一種基于數(shù)字pcr平臺檢測基因點(diǎn)突變的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體為一種檢測基因點(diǎn)突變的方法及試劑盒；以數(shù)字PCR為平臺，在反應(yīng)體系中加入PCR引物和TaqMan探針，利用兩條標(biāo)記不同類型熒光的TaqMan探針對野生和突變DNA模板進(jìn)行檢測；根據(jù)熒光類型判斷樣品中DNA模板的類型及其數(shù)量和比例。
【專利說明】—種基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的方法和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域和核酸檢測領(lǐng)域，具體為檢測基因點(diǎn)突變的方法及其試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]點(diǎn)突變是基因變異中常見的類型，會給微生物、植動物的生物性狀和人類的生理性狀帶來很多變化；包括蛋白質(zhì)功能的部分或全部失活，形成無活性的片段等，也有可能改變生物體的基因調(diào)控等其他功能。基因突變的研究對生物的遺傳、進(jìn)化和改造具有重要意義。
[0003]目前基因變異的檢測技術(shù)主要有直接測序法(亦稱Sanger測序法)和ARMS法?，F(xiàn)分別簡介于下:
[0004]Sanger測序法，即Sanger(桑格)雙脫氧鏈終止法是Frederick Sanger于1975年發(fā)明的。測序過程需要先做一個聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR過程中，雙脫氧核糖核苷酸可能隨機(jī)的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸多脫了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續(xù)增加長度。最終的結(jié)果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。目前最普遍最先進(jìn)的方法，是將雙脫氧核糖核苷酸進(jìn)行不同熒光標(biāo)記。將PCR反應(yīng)獲得的總DNA通過毛細(xì)管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發(fā)出熒光。由于ddATP，ddGTP, ddCTP, ddTTP (4種雙脫氧核糖核苷酸)熒光標(biāo)記不同，計(jì)算機(jī)可以自動根據(jù)顏色判斷該位置上堿基究竟是A，T，G，C中的哪一個。直接測序法耗時長(一般需2 — 3天)且靈敏度低，僅能檢出突變比例在10%~20%以上的突變。
[0005]ARMS 法也稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)、等位基因特性PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)等，即等位基因特異性擴(kuò)增法(Allele Specific Amplif ication, ASA)建立于 1989 年,是 PCR 技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展。
[0006]ARMS法主要用于對已知突變基因進(jìn)行檢測。利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，首先設(shè)計(jì)兩個5’端引物，一個與正常DNA互補(bǔ)，一個與突變DNA互補(bǔ)。對于純合性突變，分別加入這兩種引物及下游3’端引物進(jìn)行兩個平行PCR，只有與突變DNA完互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯配位于上游5’端引物的3’端，則引物與模板DNA不配對，導(dǎo)致PCR不能延伸，因此這種方法稱為ARMS，可選擇性地?cái)U(kuò)增突變型DNA模板。
[0007]上述現(xiàn)有技術(shù)存在以下問題:
[0008]1.均為定性檢測，也就是說只能給出基因變異是否存在的結(jié)論。但無法測定攜帶基因變異的DNA量的比例，也就是說難以進(jìn)行定量檢測，或者定量分析誤差較大。
[0009]2.均給出模擬圖結(jié)果，需要人工進(jìn)行判讀，判讀方面相對比較主觀。無法直接得到數(shù)字化的客觀結(jié)果。
[0010]3.靈敏度比較差，目前方法的靈敏最好為1%，無法滿足某些特定的臨床檢測需求。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明旨在提供一種基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的試劑盒及方法。
[0012]數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對定量方法，基于單分子PCR方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)，主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于I個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。
[0013]本發(fā)明以數(shù)字PCR為平臺，在反應(yīng)體系中加入PCR引物和TaqMan探針，利用兩條不同的TaqMan探針(標(biāo)記不同類型熒光)對野生和突變DNA模板進(jìn)行檢測；根據(jù)熒光類型判斷樣品中DNA模板的類型。
[0014]本發(fā)明技術(shù)方案為，
[0015]一種檢測基因點(diǎn)突變的方法，步驟包括:
[0016]1.將待測樣品DNA模板、點(diǎn)突變位置的上下游PCR擴(kuò)增引物、TaqMan探針以及PCR預(yù)混液混合，制備得到數(shù)字PCR混合液；
[0017]TaqMan探針，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，或者包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針；兩者均為為連接熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的核苷酸，且所含的熒光基團(tuán)的種類不同。優(yōu)選的，熒光基團(tuán)選自FAM(6-羧基突光素)、HEX (六氯-6-羧基突光素)、Cy5 (美國Life Technologies)、Cy3 (美國Life Technologies)、VIC (美國 Life Technologies),突光粹滅基團(tuán)選自 TAMARA (6_ 竣基四甲基若丹明)、BHQ1 (美國 Life Technologies),BHQ2 (美國 Life Technologies)或 MGB(美國 Life Technologies)。
