一種降低環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶產(chǎn)物抑制的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降低環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶產(chǎn)物抑制的方法，屬于基因工程和酶工程領域。本發(fā)明采用定點突變方法削弱了環(huán)糊精產(chǎn)物對酶活力的抑制，提高CGT酶的產(chǎn)環(huán)糊精能力，提供了增強來源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶產(chǎn)環(huán)糊精能力的突變方案，獲得突變體酶制品。相比于野生CGT酶，突變體酶制品產(chǎn)環(huán)糊精的能力明顯增強，更適合環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種降低環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶產(chǎn)物抑制的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種降低環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶產(chǎn)物抑制的方法，屬于基因工程和酶 工程領域。

【背景技術】
[0002] 環(huán)糊精是由D-吡喃葡萄糖通過α -1，4-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀化合物，其中以6、 7和8個葡萄糖單元所構成的α-、β_和環(huán)糊精最為常見。由于其呈中空圓筒狀結構， 具有外部親水、內(nèi)部疏水的特性，環(huán)糊精能與許多疏水客體分子形成包合物，從而改變客體 分子的理化性質，因此，在食品、醫(yī)藥等工業(yè)領域中有著廣泛的應用。
[0003] 環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法工藝，即在環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶（CGT酶）催化 作用下通過環(huán)化反應轉化淀粉所合成。由于CGT酶作用淀粉過程中，所產(chǎn)生的環(huán)糊精會與 CGT酶結合，導致環(huán)糊精的生成速率下降，出現(xiàn)產(chǎn)物抑制現(xiàn)象。當酶反應體系中環(huán)糊精達到 一定濃度后，由于產(chǎn)物抑制，環(huán)糊精產(chǎn)量基本不再增加，造成淀粉轉化率相對偏低，環(huán)糊精 生產(chǎn)成本居高不下，環(huán)糊精在工業(yè)中的應用受到限制。
[0004] 本發(fā)明中所使用的來源于環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans) STB01的β-CGT 酶，在酶反應過程中產(chǎn)物抑制比較明顯，因此，降低該酶的產(chǎn)物抑制，將有利于提高環(huán)糊精 得率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶（CGT酶）突 變體，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0. 3所示。
[0006] 所述突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的野生CGT酶的第598?636位 的氨基酸 TALGQNVYLTGSVSELGNWDPAKAIGPMYNQVVYQYPNW 替換成 TNYGTNVYLVGNAAELGTWDPNK AIGPMYNQVIAKYPSff〇
[0007] 編碼所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，來源于環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans)STB01〇
[0008] 本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一種獲得所述突變體的方法。根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的基因序列，設計合成新基因片段，通過基因重組的方法將此新基因片段替換表 達載體cgt/pST中編碼野生CGT酶第598?636位氨基酸的基因片段，獲得編碼突變體的 基因，并在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtil is) WB600中進行表達。
[0009] 所述方法包括以下步驟：
[0010] ⑴突變體的構建
[0011] 設計合成新基因片段，通過基因重組的方法將此新基因片段替換表達載體cgt/ pST中編碼野生CGT酶第598?636位氨基酸的基因片段，構建含編碼CGT酶突變體基因的 表達載體cgt/pST。
[0012] 新基因片段：
[0013] 5 ' -ACCAATTACGGAACAAATGTTTATCTTGTCGGCAACGCCGCCGAGCTCGGCACCTGGGACCCGAAC AAAGCGATTGGGCCGATGTACAATCAGGTGATCGCCAAGTACCCGTCCTGG-3，
[0014] 編碼野生CGT酶第598?636位氨基酸的基因片段（第1792?1908的基因片 段）：
