專利名稱：產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測(cè)方法及檢測(cè)引物組和檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)氣莢膜梭菌快速檢測(cè)方法及其檢測(cè)引物組 和檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是一種能引起人食物中毒、抗生素相 關(guān)性腹瀉和動(dòng)物腹瀉等疾病的重要病原菌。該菌是一種革蘭氏陽性產(chǎn)芽胞專性厭氧桿菌， 廣泛存在于自然界的土壤、水源及人和動(dòng)物腸道中。研究發(fā)現(xiàn)，該菌至少可以產(chǎn)生15種以 上的毒素，目前根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的四種重要的致病性毒素(α、β、ε、ι毒素)能 力，將其分為A、B、C、D和E五種類型，各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生α-毒素，所以α-毒素被 認(rèn)為是最基本、最重要的致病因子。對(duì)人致病的主要是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌，也有少數(shù)為C型， 其中由A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒在美國等西方國家居前三位。在我國，隨著社會(huì) 的發(fā)展、人們生活節(jié)奏的加快及海內(nèi)外文化交流的增加，人們生活方式也發(fā)生了許多變化， 生冷食品、罐頭制品等擺上了餐桌，產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)食品的污染也是引起人食物中毒和腹 瀉的一個(gè)重要原因。目前食品檢測(cè)過程中主要以平板分離鑒定為主對(duì)該菌進(jìn)行檢測(cè)，操作 均較為復(fù)雜，且耗時(shí)長，不能及時(shí)做出判斷。同時(shí)，由于該菌為厭氧菌，培養(yǎng)時(shí)對(duì)環(huán)境要求較 高，隨著檢測(cè)環(huán)節(jié)的增加，其準(zhǔn)確性受到一定限制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，環(huán)介 導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)已逐步應(yīng)用于食源性 致病菌的檢測(cè)。LAMP方法是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)主要利用4種不同的特異性引 物識(shí)別靶DNA上6個(gè)特定區(qū)域，并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNA)，在恒溫 條件下快速擴(kuò)增核酸，保證了擴(kuò)增的高特異性和高效率。由于LAMP獨(dú)特的核酸擴(kuò)增機(jī)制， 它的產(chǎn)物是由多重復(fù)靶序列的莖一環(huán)狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝 膠電泳上會(huì)呈現(xiàn)出LAMP反應(yīng)典型的階梯狀條帶；同時(shí)，核酸大量生成時(shí)，從dNIPs中析出 的焦磷酸根離子與反應(yīng)體系中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的擴(kuò)增反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸 鎂沉淀；另外，由于擴(kuò)增產(chǎn)物大量生成，加入熒光染料(如Syber Green I、溴化乙錠、Gel Red等)。因此LAMP擴(kuò)增結(jié)果不但觀察方式多樣，且結(jié)果鑒定簡單，非常適合高通量的快速 檢測(cè)。鑒于LAMP技術(shù)有眾多優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已被用于病原微生物的檢測(cè)，如分支桿菌屬、阪崎 腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等?，F(xiàn)尚未見有LAMP應(yīng)用于產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)的相關(guān) 報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測(cè)方法及檢測(cè)引物組和檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是所述產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)引物組的外引物的上游引物具有如SEQ No. 1所示的序列；其外引物的下游引物具有如SEQ No. 2 所示的序列；其內(nèi)引物的上游引物具有如SEQ No. 3所示的序列；其內(nèi)引物的下游引物具有 如SEQ No. 4所示的序列。本發(fā)明利用所述引物組對(duì)待測(cè)樣品的DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn) 行陰陽性判定。進(jìn)一步地，所述LAMP反應(yīng)按以下第一種方案或第二種方案進(jìn)行第一種方案所述LAMP反應(yīng)在59. 5-62. 5°C下反應(yīng)50_70min ；第二種方案所述LAMP反應(yīng)包含以下步驟(1)先在 59. 5-62. 5°C下反應(yīng) 50_70min ；(2)后在 80°C下反應(yīng) 6_12min。進(jìn)一步地，本發(fā)明在進(jìn)行所述LAMP反應(yīng)的反應(yīng)液中，包含濃度均為0. 15-0. 25 μ M 的所述外引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 6-1. ομ M的內(nèi)引物的上游引物和下 游引物，濃度為0. 6-0. 7Μ的甜菜堿溶液，濃度為4. 8-6. 4mM的MgSO4,10 % (體積)的 10 X BstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 2-0. 4U/ μ L的BstDNA聚合酶，各濃度為0. 