[0018]數(shù)字PCR混合液中，所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探針的含量如下:
[0019]a.DNA 模板,含量為 0.25 ~Ing/ μ L,優(yōu)選為 0.5ng/ μ L ；
[0020]b.PCR引物，包括正向弓丨物和反向引物，含量分別為500~700nM，優(yōu)選為600nM ；
[0021]c.TaqMan探針，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，含量為200~400nM，優(yōu)選為300nM ;或者，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，含量分別為200~400nM，優(yōu)選為300nM。
[0022]2.數(shù)字PCR混合液制作PCR微反應(yīng)液滴，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；條件為:93~97°C預(yù)變性3~15分鐘；93~97°C變性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共進(jìn)行20~60個循環(huán)，2~10°C終止反應(yīng)。
[0023]優(yōu)選的PCR擴(kuò)增條件為，93.5~95°C預(yù)變性3~6分鐘；93.5~95°C變性8~15秒，64.5~66°C退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共進(jìn)行30~35個循環(huán)，6~10°C終止反應(yīng)。
[0024]更優(yōu)選的PCR擴(kuò)增條件為，94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進(jìn)行32個循環(huán)，10°C終止反應(yīng)。
[0025]優(yōu)選的，數(shù)字PCR混合液制作PCR微反應(yīng)液滴的方法為，將數(shù)字PCR混合液加入微滴發(fā)生器，生成10000~20000個微反應(yīng)液滴。
[0026] 3.收集信號并進(jìn)行結(jié)果判斷:PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行信號收集，根據(jù)熒光信號類型判斷待測樣品中是否含有發(fā)生點(diǎn)突變的DNA模板，還可確定其中發(fā)生基因點(diǎn)突變的DNA模板的數(shù)量和含量。
[0027]可用QuantaSoft (Biorad)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)算樣品中發(fā)生突變的拷貝數(shù)和含量，確定突變DNA樣本的比例。
[0028]一種基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的TaqMan探針，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，或者包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針。優(yōu)選的，這種數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的TaqMan探針由與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針組成。
[0029]與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針均為為連接熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的核苷酸，且所含的熒光基團(tuán)的種類不同。
[0030]熒光基團(tuán)選自FAM (6-羧基熒光素)、HEX (六氯_6_羧基熒光素)、Cy5 (美國LifeTechnologies)、Cy3 (美國 Life Technologies)、VIC (美國 Life Technologies),突光粹滅基團(tuán)選自TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)、BHQ1 (美國Life Technologies),BHQ2 (美國Life Technologies)或 MGB (美國 Life Technologies)。
[0031]上述的TaqMan探針可以用于制備試劑盒，基于數(shù)字PCR平臺用來檢測基因是否點(diǎn)突變。
[0032]本發(fā)明將帶有不同類型熒光基團(tuán)、且分別與突變型DNA模板以及野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，用作制備基于數(shù)字PCR平臺檢測基因缺失突變的試劑盒，或者基于數(shù)字PCR平臺檢測基因缺失突變。
[0033]一種檢測基因點(diǎn)突變的試劑盒，包含以下物質(zhì):
[0034](I)與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針；
[0035](2)與野生DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，且上述兩種TaqMan探針均為連接熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的核苷酸，所含的熒光基團(tuán)類型不同。
[0036]熒光基團(tuán)選自FAM (6-羧基熒光素)、HEX (六氯_6_羧基熒光素)、Cy5 (美國LifeTechnologies)、Cy3 (美國 Life Technologies)、VIC (美國 Life Technologies),突光粹滅基團(tuán)選自TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)、BHQ1 (美國Life Technologies),BHQ2 (美國Life Technologies)或 MGB (美國 Life Technologies)。
[0037]與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0038]1.結(jié)果判讀方式:以前的技術(shù)方法結(jié)果的判讀需要人工參與，肉眼依據(jù)相關(guān)圖形作出最后的判斷，這種判讀的方式嚴(yán)重依賴經(jīng)驗(yàn)，速度慢且很容易產(chǎn)生假陽性和假陰性的判讀結(jié)果。我們的技術(shù)方式給出的是數(shù)據(jù)信息，可以借助軟件完全自動化的進(jìn)行結(jié)果判讀，從而加快了數(shù)據(jù)分析的速度，也減少了產(chǎn)生假陰性和假陽性判讀的可能。
