一種檢測(cè)肺炎鏈球菌的lamp引物組、試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種LAMP引物組，該引物組可以用于檢測(cè)肺炎鏈球菌，其特異性良好，該引物精密度高，穩(wěn)定性良好；本發(fā)明還在該LAMP引物組中引入環(huán)引物，使反應(yīng)出峰時(shí)間減少，該引物組檢測(cè)限可達(dá)300pg/μL，14min反應(yīng)出峰，臨床檢測(cè)時(shí)間為30min。應(yīng)用本發(fā)明建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肺炎鏈球菌，在特異性、靈敏度和精密性方面均可以獲得較理想的檢測(cè)結(jié)果。
【專利說明】—種檢測(cè)肺炎鏈球菌的LAMP引物組、試劑盒和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種引物組，具體涉及一種檢測(cè)肺炎鏈球菌的LAMP引物組、試劑盒和方法。

【背景技術(shù)】
[0002]肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, SP)普遍定植于人類呼吸道,是重要的侵襲性病原菌之一，是社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、鼻竇炎、腦膜炎、菌血癥等疾病的主要致病菌，其引起的腦膜炎和菌血癥死亡率高，約為30—40%和15—24%。肺炎鏈球菌主要感染2歲以下幼兒及65歲以上老年人，是導(dǎo)致兒童死亡的最重要原因之一，世界衛(wèi)生組織(WorldHealth Organizat1n, WHO)估計(jì)每年約有160萬人死于肺炎鏈球菌感染，其中70~100萬為5歲以下兒童。而且肺炎鏈球菌耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，給人類健康帶來嚴(yán)重的威脅。肺炎鏈球菌的快速診斷是一個(gè)系帶解決的問題。
[0003]2000年Notomi等開發(fā)出的一種新的DNA檢測(cè)技術(shù)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，之后Nagamine等研究表明，通過設(shè)計(jì)兩條環(huán)引物可使反應(yīng)速度提升1/3-1/2，目前該方法已經(jīng)在多種細(xì)菌及病毒的檢測(cè)方面均已建立了相關(guān)成熟的方法，并具有較高的應(yīng)用價(jià)值。2011年Naomi首次報(bào)將實(shí)時(shí)熒光LAMP(Rea-LAMP)技術(shù)用于瘧疾的診斷，其檢測(cè)的敏感度為96.7%，特異度為91.7%。實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)是在實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和傳統(tǒng)LAMP技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)的一種新的核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。由于該技術(shù)檢測(cè)的是熒光信號(hào)，其檢測(cè)敏感性顯著提高且在極大程度上縮短了檢測(cè)時(shí)間。熒光定量LAMP技術(shù)是一種便捷、靈敏、特異性高的快速檢測(cè)基因方法，該技術(shù)一旦應(yīng)用臨床將會(huì)在感染性疾病的早期診斷中發(fā)揮重要作用，同時(shí)精確的量化能為臨床治療起到指導(dǎo)作用。在疾病的預(yù)防控制中可起到早期檢測(cè)預(yù)防疾病擴(kuò)散的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種檢測(cè)肺炎鏈球菌的LAMP引物組、試劑盒、方法，以及該LAMP引物組在檢測(cè)肺炎鏈球菌中的用途。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案:一種檢測(cè)肺炎鏈球菌的LAMP引物組，包括以下引物:
[0006]外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG (SEQ ID:N0.1)；
[0007]外引物B3: GGCAACTGGTACTGGTTC (SEQ ID: N0.2)；
[0008]內(nèi)引物 FIP: TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC (SEQID: N0.3)；
[0009]內(nèi)引物BIP:
[0010]GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQ ID:N0.4)。
[0011]優(yōu)選地，所述LAMP引物組還包括:
[0012]環(huán)引物FLP: ACAGGCTGGTACTACCTCA (SEQ ID: N0.5)；
[0013]環(huán)引物BLP: GTACTTGACCCAGCCTGTC (SEQ ID: N0.6)。
[0014]本發(fā)明所述LAMP引物組中加入上述環(huán)引物后，使反應(yīng)出峰時(shí)間明顯縮短，進(jìn)而使得整個(gè)反應(yīng)時(shí)間縮短。
[0015]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)肺炎鏈球菌的試劑盒，所述試劑盒包括上述所述的LAMP引物組。
