一種檢測牛hcd攜帶者的特異性pcr引物、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測引物與試劑盒，具體公開了檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物及試劑盒。所述引物包括如SEQ ID NO.1～3所示的核苷酸序列，以待測樣本總DNA為模板，利用所述引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物中僅出現(xiàn)171bp的電泳條帶時，表示待測樣本不攜帶HCD；當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物中同時出現(xiàn)171bp和366bp電泳條帶時，表示待測樣本攜帶HCD的雜合子；當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物中僅出現(xiàn)366bp電泳條帶時，表示待測樣本為HCD純合子。
【專利說明】
-種檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物、試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及檢測引物與試劑盒，具體地說，涉及檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引 物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 在奶牛育種中，由于后裔測定、基因組選擇等現(xiàn)代育種技術(shù)的應(yīng)用，在極大地提高 了選擇準確性的同時，也潛在地提高了選擇強度。由于人工授精(AI)等繁殖生物技術(shù)的應(yīng) 用，使個別優(yōu)秀種公牛得到廣泛使用，增加了群體的近交系數(shù)，降低了有效群體含量，隱性 基因純合的概率加大，使不良基因在奶牛群體中不斷出現(xiàn)，隨著基因組學(xué)研究的不斷深入 和高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，加快了奶牛隱性遺傳缺陷的挖據(jù)、鑒定與應(yīng)用。
[0003] 單倍型，在遺傳學(xué)上是指在同一染色體上進行共同遺傳的多個基因座上等位基因 的組合。有害單倍型是新近幾年在牛群中出現(xiàn)的隱性遺傳缺陷的新形式，在荷斯坦牛群中 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種單倍型，成功進行區(qū)間定位的單倍型有15種。當(dāng)這些單倍型隱性純合時，就 會表現(xiàn)出不同類型的臨床癥狀、胚胎早期死亡等，是影響奶牛群繁殖健康的隱性殺手，嚴重 影響著奶牛養(yǎng)殖者的經(jīng)濟效益。
[0004] 膽固醇缺乏單倍型（HCD，Hap 1 〇 t yp e as so c i at ed w i th Cho 1 e s t er ο 1 Deficiency)是在荷斯坦牛群中新發(fā)現(xiàn)的一種隱性遺傳缺陷。其遺傳方式是當(dāng)一頭犢牛從 其父母處都遺傳了 HCD基因時，稱為感染者(純合子）。感染牛的血液中膽固醇含量極低，可 阻止奶牛正常的體脂沉積，其臨床表現(xiàn)為慢性腹瀉、生長緩慢、體重降低，通常6月齡的犢牛 易早期死亡。目前已知該遺傳缺陷基因最早的來源是加拿大種公牛Maughlin Storm (H0CANM5457798)。
[0005] HCD的分子遺傳基礎(chǔ)是在牛11號染色體(BTA11)上APOB(Apolipoprotein B)基因 編碼區(qū)有1299bp轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件ERV2-1的插入突變，導(dǎo)致ΑΡ0Β基因轉(zhuǎn)錄終止、剪接異常，使原 4567個氨基酸肽鏈被135個氨基酸殘肽所取代，丟失了97 %的蛋白質(zhì)(Menzi等，2016)。
[0006] 2015年加拿大使用的荷斯坦種公牛約10%是已知或可能的HCD攜帶者。在LPI前 100名的驗證公牛中，有5頭是HCD攜帶者；在基因組測定前100名的青年公牛中，有2頭是攜 帶者;Kipp等(2015)預(yù)測，德國每年大約有3400個HCD純合子出生，攜帶率約8.7%。
[0007] 牛冷凍精液和人工授精技術(shù)的普及和廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致優(yōu)秀種公牛的影響和使用范 圍是世界性的。一頭優(yōu)秀種公牛一生可以生產(chǎn)幾十萬劑甚至上百萬劑冷凍精液，其遺傳影 響可想而知。由于優(yōu)秀種公牛冷凍精液在全世界范圍內(nèi)的流通和廣泛使用，荷斯坦牛群中 發(fā)現(xiàn)的有害單倍型帶來的都是世界性的問題。這導(dǎo)致近年來奶牛育種工作者在重視優(yōu)秀種 公牛生產(chǎn)性能表現(xiàn)的同時，更加重視優(yōu)秀種公牛是否攜帶一些不良隱性基因的影響。因此， 建立一種有效的檢測膽固醇缺乏單倍型的分子生物學(xué)方法，制定合理選種選配方案，是降 低HCD純合子的最好方法。
[0008] 目前，我國尚未開展相關(guān)的研究和檢測工作，HCD單倍型在我國荷斯坦牛群中的攜 帶情況尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測牛HCD攜帶者的 特異性PCR引物、試劑盒及檢測方法。