6-1. OmM的 三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧 核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)。本發(fā)明使用權(quán)利要求1所述引物組的一種快速檢測(cè)試劑盒包括所述引物組、陽性 對(duì)照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶緩沖液、MgSO4溶液、甜菜堿溶液和無菌超純水， 所述陽性對(duì)照品為產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因組DNA。本發(fā)明使用權(quán)利要求1所述引物組的另一種快速檢測(cè)試劑盒在其LAMP反應(yīng)液 中包含有所述引物組、陽性對(duì)照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶緩沖液、MgSO4 溶液、甜菜堿溶液和無菌超純水的混合液，所述外引物的上游引物和下游引物的度均為 0. 15-0. 25 μ M，內(nèi)引物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 6-1.0 μ Μ，甜菜堿的濃度為 0. 6-0. 7Μ，MgSO4的濃度為4. 8-6. 4mM，10 X BstDNA聚合酶緩沖液與所述混合液的體積 比為10%，BstDNA聚合酶的濃度為0. 2-0. 4U/μ L的，三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸 腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的濃度各為 0. 6-1. OmM0與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明是根據(jù)已公開的產(chǎn)氣莢膜梭菌(Pa基因序列，分析設(shè)計(jì)得到本發(fā)明的產(chǎn) 氣莢膜梭菌特異性LAMP檢測(cè)引物組，特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA。2、本發(fā)明的快速檢測(cè)方法能快速高效擴(kuò)增產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA目的片段，整 個(gè)LAMP擴(kuò)增過程可在1小時(shí)內(nèi)完成，擴(kuò)增產(chǎn)物得率高，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)準(zhǔn)確、迅速、 簡便、高效。3、在本發(fā)明的快速檢測(cè)方法中，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)可在恒定溫度下完成，且允許的溫 度波動(dòng)范圍較大(士 1.5°C )，因此對(duì)溫控的儀器設(shè)備要求不高，水浴器或板式加熱器均可 滿足要求。4、本發(fā)明的快速檢測(cè)方法靈敏度高，擴(kuò)增模板產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA濃度僅需
IOfg/μ Lo5、本發(fā)明的快速檢測(cè)方法結(jié)果判定簡便，且可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件采用不同的結(jié)果判定方式，方法適應(yīng)性較強(qiáng)。6、與常規(guī)的平板培養(yǎng)法相比，本發(fā)明的快速檢測(cè)方法可大大縮短檢測(cè)周期，減少 檢測(cè)環(huán)節(jié)，從而降低因檢測(cè)環(huán)節(jié)過多而導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌因接觸空氣而死亡的幾率，使檢 測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。


圖1顯示了產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)離心后的情況。圖2顯示了產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)STOR Green I染色后，在紫外燈下觀
察的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例1產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR檢測(cè)本實(shí)施例采用灌溉用水作為檢測(cè)樣品，具體檢測(cè)步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測(cè)水樣至9mL皰肉液體培養(yǎng)基，封口后應(yīng)用Mart II厭氧系統(tǒng) 360C 士 1°C培養(yǎng)M小時(shí)。1. 2、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。2、PCR 反應(yīng)2. 1、人工合成產(chǎn)氣莢膜梭菌外引物的上下游引物，其中，上游引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下游引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列。2. 2、PCR 反應(yīng)體系PCR 反應(yīng)體系為DNA 聚合酶 0. 05U/ μ L, dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 2mM, MgSO4 2mM, 10% (體積)的10 XDNA聚合酶緩沖液，引物F3和B3各0. 5 μ Μ,模板DNA 1 μ L。2.3、PCR 反應(yīng)條件應(yīng)用PCR 儀，PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min，95°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，30 個(gè)循 環(huán)，72°C 5min，4°C保存。2.4、結(jié)果觀察將反應(yīng)液直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0.5XTBE、2.0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察結(jié)果。