專(zhuān)利名稱(chēng)：一種枯草芽孢桿菌及其制劑和制備方法以及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌菌種、利用所述菌種制成的制劑、所述制劑的制備方法、所述菌種在制備防治作物霉菌病害的制劑方面的應(yīng)用和所述制劑在防治作物霉菌病害方面的應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人們對(duì)于食品安全和環(huán)境保護(hù)的日益關(guān)注，“有機(jī)農(nóng)業(yè)”已成為農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向，而開(kāi)發(fā)出低毒、高效、低殘留的純天然生物農(nóng)藥已經(jīng)成為近來(lái)農(nóng)藥研究的新方向。但由于生物農(nóng)藥的局限性，其通常藥效較低，作用緩慢，價(jià)格高，所以難于被農(nóng)民接受?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境，具有顯著的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力。枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對(duì)致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。同時(shí)枯草芽孢桿菌還能分泌大量幾丁質(zhì)酶，幾丁質(zhì)酶可分解病原真菌的細(xì)胞壁而抑制真菌病害?？莶菅挎邨U菌生長(zhǎng)快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，能產(chǎn)生耐熱、抗逆的芽孢，其芽孢具有抗逆性強(qiáng)、 利于保藏的特點(diǎn)，又能忍受極端的外部環(huán)境而長(zhǎng)期存活，可以制成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型或與化學(xué)農(nóng)藥混用而不失活。因此有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖，而且批量生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本也較低，施用方便，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，是一種理想的生防微生物。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在枯草芽孢桿菌防治植物病害方面進(jìn)行了大量研究。一些枯草芽孢桿菌優(yōu)勢(shì)菌株已經(jīng)作為生物農(nóng)藥投入到植物病害應(yīng)用中。目前，該菌已在黃瓜、 辣椒、水稻、小麥、玉米、棉花等農(nóng)作物上應(yīng)用并顯現(xiàn)出很好的病害防治效果。如申請(qǐng)?zhí)枮?200910148250. 9的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利，公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌微生物菌劑和復(fù)合微生物菌劑，該微生物菌劑和該復(fù)合微生物菌劑可以抑制茄子菌核菌和番茄灰霉菌等病原菌，克服現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)農(nóng)藥環(huán)保性差、易產(chǎn)生抗藥性和安全性差等缺陷，以實(shí)現(xiàn)環(huán)保性好、不易產(chǎn)生抗藥性和安全性好的優(yōu)點(diǎn)。該微生物菌劑和復(fù)合微生物菌劑的抗菌譜較廣，但是抗菌效果并不是很好，尤其是針對(duì)作物霉菌特別是霜霉菌的殺滅或抑制效果有待提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決上述技術(shù)問(wèn)題提供一種枯草芽孢桿菌。一種枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌的菌株已于2012年12月沈日保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)人屯路，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 5652。該枯草芽孢桿菌的生物學(xué)命名為feciB^s subtilis。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種枯草芽孢桿菌制劑，它是由所述的枯草芽孢桿菌菌株經(jīng)過(guò)發(fā)酵制成，包含有枯草芽孢桿菌菌體及其次生代謝產(chǎn)物。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述制劑為可濕性粉劑。本發(fā)明的再一個(gè)目的是，提供所述的一種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法。
一種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，包括以下步驟
①將取出的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基選擇為L(zhǎng)B或PSA；
②挑選活化的單菌落，再進(jìn)行培養(yǎng)；
③將培養(yǎng)好的液體菌種，按0.5 4%的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；
④20 30°C培養(yǎng)1 3天；
所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，麥芽糖0. 0.4%，玉米粉0. 5% 0. 8%，黃豆粉0. 4% 0. 9%，胰蛋白胨0. 5% 1. 0%, CaCl2 0. 02% 0. 08%,MnSO4 0. 05% 0. 08%, K2HPO4 0. 1% 0. 6%，余下為水。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，它還包括以下步驟
⑤將經(jīng)過(guò)步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過(guò)干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護(hù)劑經(jīng)粉碎制得所述制劑；
所述比例為按質(zhì)量百分比計(jì)，發(fā)酵液60 70%，助劑5 15%，穩(wěn)定劑1 5%，保護(hù)劑 0. 05 0. 2%，載體填料補(bǔ)足100% ；
所述助劑為縮聚萘磺酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙二醇、烷基萘磺酸鹽、烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽、SDS、DBS中的一種或多種；
