一種類(lèi)芽孢桿菌的胞外多糖、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種類(lèi)芽孢桿菌的胞外多糖、制備方法及其應(yīng)用。所述的胞外多糖的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示，其中，n＝15～30。所述的胞外多糖的平均分子量分布為2500～5000Da，聚合度為15～30，單糖組分為果糖。所述的胞外多糖的單糖組分單一，可以由保藏號(hào)為CGMCC NO.8333的類(lèi)芽孢桿菌BD3526發(fā)酵后獲得。所述的制備方法中的發(fā)酵操作簡(jiǎn)單易行。本發(fā)明還公開(kāi)了所述的胞外多糖的提純方法以及所述的胞外多糖體在外促進(jìn)嬰兒雙歧桿菌增殖、體外調(diào)節(jié)成人腸道菌群的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種類(lèi)芽孢桿菌的胞外多糖、制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種類(lèi)芽孢桿菌的胞外多糖、制備方法及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 某些微生物（如乳酸菌、類(lèi)芽孢桿菌、根瘤菌等）在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，會(huì)分泌一類(lèi) 糖類(lèi)化合物到細(xì)胞壁外。其中，依附于微生物細(xì)胞壁外的多糖被稱(chēng)為莢膜多糖，以滲透于生 長(zhǎng)環(huán)境中形式存在的為粘液多糖。
[0003] 微生物胞外多糖（簡(jiǎn)稱(chēng)EPS)不但可以擁有特殊的風(fēng)味，還具有一定的降血脂、免 疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等功能，因此可以作為食品添加劑。而且，隨著食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到消 費(fèi)者的重視，如何獲得來(lái)源明確、產(chǎn)量穩(wěn)定、功能多樣的新型食品添加劑（如增稠劑、乳化 齊U、穩(wěn)定劑等），越來(lái)越引起研究者的重視。
[0004] 果聚糖（Levan)，由大量的果糖單元以β (2 - 6)果糖苷鍵連接構(gòu)成聚糖主鏈并含 有少量β (2 - 1)果糖苷鍵連接的支鏈組成。聚合度（簡(jiǎn)稱(chēng)DP)較低（DP = 2?9)的果 聚糖通常稱(chēng)為低聚果糖，聚合度10?30的果聚糖通常稱(chēng)為多聚果糖，聚合度高于40的果 聚糖通常稱(chēng)為高聚果糖。部分微生物來(lái)源的Levan具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、免 疫增強(qiáng)等重要的生物活性，在醫(yī)藥和功能性食品方面具有巨大的應(yīng)用潛能。
[0005] 目前大量獲得Levan有三種方法：化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵液提取和酶法合成。但 是，目前化學(xué)合成方法合成的Levan僅僅是β-糖苷鍵連接而成的三糖結(jié)構(gòu)。雖然植物和 微生物都能合成Levan，但目前微生物發(fā)酵產(chǎn)生的Levan都是高分子量、高聚合度的，通常 為2X10 6?100X 106Da(DP遠(yuǎn)高于40)。而且，目前從微生物發(fā)酵液提取Levan產(chǎn)量和蔗 糖轉(zhuǎn)化率一般較低，且發(fā)酵液中同時(shí)存在的其他高聚物和葡萄糖、果糖、低聚果糖等其他產(chǎn) 物，因而不利于Levan的規(guī)?；兓?。此外，Levan的酶法合成，需要在一定的pH、溫度等條 件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件復(fù)雜，難以控制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服微生物發(fā)酵產(chǎn)生的Levan高分子量、高聚合度 且發(fā)酵產(chǎn)物不利于純化的缺陷，提供一種類(lèi)芽孢桿菌的胞外多糖、制備方法及其應(yīng)用。所述 的胞外多糖聚合度適中，單糖成分單一；所述的制備方法簡(jiǎn)單易行，利于對(duì)所述的胞外多糖 進(jìn)行純化。
[0007] 本發(fā)明提供一種類(lèi)芽孢桿菌的胞外多糖，所述胞外多糖的結(jié)構(gòu)式如式（1)所示：
[0008]

【權(quán)利要求】
1. 一種類(lèi)芽孢桿菌的胞外多糖，其特征在于，所述胞外多糖的結(jié)構(gòu)式如式（1)所示，
其中，η = 15?30。
2. 如權(quán)利要求1所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖的平均分子量分布為 2500?5000Da ;和/或具有如下的外觀：純白色絲狀物或粉末。
3. 如權(quán)利要求1所述的胞外多糖，其特征在于，所述的胞外多糖由保藏號(hào)為CGMCC NO. 8333 的類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus damxungensis sp.nov.)BD3526 產(chǎn)生。