[0016]優(yōu)選地，所述試劑盒還包括反應(yīng)液、顯色劑、Bst大片斷DNA聚合酶、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和超純水；所述反應(yīng)液包括Tris-HCl (PH8.8)、KCUMgSO4, (NH4)2SO4, Tween20、甜菜堿以及dNTP。
[0017]優(yōu)選地，所述試劑盒中所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ M，所述外引物F3和Β3各 0.2 μ Μ，所述試劑盒中所述反應(yīng)液包括 20mM Tris-HCl (PH8.8)、1mM KCl、8mM MgSO4,1mM(NH4)2SO4^0.1% Tween20、IM甜菜堿以及1.6mM dNTP，所述試劑盒中所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/ μ L ;
[0018]或者所述試劑盒中所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，所述環(huán)引物FLP和BLP各0.8 μ Μ，所述試劑盒中所述反應(yīng)液包括20mMTris-HCl (PH8.8) UOmM KCl、8mM MgSO4UOmM(NH4)2SO4^0.1 % Tween20、IM甜菜堿以及 1.6mMdNTP,所述試劑盒中所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/ μ L。
[0019]優(yōu)選地，所述熒光顯色劑為SYBR Green I，所述陽性對(duì)照品為30ng/ μ L的肺炎鏈球菌DNA，所述陰性對(duì)照品為 ddH20。
[0020]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)肺炎鏈球菌的方法，所述方法為采用上述所述的LAMP引物組檢測(cè)肺炎鏈球菌。
[0021]優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟:
[0022](Ia)提取待檢樣品的DNA ；
[0023](2a)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng):
[0024]配置LAMP反應(yīng)體系，每25 μ L體積的LAMP反應(yīng)體系:12.5μ L反應(yīng)液，7.0μ L超純水，I μ L引物內(nèi)、外引物，0.5 μ L顯色劑，I μ LBst大片斷DNA聚合酶以及2 μ L模板；所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，所述反應(yīng)液包括20mMTris-HCl (PH8.8) UOmM KCl、8mM MgSO4UOmM(NH4)2SO4^0.1 % Tween20、IM甜菜堿以及 1.6mMdNTP,所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/ μ L ；LAMP反應(yīng)條件為在63°C恒溫反應(yīng)60min。
[0025]或者所述方法包括以下步驟:
[0026](Ib)提取待檢樣品的DNA ；
[0027](2b)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng):
[0028]配置LAMP反應(yīng)體系，每25 μ L體積的LAMP反應(yīng)體系:12.5 μ L反應(yīng)液，7.0 μ L超純水，IyL引物內(nèi)、外引物，IyL環(huán)引物，0.5 μ L顯色劑，IyLBst大片斷DNA聚合酶以及
2μ L模板；所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，所述反應(yīng)液包括 20mM Tris-HCl (PH8.8) UOmM KCl、8mM MgS04、1mM(NH4) 2S04、0.1 % Tween20、IM 甜菜堿以及1.6mM dNTP,所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/ μ L ；LAMP反應(yīng)條件為在63°C恒溫反應(yīng)30min。
[0029]優(yōu)選地，所述步驟(Ib)或(2b)中顯色劑為SYBR Green I。
[0030]本發(fā)明還提供了上述所述的LAMP引物組在檢測(cè)肺炎鏈球菌中的用途。所述用途為非疾病治療或診斷目的的。
[0031]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種LAMP引物組，該引物組可以用于檢測(cè)肺炎鏈球菌，其特異性良好，該引物精密度高，穩(wěn)定性良好；本發(fā)明還在該LAMP引物組中引入環(huán)引物，使反應(yīng)出峰時(shí)間減少，該引物組檢測(cè)限可達(dá)300pg/y L，14min反應(yīng)出峰，臨床檢測(cè)時(shí)間為30min。應(yīng)用本發(fā)明建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肺炎鏈球菌，在特異性、靈敏度和精密性方面均可以獲得較理想的檢測(cè)結(jié)果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為本發(fā)明所述肺炎鏈球菌LAMP引物組的引物組成及對(duì)應(yīng)區(qū)域；
