本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種幽門螺旋桿菌及其耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，該試劑盒用于PCR體外擴(kuò)增法檢測(cè)胃粘膜組織、胃液中的幽門螺旋桿菌 23S rRNA基因及其變異，適用于幽門螺旋桿菌感染的輔助診斷。

背景技術(shù)：

幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，簡(jiǎn)稱Hp）是革蘭氏陰性、微需氧的細(xì)菌，生存于胃部及十二指腸的各區(qū)域內(nèi)。在人群中具有較高的感染率。隨著幽門螺旋桿菌(H pylori)在人群中傳播廣泛，以及抗生素的廣泛應(yīng)用，H pylori耐藥菌株的發(fā)生率逐年上升，根除的難度逐漸增加。最近報(bào)道H pylori耐藥是全球性的，其耐藥是導(dǎo)致根除治療失敗的主要原因。對(duì)H pylori根除治療的常用抗生素有：克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林、四環(huán)素及喹諾酮類等，大多數(shù)H pylori菌株對(duì)這些抗生素的耐藥是由突變引起的，包括自發(fā)突變和通過(guò)耐藥信息的傳遞引起的突變等。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)會(huì)Hp學(xué)組2005年對(duì)全國(guó)16個(gè)省市340例Hp耐藥情況進(jìn)行的多中心研究表明，對(duì)克拉霉素的耐藥率為27.6%，有文獻(xiàn)表明幽門螺旋桿菌的23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)變異和克拉霉素耐藥相關(guān)。H pylori對(duì)抗生素耐藥的檢測(cè)目前已經(jīng)不再局限于傳統(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)，由傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)、藥物敏感試驗(yàn)逐漸轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)檢測(cè)方法。耐藥基因突變的檢測(cè)若能成為H pylori檢查的常規(guī)項(xiàng)目，無(wú)論從患者的醫(yī)藥費(fèi)開(kāi)支還是藥物對(duì)患者引起的不良反應(yīng)方面，均有重要意義。

目前臨床檢測(cè)幽門螺旋桿菌主要包括Hp培養(yǎng)，尿素酶實(shí)驗(yàn)，Hp糖體ELESA檢測(cè)和免疫印跡檢測(cè)法。培養(yǎng)的方法需要1~2周時(shí)間，免疫方法不能直接檢測(cè)菌體，且不能檢測(cè)是否耐藥。

幽門螺旋桿菌耐藥的檢測(cè)主要是通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)進(jìn)行檢測(cè)以及基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)。包括方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)（實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)）結(jié)合溶解曲線(melting curve）分析技術(shù)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、以PCR為基礎(chǔ)的變性高效液相色譜分析技術(shù)（PCR -denaturing highperformance liquid chromatography,PCR-DHPLC)、優(yōu)勢(shì)同源形成分析技術(shù)（preferentialhomoduplexformationassay,PHFA)、反向雜交。PCR-RFLP方法簡(jiǎn)單、敏感、準(zhǔn)確，是一種非創(chuàng)傷性的檢測(cè)方法，臨床應(yīng)用前景廣闊，但是存在臨床標(biāo)本易被污染的缺點(diǎn)。PCR-FISH方法不能確定除克拉霉素外其他抗生素的耐藥性。以PCR為基礎(chǔ)的變性高效液相色譜分析技術(shù)是一種簡(jiǎn)單，快速，功能強(qiáng)大發(fā)現(xiàn)基因突變的技術(shù)，但是只能提供樣本有無(wú)突變的信息，需要結(jié)合序列分析才能得出具體的突變類型?？傊?，目前市場(chǎng)上的試劑盒只能單一的檢測(cè)幽門螺旋桿菌存在或者是否耐藥，并且PCR循環(huán)反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一般需要2.5小時(shí)，試劑盒的保存溫度一般是-20℃。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種幽門螺旋桿菌及其耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，利用該試劑盒能夠快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)幽門螺旋桿菌、幽門螺旋桿菌23S rRNA基因以及23S rRNA上第2142或2143位點(diǎn)變異。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種幽門螺旋桿菌及其耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒，包括KOD DNA 聚合酶、引物HPC-F、引物HPC-R、特異性靶向熒光探針、陽(yáng)性參考品1、陽(yáng)性參考品2以及陽(yáng)性參考品3；

所述引物HPC-F為針對(duì)幽門螺旋桿菌23S rRNA基因設(shè)計(jì)的正向引物，該正向引物的序列為5’-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCC-3’（如SEQ NO:1所示）；

