本發(fā)明涉及基因檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種檢測ALDH2基因突變的探針及其應(yīng)用和試劑盒。
背景技術(shù)：
：乙醛脫氫酶(AcetaldehydeDehydrogenase，ALDH)由ALDH基因編碼，可分為ALDH1A1、ALDH1B1和ALDH2。其中，ALDH2在人體內(nèi)把乙醛催化成乙酸的能力最強(qiáng)。ALDH2基因位于第12號染色體(12q24)，由13個外顯子構(gòu)成，編碼的酶蛋白肽鏈由500個氨基酸殘基組成。研究表明，該基因的多態(tài)性在亞洲人群中很常見，并且可能影響人群的飲酒行為。ALDH2與亞洲人群最為密切的是ALDH2基因的rs671位點(diǎn)G→A突變，可導(dǎo)致其編碼的多肽鏈谷氨酸(Glu)變?yōu)橘嚢彼?Lys)。ALDH2基因與酒精在人體內(nèi)的分解代謝有關(guān)，還參與硝酸甘油的代謝。飲酒后吸收進(jìn)入體內(nèi)的乙醇，主要在肝臟進(jìn)行代謝。乙醇被氧化成乙醛后，95％在肝臟變成乙酸，余下5％在其他組織及血液被代謝掉。乙醇在體內(nèi)代謝產(chǎn)物是乙醛，是導(dǎo)致酒精性肝病的主要原因。由于ALDH2G(ALDH2*1)的基因序列發(fā)生突變形成ALDH2L(ALDH2*2)等位基因，二者隨機(jī)組合可編碼形成ALDH2GG、ALDH2GL或ALDH2LL，3種基因型。ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)的飲酒者，體內(nèi)把乙醛氧化成乙酸能力很強(qiáng)，對乙醇耐受性高，可以過量飲酒，但應(yīng)適當(dāng)節(jié)制。ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突變型雜合型)的飲酒者，血液中乙醛的濃度是前者的6倍，對酒有一定的耐受性，可以適量飲酒。ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突變型純合型)的飲酒者血液中乙醛的濃度是前者的19倍，對酒敏感，沒有耐受性，飲酒后很快出現(xiàn)嚴(yán)重不適現(xiàn)象。大量乙醛滯留在體內(nèi)，除了損傷肝臟導(dǎo)致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌，還與增加食道癌、口咽癌和胃癌、冠心病、心肌梗死等風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。硝酸甘油作為抗心絞痛的經(jīng)典藥物，已有多位學(xué)者對其生物轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究，2002年Chen等發(fā)現(xiàn)在巰基化合物參與下，ALDH2能夠催化硝酸甘油生成1，2-二硝酸甘油和亞硝基硫醇，之后ALDH2在硝酸甘油代謝中的重要作用引起越來越多學(xué)者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2*1/ALDH2*1基因型(野生型)具有ALDH2的正?；盍?，ALDH2*1/ALDH2*2基因型(突變型雜合型)存在6％的酶活力，而ALDH2*2/ALDH2*2基因型(突變型純合型)則完全喪失酶的活力，使硝酸甘油無法產(chǎn)生一氧化氮，難以發(fā)揮藥效。ALDH2除了與酒精性肝病等消化道疾病息息相關(guān)外，還與其他一些疾病相關(guān)，如消化道腫瘤、白血病、帕金森病(PD)等。ALDH2位點(diǎn)的多態(tài)性為先天遺傳，與任何疾病的發(fā)生無關(guān)，與年齡無關(guān)。研究表明，ALDH2*2在人類各族群中的分布是不同的，亞洲人種出現(xiàn)頻率較高。中國漢族ALDH2*2的頻率為15.5％，墨西哥1.0％，日本人23.8％，歐洲人0％，南非人0％。中國人群中廣東漢族最高，達(dá)31％，武漢漢族12％，洛陽人15％，上海人25％，臺灣人30％。此外，ALDH2各基因型的發(fā)生率在男女性別上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，ALDH2基因多態(tài)性檢測將為硝酸甘油的用藥、飲酒指導(dǎo)及相關(guān)高風(fēng)險(xiǎn)疾病的提示提供有效的參考依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用意義。目前，用于ALDH2基因分型的方法有以下幾種，各有其特點(diǎn)。1.限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR-RFLP)PCR-RFLP為最為經(jīng)典的SNP分型方法，它先利用PCR擴(kuò)增跨越多態(tài)位點(diǎn)的靶DNA，然后用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶切割PCR產(chǎn)物，最后根據(jù)酶切產(chǎn)物的電泳條帶判斷基因型。例如Hayashida等曾用該法對ALDH2進(jìn)行分型，PCR擴(kuò)增目的片段長度為430bp，野生型等位基因(ALDH2*1)會被AcuⅠ酶切成296bp和134bp2個片段，反之，突變型等位基因(ALDH2*2)則不能被AcuⅠ酶切。這樣野生型純合子ALDH2*1/*1的條帶為296bp、134bp，雜合子ALDH2*1/*2的條帶為430bp、296bp、134bp，突變型純合子ALDH2*2/*2的條帶為430bp。PCR-RFLP分型法操作簡單，所需模板DNA量少，無需使用大型貴重儀器，實(shí)驗(yàn)中不涉及危險(xiǎn)試劑，安全性高。但該法的一個最大缺點(diǎn)在于，會因?yàn)閮?nèi)切酶的活性、酶切時間、酶切體系的不恰當(dāng)?shù)仍蛟斐杉訇幮曰蚣訇栃远霈F(xiàn)基因型的誤判。2.等位基因特異性PCR(allelespecificPCR，AS-PCR)AS-PCR的基本原理是根據(jù)SNP位點(diǎn)的堿基特點(diǎn)設(shè)計(jì)2條等位基因特異引物(針對于野生型等位基因的P1、針對突變型等位基因的P2)，它們的3’末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同)，另需一條按常規(guī)方法設(shè)計(jì)的公共用引物P3。用P1、P3作引物，在野生型等位基因中有擴(kuò)增產(chǎn)物，在突變型等位基因中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，用P2、P3作引物，情況則剛好相反。