所述穩(wěn)定劑為CaC03、K2HP04、K3PO4、羧甲基纖維素鈉、CaCl2、NaCl中的一種或多種； 所述保護(hù)劑為玉米淀粉、大米粉、維生素C、羧甲基纖維素、糊精、熒光增白劑中的一種或多種；
所述載體填料為硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣、白炭黑、膨潤(rùn)土、滑石粉、高嶺土中的一種或多種。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述液體培養(yǎng)基的pH為6. 0 8. 0。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟②中，在挑選出活化的單菌落后，在新的LB或PSA 液體培養(yǎng)基中，在觀 35°C，培養(yǎng)15 48小時(shí)。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的菌種在制備防治作物霉菌病害的制劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述制劑在防治作物霉菌病害方面的應(yīng)用。本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供所述制劑在防治作物霜霉菌病害方面的應(yīng)用。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌制劑主要來(lái)自枯草芽孢桿菌發(fā)酵，將發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)處理后得到枯草芽孢桿菌制劑產(chǎn)品。通過(guò)體外植物活體試驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌制劑對(duì)防治作物霉菌病害方面具有一定的作用；尤其是對(duì)農(nóng)作物的霜霉菌病具有顯著的防治作用。
具體實(shí)施例方式本具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的解釋?zhuān)洳⒉皇菍?duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說(shuō)明書(shū)后可以根據(jù)需要對(duì)本實(shí)施例做出沒(méi)有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專(zhuān)利法的保護(hù)。實(shí)施例一
一種可濕性粉劑，它是通過(guò)以下方法制備的 1、液體發(fā)酵培養(yǎng)①菌種活化
菌株自-70°C冰箱取出后，經(jīng)3次轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基PSA ；
②種子菌液制備
挑取單菌落，在新的液體種子培養(yǎng)基PSA中，28°C，ISOrpm，培養(yǎng)15小時(shí)；
③將培養(yǎng)好的液體菌種，按0.5%的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；
④200rpm，20°C培養(yǎng) 3 天；
⑤將經(jīng)過(guò)步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過(guò)干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護(hù)劑，經(jīng)粉碎制得所述制劑；
所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，麥芽糖0. 2% ；玉米粉，0. 5% ；黃豆粉，0. 4% ； 胰蛋白胨，0. 5% ；CaCl2,0. 02% ；MnSO4,0. 05% ;Κ2ΗΡ04，0· 1% ；余下為水；所述液體培養(yǎng)基的ρΗ 為 7.0 ；
所述比例為按質(zhì)量百分比計(jì)，發(fā)酵液60%，助劑5%，穩(wěn)定劑1%，保護(hù)劑0. 05%,載體填料補(bǔ)足100% ；
所述助劑為縮聚萘磺酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉三種； 所述穩(wěn)定劑為羧甲基纖維素鈉； 所述保護(hù)劑為糊精和熒光增白劑兩種； 所述載體填料為硅藻土和輕質(zhì)碳酸鈣。實(shí)施例二
一種可濕性粉劑，它是通過(guò)以下方法制備的 1、液體發(fā)酵培養(yǎng)
①菌種活化
菌株自-70°C冰箱取出后，經(jīng)3次轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基LB ；
②種子菌液制備
挑取單菌落，在新的液體種子培養(yǎng)基LB中，30°C，200rpm，培養(yǎng)18小時(shí)；
③將培養(yǎng)好的液體菌種，按的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；
④230rpm，25°C 培養(yǎng) 2 天；
⑤將經(jīng)過(guò)步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過(guò)干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護(hù)劑經(jīng)粉碎制得所述制劑；
所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，麥芽糖0. 3% ；玉米粉，0. 6% ；黃豆粉，0. 6% ； 胰蛋白胨，0. 8% ；CaCl2,0. 05% ；MnSO4,0. 06% ;Κ2ΗΡ04，0· 4% ；余下為水；所述液體培養(yǎng)基的ρΗ 為 6.5 ；
所述比例為按質(zhì)量百分比計(jì)，發(fā)酵液65%，助劑10%，穩(wěn)定劑3%，保護(hù)劑0. 1%，載體填料補(bǔ)足100% ；
所述助劑為聚乙烯醇、聚乙二醇兩種； 所述穩(wěn)定劑為CaC03、CaCl2^NaCl三種； 所述保護(hù)劑為大米粉； 所述載體填料為白炭黑。實(shí)施例三
一種可濕性粉劑，它是通過(guò)以下方法制備的1、液體發(fā)酵培養(yǎng)
①菌種活化
菌株自-70°C冰箱取出后，經(jīng)3次轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基為液體種子培養(yǎng)基PSA ；
②種子菌液制備
挑取單菌落，在新的液體種子培養(yǎng)基PSA中，35°C，220rpm，培養(yǎng)20小時(shí)；
③將培養(yǎng)好的液體菌種，按4%的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；
④250rpm，30°C培養(yǎng) 1 天；
⑤將經(jīng)過(guò)步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過(guò)干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護(hù)劑經(jīng)粉碎制得所述制劑；
