一種表達鵝細(xì)小病毒vp3基因的重組新城疫病毒及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒及其構(gòu)建方法，屬于重組病毒疫苗領(lǐng)域。該重組新城疫病毒為鵝源分離株，其F蛋白的裂解位點氨基酸是GRQGRL，P3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之間非編碼區(qū)。將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pCI-NA-VP3(SEQ?ID?NO.1)和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L(SEQ?ID?NO.2～4)共轉(zhuǎn)染新城疫病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，從轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的細(xì)胞懸液中可拯救重組新城疫病毒。本發(fā)明的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒可作為預(yù)防新城疫、鵝細(xì)小病毒二聯(lián)活載體疫苗。
【專利說明】一種表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒及其構(gòu)建 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種表達鵝細(xì)小病毒VP3 基因的重組新城疫病毒及其構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 新城疫（Newcastle disease，ND)是新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV) 引起的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏 膜和漿膜出血為特征。該病在1926年首次爆發(fā)于印度尼西亞的巴塔維亞，自上個世紀(jì)九十 年代第四次大流行以來，包括中國在內(nèi)的世界多國的主要流行株為classll中基因 VII型 病毒成員。NDV幾乎可感染全部鳥類，并可隨侯鳥的遷徙而廣泛傳播。在所有禽類中，雞與 火雞最易感，常?？稍斐烧麄€雞群90%以上的死亡率。水禽如鴨、鵝等也能感染本病。近 年來，研究者從許多地區(qū)的水禽體內(nèi)分離到NDV病毒，對水禽的致病性較高，對15日齡以下 的雛鵝致死率高達100%，成年鵝發(fā)病率達50 %?70%，死亡率為10%?20%。因此，新 城疫是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病，0ΙΕ將其列為A類疫病。疫苗接種能有效預(yù)防該病。 在我國NDV疫苗接種幾乎是所有新生雛雞必不可少的免疫程序，每年用于新城疫防制的弱 毒疫苗至少在百億羽份以上，并且隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，疫苗的需求量還會不斷增加。
[0003] 不同NDV毒株的致病性差異很大，影響病毒毒力的主要因素是融合蛋白（F)的前 體能否被宿主細(xì)胞的蛋白酶有效地裂解，大量研究表明裂解部位（112-117aa)的氨 基酸序列呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，強毒株的裂解基序為（R/K)RQ(R/K)R丨F，含有多堿性氨基 酸，而弱毒株的裂解基序（G/E)(K/R)Q(G/E)R丨L。對于強毒株來說，由于裂解位點含有多 堿性氨基酸，能被多種組織細(xì)胞的蛋白酶識別，從而有效裂解，而弱毒株裂解部位中 堿性氨基酸被中性氨基酸所代替，不能被大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶識別，僅能被上呼吸道中 或雞胚尿囊液中分泌到細(xì)胞外的胰酶樣蛋白酶識別，因此，膜融合活性低。
[0004] 新城疫病毒是一種有囊膜的單股、負(fù)鏈RNA病毒，在分類上屬于副粘病毒科禽副 粘病毒屬，一般認(rèn)為，NDV基因組RNA的長度為15186個核苷酸，但近年來發(fā)現(xiàn)部分鵝源毒株 和雞源毒株基因組RNA長度為15192個核苷酸，編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白，依次為核蛋白（NP)、磷 蛋白（P)、基質(zhì)蛋白（M)、融合蛋白（F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（HN)和大聚合酶蛋白（L)。 與其他負(fù)鏈RNA病毒一樣，NDV最小感染單位是核糖核蛋白復(fù)合體（RNP)，裸露的基因組RNA 不具有感染性，只有在與核蛋白（NP)、磷蛋白（P)和大聚合酶蛋白（L)結(jié)合成核糖核蛋白復(fù) 合體（RNP)后，才能作為模板起始復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并表達和包裝出具有感染性的子代病毒。根 據(jù)這一原理可建立NDV的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)。
[0005] 鵝細(xì)小病毒（goose parvovirus, GPV)也稱為小鵝癌病毒（gosling plague virus，GPV)，是一種可引起急性或亞急性敗血性傳染病，主要侵害一月齡內(nèi)雛鵝和雛番鴨， 以傳播快、高發(fā)病率、高死亡率、嚴(yán)重下痢以及滲出性腸炎為特征。危害程度與日齡密切相 關(guān)，10日齡內(nèi)雛鵝發(fā)病率和死亡率可達100%，以后隨日齡增大而逐漸減少。目前世界許多 集約化養(yǎng)鵝和養(yǎng)殖番鴨的國家都有本病的發(fā)生，每年都有不同程度的流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成 巨大損失。1956年，方定一等在揚州首先發(fā)現(xiàn)本病，并于1961年用鵝胚分離到本病病原。
[0006] 鵝細(xì)小病毒（GPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科細(xì)小病毒屬成員，其基因組為單 股、線性DNA，大小約為5kb，GPV基因組中含有2個主要開放閱讀框架（0RF)，兩個主要的 0RF位于同一可讀框中，間隔18nt，左側(cè)ORF(LORF)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（NS)，右側(cè)ORF(RORF) 編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（VP)，即VP1、VP2和VP3。其中VP3為主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒核衣殼的主 要成分，約占衣殼總蛋白含量的80%，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激機體產(chǎn)生保護性 中和抗體的主要抗原蛋白。因此，VP3基因在小鵝瘟免疫防制中具有重要意義。