PCR結(jié)束后，用凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，從而確定基因型。AS-PCR方法避免采取酶切方法，步驟更簡潔，但是等位基因特異性PCR擴(kuò)增方法的假陽性率較高，其對實(shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)格。3.Taqman探針技術(shù)Taqman探針技術(shù)在普通PCR的基礎(chǔ)上增加熒光標(biāo)記的探針，隨著PCR產(chǎn)物的不斷增加，熒光的強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，則可以檢測到一個熒光增長曲線。該法的主要不足是采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記技術(shù)，其定量檢測受酶活性的影響；本底較強(qiáng)，有時無法鑒別高度相關(guān)序列；探針標(biāo)記以及實(shí)驗(yàn)儀器成本較高，不便普及應(yīng)用。4.高分辨率熔解曲線法高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(highresolutionmelting，HRM)是在實(shí)時熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，它在PCR體系中加入飽和雙鏈DNA結(jié)合染料，在PCR結(jié)束后制作高分辨率熔解曲線，根據(jù)熔解曲線的不同來對樣品進(jìn)行分型。該方法因其快速、通量大、使用成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關(guān)注。但HRM技術(shù)對儀器溫度的均一性要求非常高，需LightCycleryTM480PCR儀或LightScanner等價(jià)格高昂的專用儀器及精密的分析軟件。另外，該法要求擴(kuò)增片段的大小在400bp以下，引物設(shè)計(jì)受到局限，PCR條件的優(yōu)化比較復(fù)雜。5.直接測序法。測序法是檢測SNP的金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度高。包括直接測序(雙脫氧鏈終止法)、焦磷酸測序及微測序等。測序需要一些特殊的儀器設(shè)備，需要專業(yè)人員操作，費(fèi)用高，周期長；對PCR產(chǎn)物的量、純度及特異性要求高，PCR后操作步驟繁瑣。測序法目前在臨床檢測方面的應(yīng)用還是有一定的困難，多作為其他分析方法的確認(rèn)。6.變性高效液相色譜法。該方法的原理基于發(fā)生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異，利用色譜方法進(jìn)行分離。由于雜合雙鏈在突變位點(diǎn)處出現(xiàn)錯配，易于形成“Y”型結(jié)構(gòu)，與色譜柱的固定相結(jié)合能力降低，因此雜合雙鏈DNA比純合雙鏈DNA優(yōu)先洗脫出來，通過洗脫峰的改變可以判斷是否存在突變。但它只可判斷有無突變，不能確定SNP的位置和類型，需用標(biāo)準(zhǔn)樣品或結(jié)合測序驗(yàn)證，且需要昂貴特殊儀器及專業(yè)分析軟件，這也是DHPLC未能得以廣泛推行的原因之一。此外，檢測過程需要打開反應(yīng)管，容易造成污染。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種檢測ALDH2基因突變的探針，該探針可針對ALDH2基因的rs671位點(diǎn)的G→A突變進(jìn)行檢測，其具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、假陽性率低等特點(diǎn)。本發(fā)明的第二目的在于提供上述的檢測ALDH2基因突變的探針在制備用于檢測ALDH2基因突變的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三目的在于提供一種試劑盒，該試劑盒含有上述的探針，可用于ALDH2基因的rs671位點(diǎn)的G→A突變進(jìn)行檢測，其具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、假陽性率低、操作簡便、耗時短、成本低等特點(diǎn)。本發(fā)明的第四目的在于提供上述的檢測ALDH2基因突變的探針在檢測ALDH2基因突變中的應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種檢測ALDH2基因突變的探針，其包括SEQIDNO.1所示的檢測探針，以及SEQIDNO.2-3所示的捕獲探針中的一種或兩種，檢測探針的5’端或3’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的親和物。上述的檢測ALDH2基因突變的探針在制備用于檢測ALDH2基因突變的試劑盒中的應(yīng)用。一種試劑盒，其包括上述的檢測ALDH2基因突變的探針。上述的檢測ALDH2基因突變的探針在檢測ALDH2基因突變中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種檢測ALDH2基因突變的探針及其應(yīng)用和試劑盒的有益效果是：本發(fā)明提供的檢測ALDH2基因突變的探針，其包括SEQIDNO.1所示的檢測探針，以及SEQIDNO.2-3所示的捕獲探針中的一種或兩種。其中，SEQIDNO.2所示的捕獲探針為野生型捕獲探針，可對野生型ALDH2基因檢測，SEQIDNO.3所示的捕獲探針為突變型捕獲探針，可對突變型ALDH2基因檢測。任意一種捕獲探針與檢測探針配合，在EFIRM技術(shù)平臺上均能夠?qū)崿F(xiàn)對ALDH2基因的rs671位點(diǎn)是否發(fā)生了G→A突變檢測，具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、假陽性率低、特異性高、靈敏度高，成本低、操作簡單方便等特點(diǎn)，為ALDH2基因突變的檢測提供了一種全新的檢測策略。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明采用實(shí)施例1提供的檢測ALDH2基因突變的探針檢測不同濃度的待測樣本的檢測結(jié)果；圖2為本發(fā)明采用實(shí)施例2提供的檢測ALDH2基因突變的探針檢測不同濃度的待測樣本的檢測結(jié)果；圖3為本發(fā)明采用實(shí)施例3提供的檢測ALDH2基因突變的探針檢測三份樣本的檢測結(jié)果；圖4為本發(fā)明實(shí)施例8中對三份樣本的ALDH2基因rs671位點(diǎn)區(qū)域的測序結(jié)果圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對本發(fā)明實(shí)施例的檢測ALDH2基因突變的探針及其應(yīng)用和試劑盒進(jìn)行具體說明。