[0033]圖2為本發(fā)明所述肺炎鏈球菌LAMP引物組(不加環(huán)引物)的LAMP反應(yīng)曲線圖；
[0034]圖3為本發(fā)明所述肺炎鏈球菌LAMP引物組(加環(huán)引物)的LAMP反應(yīng)曲線圖；
[0035]圖4、圖5、圖6均為本發(fā)明所述肺炎鏈球菌LAMP引物組的特異性驗(yàn)證曲線圖；
[0036]圖7為本發(fā)明所述LAMP引物組的靈敏度驗(yàn)證曲線圖；
[0037]圖8、圖9均為本發(fā)明所述LAMP引物組的精密度驗(yàn)證曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0038]為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0039]實(shí)施例1
[0040]用于檢測(cè)肺炎鏈球菌的LAMP引物組設(shè)計(jì)以及性能評(píng)價(jià)
[0041]1、材料和方法
[0042]1.1.實(shí)驗(yàn)材料
[0043]1.1.1肺炎鏈球菌DNA
[0044]1.1.2其他品系及物種
[0045]銅綠假單胞菌、大腸桿菌、白色念球菌、光滑念珠菌、陰溝腸桿菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、草綠色鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷白桿菌、溶血性葡萄球菌、鳥分枝桿菌、龜膿分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌共15種對(duì)照菌株。
[0046]1.2主要試劑和耗材
[0047](I)LAMP 反應(yīng)試劑:
[0048]Bst DNA polymerase large fragment, New England B1labs 公司；
[0049]甜菜喊(Betaine)、MgCl2,Sigma 公司。
[0050]dNTPs,寶生物工程(大連)有限公司。
[0051](2)顯色劑:SYBR Green I 突光染料，Invitrogen。
[0052](3)LAMP引物組(正向外引物F3、正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、反向外引物B3、正向環(huán)引物FLF、反向環(huán)引物FLB)，生工生物工程(上海)有限公司。
[0053]1.3主要儀器設(shè)備
[0054](I)-8CTC凍存柜，DAYA-024, Thermo Fisher Scientific ；
[0055](2)高速臺(tái)式離心機(jī)，PICOl7, Thermo Fisher Scientific ；
[0056] (3) ESEQuant TubeSanner,廣州迪澳生物科技有限公司
[0057](4)漩渦混合器，MS 2，德國(guó)IKA公司；
[0058](5)微量移液器，1000 μ 1、200 μ 1、100 μ 1、10 μ 1，2.5 μ 1，德國(guó) Eppendorf 公司；
[0059](6)分析天平，AL104，梅特勒-托利多儀器有限公司；
[0060](7)超凈工作臺(tái)，SW-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；
[0061]1.4 方法
[0062]1.4.1引物的設(shè)計(jì)
[0063]1.4.1.1LAMP引物的設(shè)計(jì)步驟
[0064]①查閱肺炎鏈球菌相關(guān)文獻(xiàn)，了解肺炎鏈球菌目前核酸檢測(cè)的靶序列為溶血素A基因(pneumolysin A, ply A)。
[0065]②在NCBI網(wǎng)站中查找該序列；
[0066]③使用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer vers1n4 (http: //primerexplorer.jp/e)和LAMP Designer軟件設(shè)計(jì)特異引物，目的片段選取肺炎鏈球菌溶血素A基因中的特異、保區(qū)域；
[0067]1.4.1.2LAMP 引物簡(jiǎn)介
[0068]LAMP引物包括兩個(gè)外引物和兩個(gè)內(nèi)引物，特異結(jié)合靶序列上的6個(gè)特異區(qū)域。內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc (與Fl區(qū)域互補(bǔ))和F2序列，內(nèi)引物BIP包含Blc (與BI區(qū)域互補(bǔ))和B2序列，外引物為F3和B3序列，本發(fā)明在內(nèi)外引物的基礎(chǔ)上引入環(huán)引物FLP和BLP，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，具體引物信息見圖1。
[0069]1.4.1.3LAMP反應(yīng)引物序列
[0070]肺炎鏈球菌LAMP引物組見表1，靶基因:肺炎鏈球菌溶血素A基因(pneumolysinA, ply A)。
[0071 ] 表1肺炎鏈球菌LAMP引物組
[0072]

I 00CTCTACTGTGAATTCTGG......(SEq"",d:NOj......) I
[0073]
—GGCAACTGGTACTGGTTC ( SEQ ID:N0.2 )

tatccagtcagcggacggacttgtctgccagtgttcc
FlP ( Flc+F2 )


(SEQ ID:N0.3 )

GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCA
BIP ( Blc+B2 )