所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，麥芽糖0. 4% ；玉米粉，0. 8% ；黃豆粉，0. 9% ； 胰蛋白胨，1. 0% ；CaCl2,0. 08% ；MnSO4,0. 08% ;Κ2ΗΡ04，0· 6% ；余下為水；所述液體培養(yǎng)基的ρΗ 為 7.5 ；
所述比例為按質(zhì)量百分比計(jì)，發(fā)酵液70%，助劑15%，穩(wěn)定劑5%，保護(hù)劑0. 2%，載體填料補(bǔ)足100% ；
所述助劑為烷基萘磺酸鹽、烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽兩種； 所述穩(wěn)定劑為Κ2ΗΡ04、K3PO4兩種； 所述保護(hù)劑為玉米淀粉、維生素C兩種； 所述載體填料為膨潤(rùn)土和滑石粉。使用上述制劑對(duì)作物霜霉病進(jìn)行測(cè)試，方法如下 稱(chēng)取0. 5g干粉菌劑溶于IOOml水中，攪拌均勻得菌懸液。選擇一株真葉期長(zhǎng)勢(shì)一致盆栽植株，用油性記號(hào)筆寫(xiě)上標(biāo)簽編號(hào)，按序排放，供實(shí)驗(yàn)用。分別將實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照(嘧菌脂500倍液)的藥液噴在植株真葉上，空白照組將清水噴在植株真葉上，以剛好不滴下液滴為準(zhǔn)。噴霧處理后將試材在通風(fēng)處陰干。孢子液制備，將葉片背面的孢子洗下后，觀察，一個(gè)視野在100倍鏡下大約有10 50個(gè)孢子左右即可使用。將孢子液均勻地噴到試材上，放在黑暗處處理M小時(shí)，之后正常的開(kāi)關(guān)燈。培養(yǎng)溫度25 °C左右，濕度80%左右。一般發(fā)病5 10天，可以查病。結(jié)果統(tǒng)計(jì)分級(jí) 0級(jí)無(wú)??；
1級(jí)病斑面積占整片葉面積的5%以下； 3級(jí)病斑面積占整片葉面積的6-10% ； 5級(jí)病斑面積占整片葉面積的11-20% ； 7級(jí)病斑面積占整片葉面積的21-40% ； 9級(jí)病斑面積占整片葉面積的40%以上。結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌的菌株已于2012年12月沈日保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 5652。
2.一種枯草芽孢桿菌制劑，其特征在于它是由權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌菌株經(jīng)過(guò)發(fā)酵制成，包含有枯草芽孢桿菌菌體及其次生代謝產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑，其特征在于所述制劑為可濕性粉劑。
4.權(quán)利要求2所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，包括以下步驟①將取出的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基選擇為L(zhǎng)B或PSA；②挑選活化的單菌落，再進(jìn)行培養(yǎng)；③將培養(yǎng)好的液體菌種，按0.5 4%的接種量，接種到液體培養(yǎng)基中；④20 30°C培養(yǎng)1 3天；所述液體培養(yǎng)基配方為以重量百分比計(jì)，麥芽糖0. 0.4%，玉米粉0.5% 0. 8%,黃豆粉0. 4% 0. 9%,胰蛋白胨0. 5% 1. 0%, CaCl2 0. 02% 0. 08%,MnSO4 0. 05% 0. 08%, K2HPO4 0. 1% 0. 6%，余下為水。
5.權(quán)利要求4所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在干，它還包括以下步驟⑤將經(jīng)過(guò)步驟④發(fā)酵培養(yǎng)所得發(fā)酵液通過(guò)干燥制得母粉，然后按比例加入載體填料、 助劑、穩(wěn)定劑和保護(hù)劑，經(jīng)粉碎制得所述制劑；所述比例為按質(zhì)量百分比計(jì)，發(fā)酵液60 70%，助劑5 15%，穩(wěn)定劑1 5%，保護(hù)劑 0. 05 0. 2%，載體填料補(bǔ)足100% ；所述助劑為縮聚萘磺酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙ニ醇、烷基萘磺酸鹽、烷基萘磺酸縮聚物鈉鹽、SDS、DBS中的ー種或多種；所述穩(wěn)定劑為CaC03、K2HPO4, K3PO4、羧甲基纖維素鈉、CaCl2、NaCl中的ー種或多種； 所述保護(hù)劑為玉米淀粉、大米粉、維生素C、羧甲基纖維素、糊精、熒光增白劑中的ー種或多種；所述載體填料為硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣、白炭黑、膨潤(rùn)土、滑石粉、高嶺土中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基的PH值為6.0 8.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ー種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，其特征在于步驟②中， 在挑選出活化的單菌落后，在新的LB或PSA液體培養(yǎng)基中，在觀 35°C，培養(yǎng)15 48小時(shí)。
8.權(quán)利要求1所述的菌種在制備防治作物霉菌病害的制劑方面的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2或3所述的制劑在防治作物霉菌病害方面的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2或3所述的制劑在防治作物霜霉菌病害方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌菌種、利用所述菌種制成的制劑、所述制劑的制備方法、所述菌種在制備防治作物霉菌病害的制劑方面的應(yīng)用和所述制劑在防治作物霉菌病害方面的應(yīng)用，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌的生物學(xué)命名為Bacillussubtilis，已于2012年12月26日保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)人屯路，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo.5652。通過(guò)體外植物活體試驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌制劑對(duì)防治作物霉菌病害方面具有一定的作用；尤其是對(duì)農(nóng)作物的霜霉菌病具有顯著的防治作用。
文檔編號(hào)C12R1/125GK102533608SQ20121001712
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者張海風(fēng), 張鵬, 沈婷婷, 榮躍文, 高丙利 申請(qǐng)人:高丙利