一方面，本發(fā)明提供了檢測ALDH2基因突變的探針，該探針其包括SEQIDNO.1所示的檢測探針，以及SEQIDNO.2-3所示的捕獲探針中的一種或兩種，所述檢測探針的5’端或3’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的親和物。該探針基于人的ALDH2基因的rs671位點(diǎn)G→A突變進(jìn)行設(shè)計(jì)，可用于在電場誘導(dǎo)釋放和測量(EFIRM)技術(shù)平臺上進(jìn)行檢測。該探針由本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過長期的探索研究后得到，具有特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)。其中，SEQIDNO.2所示的捕獲探針為野生型捕獲探針，可將野生型ALDH2基因(rs671位點(diǎn)為G)片段捕獲固定。SEQIDNO.3所示的捕獲探針為突變型捕獲探針，可用于將突變型ALDH2基因(rs671位點(diǎn)為A)片段捕獲固定。各捕獲探針與檢測探針配合，在EFIRM技術(shù)平臺上實(shí)現(xiàn)對ALDH2基因的rs671位點(diǎn)是否發(fā)生了突變的檢測。相較于現(xiàn)有的檢測技術(shù)，通過本發(fā)明提供的探針和EFIRM技術(shù)的結(jié)合，其具有操作簡便快速(待測樣本處理方法簡便)、檢測時間短(整個檢測過程耗時約30min，半個小時即可輸出結(jié)果)、特異性強(qiáng)(需要捕獲探針和檢測探針的雙特異性識別結(jié)合后，才具有檢出信號)、靈敏度高(在電場誘導(dǎo)作用下，即微量的目標(biāo)序列能夠被捕獲，并通過電信號的放大作用，而輸出檢測信號)、成本低(檢測過程中所用的試劑簡單、設(shè)備要求低)等特點(diǎn)。兩種捕獲探針以及檢測探針的序列長度和堿基序列均是本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過長期的探索優(yōu)化篩選后得到，具有較強(qiáng)的特異性和靈敏度，能夠有效地將相應(yīng)目標(biāo)序列捕獲固定，具有非常好的特異性。檢測探針的5’端或3’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的生物素，生物素的作用在于與鏈霉親和素標(biāo)記的催化酶結(jié)合，通過催化酶催化底物產(chǎn)生的電流釋放檢測信號。容易理解，生物素可以采用其他類型的物質(zhì)替代，例如地高辛或者異硫氰酸熒光素等。只要檢測探針的5’端或3’端標(biāo)記有用于結(jié)合催化酶的親和物即屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另一方面，本發(fā)明還提供了上述的探針在制備用于檢測ALDH2基因突變的試劑盒中的應(yīng)用。目前來說，基于EFIRM技術(shù)平臺用于檢測ALDH2基因突變中尤其是檢測ALDH2基因的rs671位點(diǎn)G→A突變的試劑盒基本沒有。本發(fā)明的試劑盒填補(bǔ)了這一檢測領(lǐng)域的空白，提供了更加便捷、快速、成本低、特異性好、靈敏度高的用于檢測ALDH2基因的rs671位點(diǎn)G→A突變的試劑盒，有效地克服了現(xiàn)有檢測技術(shù)中存在的問題。為檢測ALDH2基因的s671位點(diǎn)的G→A突變提供了一種全新的檢測策略。優(yōu)選地，上述探針以溶液的形式獨(dú)立存在，例如捕獲探針以含有捕獲探針的捕獲探針溶液的形式存在，檢測探針以含有檢測探針的檢測探針溶液的形式存在。各探針溶液含有的探針濃度為可以根據(jù)實(shí)際情況設(shè)置。優(yōu)選地，各探針溶液含有的探針終濃度為0.5～1.5μM。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括將探針的捕獲探針固定至檢測孔板的固定物。固定物包括導(dǎo)電聚合物和離子化合物。導(dǎo)電聚合物選自吡咯、苯胺和噻吩中的一種，當(dāng)然，導(dǎo)電聚合物也可以是其他的導(dǎo)電聚合物材料。離子化合物選自氯化鈉和氯化鉀中的任意一種。導(dǎo)電聚合物帶正電，其在電場的作用下形成網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，被沉積在反應(yīng)孔的底部，網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)能夠穩(wěn)定地將捕獲探針固定在底部，有助于提高捕獲探針的穩(wěn)定性和捕獲能力。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括催化酶，催化酶是帶有標(biāo)記物的辣根過氧化物酶，優(yōu)選地，催化酶是帶有鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶。當(dāng)然，催化酶也可以是帶有標(biāo)記物的堿性磷酸酶，標(biāo)記物為地高辛抗體、異硫氰酸熒光素抗體或鏈霉親和素中的任意一種，標(biāo)記物與親和物相對應(yīng)，其可根據(jù)檢測探針上的親和物的類別進(jìn)行選擇。當(dāng)親和物是生物素時，標(biāo)記物為鏈霉親和素；當(dāng)親和物是地高辛?xí)r，標(biāo)記物為地高辛抗體；當(dāng)親和物是異硫氰酸熒光素時，標(biāo)記物為異硫氰酸熒光素抗體。只要親和物與標(biāo)記物相對應(yīng)，可相互結(jié)合即可。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括底物，底物的類別根據(jù)催化酶的類別選擇。當(dāng)催化酶為辣根過氧化物酶時，底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基聯(lián)苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)和OPD(o-Phenylenediamine、鄰苯二胺)中的任意一種。TMB、ABTS和OPD均是辣根過氧化物酶的底物，在辣根過氧化物酶的催化作用下發(fā)生顯色反應(yīng)并伴隨電流產(chǎn)生，有助于提高檢測信號的釋放。