TG ( SEQ 1D:N0.4 )
FLPACAGGCTGGTACTACCTCA ( SEQ ID:N0.5 )
—-GTACTTGACCCAGCCTGTC ( SEQ ID:N0.6)
[0074]1.4.2DNA濃度及純度的測(cè)定
[0075]取50 μ L DNA溶液加ddH20梯度稀釋至500 μ L，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm處的光密度值。DNA的濃度按照以下公式計(jì)算獲得:
[0076]C = ODX 50 μ g/mL 式中:
[0077]C——DNA 濃度(ng/ μ L)；
[0078]OD——260nm處的測(cè)得的OD值，約為0.666 ；
[0079]10D260nm = 50ng/ μ L 雙鏈 DNA ；
[0080]C = 0.666x50 = 33.3 μ g/mL。
[0081]1.4.3LAMP引物篩選及反應(yīng)體系的建立
[0082]參考文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)，初步確定25 μ L的LAMP反應(yīng)體系，其成分包括:FIP和BIP各
1.6 μ M，F(xiàn)3 和 B3 各 0.2 μ M，F(xiàn)LP 和 BLP 各 0.8 μ Μ，反應(yīng)液(20mMTris-HCl (PH8.8)，1mMKCl，8mM MgSO4, 1mM (NH4)2SO4,0.1 % Tween20，IM甜菜堿，1.6mMdNTP)，8U/μ L Bst 大片斷 DNA聚合酶，2 μ I DNA。
[0083]具體操作時(shí)先在冰上準(zhǔn)備LAMP反應(yīng)混合液，擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:
[0084]12.5 μ L反應(yīng)液,7.0yL超純水，I μ L引物內(nèi)、外引物，I μ L環(huán)引物,0.5 μ L顯色劑，I μ LBst酶以及2μ L模板。
[0085]將除模板外其他試劑配備成混合液混勻后，每管分裝23 μ L，加入20 μ L密封液后再分別加入2 μ L模板DNA或陰陽性對(duì)照模板，混勻離心。所述密封液成分為礦物油。
[0086]最后參照LAMP ESEQuant TubeSanner使用說明書，將混合物置于ESEQuantTubeSanner反應(yīng)孔中，于63?恒溫反應(yīng)60min,激發(fā)光強(qiáng)度為40。反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)出峰時(shí)間及陰陽性符合率初步篩選引物。
[0087]1.4.4LAMP引物特異性實(shí)驗(yàn)
[0088]用銅綠假單胞菌、大腸桿菌、白色念球菌、光滑念珠菌、陰溝腸桿菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、草綠色鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷白桿菌、溶血性葡萄球菌、鳥分枝桿菌、龜膿分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌共15種對(duì)照菌株的DNA作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，以300ng/ μ L肺炎鏈球菌DNA和ddH20分別作為陽性、陰性對(duì)照，在ESEQuantTube Sanner上63°C運(yùn)行60min，激發(fā)光強(qiáng)度為40，驗(yàn)證LAMP反應(yīng)的特異性，利用擴(kuò)增曲線觀察反應(yīng)結(jié)果。
[0089]1.4.5LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0090]將300ng/ μ L 肺炎鏈球菌 DNA 逐次稀釋到 30ng/ μ L, 3ng/ μ L, 0.3ng/ μ L0.03ng/μ L, 3pg/ μ L,0.3pg/ μ L 6 個(gè)梯度，取后稀釋后的 5 個(gè)濃度(3ng/ μ L,0.3ng/ μ L0.03ng/μ L, 3pg/ μ L, 0.3pg/ μ L)做靈敏度實(shí)驗(yàn)；每個(gè)稀釋度分別取2 μ I進(jìn)行LAMP實(shí)驗(yàn)，以ddH20代替DNA模板作為陰性對(duì)照，以本發(fā)明所述LAMP引物組(加環(huán)引物)作為引物，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；激發(fā)光強(qiáng)度為40，63°C運(yùn)行60min以確定LAMP反應(yīng)的靈敏度；同時(shí)根據(jù)最低靈敏度出峰時(shí)間，確定反應(yīng)時(shí)間。
[0091]1.4.6LAMP精密度實(shí)驗(yàn)(最低檢出度10倍濃度樣品，10個(gè)重復(fù))
[0092]將3ng/ μ L肺炎鏈球菌DNA作為模板，肺炎鏈球菌30ng/ μ L DNA作為陽性對(duì)照，ddH20代替DNA模板作為陰性對(duì)照，以本發(fā)明所述LAMP引物組作為引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，激發(fā)光強(qiáng)度為40，63°C運(yùn)行，10個(gè)平行樣品觀察3ng/ μ L精密度LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性。