[0039]2.結(jié)果描述的方式:以前的技術(shù)方式對基因變異的描述是定性的方式，也就是說，只是描述某個特異的基因變異是否存在于檢測樣本。本技術(shù)方法對基因變異的描述是絕對定量的方式，可以給出樣本所攜帶某種特異基因變異DNA的絕對數(shù)量和比例。而且準(zhǔn)確率高，即使在突變樣本含量極低的情況下，定量分析的誤差也很小。
[0040]3.檢測靈敏度(數(shù)值越小靈敏度越好):以前技術(shù)方法的靈敏度一般在I % — 50%之間，而我們提出的技術(shù)方法對基因變異的檢測靈敏度提升非常明顯，能達(dá)到1/2500。可以在非常高背景的野生DNA中檢測出極其微量的攜帶基因變異的DNA。【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為實(shí)施例1中，不同含量EGFR外顯子21上L858R點(diǎn)突變樣本的熒光檢測結(jié)
果O
[0042]圖2為實(shí)施例2中，不同含量EGFR外顯子20上T790M點(diǎn)突變樣本的熒光檢測結(jié)
果O
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下實(shí)施例是對本發(fā)明的更詳細(xì)說明，而不是對本發(fā)明范圍的限定。
[0044]所用基因序列的來源為NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心):
[0045]實(shí)施例1EGFR (人表皮生長因子受體)基因外顯子21上L858R點(diǎn)突變
[0046](I)準(zhǔn)備樣品:含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外顯子21上L858R點(diǎn)突變的突變陽性DNA與野生型DNA混合的樣本(其中突變體與野生型的含量比分別為1/1、1/100、1/1000、1/2500)。DNA來源可以是血清、血漿、外周血、口腔黏膜、胸腔積液、體液或者組織等。其中，突變DNA模板來源于攜帶EGFR外顯子21上L858R點(diǎn)替換突變的細(xì)胞系(經(jīng)PCR測序鑒定)，其中突變的位點(diǎn)在EGFR外顯子21上c.2573位。
[0047](2 )室溫融解PCR弓丨物及對應(yīng)TaqMan探針。
[0048]正向和反向PCR引物的序列為:
[0049]Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，
[0050]Rl: 5 ’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3，
[0051 ] TaqMan探針的序列為:
[0052]與野生型DNA結(jié)合的TaqMan探針PWl上連接的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)為VIC和MGB，其核苷酸部分序列為:5’ -TTGGCCAGCCCAA-3’。
[0053]與突變型DNA結(jié)合的TaqMan探針PMl上連接的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)為FAM和MGB，其核苷酸部分序列為:PM15’ -TTGGCCCGCCCAA-3’。
[0054](3)按照以下配比制備PCR反應(yīng)液:2X數(shù)字PCR預(yù)混液(Biorad，#186-3022)與正向及反向PCR引物、與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針、與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針及與待檢測DNA (IOng)混合，用蒸餾水補(bǔ)足至終體積為20 μ L，配制成數(shù)字PCR混合液。其中正向及反向PCR引物含量分別為600ηΜ，與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針分別為300ηΜ。
[0055](4)配制好的20 μ L數(shù)字PCR混合液加入到8-道的液滴制作板內(nèi)，然后加入60 μ L液滴制作油到制作板用于制備PCR微反應(yīng)液滴(QX200微滴發(fā)生器)。
[0056](5)將制備好的PCR微反應(yīng)液滴轉(zhuǎn)移至96孔反應(yīng)板，并用封板膜進(jìn)行熱封，生成的微反應(yīng)液滴數(shù)量為10000~20000個。
[0057](6)將96孔PCR板放入PCR儀按照下面條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng):
[0058]94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進(jìn)行32個循環(huán)，10°C終止反應(yīng)。
[0059](7)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后將PCR反應(yīng)板放置于PCR微反應(yīng)液滴信號讀取儀(QX200微滴熒光信號 收集系統(tǒng))中進(jìn)行信號收集，檢測FAM和VIC的熒光信號。用QuantaSoft(Biorad)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析結(jié)果如圖1?？蛇M(jìn)行定量分析，得出樣本中突變DNA的絕對含量以及相對于總DNA的比例。
[0060]以上述方法，可以檢測位于c.2573的EGFR外顯子21上L858R點(diǎn)突變，檢出限達(dá)到 1/2500。
[0061]突變體與野生型的含量不同的樣品檢測結(jié)果中，突變陽性信號數(shù)(FAM)與總信號數(shù)(FAM和VIC)如下:
[0062]1/1 樣品:5570/11274，計(jì)算值突變 / 野生=0.976/1，誤差 2.4%
[0063]1/100 樣品 87/9012，計(jì)算值突變 / 野生=0.00975/1，誤差 2.5%
[0064]1/1000 樣品:22/19782，計(jì)算值突變/野生=0.0011/1，誤差 10%
[0065]1/2500 樣品:5/12582，計(jì)算值突變 / 野生=0.000397/1，誤差 0.1%。
[0066]定量分析的結(jié)果顯示，誤差一般在0.5%~4%，不超過10%。