當(dāng)催化酶為堿性磷酸酶時，底物是對BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-IndolylPhosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽)和NBT(NitrotetrazoliumBluechloride、四唑硝基藍(lán))的組合物、硝基苯磷酸鹽、4-硝基苯磷酸二鈉、萘酚AS-BI磷酸鹽、萘酚-AS-MX-磷酸鹽中的任意一種。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括清洗液，清洗液包括洗液A和洗液B，洗液A是含SDS的SSC緩沖液，洗液B是含Tween20的PBS緩沖液。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括稀釋液，稀釋液是含酪蛋白的PBS緩沖液。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括雜交buffer。用于提高探針和目標(biāo)序列的結(jié)合效率。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的試劑盒還可包括檢測孔板，檢測孔板的反應(yīng)孔內(nèi)固定有上述捕獲探針。需要說明的是，在其他的實(shí)施例中，捕獲探針也可不用固定在檢測孔板的反應(yīng)孔內(nèi)，在使用時采用相應(yīng)方法將捕獲探針固定至檢測孔板也是可以的。以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供的檢測ALDH2基因突變的探針包括野生型捕獲探針和檢測探針，檢測探針的5’端標(biāo)記有生物素(Biotin)。野生型捕獲探針的堿基序列如下：5’-ATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTCACTTCAGTGTA-3’(SEQIDNO.2)，其中，下劃線部分用于與野生型ALDH2基因的覆蓋了rs671位點(diǎn)(G)的目標(biāo)序列(SEQIDNO.4)的靶區(qū)域(5’-TACACTGAAGTGA-3’)反向互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而將野生型目標(biāo)序列捕獲固定。另外，該野生型捕獲探針5’端的第1-77位富含胸腺嘧啶(T)的區(qū)域?yàn)檠娱L臂，用于提高其與野生型目標(biāo)序列的捕獲結(jié)合概率，進(jìn)而提高檢測的靈敏度。從野生型ALDH2基因上的選取的覆蓋rs671位點(diǎn)的野生型目標(biāo)序列(SEQIDNO.4)的堿基序列如下：5’-GCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGC-3’，其中，下劃線部分為rs671位點(diǎn)(G)。檢測探針的堿基序列如下：5’-CTTATGGAGCCCCCAGCAGGTCCCACACTCACA-3’(SEQIDNO.1)，其中，下劃線部分用于與野生型目標(biāo)序列(SEQIDNO.4)上的靶區(qū)域(5’-TGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTC-3’)互補(bǔ)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)序列的特異性結(jié)合和檢測。本實(shí)施例提供的探針可用于對野生型ALDH2基因(rs671位點(diǎn)為G)的檢測，具有特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)。實(shí)施例2本實(shí)施例提供的檢測ALDH2基因突變的探針包括突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)和檢測探針(SEQIDNO.1)，檢測探針的堿基序列和結(jié)構(gòu)同實(shí)施例1。突變型捕獲探針的堿基序列如下：5’-ATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTATTTTTCACTTTAGTGTA-3’(SEQIDNO.3)，其中，下劃線部分用于與突變型ALDH2基因的覆蓋了rs671位點(diǎn)(A)的突變型目標(biāo)序列(SEQIDNO.5)的靶區(qū)域(5’-TACACTAAAGTGA-3’，下劃線為rs671位點(diǎn)(A))反向互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而將突變型目標(biāo)序列捕獲固定。另外，該突變型捕獲探針5’端的第1-77位富含胸腺嘧啶(T)的區(qū)域?yàn)檠娱L臂，通過延長臂的修飾，可用于提高突變型捕獲探針與突變型目標(biāo)序列(SEQIDNO.5)的捕獲結(jié)合概率，提高檢測的靈敏度。從突變型ALDH2基因上的選取的突變型目標(biāo)序列(SEQIDNO.5)的堿基序列如下：5’-GCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGGGACCTGCTGGGGGCTCAGGGC-3’，其中，下劃線部分為rs671位點(diǎn)(A)。本實(shí)施例提供的探針可用于對突變型ALDH2基因(rs671位點(diǎn)為A)的檢測，具有特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)。實(shí)施例3本實(shí)施例提供的檢測ALDH2基因突變的探針包括：野生型捕獲探針、突變型捕獲探針以及檢測探針。野生型捕獲探針的堿基序列同實(shí)施例1，突變型捕獲探針的堿基序列同實(shí)施例2，檢測探針的堿基序列和結(jié)構(gòu)同實(shí)施例1。本實(shí)施例提供的探針不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對待測樣品的ALDH2基因rs671位點(diǎn)的突變情況進(jìn)行檢測，還能夠區(qū)別出待測樣品是野生型純合子、還是突變型雜合子或者是突變型純合子，同樣具有特異性好、靈敏度高、假陽性率低等特點(diǎn)。實(shí)施例4本實(shí)施例提供了試劑盒，該試劑盒包括上述實(shí)施例中任一項(xiàng)所述的檢測ALDH2基因突變的探針。該試劑盒可用于對ALDH2基因rs671位點(diǎn)的G→A突變進(jìn)行檢測，其具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、假陽性率低等特點(diǎn)。