電泳結(jié)果可見與預(yù)期分 子量(214bp) —致的明亮片段，說明本實(shí)施例樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證采用常規(guī)平板檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，與PCR檢測(cè)結(jié)果一 致。 實(shí)施例2產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)Mg2+濃度測(cè)試本實(shí)施例采用灌溉用水作為檢測(cè)樣品，具體檢測(cè)步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測(cè)水樣至9mL皰肉液體培養(yǎng)基，封口后應(yīng)用Mart II厭氧系統(tǒng) 360C 士 1°C培養(yǎng)M小時(shí)。
1. 2、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。2、LAMP快速檢測(cè)2. 1、人工合成產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)引物組，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應(yīng)體系分別應(yīng)用不同的Mg2+濃度分別建立6組LAMP反應(yīng)體系。反應(yīng)體系的總體積為 25 μ L，各反應(yīng)體系均包含外引物F3和Β3各0. 2 μ Μ、內(nèi)引物FIP和BIP 0. 8 μ Μ、甜菜堿溶 液 0. 65MU0% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩沖液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 8mM,BstDNA 聚合酶0. 3U/yL，模板DNA 1 μ L ；在6組反應(yīng)體系中，MgSO4濃度分別采用2. 4mM、3. 2mM、 4mM、4. 8mM、5. 6mM、6. 4mM ；反應(yīng)體系的剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、LAMP 反應(yīng)條件應(yīng)用恒溫水浴器，反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度為61°C，反應(yīng)時(shí)間為60min ；終止反應(yīng)的 溫度為80°C，反應(yīng)時(shí)間為6min。2. 4、反應(yīng)結(jié)果觀察將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條 件下電泳30min。圖 2 中，泳道 M 為 DNA Marker,泳道 1-6 的 Mg2+ 濃度分別為2. 4mM、3. 2mM、4mM、 4. 8mM、5. 6mM、6. 4mM。從圖2中可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Mg2+濃度為4. 8-6. 4mM時(shí)，反應(yīng)結(jié)果較為明亮，因 此本發(fā)明方法中，Mg2+最優(yōu)反應(yīng)濃度為4. 8-6. 4mM。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證采用常規(guī)平板檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，與LAMP檢測(cè)結(jié)果一 致。實(shí)施例3產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)靈敏度測(cè)試本實(shí)施例采用灌溉用水作為檢測(cè)樣品，具體檢測(cè)步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測(cè)水樣至9mL皰肉液體培養(yǎng)基，封口后應(yīng)用Mart II厭氧系統(tǒng) 360C 士 1°C培養(yǎng)M小時(shí)。1. 2、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。2、LAMP快速檢測(cè)2. 1、人工合成產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)引物組，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應(yīng)體系建立9個(gè)反應(yīng)管，反應(yīng)體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3 各 0. 2 μ Μ、內(nèi)引物FIP 和 BIP 0. 8 μ M,MgS04 5. 6mM、甜菜堿 0. 65M、10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩沖液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0. 8mM、BstDNA聚合酶0. 3U/ μ L。各反應(yīng)管還需加入模板DNA液1 μ L，所用模板DNA液濃度分別為IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ L、lfg/ μ L、0. Ifg/ μ L，以測(cè)試該檢測(cè)方法的靈敏度。2. 3、LAMP 反應(yīng)條件應(yīng)用恒溫水浴器，反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度為61°C，反應(yīng)時(shí)間為60min ；終止反應(yīng)的 溫度為80°C，反應(yīng)時(shí)間為6min。2. 4、反應(yīng)結(jié)果觀察將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條 件下電泳30min。通過對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的電泳分析，當(dāng)模板DNA液的濃度降至IOfg/ μ L時(shí)，仍可見較為 明亮的反應(yīng)產(chǎn)物。說明本方法的檢測(cè)靈敏度為10fg/yL。