[0007] 新城疫自1926年爆發(fā)以來其病毒雖只有一個血清型，但在進化上分為class I和 Π 兩個分支，其中class I包括9個基因型成員大多不致病，class II包括11個基因型， 九十年代以來包括中國在內(nèi)世界多國主要的流行株為基因 VII型，而廣泛使用的弱毒疫苗 株為基因 II型，由于基因型與抗原性的不匹配當(dāng)前弱毒疫苗株不能完全抵抗感染并且強 毒攻擊后排毒現(xiàn)象嚴(yán)重，尤其在鵝群中愈演愈烈，不斷有強毒株的分離的報道，研究表明使 用當(dāng)前流行毒株致弱后免疫家禽不僅能提供很好的保護作用而且顯著降低排毒水平，為新 型新城疫病毒弱毒疫苗候選株研制指明了方向。
[0008] 重組NDV作為活病毒載體疫苗具有突出的優(yōu)點：NDV弱毒疫苗長期以來一直用于 家禽防疫，其安全性與有效性已被充分證明；NDV遺傳相對穩(wěn)定，僅有一個血清型，毒株間 發(fā)生重組及毒力返強可能性極??；NDV復(fù)制過程在細(xì)胞漿內(nèi)完成，從RNA到RNA，不存在DNA 階段及與細(xì)胞基因組整合的可能；NDV弱毒疫苗可同時誘導(dǎo)全身性體液免疫、局部粘膜免 疫及細(xì)胞免疫的形成，產(chǎn)生更加全面、確實的免疫保護；可通過飲水、噴霧、滴鼻、點眼或注 射多種方式給苗，使用極為方便；NDV具有雞胚生長高滴度的特性，因而作為疫苗生產(chǎn)成本 極為低廉。另外，在養(yǎng)禽業(yè)中對NDV的疫苗免疫幾乎是必不可少的免疫程序，以NDV作為表 達家禽病毒保護性抗原的載體可以做到一針防兩病甚至多病，其經(jīng)濟價值十分巨大。
[0009] 小鵝瘟對養(yǎng)鵝業(yè)危害嚴(yán)重，目前常用的預(yù)防小鵝瘟感染的疫所分為種鵝用和雛鵝 用疫苗兩種，種鵝用疫苗可分為鴨胚適應(yīng)的弱毒苗和鵝胚強毒疫苗，雛鵝用疫苗也分為鴨 胚適應(yīng)的弱毒苗和鵝胚強毒疫苗，強毒疫苗能產(chǎn)生較好的母源抗體，通過卵黃傳遞給雛鵝， 但可能會造成強毒擴散，弱毒疫苗沒有致病性，但存在保護力較弱的缺點，不足以控制小鵝 瘟的大流行。并且弱毒苗不穩(wěn)定且易發(fā)生毒力返祖現(xiàn)象，可能會選成潛在感染和排毒的風(fēng) 險，油乳劑苗產(chǎn)生免疫力慢且存在使用劑量大、制備工藝比較復(fù)雜、成本較高等一系列問 題，難以滿足集約化的需要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種表達鵝細(xì)小病毒VP3基 因的重組新城疫病毒及其構(gòu)建方法。
[0011] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0012] 一種表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其新城疫病毒為鵝源分離株。
[0013] 優(yōu)選的，所述的重組新城疫病毒F蛋白的裂解位點氨基酸是弱毒株特征序列，具 體的是GRQGRL。
[0014] 優(yōu)選的，所述的VP3基因位于新城疫病毒P基因和Μ基因之間非編碼區(qū)。
[0015] 優(yōu)選的，所述的新城疫病毒是NA-1株。
[0016] 優(yōu)選的，所述的VP3基因來源于鵝細(xì)小病毒GD-01株。
[0017] 更優(yōu)選的，所述的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒的核苷酸序列在 SEQ ID NO. 1所示的pCI-NA-VP3質(zhì)粒的Sail和Notl位點之間。
[0018] 上述表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0019] (1)構(gòu)建包含插入鵝細(xì)小病毒VP3基因的新城疫病毒基因組序列的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒；
[0020] (2)構(gòu)建能夠表達新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的一個或多個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì) 粒；
[0021] (3)將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染新城疫病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后 的宿主細(xì)胞；
[0022] (4)從轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的細(xì)胞懸液中拯救重組新城疫病毒。
[0023] 步驟（1)中所述的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒優(yōu)選為PCI-NA-VP3,其核苷酸序列（不含骨架載體） 如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0024] 步驟（2)中所述的轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒優(yōu)選為pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L，序列（不含 骨架載體）如SEQ ID NO. 2?4所示；
[0025] 步驟（3)中所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為Vero細(xì)胞或BHK細(xì)胞。
[0026] 本發(fā)明通過建立當(dāng)前流行的基因 VII型新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)，并在此基 礎(chǔ)上對其致弱后作為活病毒載體，成功表達了鵝細(xì)小病毒保護性抗原蛋白VP3,構(gòu)建了表達 鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其可作為預(yù)防新城疫、鵝細(xì)小病毒二聯(lián)活載體疫 苗。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1是新城疫病毒NA-1株野生型及重組鵝細(xì)小病毒VP3基因組cDNA的構(gòu)建示意 圖。其中1A為克隆于pCI載體上的新城疫病毒NA-1株基因組cDNA克隆pCI-NA-1。1B為 插入鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組NDV基因組cDNA克隆pCI-NA-VP3 ;其中，"粗體字母"標(biāo)識 為Pmel酶切位點，"小寫字母"標(biāo)識為基因轉(zhuǎn)錄終止信號序列GE，"下劃線的大寫字母"標(biāo) 識為基因轉(zhuǎn)錄起始信號序列GS，"斜體序列GCCACC"為KozaK序列。