實(shí)施例5本實(shí)施例提供了試劑盒，該試劑盒不僅包括上述實(shí)施例1-3中任一項(xiàng)所述的檢測檢測ALDH2基因突變的探針。還包括帶有鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC緩沖液以及含Tween20的PBS緩沖液、吡咯溶液、氯化鉀溶液、雜交buffer。容易理解，在其他的實(shí)施例中，試劑盒可包括鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶、TMB、含SDS的2×SSC緩沖液以及含Tween20的PBS緩沖液、吡咯溶液、氯化鉀溶液、雜交buffer中的一種或多種。本實(shí)施例提供的試劑盒的效果同實(shí)施例4。實(shí)施例6實(shí)施例1提供的檢測ALDH2基因突變的探針的靈敏度驗(yàn)證。以實(shí)施例1提供的檢測ALDH2基因突變的探針的野生型捕獲探針(命名為ALDH2-WLSCP13，SEQIDNO.2)為實(shí)驗(yàn)組、以SEQIDNO.6所示的捕獲探針(命名為ALDH2-WCP13，堿基序列為：5’-TCACTTCAGTGTAGCATGGCCTTAG-3’，其第1-13位用于與野生型目標(biāo)序列(SEQIDNO.4)的靶區(qū)域結(jié)合，捕獲目標(biāo)序列；第14-25位為延長臂，但該序列和長度與野生型捕獲探針的延長臂不同)為對照組、以不同濃度(1nM、100pM、10pM、1pM)的SEQIDNO.4所示的目標(biāo)序列(寡核苷酸片段)為待測樣本，驗(yàn)證實(shí)施例1提供的檢測ALDH2基因突變的探針的靈敏度，檢測方法如下。1捕獲探針(以下簡稱CP)固定1.1配制吡咯(pyrrole)與CP的混合液取1個1.5mL離心管，依次加入超純水885μl，離子化合物100μl3MKCl，渦旋震蕩混勻，離心；加入導(dǎo)電聚合物5μlpyrrole(≥98.0％，購自Sigma，貨號W338605)，渦旋震蕩混勻，離心；加入10μl100μM的CP(實(shí)驗(yàn)組加入SEQIDNO.2所示的野生型捕獲探針(ALDH2-WLSCP13)、對照組加入SEQIDNO.6所示的野生型捕獲探針(ALDH2-WCP13)；渦旋震蕩混勻后離心，備用。1.2固定捕獲探針在96孔的檢測孔板(E-plate)(其結(jié)構(gòu)和工作原理可見參考文獻(xiàn)201620769829.2)上，按其操作說明書，往反應(yīng)孔加入30μl的已配制好的pyrrole與CP的混合液(實(shí)驗(yàn)組和對照組各自都設(shè)置5個反應(yīng)孔，均加入各自對應(yīng)的混合液，其中四個孔用于后續(xù)步驟加入不同濃度的待測樣本，作為檢測孔，剩下的一個孔用于做空白對照孔)，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM儀器上(其工作原理和結(jié)構(gòu)可參考申請日為2016年8月11日、申請?zhí)枮?01610658321.X、名稱為保持結(jié)構(gòu)及包括保持結(jié)構(gòu)的檢測儀的專利文獻(xiàn))，按其操作說明書，進(jìn)行電場操作。1.3EFIRM電場處理在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對應(yīng)列，電場參數(shù)設(shè)置為：電壓A：350mV，1s；電壓B:950mV，1s；進(jìn)行9個循環(huán)。電場處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。1.4E-plate板清洗：在洗板機(jī)程序上選擇對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行下一步，樣本上樣操作。其中，洗液A為含0.05％(質(zhì)量百分比)SDS的2×SSC緩沖液。2樣本雜交2.1雜交buffer預(yù)處理取雜交buffer(購自生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號:B548207)平衡至室溫。2.2配制待測樣本將待測樣本與雜交buffer按體積比1:2混合，渦旋振蕩后離心，即可上樣進(jìn)行檢測。2.3加待測樣本在E-plate上，在對應(yīng)的反應(yīng)孔里加入上述待測樣本與雜交buffer混合后的混合液30μl，且控制待測樣本在各組的三個檢測孔中的終濃度依次為1nM、100pM、10pM、5pM。各組的空白對照孔僅加入相同體積的雜交buffer。需要注意的是:加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進(jìn)行電場操作。2.4EFIRM電場處理在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對應(yīng)列，電場參數(shù)設(shè)置為：電壓A：300mV，1s；電壓B:500mV，1s；進(jìn)行150個循環(huán)。電場處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。2.5室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺上室溫孵育15min。2.6E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行DP加樣操作。3檢測探針(DP)結(jié)合3.1DP溶液配制從4℃冰箱取出稀釋液，取1個1.5mL離心管，加入990μl的稀釋液，往各組的反應(yīng)孔中加入對應(yīng)的10μl100μMDP(SEQIDNO.1，即實(shí)施例1中的檢測探針)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。其中，稀釋液為含0.1％(質(zhì)量體積比)酪蛋白的PBS緩沖液(pH7.4)。酪蛋白的作用是封閉非特異性位點(diǎn)，以提高檢測的靈敏性和準(zhǔn)確度。3.2加樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在對應(yīng)的孔加入對應(yīng)DP溶液30μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進(jìn)行電場操作。3.3室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺上室溫孵育15min。3.4E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行加樣操作。4鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Poly-HRP)與生物素結(jié)合4.1Poly-HRP溶液配制從4℃冰箱取出稀釋液，取1個1.5mL離心管，加入999μl的稀釋液，加入1μl的酶液(含Poly-HRP，濃度為0.5mg/ml，購自thermofisher,產(chǎn)品名稱為PierceTMStreptavidinPoly-HRP，貨號為21140，單位規(guī)格為0.5mL)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。4.2加酶液在對應(yīng)的各孔加入上述稀釋液和酶液混合后的混合液30μl，Poly-HRP通過其標(biāo)記的鏈霉親和素與檢測探針上的生物素識別并結(jié)合。4.3室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺上室溫孵育15min。4.4E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(3bottom，3top)，清洗液選擇洗液B。清洗完畢，立刻進(jìn)行TMB加樣操作。其中，洗液B為含0.1％(質(zhì)量百分比)Tween20的PBS緩沖液。5數(shù)據(jù)讀取5.1加底物在反應(yīng)孔中加入底物60μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極。加完立刻到EFIRM上進(jìn)行電場操作。其中，底物為含TMB的溶液(購自thermofisher，產(chǎn)品貨號為34028，名稱為1-StepTMUltraTMB-ELISA)。加入酶的底物，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流，檢測各孔內(nèi)電流值即完成整個檢測過程。5.2EFIRM電場讀數(shù)在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對應(yīng)列，電場參數(shù)設(shè)置為：電壓A：-200mV，60s；電壓B:0mV，0s；進(jìn)行1個循環(huán)。電場處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。儀器將自動完成檢測工作，檢測數(shù)據(jù)自動上傳到云計(jì)算平臺。根據(jù)檢測數(shù)據(jù)繪制柱狀圖，橫坐標(biāo)為檢測組的類別，縱坐標(biāo)為各檢測組中各反應(yīng)孔中的電流值(Current)，單位為納安(nA)，本實(shí)施例的檢測結(jié)果如表1和圖1所示。表1.采用實(shí)施例1提供的檢測ALDH2基因突變的探針檢測不同濃度的待測樣本的檢測結(jié)果由表1和圖1的結(jié)果顯示，相較于對照組的ALDH2-WCP13，實(shí)施例1提供的檢測ALDH2基因突變的探針的野生型捕獲探針ALDH2-WLSCP13的靈敏度更高，其在待測樣本的濃度低至1pM的情況下也能夠?qū)⒋郎y樣本檢出，其檢出電流信號達(dá)到234.7nA，比對照組的電流信號值(107.32nA)高。由此表明，通過延長臂的設(shè)置，SEQIDNO.2所示的野生型捕獲探針的捕獲能力較好，能夠?qū)⒌蜐舛鹊哪繕?biāo)序列捕獲固定，使得實(shí)施例1提供的檢測ALDH2基因突變的探針具有較高的靈敏度。實(shí)施例7實(shí)施例2提供的檢測ALDH2基因突變的探針的靈敏度驗(yàn)證。以實(shí)施例2提供的檢測ALDH2基因突變的探針的野生型捕獲探針(SEQIDNO.3，命名為ALDH2-MLSCP13)為實(shí)驗(yàn)組、以SEQIDNO.7所示的捕獲探針(命名為ALDH2-MCP13，堿基序列為：5’-TCACTTTAGTGTAGCATGGCCTTAG-3’，其中，第1-13位與突變型目標(biāo)序列的靶區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合)為對照組、以不同濃度(1nM、100pM、10pM、1pM)的SEQIDNO.5所示的突變型目標(biāo)序列(寡核苷酸片段)為待測樣本，檢測實(shí)施例2提供的檢測ALDH2基因突變的探針的靈敏度，檢測方法與實(shí)施例6基本相同。檢測結(jié)果如表2和圖2所示。表1.采用實(shí)施例2提供的檢測ALDH2基因突變的探針檢測不同濃度的待測樣本的檢測結(jié)果由表2和圖2的結(jié)果顯示，相較于對照組的ALDH2-MCP13，實(shí)施例2提供的檢測ALDH2基因突變的探針的突變型捕獲探針ALDH2-MLSCP13的檢出限更低，其在待測樣本的各濃度下均有較強(qiáng)的檢出電流信號值。由此，進(jìn)一步表明，通過在突變型探針的5’端加入的延長臂，提高了突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)的捕獲能力，能夠?qū)⒌蜐舛鹊哪繕?biāo)序列(SEQIDNO.5)捕獲固定，使得實(shí)施例2提供的檢測ALDH2基因突變的探針也具有較高的靈敏度。實(shí)施例8本實(shí)施例提供了采用實(shí)施例3提供的檢測ALDH2基因突變的探針檢測ALDH2基因rs671位點(diǎn)突變情況的方法，步驟如下。1捕獲探針(以下簡稱CP)固定1.1配制吡咯(pyrrole)與CP的混合液取1個1.5mL離心管，依次加入超純水885μl，離子化合物100μl3MKCl，渦旋震蕩混勻，離心；加入導(dǎo)電聚合物5μlpyrrole，渦旋震蕩混勻，離心；加入10μl100μM的CP；渦旋震蕩混勻后離心，備用。1.2固定捕獲探針在96孔的檢測孔板(E-plate)上，按其操作說明書，往反應(yīng)孔加入30μl的已配制好的pyrrole與CP的混合液，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM儀器上，按其操作說明書，進(jìn)行電場操作。設(shè)置2個檢測組，分別為野生型檢測組和突變型檢測組。每個檢測組設(shè)置一個陽性對照孔，一個陰性對照孔，一個樣本1的檢測孔、一個樣本2的檢測孔和一個樣本3的檢測孔(樣本的檢測孔根據(jù)需要檢測的樣本數(shù)量確定，可以是一個，或者多個)。野生型檢測組的各反應(yīng)孔里加入野生型捕獲探針(SEQIDNO.2)；突變型檢測組的各反應(yīng)孔里加入突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)。