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證采用常規(guī)平板檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，與LAMP檢測(cè)結(jié)果一 致。實(shí)施例4產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)本實(shí)施例采用灌溉用水作為檢測(cè)樣品，具體檢測(cè)步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測(cè)水樣至9mL皰肉液體培養(yǎng)基，封口后應(yīng)用Mart II厭氧系統(tǒng) 360C 士 1°C培養(yǎng)M小時(shí)。1. 2、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。1. 3、同時(shí)準(zhǔn)備12種非產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種DNA作為陰性對(duì)照。2、LAMP快速檢測(cè)2. 1、人工合成產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)引物組，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各為0. 15μΜ、內(nèi) 引物 FIP 和 BIP 各為 0·6μΜ、MgSO4 4. 8mM、甜菜堿 0· 6Μ、10 % (體積)IOXBstDNA 聚合酶 緩沖液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各為 0. 6mM、BstDNA 聚合酶為 0. 2U/ μ L,模板 DNA 為 1 μ L ； 剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、LAMP 反應(yīng)條件應(yīng)用恒溫水浴器，反應(yīng)分別采用以下條件進(jìn)行。2. 3. 1反應(yīng)溫度為59. 5°C，反應(yīng)時(shí)間為50min ；終止反應(yīng)的溫度為80°C，反應(yīng)時(shí)間 為 6min。2. 4、反應(yīng)結(jié)果觀察將反應(yīng)液在6000rpm條件下離心5min，樣品管底部呈現(xiàn)明顯沉淀，說明本實(shí)施例
樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌。圖1顯示各反應(yīng)管離心后沉淀情況。其中1號(hào)和9號(hào)管為待測(cè)樣品DNA的反應(yīng)管， 其余12個(gè)反應(yīng)管為非產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種DNA的反應(yīng)管。在肉眼觀察下，1號(hào)和9號(hào)管底部呈現(xiàn)明顯沉淀，說明本實(shí)施例樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌。其余12管底部未呈現(xiàn)沉淀，證明 該方法檢測(cè)特異性良好。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證采用常規(guī)平板檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，與LAMP檢測(cè)結(jié)果一 致。 實(shí)施例5產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)本實(shí)施例采用灌溉用水作為檢測(cè)樣品，具體檢測(cè)步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測(cè)水樣至9mL皰肉液體培養(yǎng)基，封口后應(yīng)用Mart II厭氧系統(tǒng) 360C 士 1°C培養(yǎng)M小時(shí)。1. 2、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。1. 3、同時(shí)準(zhǔn)備12種非產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種DNA作為陰性對(duì)照。2、LAMP快速檢測(cè)2. 1、人工合成產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)引物組，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3的濃度各為 0. 2 μ Μ、內(nèi)引物 FIP 和 BIP 為 0. 8 μ M、MgS04 5. 6mM、甜菜堿 0. 65MU0% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩沖液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP的濃度各為0. 8mM、BstDNA聚合酶0. 3υ/μ L，模板 DNA IyL;剩余體積以無菌超純水補(bǔ)充。2. 3、LAMP 反應(yīng)條件應(yīng)用恒溫水浴器，反應(yīng)溫度為61°C，反應(yīng)時(shí)間為60min ；終止反應(yīng)的溫度為80°C， 反應(yīng)時(shí)間為9min。2. 4、反應(yīng)結(jié)果觀察在反應(yīng)液中加入染料STOR Green I，樣品反應(yīng)管在紫外燈下呈現(xiàn)明顯熒光。說明 本實(shí)施例樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌。圖2顯示各反應(yīng)管在加入STOR Green I后熒光情況。其中1號(hào)和2號(hào)管為待測(cè) 樣品DNA的反應(yīng)管，其余12管為非產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種DNA的反應(yīng)管。在肉眼觀察下，1號(hào) 和2號(hào)管呈現(xiàn)明顯熒光，說明本實(shí)施例樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌。其余12管未呈現(xiàn)明顯熒 光，證明該方法檢測(cè)特異性良好。