[0010] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0011] 第一方面，本發(fā)明經(jīng)嚴格篩選后提供一種檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物，其 特征在于，所述引物包括：
[0012] 上游引物F: 5' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3' ；
[0013] 下游引物R1:5' -AGATGATGCCCCTCTTGATG-3' ；
[0014] 下游引物R2:5 ' -CACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '。
[0015] 進一步地，本發(fā)明提供了前述引物在制備檢測牛HCD攜帶者的試劑盒方面的應(yīng)用， 并提供了含有前述引物的試劑或試劑盒。
[0016] 所述試劑盒包括:本發(fā)明所述特異性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、10 X Buffer、 ddH20〇
[0017] 所述試劑盒的工作程序為：94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，58±8°C退火30s，72°C 延伸30s，35個循環(huán)；72°C延伸7min。
[0018] 經(jīng)過對PCR反應(yīng)程序試劑盒的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)退火溫度為62°C時，PCR擴增特異性最 好，條帶單一，且最亮。能夠有效保證擴增的有效性和準確性。
[0019] 第二方面，本發(fā)明還提供了一種非疾病的診斷和治療目的的檢測牛HCD攜帶者的 方法，該方法可用于牛HCD單倍型的篩選和鑒定工作。所述方法具體為：以待測樣本總DNA為 模板，利用本發(fā)明所述引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物中僅出 現(xiàn)17lbp的電泳條帶時，表示待測樣本不攜帶HCD;當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物中出現(xiàn)366bp電泳條帶時， 表示待測樣本攜帶HCD。且進一步地，當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物中同時出現(xiàn)171bp和366bp電泳條帶時， 表示待測樣本為攜帶HCD的雜合子;當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物中僅出現(xiàn)366bp電泳條帶時，表示待測樣 本為HCD純合子。
[0020] 進一步地，本發(fā)明PCR反應(yīng)體系總體積25yL:
[0023] 更進一步地，PCR工作程序為：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，58 ± 8 °C退火30s，72。(:延伸30s，35個循環(huán);72°C延伸7min。優(yōu)選退火溫度為62°C。
[0021]
[0022]
[0024]本發(fā)明的有益效果在于：
[0025]本發(fā)明提供了檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物及試劑盒，并提供了利用所述特 異性PCR引物進行多重PCR法檢測牛膽固醇缺乏單倍型的方法，具體為利用SEQ ID NO. 1~3 所示的核苷酸序列為引物，對牛的總DNA進行PCR擴增，得到SEQ ID NO.4和或SEQ ID NO. 5 所示的DNA序列，通過瓊脂糖電泳檢測，得到如附圖1所示的基因型，從而可以直接判定HCD 攜帶者的基因型。
[0026] 本發(fā)明還優(yōu)化了上述PCR的反應(yīng)程序，開發(fā)了一套檢測HCD單倍型的的PCR檢測方 法，為荷斯坦牛的選種、選配提供了技術(shù)支撐。
[0027] 本發(fā)明建立了一種快速、準確、高效的膽固醇缺乏單倍型(H⑶)分子檢測方法，為 奶牛Η⑶單倍型因的分子篩查提供一種技術(shù)手段，為在今后的育種工作中有計劃地降低HCD 單倍型頻率提供了技術(shù)支撐，為奶牛場進行科學(xué)的選種選配提供了依據(jù)。
【附圖說明】
[0028]圖1為檢測牛膽固醇缺乏單倍型(HCD)攜帶者的PCR電泳圖；其中，泳道1、3、4:不攜 帶HCD單倍型;泳道2:HCD單倍型攜帶者;泳道5:陽性對照;M:100bp DNA ladder Marker。
[0029] 圖2為正常個體和HCD攜帶者的測序峰圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0031 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033]實施例1引物設(shè)計