[0093]2、結(jié)果與分析
[0094]2.1LAMP引物篩選及反應(yīng)體系的建立
[0095]應(yīng)用1.4.1.3中設(shè)計(jì)的LAMP引物，采用1.4.3中的反應(yīng)體系，進(jìn)行LAMP弓丨物篩選與反應(yīng)體系的建立。
[0096]用30ng/ μ L肺炎鏈球菌DNA作為陽性模板，ddH20作為陰性對(duì)照，分別用各套引物進(jìn)行LAMP反應(yīng)，63°C運(yùn)行60min，激發(fā)光強(qiáng)度為40。結(jié)果如圖2所示。
[0097]由圖2可知，設(shè)計(jì)的LAMP引物組出峰時(shí)間約35min ;考慮加入環(huán)引物再次驗(yàn)證，初步將反應(yīng)時(shí)間控制在60min。
[0098]加環(huán)引物后實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。
[0099]由圖3可知，加入環(huán)引物后，設(shè)計(jì)的引物組出峰時(shí)間均明顯縮短，約9-10min，可用LAMP引物組進(jìn)行特異性和靈敏度等實(shí)驗(yàn)。
[0100]2.2LAMP引物特異性的鑒定
[0101]根據(jù)1.4.4的實(shí)驗(yàn)方案，驗(yàn)證本發(fā)明所述LAMP引物組的特異性。結(jié)果如圖4、圖5和圖6所示。
[0102]由圖4、圖5和圖6可知:本發(fā)明所述LAMP引物組只對(duì)肺炎鏈球菌特異性檢出，陽性對(duì)照的15種均無檢出，特異性良好，可以用該引物組進(jìn)行肺炎鏈球菌靈敏度和精密度實(shí)驗(yàn)。
[0103]2.3LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0104]根據(jù)1.4.5中的LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果如圖7所示。
[0105]從圖7中可以看出，采用肺炎鏈球菌DNA稀釋至不同濃度梯度，本發(fā)明所述LAMP引物組作為引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，出峰時(shí)間和濃度梯度呈明顯梯度變化；檢測(cè)靈敏度可達(dá)300pg/y L，約14min出峰；未出現(xiàn)假陽性，可以將反應(yīng)時(shí)間確定為30min。
[0106]2.4LAMP精密度實(shí)驗(yàn)(最低檢出度10倍濃度樣品，10個(gè)重復(fù))
[0107]按1.4.6的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行LAMP精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8、圖9所示。
[0108]由圖8及圖9可知，最低檢出度10倍濃度(3ng/l.! I)的10個(gè)平行樣品都能穩(wěn)定地檢出，說明LAMP穩(wěn)定性較好。
[0109]3、結(jié)論
[0110](I)本發(fā)明針對(duì)肺炎鏈球菌溶血素A基因(ply A)序列，采用Primer Explorervers1n4(http://primerexplorer.jp/e)和 LAMP Designer 軟件設(shè)計(jì)了引物 Strep-1,用ESEQuant Tube Sanner平臺(tái)在63°C、60min、激發(fā)光強(qiáng)度為40條件下進(jìn)行檢測(cè),成功建立了肺炎鏈球菌的LAMP檢測(cè)方法；
[0111](2)以銅綠假單胞菌、大腸桿菌、白色念球菌、光滑念珠菌、陰溝腸桿菌、表皮葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、草綠色鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷白桿菌、溶血性葡萄球菌、鳥分枝桿菌、龜膿分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌共15種菌做陰性對(duì)照，進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果顯示該引物與上述15種菌均無擴(kuò)增，特異性良好；
[0112](3)進(jìn)行了本發(fā)明所述LAMP引物組的靈敏度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示該引物檢測(cè)限可達(dá)300pg/yL, 14min反應(yīng)出峰，臨床檢測(cè)時(shí)間定為30min ；
[0113](4)進(jìn)行了本發(fā)明所述LAMP引物組的精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示最低檢出度10倍濃度的樣品(3ng/yl)的穩(wěn)定性良好。
[0114]綜上所述，應(yīng)用本發(fā)明建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肺炎鏈球菌，在特異性、靈敏度和精密性方面均可以獲得較理想的檢測(cè)結(jié)果。
[0115]實(shí)施例2
[0116]本發(fā)明所述檢測(cè)肺炎鏈球菌的試劑盒的一種實(shí)施例，所述試劑盒包括LAMP引物組，反應(yīng)液，顯色劑，Bst大片斷DNA聚合酶，陽性對(duì)照品，陰性對(duì)照品和超純水；
[0117]所述引物組:
[0118]外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG (SEQ ID:N0.1)；
[0119]外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC (SEQ ID:N0.2)；
[0120]內(nèi)引物 FIP: TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC (SEQ ID: N0.3)；
[0121]內(nèi)引物BIP:
[0122]GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQ ID:N0.4)；
[0123]所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ。
[0124]所述反應(yīng)液包括20mMTris-HCl(PH8.8)，10mM KCl, 8mM MgS04,10mM(NH4) 2S04,
0.1% Tween20, IM 甜菜堿，1.6mM dNTP。
[0125]所述顯色劑為SYBR Green I。
[0126]所述Bst大片段DNA聚合酶濃度為8U/μ L。
[0127]所述陽性對(duì)照品為30ng/ μ L的肺炎鏈球菌DNA。
[0128]所述陰性對(duì)照品為ddH20。
[0129]本試劑盒的使用方法的一種實(shí)施例如下:
[0130](I)配制25 μ L的LAMP反應(yīng)體系:12.5 μ L反應(yīng)液，8.0 μ L超純水，I μ L引物內(nèi)、外引物，0.5 μ L顯色劑，I μ LBst酶以及2 μ L模板。
[0131](2)將除模板外其他試劑配備成混合液混勻后，每管分裝23μ L，加入20μ L密封液后再分別加入2 μ L模板DNA或陰陽性對(duì)照模板，混勻離心。
[0132](3)參照 LAMP ESEQuant TubeSanner 使用說明書，將混合物置于 ESEQuantTubeSanner反應(yīng)孔中，于63°C恒溫反應(yīng)60min,激發(fā)光強(qiáng)度為40。
[0133]實(shí)施例3
[0134]本發(fā)明所述檢測(cè)肺炎鏈球菌的試劑盒的一種實(shí)施例，所述試劑盒包括LAMP引物組，反應(yīng)液，顯色劑，Bst大片斷DNA聚合酶，陽性對(duì)照品，陰性對(duì)照品和超純水；
[0135]所述引物組:
[0136]外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG (SEQ ID:N0.1)；
[0137]外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC (SEQ ID:N0.2)；
[0138]內(nèi)引物 FIP: TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC (SEQ ID: N0.3)；
[0139]內(nèi)引物BIP:
[0140]GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQ ID:N0.4)；
[0141]環(huán)引物FLP: ACAGGCTGGTACTACCTCA (SEQ ID: N0.5)；
[0142]環(huán)引物BLP: GTACTTGACCCAGCCTGTC (SEQ ID: N0.6)；
[0143]所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6μΜ，所述外引物F3和B3各0.2μΜ，所述環(huán)引物FLP和 BLP 各 0.8 μ Μ。
[0144]所述反應(yīng)液包括20mMTris-HCl(PH8.8)，10mM KCl, 8mM MgS04,10mM(NH4) 2S04,
0.1% Tween20, IM 甜菜堿，1.6mM dNTP。
[0145]所述顯色劑為SYBR Green I。
[0146]所述Bst大片段DNA聚合酶濃度為8U/μ L。
[0147]所述陽性對(duì)照品為30ng/ μ L的肺炎鏈球菌DNA。
[0148]所述陰性對(duì)照品為ddH20。
[0149]本試劑盒的使用方法的一種實(shí)施例如下:
[0150](I)配制25 μ L的LAMP反應(yīng)體系:12.5 μ L反應(yīng)液，7.0 μ L超純水，I μ L引物內(nèi)、外引物，I μ L環(huán)引物,0.5 μ L顯色劑，I μ LBst酶以及2 μ L模板。
[0151](2)將除模板外其他試劑配備成混合液混勻后，每管分裝23μ L，加入20μ L密封液后再分別加入2 μ L模板DNA或陰陽性對(duì)照模板，混勻離心。所述封閉液成分為礦物油。
[0152](3)參照 LAMP ESEQuant TubeSanner 使用說明書，將混合物置于 ESEQuantTubeSanner反應(yīng)孔中，于63°C恒溫反應(yīng)60min,激發(fā)光強(qiáng)度為40。
[0153]實(shí)施例4
[0154]本發(fā)明所述檢測(cè)肺炎鏈球菌的方法的一種實(shí)施例，所述方法包括:
[0155](I)提取待檢樣品的DNA ；
[0156](2)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng):