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證采用常規(guī)平板檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，與LAMP檢測(cè)結(jié)果一 致。實(shí)施例6產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)本實(shí)施例采用灌溉用水作為檢測(cè)樣品，具體檢測(cè)步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測(cè)水樣至9mL皰肉液體培養(yǎng)基，封口后應(yīng)用Mart II厭氧系統(tǒng)360C 士 1°C培養(yǎng)M小時(shí)。1. 2、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。2、LAMP快速檢測(cè)2. 1、人工合成產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)引物組，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各0. 25 μ Μ、內(nèi)引 物 FIP 和 BIP 1. OyM^MgSO4 6. 4mM、甜菜堿 0. 7Μ、10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩沖液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 1. OmM, BstDNA 聚合酶 0. 4U/ μ L,模板 DNAl μ L ；剩余體積以無菌 超純水補(bǔ)充。2. 3、LAMP 反應(yīng)條件應(yīng)用恒溫水浴器，反應(yīng)溫度為62. 5°C，反應(yīng)時(shí)間為70min ；終止反應(yīng)的溫度為 80°C，反應(yīng)時(shí)間為12min。2. 4、反應(yīng)結(jié)果觀察在反應(yīng)液中加入染料STOR Green I，樣品反應(yīng)管在紫外燈下呈現(xiàn)明顯熒光。說明 本實(shí)施例樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證采用常規(guī)平板檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，與LAMP檢測(cè)結(jié)果一 致。實(shí)施例7產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)本實(shí)施例采用灌溉用水作為檢測(cè)樣品，具體檢測(cè)步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測(cè)水樣至9mL皰肉液體培養(yǎng)基，封口后應(yīng)用Mart II厭氧系統(tǒng) 360C 士 1°C培養(yǎng)M小時(shí)。1. 2、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。2、LAMP快速檢測(cè)2. 1、人工合成產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)引物組，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各0. 15μΜ、內(nèi)引 物 FIP 和 BIP 0. 6 μ M^MgSO4 4. 8mM、甜菜堿 0. 6Μ、10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩沖液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 6mM,BstDNA 聚合酶 0. 2U/ μ L,模板 DNAl μ L。剩余體積以無菌 超純水補(bǔ)充。2. 3、LAMP 反應(yīng)條件應(yīng)用恒溫水浴器，反應(yīng)溫度為59. 50C，反應(yīng)時(shí)間為50min。
2. 4、反應(yīng)結(jié)果觀察將反應(yīng)液在6000rpm條件下離心5min，樣品管底部呈現(xiàn)明顯沉淀。說明本實(shí)施例 樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證采用常規(guī)平板檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，與LAMP檢測(cè)結(jié)果一 致。實(shí)施例8產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)本實(shí)施例采用灌溉用水作為檢測(cè)樣品，具體檢測(cè)步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測(cè)水樣至9mL皰肉液體培養(yǎng)基，封口后應(yīng)用Mart II厭氧系統(tǒng) 360C 士 1°C培養(yǎng)M小時(shí)。1. 2、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。2、LAMP快速檢測(cè)2. 1、人工合成產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)引物組，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；內(nèi)引 物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各0. 2μΜ、內(nèi)引 物 FIP 和 BIP 0. 8 μ M^MgSO4 5. 6mM、甜菜堿 0. 65Μ、10% (體積)10 X BstDNA 聚合酶緩沖液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 8mM、BstDNA 聚合酶 0. 3U/ μ L,模板 DNAl μ L ；剩余體積以無菌 超純水補(bǔ)充。2. 3、LAMP 反應(yīng)條件應(yīng)用恒溫水浴器，反應(yīng)溫度為61°C，反應(yīng)時(shí)間為60min。2. 4、反應(yīng)結(jié)果觀察在反應(yīng)液中加入染料STOR Green I，樣品反應(yīng)管在紫外燈下呈現(xiàn)明顯熒光。說明 本實(shí)施例樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證采用常規(guī)平板檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，與LAMP檢測(cè)結(jié)果一 致。