[0034] 依據(jù) GenBank 上牛 ΑΡ0Β 基因序列（ID:494004)，并參考 Schiitz 等（2016)針對 ΑΡ0Β 基 因設(shè)計的檢測HCD單倍型的引物序列，利用在線引物設(shè)計軟件(http://bioinfo.ut.ee/ primer3-0.4.0/)進行檢測HCD的特異性引物設(shè)計，獲得引物對:上游引物AP0B-Pr imer-F: 5 ' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3 ' ；下游引物AP0B-Primer-Rl: 5 ' -AGATGATGCCCCTCTTGATG-3 '， 該引物對橫跨ΑΡ0Β基因1299bp的插入序列，從理論上講，正常個體可以擴增處171bp的長度 片段;Η⑶攜帶者個體能擴增出171/1470bp長度的片段，Η⑶純合子能擴增出1470bp的長度 片段。經(jīng)過第一輪引物的篩選和優(yōu)化，當(dāng)對HCD攜帶者進行擴增時，該引物對僅能擴增出 171bp的片段，1470bp的長度片段不能正常的擴增出來，可能是由于171bp的短片段擴增會 抑制長片段的擴增，而且，長片段本身就容易擴增。又重新設(shè)計了兩對特異性PCR引物，通過 PCR條件的篩選和優(yōu)化，仍然不能擴增出長片段的擴增片段。目前，還沒有資料顯示，1299bp 片段的插入突變能夠直接用PCR擴增出來。所以，采用簡單PCR引物進行直接擴增的方案是 不可行的。
[0035] 鑒于以上的經(jīng)驗，本發(fā)明通過巧妙構(gòu)思，設(shè)計多條引物，采用復(fù)合式PCR來檢測部 分插入序列的方法來對HCD攜帶者進行鑒定。于是，本發(fā)明補充設(shè)計了第三條引物ΑΡ0Β-Primer-R2：
[0036] 5 ' -ACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '，該引物序列是1299bp插入序列的一部分，是用來檢 測HCD單倍型的特異性引物。該方法具有快速、準確的特定。
[0037]所設(shè)計的引物一覽表：
[0038]
[0039] 經(jīng)試驗，最后確定了如下檢測HCD攜帶者的特異性PCR引物APOB-Primers:
[0040]上游引物APOB-Primer-F: 5 ' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3 ' ；
[0041 ]下游引物APOB-Primer-Rl: 5 ' -AGATGATGCCCCTCTTGATG-3 ' ；
[0042]下游引物AP0B-Primer-R2:5 ' -ACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '。
[0043] F/R1引物對擴增片段長度：171bp;
[0044] F/R2引物對擴增片段長度:366bp。
[0045] 上述引物相對其他設(shè)計得到的大量引物來說，具有專一性高、特異性強、目的條帶 容易識別等特點，能夠更好的實現(xiàn)HCD基因的快速、準確檢測。
[0046] 實施例2 PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化
[0047] 本發(fā)明基于設(shè)計得到的特異性PCR引物，進一步對PCR的反應(yīng)程序進行了優(yōu)化。
[0048] 最終確定了鑒定HCD攜帶者的PCR反應(yīng)程序與反應(yīng)體系。
[0049] 所述反應(yīng)程序為：
[0050] 94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 3〇8,62°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8，進行35個循環(huán)；721€ 延伸7min，然后4°C保存。其中，最佳退火溫度為62 °C
[0051 ] 所述PCR反應(yīng)體系：總體積25yL
[0052]
[0053] 實施例3
[0054] 1、牛總DNA的提取
[0055] 選擇北京市種公牛站的荷斯坦公牛為實驗材料，提取總DNA，總DNA可以從血液(例 如，新鮮或冷凍的）、精液(例如，新鮮或冷凍的）、組織樣品（如耳組織等)或含有毛囊的牛毛 樣品中提取、分離和純化。
[0056] 2、PCR擴增和基因型判定
[0057] 根據(jù)實施例1篩選得到的特異性引物對，和實施例2優(yōu)化得到的PCR反應(yīng)條件及反 應(yīng)體系進行多重PCR擴增。
[0058]取4yL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增結(jié)果如附圖1所示。
[0059] 基因型判定：
[0060]健康奶牛:基因型為AA型，僅出現(xiàn)171bp電泳條帶；
[0061 ] HCD隱性攜帶者:基因型為AB型，即出現(xiàn)171 bp電泳條帶和366bp電泳條帶；
[0062] Η⑶純合子:基因型為BB型，僅出現(xiàn)366bp電泳條帶。Η⑶單倍型在胚胎早期多數(shù)致 死或出生后死亡，在牛群中很少出現(xiàn)，我們篩查隱性有害單倍型HCD的目的就是要找出HCD 隱性攜帶者。
[0063] 利用上述建立的分子檢測方法，對北京地區(qū)的138頭荷斯坦公牛和90頭母牛進行 了檢測分析，結(jié)果分別檢測到了7頭和1頭HCD攜帶者，攜帶率分別為5.07%、1.11%。
[0064] 3、測序驗證
[0065]對全部HCD攜帶者個體進行測序驗證。
