重復(fù)(2)中的氯仿抽提步驟1次；(4)在上清液中加入12mL異丙醇，混勻后置于-20。C30min，接著4。C12000g離心15min獲得RNA沉淀；(5)用75%乙醇清洗沉淀2次，在室溫干燥20min后用1.2mLDEPC處理過的ddH2O徹11底溶解；(6)在RNA水溶液中加入Tris飽和酚(pH8.0)1.2mL，劇烈震蕩將兩相混勻，常溫12000g離心10min，取上清到新離心管中；(7)在上清液中加入1.2mL氯仿，劇烈震蕩混勻后，常溫12000g離心10min，取上清液；(8)在上清液中加入0.12mL的醋酸鈉和1.2mL異丙醇，混勻后于-20。C放置30min，4°C12000g離心15min得到純化的RNA沉淀；(9)用75%乙醇清洗RNA沉淀2次，在室溫干燥20min后用120jnLDEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀，得到的高質(zhì)量的RNA。本實(shí)施例中所用的RNA抽提緩沖液及其他試劑同實(shí)施例1。應(yīng)用本實(shí)施例，得到葡萄幼嫩葉片、幼果果皮、果肉RNA總量分別為400微克、300微克、280微克，RNA產(chǎn)率分別為400微克/克(總RNA量/樣品量)、300微克/克、280微克/克。質(zhì)量檢測(cè)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(附圖4)表明RNA完整性好，在紫外分光光度儀上測(cè)定260nm與280nm吸光度比值八26()/28()為1.71.8，完全滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需要。實(shí)施例3:草莓未成熟果實(shí)(綠色)和成熟果實(shí)(紅色)總RNA提取(1)取液氮速凍的草莓未成熟果實(shí)和成熟果實(shí)各2克，用液氮將其研磨成粉末；快速將各樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，并加入20mL預(yù)冷的RNA抽提緩沖液，混勻置于冰上5min，再加入pH4.5的3molL—1醋酸鈉2mL，上下顛倒混勻；(2)接著加入22mL氯仿，劇烈震蕩將兩相混勻，冰上放置10min后于4°C12000g離心10min，取上清液到新的離心管中；(3)重復(fù)(2)中的氯仿抽提步驟1次；(4)在上清液中加入20mL異丙醇，混勻后置于-20。C30min，接著4。C12000g離心15min獲得RNA沉淀；(5)用75%乙醇清洗沉淀2次，在室溫干燥20min后用2mLDEPC處理過的ddH20徹底溶解；(6)在RNA水溶液中加入Tris飽和酚(pH8.0)2mL，劇烈震蕩將兩相混勻，常溫12000g離心10min，取上清到新離心管中；(7)在上清液中加入2mL氯仿，劇烈震蕩混勻后，常溫12000g離心10min，取上清液；(8)在上清液中加入0.2mL的醋酸鈉和2mL異丙醇，混勻后于-20。C放置30min，4°C1212000g離心15min得到純化的RNA沉淀；(9)用75%乙醇清洗RNA沉淀2次，在室溫干燥20min后用200pLDEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀，得到的高質(zhì)量的RNA。本實(shí)施例中所用的RNA抽提緩沖液及其他試劑同實(shí)施例1。應(yīng)用本實(shí)施例，得到草莓未成熟果實(shí)和完熟果實(shí)總RNA量分別為270微克和240微克，RNA產(chǎn)率分別為270微克/克(總RNA量/樣品量)和240微克/克。質(zhì)量檢測(cè)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(附圖5)表明RNA完整性好，在紫外分光光度儀上測(cè)定260nm與280nm吸光度比值A(chǔ)26o/2so為1.71.8，完全滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需要。實(shí)施例4:新疆紫草愈傷組織的總RNA提取(1)取液氮速凍的新疆紫草紅色愈傷組織(產(chǎn)生紫草素)和灰白色愈傷組織(未產(chǎn)生紫草素)各1.6克，用液氮將其研磨成粉末；快速將樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，并加入16mL預(yù)冷的RNA抽提緩沖液，混勻置于冰上5min，再加入pH4.5的3molL"醋酸鈉1.6mL，上下顛倒混勻；(2)接著加入18mL氯仿，劇烈震蕩將兩相混勻，冰上放置10min后于4°C12000g離心10min，取上清液到新的離心管中；(3)重復(fù)(2)中的氯仿抽提步驟1次；(4)在上清液中加入18mL異丙醇，混勻后置于-20。C30min，接著4。C12000g離心15min獲得RNA沉淀；(5)用75%乙醇清洗沉淀2次，在室溫干燥20min后用1.6mLDEPC處理過的ddH20徹底溶解；(6)在RNA水溶液中加入Tris飽和酚(pH8.0)1.6mL，劇烈震蕩將兩相混勻，常溫12000g離心10min，取上清到新離心管中；(7)在上清液中加入1.6mL氯仿，劇烈震蕩混勻后，常溫12000g離心10min，取上清液；(8)在上清液中加入0.16mL的醋酸鈉和1.6mL異丙醇，混勻后于-20。