實(shí)施例9產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)本實(shí)施例采用灌溉用水作為檢測(cè)樣品，具體檢測(cè)步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測(cè)水樣至9mL皰肉液體培養(yǎng)基，封口后應(yīng)用Mart II厭氧系統(tǒng) 360C 士 1°C培養(yǎng)M小時(shí)。1. 2、應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中細(xì)菌DNA。2、LAMP快速檢測(cè)2. 1、人工合成產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)引物組，外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各0. 25 μ Μ、內(nèi)引 物 FIP 和 BIP 1. OyM^MgSO4 6. 4mM、甜菜堿 0. 7Μ、10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩沖液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 1. OmM, BstDNA 聚合酶 0. 4U/ μ L,模板 DNAl μ L ；剩余體積以無菌 超純水補(bǔ)充。2. 3、LAMP 反應(yīng)條件應(yīng)用恒溫水浴器，反應(yīng)溫度為62. 50C，反應(yīng)時(shí)間為70min2. 4、反應(yīng)結(jié)果觀察在反應(yīng)液中加入染料STOR Green I，樣品反應(yīng)管在紫外燈下呈現(xiàn)明顯熒光。說明 本實(shí)施例樣品中存在產(chǎn)氣莢膜梭菌。2. 5、結(jié)果驗(yàn)證采用常規(guī)平板檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，與LAMP檢測(cè)結(jié)果一 致。實(shí)施例10產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒本實(shí)施例試劑盒由如下試劑組成1、產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)引物，包括外引物的上游引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的上游引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；2、BstDNA 聚合酶；3、陽性對(duì)照品產(chǎn)氣莢膜梭菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組；4、空白對(duì)照品無菌超純水；5、10 X BstDNA聚合酶緩沖液；6、MgSO4 溶液；7、甜菜堿溶液。8、顯色劑SYBR Green I ；實(shí)施例11產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒本實(shí)施例試劑盒由如下試劑組成1、產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)反應(yīng)液，其具體組成及濃度為外引物F3和B3均0.2 μ M，內(nèi)引物FIP和BIP 0. 8 μ M, MgSO4 5. 6mM，甜菜堿溶液 0. 65M, 10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩沖液，dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均 0. 8mM,BstDNA 聚 合酶0. 3U/yL;其中，外引物的上游引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的上游引物FIP具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；
2、陽性對(duì)照品產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA ；3、空白對(duì)照品無菌超純水；4、顯色劑SYBR Green I。實(shí)施例12產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒本實(shí)施例的試劑盒由如下試劑組成1、產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)反應(yīng)液，其具體組成及濃度為外引物F3和B3均0. 15 μ M，內(nèi)引物FIP和BIP 0. 6 μ MjMgSO4 4. 8mM，甜菜堿溶液 0. 6M, 10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩沖液，dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均 0. 6mM、BstDNA 聚 合酶0. 2U/yL;其中，外引物的上游引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的上游引物FIP具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；2、陽性對(duì)照品產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA ；3、空白對(duì)照品無菌超純水；實(shí)施例13產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP快速檢測(cè)試劑盒本實(shí)施例的試劑盒由如下試劑組成1、產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測(cè)反應(yīng)液，其具體組成及濃度為外引物F3禾口 B3均0.25 μ M，內(nèi)引物FIP禾口 BIP 1. OyMjMgSO4 6. 4mM，甜菜堿溶液 0. 7M, 10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩沖液，dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均 1. OmM, BstDNA 聚 合酶0. 