一種微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，屬于物理場輔助生物催化技術(shù)從而用于有機(jī)合成的范疇。本發(fā)明意在將蔗糖溶解于非水介質(zhì)二甲亞砜/叔丁(戊)醇的混合溶劑中，利用微波輔助脂肪酶催化蔗糖與脂肪酸乙烯酯反應(yīng)生成蔗糖-6-酯。該方法快速、高效、操作簡單，符合綠色化學(xué)的要求。
【專利說明】一種微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于物理場輔助生物催化的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蔗糖-6-酯是制備三氯蔗糖的重要中間體。三氯蔗糖是蔗糖分子中4，I’，6’ -OH被Cl原子取代而其它-OH保持不變的一種功能甜味劑。而蔗糖分子中8個-OH的氯化反應(yīng)活性順序為6，6’ >4>1’ >其他位，因此在氯化處理之前，必須首先屏蔽蔗糖分子中反應(yīng)活性較高的6-OH使之不能被氯化，再對4，I’，6’ -OH進(jìn)行氯化。所以6-OH保護(hù)是氯化反應(yīng)的關(guān)鍵前期步驟，必須采用有效地6-OH?；姆椒ā?br> [0003]傳統(tǒng)的蔗糖-6-酯中間體的制備主要采用原酸酯法與有機(jī)錫催化法等。原酸酯法雖然操作簡單，但收率偏低。相反，有機(jī)錫法收率較高，但是操作及后處理過程復(fù)雜，并存在廣品中重金屬超標(biāo)的風(fēng)險。
[0004]由于酶具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、操作簡單、環(huán)境友好、安全性高等優(yōu)勢，近年來蔗糖-6-酯的制備越來越傾向于酶催化法。經(jīng)大量的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶、脂肪酶、抗體酶是用來合成蔗糖酯的主要酶。但不同來源的酶具有不同的催化特點和催化活力。蛋白酶主要對蔗糖的I’ -OH或2-OH進(jìn)行選擇性催化，且通常不接受長鏈脂肪酸作為?；w。相比蛋白酶，脂肪酶來源廣泛，較寬范圍的脂肪酸蔗糖酯都可被催化合成，并且反應(yīng)一般發(fā)生在6-OH。利用抗體酶催化可得到更純的蔗糖-6-酯最近也有研究證實，但仍待深一步研究。所以目前用于催化合成蔗糖-6-酯的酶主要還是指脂肪酶。
[0005] Ferrel 等(Ferrer M, Cruces MA, BernatT e M, Ballesteros A, Plou FJ.Lipase-catalyzed regioselective acylation of sucrose in two-solvent mixtures.Biotechnol Bioeng 1999;65:10 - 16)利用 H.lanuginosa 脂肪酶在非水相 DMSO/叔戍醇=1:4 (體積比)混合溶液中催化蔗糖與棕櫚酸乙烯酯反應(yīng)，48h后蔗糖轉(zhuǎn)化率為80%，蔗糖-6-棕櫚酸酯的產(chǎn)率為51%。羅旭等(羅旭，錢俊青.叔丁醇體系中脂肪酶催化合成蔗糖乙酸酯[J].高化學(xué)工程學(xué)報，2010, 24(3):451-455)用Lipozyme TL頂催化蔗糖和乙酸乙烯酯反應(yīng)，24 h后酯化率84.7%，但蔗糖-6-乙酸酯卻只占總酯的48.3%。王勅等(王勅，鄭璞，倪曄，等.非水介質(zhì)中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè).2010，36(12):20-24)在DMSO/叔丁醇的混合溶液中，脂肪酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯生成蔗糖-6-乙酸酯，反應(yīng)9h后，相應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率為77%-89%。王勅等雖然使反應(yīng)時間相對縮短、蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率得以提高，但反應(yīng)時間偏長等仍是主要問題。
[0006]自1986年Gedye等利用微波輻射有效地加速有機(jī)反應(yīng)以來，人們對微波的研究越來越深入，并逐步發(fā)展成為一個極具發(fā)展前景的新領(lǐng)域一MORE化學(xué)，即微波促進(jìn)有機(jī)化學(xué)(Microwave Induced Organic Reaction Enhancement Chemistry),也可以叫做微波誘導(dǎo)催化有機(jī)反應(yīng)化學(xué)。目前微波加速有機(jī)反應(yīng)主要用微波的致熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)來解釋。微波熱效應(yīng)表現(xiàn)在其高效加熱特性致使反應(yīng)速度加速。相比于常規(guī)加熱的熱傳遞模式，微波輻射加熱是內(nèi)加熱模式，其加熱均勻、速度快且沒有加熱滯后性及溫度梯度。微波的非熱效應(yīng)表現(xiàn)在微波輻射還起到催化劑的作用，改變了反應(yīng)的動力學(xué)，降低了反應(yīng)活化能，提高了反應(yīng)速率。