所述引物HPC-R為針對(duì)幽門螺旋桿菌23S rRNA基因設(shè)計(jì)的反向引物，該反向引物的序列為5’-GGCTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3’ （如SEQ NO:2所示）；

所述特異性靶向熒光探針是以幽門螺旋桿菌23S rRNA野生型基因組為模板設(shè)計(jì)的探針，其堿基序列為5’- CAAGACGGAAAGACCC -3’（如SEQ NO:3所示）， 熒光染料為氟硼二吡咯；

所述陽(yáng)性參考品1是以野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因?yàn)槟０宥O(shè)計(jì)的一段線性重組DNA序列，陽(yáng)性參考品1的序列為5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’（如SEQ NO:4所示），其中，帶有下劃線的堿基從左到右分別表示野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2142和2143位點(diǎn)；

所述陽(yáng)性參考品2是以幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2142位點(diǎn)有突變?yōu)槟０宥O(shè)計(jì)的一段線性重組DNA序列，陽(yáng)性參考品2的序列為5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGGAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’（如SEQ NO:5所示），其中，帶有下劃線的堿基表示幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2142位點(diǎn)突變后的堿基；

所述陽(yáng)性參考品3是以幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2143位點(diǎn)有突變?yōu)槟０宥O(shè)計(jì)的一段線性重組DNA序列，陽(yáng)性參考品3的序列為5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’（如SEQ NO:6所示），其中，帶有下劃線的堿基表示幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2143位點(diǎn)突變后的堿基。

上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下：

1、上述方案中，KOD DNA聚合酶是從鹿兒島縣小寶島的含硫氣孔中分離出來(lái)的超嗜熱原始菌Thermococcus kodakaraensis KOD1提取純化出來(lái)的，具有很強(qiáng)的3'→5'核酸外切酶活性(校正活性)，保真性約為Taq DNA Polymerase的50倍。具有1Kb/30s以上的DNA合成速度，該速度是最為普通的Taq聚合酶的兩倍。另外，持續(xù)合成能力等較為優(yōu)秀也是其伸長(zhǎng)速度很快的主要原因之一。采用KOD DNA聚合酶，可以使一次循環(huán)的時(shí)間從原來(lái)的幾分鐘縮短為幾十秒。生產(chǎn)公司為TOYOBO公司，其結(jié)構(gòu)參見(jiàn)日本專利JP2008306935A。

2、上述方案中，所述熒光探針為QProbe，通過(guò)混合特定的排列，將具有熒光淬滅這一特征的熒光色素作為標(biāo)識(shí)的探針。QProbe的結(jié)構(gòu)參見(jiàn)日本專利JP2011097956A，利用這一特征，就無(wú)需使用插入DNA嵌入劑等其它雙鏈核酸結(jié)構(gòu)的色素，也無(wú)需使用會(huì)引起FRET現(xiàn)象的兩種探針，而是使用在一種熒光物質(zhì)中作出標(biāo)識(shí)的探針，在不會(huì)阻礙高速擴(kuò)增的同時(shí)，能夠特異性地檢測(cè)出目標(biāo)核酸序列。

3、上述方案中，所述試劑盒還包括內(nèi)部質(zhì)控引物IC-F、內(nèi)部質(zhì)控引物IC-R、內(nèi)部質(zhì)控探針以及內(nèi)部質(zhì)控模板；所述內(nèi)部質(zhì)控引物IC-F是針對(duì)Lagarosiphon madagascariensis的matK基因設(shè)計(jì)的正向引物，該正向引物的序列為5’-CCCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTC-3’ （如SEQ NO:7所示）；

所述內(nèi)部質(zhì)控引物IC-R是針對(duì)Lagarosiphon madagascariensis的matK基因設(shè)計(jì)的反向引物，該反向引物的序列為5’-CCCCATCCAGGATTGTAGAATTTGAATCAAG-3’ （如SEQ NO:8所示）；

所述內(nèi)部質(zhì)控探針是以Lagarosiphon madagascariensis的matK基因?yàn)槟０宥O(shè)計(jì)的探針，該探針的序列為5’-GATCTATTCATTCGATATTCC-3’ （如SEQ NO:9所示）；

所述內(nèi)部質(zhì)控模板為L(zhǎng)agarosiphon madagascariensis的matK基因的一個(gè)片段，內(nèi)部質(zhì)控模板的序列為5’-GCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTCCATTTTTTCTTGAAGAAAAAAAAGAAATACCAAAATATCAAAATTTACGATCTATTCATTCGATATTCCCTTTTTTAGAGGACAAATTTTTACATTTAAATTATGTGTCTGATATAGTAATACCTTATCCTATTCATCTCGAAATCTTGATTCAAATTCTACAATCCTGGAT-3’ （如SEQ NO:10所示）。