4U/yL;其中，外引物的上游引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下游引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的上游引物FIP具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內(nèi)引物的下游引物BIP具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；2、陽性對(duì)照品產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA ；3、空白對(duì)照品無菌超純水。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測(cè)引物組，其特征是其外引物的上游引物具有如SEQ No. 1 所示的序列，其外引物的下游引物具有如SEQ No. 2所示的序列；其內(nèi)引物的上游引物具有 如SEQ No. 3所示的序列，其內(nèi)引物的下游引物具有如SEQ No. 4所示的序列。
2.一種使用權(quán)利要求1所述的引物組對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行快速檢測(cè)的方法，其特征 是利用所述引物組對(duì)待測(cè)樣品的DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行陰陽性判 定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是所述LAMP反應(yīng)按以下第一種方案或第二種 方案進(jìn)行第一種方案所述LAMP反應(yīng)在59. 5-62. 5°C下反應(yīng)50_70min ；第二種方案所述LAMP反應(yīng)包含以下步驟(1)先在59. 5-62. 5°C下反應(yīng) 50_70min ；(2)后在80°C下反應(yīng)6-12min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征是在進(jìn)行所述LAMP反應(yīng)的反應(yīng)液中，包含 濃度均為0. 15-0. 25 μ M的所述外引物的上游引物和下游引物、濃度均為0. 6-1. 0μ M的所 述內(nèi)引物的上游引物和下游引物，濃度為0. 6-0. 7Μ的甜菜堿，濃度為4. 8-6. 4mM的MgS04， 10% (體積)的IOXBstDNA聚合酶緩沖液，濃度為0. 2-0. 4U/ μ L的BstDNA聚合酶，各濃 度為0. 6-1. OmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶 脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸。
5.一種使用權(quán)利要求1所述引物組的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括所述引物組、 陽性對(duì)照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶緩沖液、MgSO4溶液和甜菜堿溶液和無菌超 純水，所述陽性對(duì)照品為產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因組DNA。
6.一種使用權(quán)利要求1所述引物組的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于在其LAMP反應(yīng)液 中包含有所述引物組、BstDNA聚合酶、10 XBstDNA聚合酶緩沖液、MgSO4溶液、甜菜堿溶液 和無菌超純水的混合液，所述外引物的上游引物和下游引物的度均為0. 15-0. 25μΜ，內(nèi)引 物的上游引物和下游引物的濃度均為0. 6-1. 0 μ Μ,甜菜堿的濃度為0. 6-0. 7Μ，MgSO4的濃 度為4. 8-6. 4mM, IOXBstDNA聚合酶緩沖液與所述混合液的體積比為10%，BstDNA聚合酶 0. 2-0. 4U/μ L，三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧 核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的濃度各為0. 6-1. OmM。
全文摘要
本發(fā)明公開一種產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)方法及其引物組和檢測(cè)試劑盒。該引物組是基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)，根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌特有的α毒素(C.perfringensalphatoxin，CPa)基因序列分析設(shè)計(jì)并人工合成獲得，包含的核苷酸序列如SEQ No.1-4所示，該引物組對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有很高特異性。該產(chǎn)氣莢膜梭菌快速檢測(cè)方法利用上述檢測(cè)引物組對(duì)樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，通過對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定來判斷樣品中是否含有產(chǎn)氣莢膜梭菌。本發(fā)明還依據(jù)上述檢測(cè)方法設(shè)計(jì)了產(chǎn)氣莢膜梭菌快速檢測(cè)試劑盒，可對(duì)樣品進(jìn)行快速、簡便、準(zhǔn)確、高效的產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測(cè)鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102134590SQ20101059069
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者姜侃, 張東雷, 金燕飛, 陳小珍, 魯燕驊 申請(qǐng)人:浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院