[0067]使用以下各組之一的PCR引物時，按照上述步驟檢測，結(jié)果相同，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出，并且突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時，定量分析的誤差一般在0.1%~5%。
[0068](I)正向 F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3 ’，
[0069]反向R2:5，-TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，或者，
[0070](2 )正向 F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3 ’，
[0071]反向R3:5 ’ -CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3 ’，或者，
[0072](3 )正向 F4:5，-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0073]反向R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，或者，
[0074](4 )正向 F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，，
[0075]反向R5:5，-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
[0076]使用的TaqMan探針核苷酸部分改為以下各組序列之一時，按照上述步驟檢測，結(jié)果相同，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出，并且突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時，定量分析的誤差一般不超過5%。
[0077](I) PW2:5，-TTGGGCTGGCCAA-3 ’，
[0078]PM2:5，-TTTGGCCCGCCCA-3，，或者，
[0079](2 ) PW3:5，-TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
[0080]PM3:5，-GTTTGGCCCGCCC-3，，或者，
[0081 ] (3 ) PW4:5，-TGGGCTGGCCAAA-3，，
[0082]PM4:5 ’ -AGTTTGGCCCGCC-3 ’，或者，
[0083](4 ) PW5:5，-GGGCTGGCCAAACTG-3 ’，
[0084]PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3’。
[0085]根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)記載，使用其他方法如熒光定量PCR法檢測，檢出限為1/100，而且在突變樣本含量大于1%的情況下，定量分析的誤差大于10%。
[0086]實(shí)施例2EGFR基因外顯子20上T790M點(diǎn)突變
[0087]采用與實(shí)施例1相同的條件和操作方法，區(qū)別在于使用以下的PCR引物及TaqMan探針:
[0088]正向和反向PCR引物的序列為:[0089]正向F1:5，-TCTGCCTCACCTCCACCG-3 ’
[0090]反向Rl: 5，-AGGCAGCCGAAGGGCA-3，
[0091]與野生型DNA結(jié)合的TaqMan探針上連接的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)為VIC和MGB，其核苷酸部分序列為:PW3:5’ -TGAGCTGCGTGAT-3’。
[0092]與突變型DNA結(jié)合的TaqMan探針上連接的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)為FAM和MGB，其核苷酸部分序列為:PM4:5’ -GCTGCATGATGAG-3’。
[0093]結(jié)果如圖2，以上述方法，可以檢測位于c.2573的EGFR外顯子20上T790M點(diǎn)突變，檢出限達(dá)到1/2500。定量分析誤差一般在0.01%~1%，突變體與野生型的含量不同的樣品檢測結(jié)果中，突變陽性信號數(shù)(FAM)與總信號數(shù)(FAM和VIC)如下:
[0094]1/1 樣品 5365/10756，計(jì)算值突變 / 野生=0.995/1，誤差 0.5%[0095]1/100 樣品 105/10564，計(jì)算值突變 / 野生=0.010/1
[0096]1/1000 樣品 21/19691，計(jì)算值突變 / 野生=0.00107/1，誤差 7%
[0097]1/2500 樣品 7/17523 計(jì)算值突變 / 野生=0.000399/1。
[0098]使用以下各組之一的PCR引物時，按照上述步驟檢測，結(jié)果相同，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出，并且突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時，
定量檢測誤差一般低于2%。
[0099](I)正向 F1:5，-TCTGCCTCACCTCCACCG-3，
[0100]反向R3:5，-CAGGAGGCAGCCGAAG-3 ’
[0101](2 )正向 F3:5，-CCTCACCTCCACCGTGCA-3，
[0102]反向R3:5，-CAGGAGGCAGCCGAAG-3 ’
[0103](3 )正向 F4:5，-TCACCTCCACCGTGCAGC-3 ’
[0104]反向R4:5 ’ -TCCAGGAGGCAGCCGA-3 ’
[0105](4 )正向 F4:5，-TCACCTCCACCGTGCAGC-3 ’，
[0106]反向R5:5，-AGTCCAGGAGGCAGCC-3，。
[0107]使用的TaqMan探針的核苷酸部分改為以下各組之一時，按照上述步驟檢測，結(jié)果相同，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出，并且突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時，定量檢測誤差一般低于2%。
[0108](I) PM5:5 ’ -CTGCATGATGAGC-3，
[0109]PW5:5 ’ -CTGCGTGATGAGC-3，；
[0110](2 ) PM2:5，-GAGCTGCATGATG-3，，
[0111]PW2:5 ’ -GAGCTGCGTGATG-3，。
[0112]使用熒光定量PCR的方法檢測，檢出限為1/100，而且在突變樣本含量大于1%的情況下，定量分析的誤差大于10%。
【權(quán)利要求】