[0015] 5 ' -ACGGCCCTTGGGCAAAATGTGTACCTGACGGGCAGTGTCAGCGAGCTGGGGAACTGGGACCCGGCA AAAGCAATCGGGCCGATGTACAATCAGGTCGTTTACCAATATCCGAACTGG-3，
[0016] 將含編碼CGT酶突變體基因的表達載體cgt/pST轉入大腸桿菌（Escherichia coli) JM109感受態(tài)細胞中，涂布到含有瓊脂的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后提取質粒并進行測序驗證，然后將質粒轉入表達宿主B. subtilis WB600感受態(tài)細胞中。上述各培養(yǎng)基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0017] (2)突變體的表達與純化
[0018] 挑取含突變質粒的表達宿主B. subtilis WB600的單克隆于LB培養(yǎng)基中，在37°C、 200r/min下培養(yǎng)8?12h，以4% (v/v)接種量接種到TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下 發(fā)酵24?48h。各培養(yǎng)基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。將發(fā)酵液于4°C、 lOOOOrpm離心20min以除去菌體，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和強陰離子交換Q-HP 柱相結合的方法，純化得到CGT酶突變體酶制品。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：構建了 1個有意義的突變體，其三種環(huán)化活力所對應的非競 爭性抑制常數(shù)均增加了 2-4倍，說明非競爭性產(chǎn)物抑制明顯減弱，而且，競爭性產(chǎn)物抑制也 有一定程度減弱，實現(xiàn)了重組CGT酶產(chǎn)物抑制的降低，比野生型CGT酶更利于環(huán)糊精的工業(yè) 化生產(chǎn)。

【具體實施方式】
[0020] 實施例1突變位點的確定
[0021] CGT酶中存在3個麥芽糖基結合位點（簡稱MBS)，分別稱為MBS1、MBS2和MBS3。 CGT酶作用淀粉生成環(huán)糊精過程中，環(huán)糊精產(chǎn)物會與CGT酶中MBS2結合，阻礙淀粉分子進 入催化活性中心，產(chǎn)生明顯的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，導致環(huán)糊精得率偏低。來源于環(huán)狀芽孢桿菌 (Bacillus circulans) STB01的CGT酶的MBS2,是由第598?636位的39個氨基酸殘基組 成。因此，若改變MBS2區(qū)域的的空間結構，可能能夠降低CGT酶的產(chǎn)物抑制，提高環(huán)糊精得 率。
[0022] 實施例2CGT酶突變體的制備
[0023] (1)突變體的構建
[0024] 設計合成新基因片段，并添加酶切位點5' Bsal和5' UTR，使用基因重組的方法通 過酶切位點5' Bsa I和3' BsrG I將此新基因片段替換表達載體cgt/pST中編碼野生CGT 酶第598?636位氨基酸的基因片段，構建含編碼CGT酶突變體基因的表達載體cgt/pST。
[0025] 新基因片段：
[0026] 5 ' -ACCAATTACGGAACAAATGTTTATCTTGTCGGCAACGCCGCCGAGCTCGGCACCTGGGACCCGAAC AAAGCGATTGGGCCGATGTACAATCAGGTGATCGCCAAGTACCCGTCCTGG-3，
[0027] 替換編碼野生CGT酶第598?636位氨基酸的基因片段（第1792?1908的基因 片段）：
[0028] 5，-ACGGCCCTTGGGCAAAATGTGTACCTGACGGGCAGTGTCAGCGAGCTGGGGAACTGGGACCCGGCA AAAGCAATCGGGCCGATGTACAATCAGGTCGTTTACCAATATCCGAACTGG-3 ,
[0029] 將含編碼CGT酶突變體基因的表達載體cgt/pST轉入大腸桿菌（Escherichia coli) JM109感受態(tài)細胞中，涂布到含有瓊脂的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后提取質粒并進行測序驗證，然后將質粒轉入表達宿主B. subtilis WB600感受態(tài)細胞中。上述各培養(yǎng)基中均添加5 μ g/mL硫酸卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。
[0030] (2)突變體的表達和純化
[0031] 挑取含突變質粒的表達宿主B. subtilis WB600的單克隆于LB培養(yǎng)基中，在37°C、 200r/min下培養(yǎng)8?12h，以4% (v/v)接種量接種到TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下 發(fā)酵24?48h。各培養(yǎng)基中添加5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素。將發(fā)酵液于4°C、 lOOOOrpm離心20min以除去菌體，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和強陰離子交換Q-HP 柱相結合的方法，純化得到CGT酶突變體酶制品。
[0032] 實施例3酶活測定分析
[0033] (1)酶活力的測定