1.3EFIRM電場處理在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對應(yīng)列，電場參數(shù)設(shè)置為：電壓A：350mV，1s；電壓B:950mV，1s；進(jìn)行9個循環(huán)。電場處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。1.4E-plate板清洗：在洗板機(jī)程序上選擇對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行下一步，樣本上樣操作。其中，洗液A為含0.05％(質(zhì)量百分比)SDS的2×SSC緩沖液。2樣本雜交2.1雜交buffer預(yù)處理取雜交buffer(購自生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號:B548207)平衡至室溫。2.2配制待測樣本待測樣本(樣本采集方式：小心取出口腔拭子；握住手柄，將拭子分別伸進(jìn)兩側(cè)口腔，使拭子頭部充分接觸左側(cè)臉頰內(nèi)部/左側(cè)上下牙床處粘膜，用刷牙的力度上下擦動，同時，旋轉(zhuǎn)拭子，讓拭子頭部充分接觸口腔粘膜，將拭子頭放置在采樣管中，加PBS浸泡，并震蕩重懸細(xì)胞，于-20℃保存。)從-20℃冰箱取出，放進(jìn)4℃冰箱解凍。完全溶解后，使用煮沸法或0.4MNaOH預(yù)處理待測樣本，然后將待測樣本與雜交buffer按體積比1:2混合，渦旋振蕩后離心，即可上樣進(jìn)行檢測。2.3加待測樣本在E-plate上，在對應(yīng)的孔里加入上述待測樣本(樣本1、樣本2或樣本3)與雜交buffer混合后的混合液30μl。(需要注意的是:加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進(jìn)行電場操作。)野生型檢測組的陽性對照孔加入含ALDH2-WT(野生型寡核酸片段，SEQIDNO.4)的陽性對照Buffer混合液，突變型檢測組的陽性對照孔加入含ALDH2-MT(突變型寡核酸片段，SEQIDNO.5)的陽性對照Buffer混合液，各檢測組的陰性對照孔均僅加入Buffer。樣本檢測孔加入相應(yīng)的待測樣本(樣本1、樣本2或樣本3)與雜交buffer混合后的混合液。2.4EFIRM電場處理在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對應(yīng)列，電場參數(shù)設(shè)置為：電壓A：300mV，1s；電壓B:500mV，1s；進(jìn)行150個循環(huán)。電場處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。2.5室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺上室溫孵育15min。2.6E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行DP加樣操作。3DP結(jié)合3.1DP溶液配制從4℃冰箱取出稀釋液，取1個1.5mL離心管，加入990μl的稀釋液，往各檢測組的反應(yīng)孔中加入對應(yīng)的10μl100μMDP(SEQIDNO.1)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。其中，稀釋液為含0.1％(質(zhì)量體積比)酪蛋白的PBS緩沖液(pH7.4)。酪蛋白的作用是封閉非特異性位點(diǎn)，以提高檢測的靈敏性和準(zhǔn)確度。3.2加樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在對應(yīng)的孔加入對應(yīng)DP溶液30μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極，加完后傾斜或拍打E-plate使液體在孔里的電極表面均勻覆蓋，然后立刻到EFIRM上進(jìn)行電場操作。3.3室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺上室溫孵育15min。3.4E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(2bottom，2top)，清洗液選擇洗液A。清洗完畢，立刻進(jìn)行加樣操作。4鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Poly-HRP)與生物素結(jié)合4.1Poly-HRP溶液配制從4℃冰箱取出稀釋液，取1個1.5mL離心管，加入999μl的稀釋液，加入1μl的酶液(含Poly-HRP，濃度為0.5mg/ml)，渦旋震蕩混勻，離心，備用。4.2加酶液在對應(yīng)的各孔加入上述稀釋液和酶液混合后的混合液30μl，Poly-HRP通過其標(biāo)記的鏈霉親和素與檢測探針上的生物素識別并結(jié)合。4.3室溫孵育蓋上E-plate蓋子，實(shí)驗(yàn)臺上室溫孵育15min。4.4E-plate板清洗在洗板機(jī)程序上選擇對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)列，清洗程序選擇(3bottom，3top)，清洗液選擇洗液B。清洗完畢，立刻進(jìn)行TMB加樣操作。其中，洗液B為含0.1％(質(zhì)量百分比)Tween20的PBS緩沖液。5數(shù)據(jù)讀取5.1加底物在對應(yīng)的各孔加入底物60μl，加樣時槍頭貼近孔的底部，但是不接觸到底部電極。加完立刻到EFIRM上進(jìn)行電場操作。其中，底物為含TMB的溶液。加入酶的底物，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電流，檢測各孔內(nèi)電流值即完成整個檢測過程。5.2EFIRM電場讀數(shù)在EFIRM軟件上選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的對應(yīng)列，電場參數(shù)設(shè)置為：電壓A：-200mV，60s；電壓B:0mV，0s；進(jìn)行1個循環(huán)。電場處理完畢，立刻取出，清洗E-plate板。儀器將自動完成檢測工作，檢測數(shù)據(jù)自動上傳到云計(jì)算平臺。根據(jù)檢測數(shù)據(jù)繪制柱狀圖，橫坐標(biāo)為檢測組的類別，縱坐標(biāo)為各檢測組中各檢測孔的電流值(Current)，單位為納安(nA)。本實(shí)施例的檢測結(jié)果如圖3和表3所示。5.3結(jié)果分析質(zhì)控結(jié)果說明：對于野生型和突變型檢測組，陰性對照的值均需小于100nA，陽性對照值均需大于100nA，否則結(jié)果不成立。