1.一種基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的方法，其特征在于， (1)數(shù)字PCR混合液制備:將待測的DNA模板、PCR引物、TaqMan探針以及PCR預(yù)混液混合，制備得到數(shù)字PCR混合液； 所述的TaqMan探針包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，或者，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針；所述與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針為連接熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的核苷酸，且兩者所含的熒光基團(tuán)不同； (2)用數(shù)字PCR混合液制作PCR微反應(yīng)液滴，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； PCR擴(kuò)增條件為:93~97°C預(yù)變性3~15分鐘；93~97°C變性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共進(jìn)行20~60個循環(huán)，2~10°C終止反應(yīng)； (3)信號收集與結(jié)果判斷:對PCR擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行信號收集，根據(jù)熒光信號的類型判斷待測樣品中是否含有點(diǎn)突變的DNA模板及其數(shù)量和含量。
2.權(quán)利要求1所述基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的T方法其特征在于，所述熒光基團(tuán)選自6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素、Cy5、Cy3或VIC，猝滅基團(tuán)選自6-羧基四甲基若丹明、BHQl、BHQ2或MGB。
3.權(quán)利要求1所述基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的T方法其特征在于，所述的TaqMan探針由與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針組成。
4.權(quán)利要求1所述基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的T方法其特征在于，PCR擴(kuò)增條件為，93.5~95°C預(yù)變性3~6分鐘；93.5~95°C變性8~15秒，64.5~66°C退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共進(jìn)行30~35個循環(huán)，6~10°C終止反應(yīng)。
5.權(quán)利要求1所述基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的T方法其特征在于，PCR擴(kuò)增條件為，94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進(jìn)行32個循環(huán)，10°C終止反應(yīng)。
6.權(quán)利要求1所述基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的T方法其特征在于，數(shù)字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探針的含量如下: a.DNA模板,含量為0.25~Ing/ μ L ； b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分別為500~700nM ； c.TaqMan探針，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，含量為200~400nM ;或者，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，含量分別為200~400nM。
7.權(quán)利要求1所述基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的T方法其特征在于，數(shù)字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探針的含量如下: a.DNA模板,含量為0.5ng/ μ L ； b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分別為600nM ； c.TaqMan探針，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，含量為300nM ;或者，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，含量分別為300nM。
8.TaqMan探針用于制備基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的試劑盒，其特征在于，所述的TaqMan探針包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，含量為200~400nM ;或者，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針。
9.TaqMan探針用于基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變，其特征在于，所述的TaqMan探針包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針，含量為200~400nM ;或者，包括與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針。
10.一種基于數(shù)字PCR平臺檢測基因點(diǎn)突變的試劑盒，其特征在于，包含以下物質(zhì): (1)與突變型DNA模板結(jié)合的TaqMan探針； (2)與野生DNA模板結(jié)合的TaqMan探針； 且上述兩種TaqMan探針均為連接熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的核苷酸，所含的熒光基團(tuán)類 型不同。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911427SQ201410040843
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】王貽锘 申請人:上海涌泰生物醫(yī)藥科技有限公司