[0034] α -環(huán)化活力的測定：取適當稀釋的酶液〇. lmL，加入裝有0. 9mL預先用10mM磷酸 緩沖液（PH6. 5)配制的1% (w/v)麥芽糊精（DE = 5)溶液的試管中，在50°C下反應lOmin 后，加入1. OmL 1. ON的鹽酸停止反應，再加入1. OmL用10mM磷酸緩沖液配制的0. ImM甲基 橙溶液20°C下保溫15min，在505nm下測定吸光度。以失活的酶作為空白，對應α-環(huán)糊 精標準曲線的測定出α-環(huán)糊精的含量。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成 1 μ mol的環(huán)糊精所需的酶量。
[0035] β -環(huán)化活力的測定：取適當稀釋的酶液0· lmL，加入裝有0· 9mL預先用10mM磷酸 緩沖液（PH6. 5)配制的1% (w/v)麥芽糊精（DE = 5)溶液的試管中，在50°C下反應lOmin 后，加入3. 5mL 30mM NaOH和0. 5mL由5mM Na2C03溶液配制的0. 02% (w/v)酚酞溶液反應， 在室溫下保溫15min，在550nm下測定吸光度。以失活的酶作為空白。一個酶活單位定義為 在上述條件下每分鐘生成1 μ mol β -環(huán)糊精所需的酶量。
[0036] 環(huán)化活力的測定：取適當稀釋的酶液0· lmL，加入裝有0· 9mL預先用10mM磷酸 緩沖液（PH6. 5)配制的1% (w/v)麥芽糊精（DE = 5)溶液的試管中，在50°C下反應10min 后，加入50 μ L 1. ON的鹽酸停止反應，再加入2mL 0. 2M檸檬酸緩沖液（pH4. 2)和100 μ L 5mM溴甲酚綠溶液，在室溫下保溫15min，在615nm下測定吸光度。以失活的酶作為空白。一 個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成1 μ mol γ -環(huán)糊精所需的酶量。
[0037] (2)酶產(chǎn)物抑制比較
[0038] CGT酶產(chǎn)物抑制的測定：控制反應溫度、pH、酶添加量不變，以麥芽糊精（DE = 5) 溶液作為反應底物，選擇反應底物濃度范圍為〇. 05?1 % (干基），測定不同底物濃度下反 應30min后α-、β-或γ-環(huán)糊精的的含量，得到以環(huán)糊精含量為指標的初始反應速率，作 米氏方程雙倒數(shù)圖；其他條件不變，在酶反應體系中添加 1或2mg/mL的β-環(huán)糊精，測定不 同底物濃度下反應30min后α-、β-或環(huán)糊精的的含量，得到以環(huán)糊精含量為指標的 初始反應速率，作米氏方程雙倒數(shù)圖。
[0039] 實驗結果列于表1，結果發(fā)現(xiàn)，β -環(huán)糊精對野生CGT酶及其突變體的三種環(huán)化活 力抑制類型為線性混合型抑制，方程式如下：
[0040]

【權利要求】
1. 一種環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶突變體，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2. 根據(jù)權利要求1所述的突變體，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的 野生環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的第598?636位的氨基酸替換成TNYGTNVYLVGNAAELGTWDPNK AIGPMYNQVIAKYPSff〇
3. 編碼權利要求1或2所述突變體的基因。
4. 含有權利要求3所述基因的載體或細胞。
5. -種獲得權利要求1所述突變體的方法，其特征在于，通過基因重組的方法對編碼 野生環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的基因進行突變，將突變后的基因進行表達得到突變體。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，設計合成SEQ ID NO. 4所示的基因片段， 通過基因重組的方法將此新基因片段替換編碼野生CGT酶第598?636位氨基酸的基因片 段，獲得編碼突變體的基因，并在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)WB600中進行表達。
7. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，挑取含突變基因的表達宿主B. subtilis WB600的單克隆于含5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/ min下培養(yǎng)8?12h，以體積比4%的接種量接種到含5 μ g/mL卡那霉素和10 μ g/mL赤霉素 的TB培養(yǎng)基中，在37°C、200r/min下發(fā)酵24?48h ;將發(fā)酵液于4°C、lOOOOrpm離心20min 以除去菌體，收集上清液并純化，得到CGT酶突變體。
8. -種減弱CGT酶產(chǎn)物抑制的方法，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 示的 CGT 酶的第 598 ?636 位的氨基酸替換成 TNYGTNVYLVGNAAELGTWDPNKAIGPMYNQVIAKYP Sff〇
9. 權利要求1所述CGT酶突變體在環(huán)糊精生產(chǎn)中的應用。
【文檔編號】C12R1/125GK104232602SQ201410467084
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權日:2014年9月12日
【發(fā)明者】李兆豐, 顧正彪, 李才明, 徐琪, 洪雁, 程力 申請人:江南大學