[0028] 圖2是間接免疫熒光檢測重組NDV rNA-Ι和野生型NA-1感染的BHK-21細(xì)胞結(jié)果 圖。其中，㈧：rNA-Ι感染的BHK-21細(xì)胞，（B) :NA-1感染的BHK-21細(xì)胞，（〇):未感染病 毒的BHK-21細(xì)胞。
[0029] 圖3是重組病毒RT-PCR檢測結(jié)果圖；泳道1 :rNA-VP3 (1605bp條帶），泳道2 : rNA-Ι (無條帶），泳道 3 :DL2000。
[0030] 圖4是間接免疫熒光檢測重組病毒rNA-VP3GPV VP3的表達結(jié)果圖；(A) :rNA-VP3 感染的BHK-21細(xì)胞，（B) :rNA-l感染的BHK-21細(xì)胞，（C):未感染病毒BHK-21細(xì)胞。
[0031] 圖5是母本NDV病毒及重組病毒雞胚生長特性圖。

【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做基因不詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。 若非特殊說明，實施例中的方法均為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)方法。
[0033] 實施例1新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建
[0034] 1材料和方法
[0035] 1. 1 材料
[0036] 新城疫病毒 NA-1 株（GenBank :DQ659677· 1) ;BHK_21 細(xì)胞（ATCC No. CCL-10)，培 養(yǎng)液為含 10%胎牛血清的 DMEM;質(zhì)粒 pCI(Promega)和 pBluescript II KS+(Clontech); Phusion DNA聚合酶，T4DNA連接酶及其它限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；感受態(tài)細(xì)胞購自 TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；RNA提取用TRIzol、鼠源 反轉(zhuǎn)錄酶MLV、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒，RPMI1640培養(yǎng)液購自Invitrogen ;雞抗NDV全病毒高免 血清；熒光素（FITC)標(biāo)記的羊抗雞二抗購自Sigma公司；熒光顯微鏡為BX51FL ;01ympus， 購自O(shè)lympus公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購自CORNING公司，無特定病原體（SPF)白來航雞及雞胚購 自北京梅里亞公司等。
[0037] 1. 2NDV基因組全長cDNA克隆及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建
[0038] NDV基因組全長cDNA克隆及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建所設(shè)計的引物如下表：
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 一種表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其特征在于：所述的重組新城疫 病毒為鵝源新城疫病毒分尚株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其特征在于： 所述的重組新城疫病毒F蛋白的裂解位點氨基酸是弱毒株特征序列GRQGRL。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其特征在于： VP3基因位于新城疫病毒P基因和Μ基因之間非編碼區(qū)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其特征在于： 所述的新城疫病毒是ΝΑ-1株。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其特征在于： 所述的VP3基因來源于鵝細(xì)小病毒GD-01株。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒，其特征在于： 所述的重組新城疫病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
7. 權(quán)利要求1-6任一項所述的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒的構(gòu)建方 法，其特征在于包括如下步驟： (1) 構(gòu)建包含插入鵝細(xì)小病毒VP3基因的新城疫病毒基因組序列的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒； (2) 構(gòu)建能夠表達新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的一個或多個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒； (3) 將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染新城疫病毒復(fù)制許可的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿 主細(xì)胞； (4) 從轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的細(xì)胞懸液中拯救重組新城疫病毒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組新城疫病毒的構(gòu)建方法，其特在于： 步驟（1)中所述的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒為PCI-NA-VP3,序列如SEQ ID NO. 1所示； 步驟（2)中所述的轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒為pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L，序列如SEQIDN0.2? 4所示； 步驟⑶中所述的宿主細(xì)胞是Vero細(xì)胞或BHK細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求1-6任一項所述的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒在制備新城 疫病毒、鵝細(xì)小病毒二聯(lián)苗中的應(yīng)用。
10. -種新城疫病毒、鵝細(xì)小病毒二聯(lián)苗，其特征在于：包含權(quán)利要求1-6任一項所述 的表達鵝細(xì)小病毒VP3基因的重組新城疫病毒。
【文檔編號】C12R1/93GK104195116SQ201410398258
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】丁壯, 王建忠, 叢彥龍, 李芹, 李想 申請人:吉林大學(xué)