閾值設(shè)定即為100nA。需要說明的是，采用其他實(shí)施例提供的探針的進(jìn)行檢測的方法與本實(shí)施例基本相同。表3.采用實(shí)施例3提供的檢測ALDH2基因突變的探針檢測三份樣本的檢測結(jié)果組別陰性對照陽性對照樣本1樣本2樣本3野生型檢測組24.47nA213.56nA206.77nA38.23nA196.99nA突變型檢測組20.13nA240.17nA33.88nA841.73nA191.09nA由表3和圖3(圖中：縱坐標(biāo)為電流值nA)可知，在野生型檢測組中，陰性對照值為24.47nA，小于100nA，陽性對照值為213.56nA，大于100nA，符合質(zhì)控要求；在突變型檢測組中，陰性對照值為20.13nA，小于100nA，陽性對照值為240.17nA，大于100nA，符合質(zhì)控要求。樣本1的野生型檢測結(jié)果為206.77nA，大于100nA，野生型檢測結(jié)果為陽性；樣本1的突變型檢測結(jié)果為33.88nA，小于100nA，突變型檢測結(jié)果為陰性；說明樣本1為ALDH2野生型純合子，即基因型為ALDH2GG(ALDH2*1/ALDH2*1)。樣本2的野生型檢測結(jié)果為38.23nA，小于100nA，野生型檢測結(jié)果為陰性；樣本2的突變型檢測結(jié)果為841.73nA，大于100nA，突變型檢測結(jié)果為陽性；說明樣本2為突變型純合子，即基因型為ALDH2LL(ALDH2*2/ALDH2*2)。樣本3的野生型檢測結(jié)果為196.99nA，大于100nA，野生型檢測結(jié)果為陽性，樣本3的突變型檢測結(jié)果為191.09nA，大于100nA，突變型檢測結(jié)果為陽性。兩種基因型信號均成陽性，說明樣本3為突變型雜合子，即基因型為ALDH2GL(ALDH2*1/ALDH2*2)。此外，通過對上述三份樣本的檢測結(jié)果也表明實(shí)施例3提供的探針的野生型捕獲探針(SEQIDNO.2)和突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)的特異性較好。因?yàn)槎叩膲A基序列只有一個堿基的差異，但各自都僅與其互補(bǔ)的目標(biāo)序列特異性結(jié)合，例如樣本1的突變型檢測結(jié)果為陰性(33.88nA)，說明突變型捕獲探針(SEQIDNO.3)不與SEQIDNO.4所示的目標(biāo)序列結(jié)合，表明突變型捕獲探針的特異性好，假陽性率低；又例如樣本2的野生型檢測結(jié)果為陰性(38.23nA)，說明野生型捕獲探針(SEQIDNO.2)不與SEQIDNO.5所示的目標(biāo)序列結(jié)合，這也表明野生型捕獲探針的特異性好，假陽性率低。另外，本實(shí)施例中，還利用引物5’-TGGAGCCCAGTCACCCTT-3’和5’-CGCCCAGCAGACCCTAAAT-3’，通過測序的方式檢測樣本1、樣本2和樣本3的ALDH2基因的rs671位點(diǎn)的突變情況，以驗(yàn)證上述檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，針對rs671位點(diǎn)區(qū)域的測序結(jié)果如圖4所示。圖4的結(jié)果顯示(圖中：a代表樣本1、b代表樣本2、c代表樣本3，箭頭處為待測突變位點(diǎn))，樣本1為野生型純合子，樣本2為突變型純合子，樣本3為突變型雜合子，該結(jié)果與上述的檢測結(jié)果一致，表明采用實(shí)施例3提供的ALDH2基因突變的探針檢測ALDH2基因rs671位點(diǎn)G→A突變的結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。綜上所述，本發(fā)明提供的檢測ALDH2基因突變的探針基于人的ALDH2基因rs671位點(diǎn)G→A突變進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過在捕獲探針的5’端引入特殊序列的延長臂修飾，提高了捕獲探針的捕獲能力，進(jìn)而提高其檢測的靈敏度，再然后根據(jù)rs671位點(diǎn)位點(diǎn)的附件序列選取一段互補(bǔ)結(jié)合區(qū)(靶區(qū)域)作為捕獲探針的結(jié)合區(qū)域，提高其檢測的特異性，降低其假陽性率。此外，本發(fā)明提供的檢測ALDH2基因突變的探針不僅能夠檢測出ALDH2基因在rs671位點(diǎn)是否發(fā)生突變，還能夠檢測出突變基因型是雜合還是純合。且采用本發(fā)明提供的探針在EFIRM技術(shù)平臺進(jìn)行檢測時，具有操作簡便快速、耗時短、成本低等特點(diǎn)。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>北京易活生物科技有限公司<120>一種檢測ALDH2基因突變的探針及其應(yīng)用和試劑盒<160>7<170>PatentInversion3.5<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>1cttatggagcccccagcaggtcccacactcaca33<210>2<211>90<212>DNA<213>人工序列<400>2atttttttttttttttttatttttttttttttttttatttttttttttttttttattttt60ttttttttttttatttttcacttcagtgta90<210>3<211>90<212>DNA<213>人工序列<400>3atttttttttttttttttatttttttttttttttttatttttttttttttttttattttt60ttttttttttttatttttcactttagtgta90<210>4<211>59<212>DNA<213>智人（Homosapiens）<400>4gctgcaggcatacactgaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggc59<210>5<211>59<212>DNA<213>智人（Homosapiens）<400>5gctgcaggcatacactaaagtgaaaactgtgagtgtgggacctgctgggggctcagggc59<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6tcacttcagtgtagcatggccttag25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7tcactttagtgtagcatggccttag25當(dāng)前第1頁1 2 3