4. 一種制備如權(quán)利要求1?3任意一項(xiàng)所述的類(lèi)芽孢桿菌的胞外多糖的制備方法，其 包括以下的步驟： (1) 將類(lèi)芽孢桿菌CGMCC NO. 8333發(fā)酵得發(fā)酵液； (2) 將步驟（1)所得的發(fā)酵液在95?KKTC加熱10?30分鐘，冷卻至15?25°C后， 調(diào)節(jié)pH值至4. 4?4. 8,靜置3?5小時(shí)，離心取上清液，加入所述上清液體積2?4倍的 80?100 %乙醇溶液，靜置過(guò)夜，離心收集沉淀物，所述的百分比為乙醇占乙醇溶液的質(zhì)量 百分比； (3) 用50?80°C蒸餾水將步驟（2)所得的沉淀物溶解，獲得濃度為0. 5?1. 0%的沉淀 物溶液，所述百分比為占所述沉淀物溶液的質(zhì)量體積百分比，待所述溶液冷卻至20?25°C 時(shí)加入三氯乙酸，使三氯乙酸最終為4%?10%，所述百分比為占所述溶液的質(zhì)量體積百 分比，再靜置離心獲得上清液，將所述上清液經(jīng)過(guò)截留分子量為IOOODa的膜透析后得到含 胞外多糖的水溶液； (4) 將步驟（3)所得的含胞外多糖的水溶液干燥后即得胞外多糖粗品。
5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)所述的發(fā)酵為30°C發(fā)酵72小 時(shí)；所述的發(fā)酵在液體產(chǎn)糖培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述的液體產(chǎn)糖培養(yǎng)基由10%蔗糖、1 %胰酪蛋 白胨、0. 5%酵母膏、0. 5% Κ2ΗΡ04、0. 034% CaCl2與蒸餾水組成，所述的百分比為占所述液 體產(chǎn)糖培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比； 步驟（2)所述的離心為HOOOg離心10分鐘；所述的調(diào)節(jié)pH值為調(diào)節(jié)至4. 6 ;所述的 乙醇溶液為95%乙醇溶液，所述的百分比為占乙醇溶液的質(zhì)量百分比；所述乙醇溶液的加 入量為所述上清液體積的3倍； 步驟（3)所述溶解為用60°C蒸餾水將步驟（2)所得的沉淀物溶解，獲得濃度為0. 8% 的沉淀物溶液，所述百分比為占所述沉淀物溶液的質(zhì)量體積百分比，待所述溶液冷卻至 25°C時(shí)加入三氯乙酸，使三氯乙酸最終為4%，所述百分比為占所述溶液的質(zhì)量體積百分 比；或者， 步驟（4)所述的干燥為真空冷凍干燥；較佳地，為0. 160mBar，-30°C條件下真空冷凍干 燥72小時(shí)。
6. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的制備方法還包括以下的步驟： (5) 將步驟（4)制得的胞外多糖粗品溶于0. 05mol/L，pH7. 60的Tris-HCl緩沖液中，配 成溶液，經(jīng)DEAE-Sepharose FF柱子層析；依次用所述Tris-HCl緩沖液和含0. 2?I. 2mol/ L NaCl的所述Tris-HCl緩沖液線性梯度洗脫，流速為2?6mL/min，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)吸 光度，以吸光度對(duì)應(yīng)的管號(hào)作圖，得洗脫曲線A ; (6) 將步驟（5)得到的洗脫曲線A中單峰所對(duì)應(yīng)的透析過(guò)的水溶液收集，用水透析，干 燥，得到胞外多糖組份B ; ⑵將步驟（6)得到的胞外多糖組份B，溶于所述的Tris-HCl緩沖液中，配成溶液，上 DEAE-Sepharose CL-4B離子交換柱進(jìn)行層析；用含0. 2?I. 2mol/L NaCl的所述Tris-HCl 緩沖液洗脫，流速為2?6mL/min，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度對(duì)應(yīng)的管號(hào)作圖，得 洗脫曲線B ; (8)將步驟（7)獲得的洗脫曲線B中單峰所對(duì)應(yīng)的透析過(guò)的水溶液收集，用水透析，干 燥，即可。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟（5)中，將制得的胞外多糖粗 品50?200mg溶于0· 05mol/L，ρΗ7· 60的Tris-HCl緩沖液中，配成5?20mg/mL的溶 液；步驟（5)中所述的流速為3mL/min;步驟（5)中所述的DEAE-Sepharose FF柱子為 DL 6 X IOOcm ;步驟（7)中，將制得的胞外多糖粗品50?200mg溶于所述的Tris-HCl緩沖 液中，配成5?20mg/mL的溶液；步驟（7)中所述的流速為3mL/min ;或者，步驟（7)中所述 的 DEAE-Sepharose FF 柱子為 DL 6 X 100cm。
8. 如權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述的胞外多糖在促進(jìn)雙歧桿菌增殖中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的雙歧桿菌為短雙歧桿菌（B. breve)。
10. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的雙歧桿菌是人體腸道菌群中的雙歧 桿菌。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104231106SQ201410535126
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】吳正鈞, 郭本恒, 高彩霞, 劉振民, 徐曉芬, 韓瑨 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司