[0066] 為了進一步驗證基因分型結(jié)果，將具有不同基因型的個體進行測序，用DNAMAN軟 件與GenBank上的基因序列進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，ΑΑ基因型的ΑΡ0Β基因擴增序列與GenBank 上的基因序列（ID:494004)相同，該基因型屬正常牛只，在國際上統(tǒng)一采用"Η⑶0"標識；而 ΑΒ基因型的ΑΡ0Β基因的第24位堿基和25位堿基之間插入了 LTR(末端重復(fù)序列)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元 件序列(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/dbvar)(登錄號:NSTD119)，該基因型的牛只是ΗΟ) 攜帶者，在國際上統(tǒng)一采用"HCD1"標識。測序結(jié)果見附圖2。研究結(jié)果表明附圖1中的基因分 型結(jié)果是正確的，而且準確率達100%，說明建立的檢測HCD有害單倍型的方法是可靠的。 [0067] 4、系譜驗證
[0068] 通過系譜追蹤發(fā)現(xiàn)，7頭HCD攜帶者公牛的共同祖先是Maugh 1 in Storm (H0CA匪5457798,1991)，與國際上報道的可追溯到的共同祖先相一致，更加證實了所建立 方法的準確性和可靠性。本發(fā)明對我國荷斯坦牛進行了 HCD單倍型的分子診斷，并證實HCD 單倍型在我國荷斯坦牛群中存在一定比例，有必要對我國荷斯坦牛群進行大規(guī)模的篩查， 標識或淘汰HCD單倍型攜帶者，降低HCD帶來的潛在危害。
[0069]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測牛HCD攜帶者的特異性PCR引物，其特征在于，所述引物包括： 上游引物F: 5 ' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3 ' ； 下游引物R1:5 '-AGATGATGCCCCTCTTGATG-3 ' ； 下游引物R2:5 ' -CACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '。2. 權(quán)利要求1所述的引物在制備檢測牛HCD攜帶者的試劑盒方面的應(yīng)用。3. 含有權(quán)利要求1所述的引物的試劑或試劑盒。4. 一種檢測牛HCD攜帶者的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:權(quán)利要求1所述的特 異性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、10 X Buffer、ddH20及陽性對照。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性 5min;94°C 變性 30s，62°C 退火 30s，72°C 延伸 3〇8,35個循環(huán)；72°(：延伸711^11。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，退火溫度為62 °C。7. -種非疾病的診斷和治療目的的檢測牛HCD攜帶者的方法，其特征在于，以待測樣本 總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，當(dāng)PCR擴增 產(chǎn)物中僅出現(xiàn)17lbp的電泳條帶時，表示待測樣本不攜帶HCD;當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物中同時出現(xiàn) 171bp和366bp電泳條帶時，表示待測樣本為攜帶HCD的雜合子；當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物中僅出現(xiàn) 366bp泳條帶時，表示待測樣本為HCD純合子。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系總體積25yL: dNTP 混合物，（4><2.5mmol/L) 2.0tuL; lOxBuffer (含 Mg2+ ) 2.5μΙ.; 上游引物 F (: 20pmol/L ) 0.5μΙ; 下游引物 R ]. ( 20pmoL/L ) 0.5μL; 下游引物 R1 ( 20pmoL/L ) 0.5μL； Taq DNA 聚合酶（3U/pL) 0.5μΙ; 模板 DNA ( 50ng/:uL ) 0.5μΙ; ddH20 18.0μLο9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，PCR工作程序為:94°C預(yù)變性5min; 94°C 變性 30s，58 ±8 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，35 個循環(huán)；72 °C 延伸 7min。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，退火溫度為62 °C。
【文檔編號】C12Q1/68GK106065416SQ201610659243
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2016年8月11日
【發(fā)明人】李艷華, 麻柱, 劉林, 趙鳳, 呂小青, 韓廣文, 朱玉林, 孫東曉
【申請人】北京奶牛中心