[0007]1990年以來，微波被應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域特別是在非水相酶催化方面。微波輻射對生物酶催化反應(yīng)的影響主要表現(xiàn)在:適宜強(qiáng)度的微波輻射能使酶分子的活性部位更加“裸露”，便于更好地與底物結(jié)合，結(jié)果表現(xiàn)出酶活升高；微波輻射能增加反應(yīng)體系及底物分子的能量，加強(qiáng)底物分子之間的有效碰撞，從而實現(xiàn)加快反應(yīng)速率的目的。BradooS 等(Bradoo S，Rathi P, Saxena RK and Gupta R, Microwave - assisted rapidcharacterization of lipase selectivities.J Biochem Biophys Meth 51:115 - 120(2002))研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)奈⒉ㄝ椛洳粌H沒有改變用于水解反應(yīng)或合成反應(yīng)的脂肪酶的選擇性，而且還提高了酶的重復(fù)利用率、顯著的加快了反應(yīng)速率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明采用一種微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，實現(xiàn)了縮短反應(yīng)時間、提高酶的重復(fù)利用率的目的。
[0009]技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，包括以下步驟:
1)將真空干燥的蔗糖溶解于非水相二甲亞砜與叔丁醇或叔戊醇的混合溶劑中得到溶液，將溶液置于微波反應(yīng)器中，加入脂肪酶和脂肪酸乙烯酯得到反應(yīng)體系，采用微波輔助酶催化的方式，控制反應(yīng)溫度為20-60°C，輻射頻率2450MHz和輻射功率30-200W，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到設(shè)定值時開始計時，記錄反應(yīng)3-100min的轉(zhuǎn)化率；
2)反應(yīng)結(jié)束后，通過離心將脂肪酶從混合物中分離，然后用叔丁醇或叔戊醇清洗、真空干燥備用；
3)離心后的液體冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯的濃縮液。
[0010]其中，上述脂肪酸乙烯酯包括乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯或硬脂酸乙烯酯中的一種。
[0011]其中，上述二甲亞砜與叔丁醇或叔戊醇的體積比為1:3-9。
[0012]其中，上述脂肪酶加入量為lO-lOOmg/mL。
[0013]其中，上述蔗糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比為1:2_20。
[0014]其中，上述脂肪酶為Lipozyme TL IM、Lipozyme TL IOOL 和 Lipozyme RM IM 中的一種。
[0015]其中，上述微波輔助酶催化的方式為先對脂肪酶進(jìn)行微波預(yù)處理后再置于微波反應(yīng)器中進(jìn)行催化反應(yīng)或者直接對反應(yīng)體系進(jìn)行微波輻射，即微波輻射與酶催化反應(yīng)同步進(jìn)行。
[0016]其中，上述先對脂肪酶進(jìn)行微波預(yù)處理的輻射功率30-200W，優(yōu)選30-60W ;輻射頻率2450MHz，預(yù)處理脂肪酶的時間為30s-10min，優(yōu)選l_5min ；。
[0017]其中，上述直接對反應(yīng)體系進(jìn)行微波輻射的輻射功率30-200W，優(yōu)選30-60W ;輻射頻率2450MHz，其目的是防止改變酶催化的區(qū)域選擇性，甚至導(dǎo)致酶失活。
[0018]有益效果:本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有以下優(yōu)點:本發(fā)明采用微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯，不僅反應(yīng)迅速、得到高純度的蔗糖-6-酯，而且脂肪酶可反復(fù)多次使用，有效解決了副產(chǎn)物多、反應(yīng)耗時、操作繁瑣等問題，符合綠色化學(xué)理念。本發(fā)明采用微波輔助脂肪酶催化蔗糖和脂肪酸乙烯酯合成蔗糖-6-酯，非但沒有破壞酶的活性、改變其區(qū)域選擇性，而且還使反應(yīng)時間大幅度縮短。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。
[0020]高效液相色譜(HPLC)分析條件:島津LC-10AT型高效液相色譜儀:LC_10AT高壓輸送泵，色譜柱 Supelcosil?LC-18 (250X4.6mm, 5um)，柱溫 30 °C ;檢測器=RID-1OA ;連接器=CBM-1OA VP PLUS ;流動相:乙腈 / 水=6/1 (V/V);進(jìn)樣量:20 μ L，流速 0.8mL/min。
[0021]實施例1:
在150mL的微波反應(yīng)器中先加入已用IOmL DMSO溶解的1.2g蔗糖，再依次加入40mL叔丁醇、Lipozyme TL IM 4.0g、乙酸乙烯酯3.0mL (鹿糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比約為1:9)，將微波反應(yīng)器移入微波反應(yīng)裝置，啟用微波輻射，設(shè)定反應(yīng)溫度35°C，輻射功率30W，輻射頻率2450MHz，攪拌反應(yīng)30min。離心、旋蒸后得淡黃色液體。HPLC分析得蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率約83.1%。
[0022]實施例2:
在150mL的微波反應(yīng)器中先加入已用IOmL DMSO溶解的1.0g蔗糖，再依次加入40mL叔丁醇、Lipozyme TL IM 4.0g、乙酸乙烯酯9.0mL (鹿糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比約為1:20)，將微波反應(yīng)器移入微波反應(yīng)裝置，啟用微波輻射，設(shè)定反應(yīng)溫度35°C，輻射功率40W，輻射頻率2450MHz，攪拌反應(yīng)35min。離心、旋蒸后得淡黃色液體。HPLC分析得蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率約90.5%。
[0023]實施例3:
在150mL的微波反應(yīng)器中先加已用IOmLDMSO溶解的1.0g蔗糖，再依次加入40mL叔戊醇,Lipozyme TL 100L 100mg/mL,乙酸乙烯酯4.5mL(鹿糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比約為1:15)，將微波反應(yīng)器移入微波反應(yīng)裝置，啟用微波輻射，設(shè)定反應(yīng)溫度35 V，輻射功率60W，輻射頻率2450MHz，攪拌反應(yīng)40min。加熱到80°C使脂肪酶TL 100L失活，從而離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯濃縮液。HPLC分析得蔗糖-6-乙酸酯的產(chǎn)率約81.5%。
[0024]實施例4:
將干燥后的蔗糖溶解于非水相二甲亞砜與叔丁醇的混合溶劑中，二甲亞砜與叔戊醇的體積比為1:4，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速3001'/1^11，恒溫501:至蔗糖完全溶解；然后加Lipozyme TL頂，此酶已用40W、2450MHz的微波輻射預(yù)處理5min ;再加入棕櫚酸乙烯酯，使得蔗糖與棕櫚酸乙烯酯的摩爾比為1:15，控制水域溫度351:。反應(yīng)60min后，離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯濃縮液。HPLC分析得蔗糖-6-棕櫚酸酯的產(chǎn)率約82.6%。
[0025]實施例5:
將干燥后的蔗糖溶解于非水相二甲亞砜與叔丁醇的混合溶劑中，二甲亞砜與叔戊醇的體積比為1:6，置于水浴鍋恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速300r/min，恒溫50°C至蔗糖完全溶解；然后加Lipozyme RM頂，此酶已用40W、2450MHz的微波輻射預(yù)處理30s ;再加入癸酸乙烯酯，使得蔗糖與癸酸乙烯酯的摩爾比為1:6，30°C下反應(yīng)40min。離心除去脂肪酶；反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯濃縮液。HPLC分析得蔗糖-6-癸酸酯的產(chǎn)率約為80.1%。
[0026]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將真空干燥的蔗糖溶解于非水相二甲亞砜與叔丁醇或叔戊醇的混合溶劑中得到溶液，將溶液置于微波反應(yīng)器中，加入脂肪酶和脂肪酸乙烯酯得到反應(yīng)體系，采用微波輔助酶催化的方式，控制反應(yīng)溫度為20-60°C，輻射頻率2450MHz和輻射功率30-200W，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到設(shè)定值時開始計時，記錄反應(yīng)3-100min的轉(zhuǎn)化率； 2)反應(yīng)結(jié)束后，通過離心將脂肪酶從混合物中分離，然后用叔丁醇或叔戊醇清洗、真空干燥備用； 3)離心后的液體冷卻至室溫，減壓蒸餾得到蔗糖-6-酯的濃縮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述脂肪酸乙烯酯包括乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯或硬脂酸乙烯酯中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述二甲亞砜與叔丁醇或叔戊醇的體積比為1:3-9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述脂肪酶加入量為lO-lOOmg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述蔗糖與脂肪酸乙烯酯的摩爾比為1:2_20。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述脂肪酶為 Lipozyme TL IM、Lipozyme TL IOOL 和 Lipozyme RM IM 中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述微波輔助酶催化的方式為先對脂肪酶進(jìn)行微波預(yù)處理后再置于微波反應(yīng)器中進(jìn)行催化反應(yīng)或者直接對反應(yīng)體系進(jìn)行微波輻射，即微波輻射與酶催化反應(yīng)同步進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述先對脂肪酶進(jìn)行微波預(yù)處理的輻射功率30-200W，輻射頻率2450MHz，預(yù)處理脂肪酶的時間為 30s-10min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微波輔助脂肪酶催化合成蔗糖-6-酯的方法，其特征在于，所述直接對反應(yīng)體系進(jìn)行微波輻射的輻射功率30-200W，輻射頻率2450MHz。
【文檔編號】C12P19/12GK103966278SQ201410233056
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】沈彬, 申桂賢, 趙芬利, 張衡 申請人:東南大學(xué)