C放置30min,4°C12000g離心15min得到純化的RNA沉淀；(9)用75%乙醇清洗RNA沉淀2次，在室溫干燥20min后用160&DEPC處理過的ddH20徹底溶解沉淀，得到的高質(zhì)量的RNA。本實(shí)施例中所用的RNA抽提緩沖液及其他試劑同實(shí)施例1。應(yīng)用本實(shí)施例，得到新疆紫草紅色愈傷組織和灰白色愈傷組織總RNA量分別為320微克和340微克，RNA產(chǎn)率分別為320微克/克(總RNA量/樣品量)和340微克/克。質(zhì)量檢測(cè)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(附圖6)表明RNA完整性好，在紫外分光光度儀上測(cè)定260nm與280nm吸光度比值八26()/28()為1.8~1.9，完全滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需要。權(quán)利要求1、一種從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取總RNA的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)稱取1-2克植物組織，在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨成粉，轉(zhuǎn)入50mL離心管中，迅速加入10-20mL預(yù)冷的RNA抽提緩沖液，混勻后置于冰上5分鐘，再加入pH4.5-5.5的3molL-1醋酸鈉1-2mL，上下顛倒混勻；RNA抽提緩沖液組成成分為4molL-1異硫氰酸胍，25mmolL-1檸檬酸鈉，0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸鈉，2％(w/v)可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每100mL抽提緩沖液加入0.5mLβ-巰基乙醇；(2)加入11-22mL的氯仿，劇烈震蕩將兩相混勻，冰上放置10分鐘后于4℃12000g離心10分鐘，取上清液置于新的離心管中；(3)重復(fù)(2)中的氯仿抽提步驟1次；(4)在上清液中加入10-20mL異丙醇，混勻后置于-20℃30分鐘，接著4℃12000g離心15min獲得RNA沉淀；(5)用75％的乙醇溶液清洗沉淀2次，置于室溫干燥20分鐘，用DEPC處理過的ddH2O1-2mL徹底溶解RNA沉淀(6)在RNA溶液中加入Tris飽和酚1-2mL，劇烈震蕩將兩相混勻，常溫12000g離心10分鐘，取上清液；(7)在上清液中加入1-2mL氯仿，劇烈震蕩混勻后，常溫12000g離心10分鐘，取上清液；(8)在上清液中加入pH4.5-5.5的3molL-1醋酸鈉0.1-0.2mL和1-2mL異丙醇，混勻后于-20℃中放置30分鐘，4℃12000g離心15分鐘得到RNA沉淀；(9)用75％乙醇溶液洗RNA沉淀物2次，室溫干燥20分鐘后，用100-200μLDEPC處理過的ddH2O溶解沉淀，獲得純化后的RNA；2、根據(jù)權(quán)利1所述的從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取總RNA的方法，其特征在于植物組織包括紅皮梨和葡萄的幼嫩葉片、果肉、果皮組織以及草莓果實(shí)和新疆紫草愈傷組織。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取總RNA的方法，其特征在于所述的75%乙醇是由7.5份無水乙醇和2.5份DEPC處理過的ddH20配制，DEPC處理過的ddH2O是由0.1份DEPC加入99.9份ddH2O中渦旋混勻再經(jīng)高溫高壓滅菌的純水。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取總RNA的方法，其特征在于所述的Tris飽和酚溶液其pH值為7.8-8.0，含8-羥基喹啉和巰基乙醇。全文摘要本發(fā)明是一種利用異硫氰酸胍-氯仿抽提、Tris飽和酚純化植物RNA的抽提方法。本發(fā)明改良了傳統(tǒng)的異硫氰酸胍法，采用裂解后氯仿抽提加酚純化兩步法，分別從紅皮梨的葉片和果皮、葡萄的葉片和果肉、果皮組織以及草莓果實(shí)和新疆紫草愈傷組織中提取到了高質(zhì)量的總RNA。該方法的抽提緩沖液中含有異硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸鈉、檸檬酸鈉、可溶性聚乙烯吡咯烷酮和β-巰基乙醇，既能高效裂解植物細(xì)胞釋放RNA，有效抑制RNA酶的活性，還能防止酚類物質(zhì)的氧化和排除次生代謝物質(zhì)的干擾。第二步用Tris飽和酚純化粗提RNA溶液，能除去與RNA共沉淀的多糖和蛋白質(zhì)。本發(fā)明操作步驟簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、穩(wěn)定性好，適用于從富含多糖多酚及次生代謝物質(zhì)的植物組織中提取高質(zhì)量總RNA。文檔編號(hào)C12N15/10GK101638651SQ20091009470公開日2010年2月3日申請(qǐng)日期2009年7月9日優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日發(fā)明者劉迪秋,李文嫻,王繼磊,田榮歡,鋒葛,陳朝銀申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)