[0157]配置LAMP反應(yīng)體系，每25 μ L體積的LAMP反應(yīng)體系:12.5 μ L反應(yīng)液，7.0 μ L超純水，I μ L引物內(nèi)、外引物，0.5 μ L顯色劑，I μ LBst大片斷DNA聚合酶以及2 μ L模板；所述試劑盒中所述內(nèi)引物F IP和BIP各1.6 μ Μ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，所述試劑盒中所述反應(yīng)液包括 20mM Tris-HCl (PH8.8) UOmM KCl、8mM MgSO4UOmM(NH4)2SO4^0.l%Tween20,IM甜菜堿以及1.6mM dNTP,所述試劑盒中所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/ μ L ；LAMP反應(yīng)條件為在63°C恒溫反應(yīng)60min。
[0158]其中，外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG (SEQ ID:N0.1)；
[0159]外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC (SEQ ID:N0.2)；
[0160]內(nèi)引物 FIP: TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC (SEQ ID: N0.3)；
[0161]內(nèi)引物BIP:
[0162]GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQ ID:N0.4)；
[0163]所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ。
[0164]所述顯色劑為SYBR Green I。
[0165]實(shí)施例5
[0166]本發(fā)明所述檢測(cè)肺炎鏈球菌的方法的一種實(shí)施例，所述方法包括:
[0167](I)提取待檢樣品的DNA ；
[0168](2)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng):
[0169]配置LAMP反應(yīng)體系，每25 μ L體積的LAMP反應(yīng)體系:12.5 μ L反應(yīng)液，7.0 μ L超純/Jc, I μ L引物內(nèi)、外引物，I μ L環(huán)引物，0.5 μ L顯色劑，I μ LBst大片斷DNA聚合酶以及2 μ L模板；所述試劑盒中所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，所述試劑盒中所述反應(yīng)液包括 20mM Tris-HCl (PH8.8) UOmM KCl、8mM MgSO4UOmM(NH4)2SO4、0.1% Tween20、lM甜菜堿以及1.6mM dNTP，所述試劑盒中所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/ μ L ；LAMP反應(yīng)條件為在63°C恒溫反應(yīng)30min。
[0170]其中，外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG (SEQ ID:N0.1)；
[0171]外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC (SEQ ID:N0.2)；
[0172]內(nèi)引物 FIP: TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC (SEQ ID: N0.3)；
[0173]內(nèi)引物BIP:
[0174]GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQ ID:N0.4)；
[0175]環(huán)引物FLP: ACAGGCTGGTACTACCTCA (SEQ ID: N0.5)；
[0176]環(huán)引物BLP:GTACTTGACCCAGCCTGTC (SEQ ID:N0.6)；
[0177]所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6μΜ，所述外引物F3和B3各0.2μΜ，所述環(huán)引物FLP和 BLP 各 0.8 μ Μ。
[0178]所述顯色劑為SYBR Green I。
[0179] 最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)肺炎鏈球菌的LAMP引物組，其特征在于，包括以下引物:
外引物 F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG ； 外引物 B3:GGCAACTGGTACTGGTTC ；
內(nèi)引物 FIP:TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC ； 內(nèi)引物BIP:
GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATGo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)肺炎鏈球菌的LAMP引物組，其特征在于，所述LAMP引物組還包括:
環(huán)引物 FLP: ACAGGCTGGTACTACCTCA ；
環(huán)引物 BLP: GTACTTGACCCAGCCTGTC。
3.—種檢測(cè)肺炎鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1或2所述的LAMP引物組。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)肺炎鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反應(yīng)液、顯色劑、Bst大 片斷DNA聚合酶、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和超純水；所述反應(yīng)液包括 Tris-HCl (PH8.8)、KCUMgSO4, (NH4)2SO4, Tween20、甜菜堿以及 dNTP。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)肺炎鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ M，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，所述試劑盒中所述反應(yīng)液包括 20mM Tris-HCl (PH8.8) UOmM KCl、8mM MgS04、1mM(NH4) 2S04、0.1 % Tween20、IM 甜菜堿以及1.6mM dNTP，所述試劑盒中所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/μ L ; 或者所述試劑盒中所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，所述環(huán)引物FLP和BLP各0.8 μ Μ，所述試劑盒中所述反應(yīng)液包括20mM Tris-HCl (PH8.8)、1mM KCl、8mM MgS04、1mM(NH4) 2S04、0.1 % Tween20、IM 甜菜堿以及 1.6mM dNTP，所述試劑盒中所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/ μ L0
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)肺炎鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述熒光顯色劑為SYBR Green I，所述陽性對(duì)照品為30ng/μ L的肺炎鏈球菌DNA，所述陰性對(duì)照品為ddH20。
7.—種檢測(cè)肺炎鏈球菌的方法，其特征在于，所述方法為采用如權(quán)利要求1或2所述的LAMP引物組檢測(cè)肺炎鏈球菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)肺炎鏈球菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (Ia)提取待檢樣品的DNA ； (2a)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng): 配置LAMP反應(yīng)體系，每25 μ L體積的LAMP反應(yīng)體系:12.5 μ L反應(yīng)液，7.0 μ L超純/K，I μ L引物內(nèi)、外引物,0.5μ L顯色劑，I μ LBst大片斷DNA聚合酶以及2μ L模板；所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6μΜ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，所述反應(yīng)液包括20mMTris-HCl (PH8.8) UOmM KCl、8mM MgSO4UOmM(NH4)2SO4^0.1 % Tween20、IM甜菜堿以及 1.6mMdNTP所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/ μ L ；LAMP反應(yīng)條件為在63°C恒溫反應(yīng)60min ；或者所述方法包括以下步驟: (Ib)提取待檢樣品的DNA ； (2b)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng):配置LAMP反應(yīng)體系，每25 μ L體積的LAMP反應(yīng)體系:12.5 μ L反應(yīng)液，7.0 μ L超純水，Iμ L引物內(nèi)、外引物，I μ L環(huán)引物，0.5 μ L顯色劑，I μ LBst大片斷DNA聚合酶以及2 μ L模板；所述試劑盒中所述內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，所述外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，所述試劑盒中所述反應(yīng)液包括20mM Tris-HCl (PH8.8) UOmM KCl、8mM MgSO4UOmM(NH4)2SO4^0.1%Tween20、lM甜菜堿以及1.6mM dNTP，所述試劑盒中所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/μ L ；LAMP反應(yīng)條件為在63°C恒溫反應(yīng)30min。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)肺炎鏈球菌的方法，其特征在于，所述步驟(Ib)或(2b)中顯色劑為SYBR Green I。
10.一種如權(quán)利要求1或2所述的LAMP引物組在檢測(cè)肺炎鏈球菌中的用途。
【文檔編號(hào)】C12R1/46GK104164508SQ201410406124
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】郭旭光, 夏勇, 江鏡全, 陳瓊, 劉美玲, 唐曉華 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院