所述Lagarosiphon madagascariensis（拉丁文學(xué)名）是一種水草、有莖草，主要分布在馬達(dá)加斯加。

4、上述方案中，所述陽(yáng)性參考品1、陽(yáng)性參考品2以及陽(yáng)性參考品3均是事先設(shè)計(jì)好的、當(dāng)做已知濃度及堿基序列的樣本，和其他被檢樣本一起進(jìn)行檢測(cè)，從而驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明還一種幽門螺旋桿菌及其耐藥基因突變的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

第一步，準(zhǔn)備目標(biāo)物，以目標(biāo)物作為檢測(cè)的對(duì)象，目標(biāo)物為不經(jīng)任何處理的被檢樣本或者為從被檢樣本中提取的幽門螺旋桿菌核酸，所述被檢樣本為胃粘膜組織、牙菌斑或漱口水；

第二步，以所述目標(biāo)物為模板基因鏈，利用權(quán)利要求1或2所述試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為：

引物HPC-F 0.1μmol/L，0.52至1.04μL；

引物HPC-R 0.1μmol/L，0.52至1.04μL；

特異性靶向熒光探針 0.1μmol/L，0.4至0.8μL；

內(nèi)部質(zhì)控引物IC-F 0.1μmol/L，0.52至1.04μL；

內(nèi)部質(zhì)控引物IC-R 0.1μmol/L，0.52至1.04μL；

內(nèi)部質(zhì)控探針 0.1μmol/L，0.4至0.8μL；

內(nèi)部質(zhì)控模板 4ng/μL，1.8至3.6μL；

MgCl₂*6H₂O 0.35g/L，0.52至1.04μL；

dNTPs 0.02mM，0.4至0.8μL；

KOD DNA 聚合酶 0.02U/μL，0.4至0.8μL；

KOD buffer 3.2至6.4μL；

模板 4至8μL；

第三步，用高分辨率熔解曲線法進(jìn)行檢出，檢出條件依次為：

（1）94.0 ℃，30.0秒，

（2）39.0 ℃，30.0秒，

（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；

第四步，檢出結(jié)果通過(guò)陽(yáng)性判斷值來(lái)判斷，陽(yáng)性判斷值的三種結(jié)果的判斷依據(jù)為：

（1）幽門螺旋桿菌菌群陽(yáng)性及23S rRNA基因2142和2143位點(diǎn)無(wú)突變：熒光微分值≥10，并且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在50℃~60℃之間；

（2）幽門螺旋桿菌菌群陽(yáng)性及23S rRNA基因2142或2143位點(diǎn)有突變：熒光微分值≥10，并且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42℃~50℃之間；

（3）幽門螺旋桿菌菌群陰性：無(wú)熒光微分值，內(nèi)部質(zhì)控?zé)晒馕⒎种怠?.0，且其熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42℃~68℃之間；

所述熒光微分值是指對(duì)檢測(cè)到的目標(biāo)物的熒光強(qiáng)度隨溫度變化的值做微分求導(dǎo)，得到熒光微分值。

1、上述方案中，所述dNTP是脫氧腺苷三磷酸（dATP）、脫氧胞苷三磷（dCTP）、脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸（dGTP）、脫氧胸腺三磷酸（dTTP）的混合物。

2、上述方案中，所述第二步的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)過(guò)程如下：

（1）94.0℃預(yù)變性30.0秒，

（2）97.0℃變性1.0秒，

（3）60.0℃退火3.0秒，

（4）63.0℃延伸 5.0秒，其中，步驟（2）~（4）循環(huán)50次。

3、上述方案中，高分辨熔解曲線（high-resolution melt，HRM) 分析技術(shù)是近幾年來(lái)在國(guó)外興起的一種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學(xué)分析方法，是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的基因分析新技術(shù)，具有極高的敏感性，可以檢測(cè)出單個(gè)堿基的差異，并且成本低、通量高、速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、不受檢測(cè)位點(diǎn)的局限，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。

本發(fā)明的設(shè)計(jì)原理是：本發(fā)明的試劑盒采用PCR法對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，并采用熒光標(biāo)記探針（QProbe）檢測(cè)目標(biāo)核酸的方法，來(lái)檢測(cè)幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因及其第2142或2143位點(diǎn)變異的試劑盒。以幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因領(lǐng)域?yàn)槟繕?biāo)模板基因鏈，加入正向引物和反向引物，進(jìn)行變性、退火，采用能高速擴(kuò)增的KOD DNA 聚合酶催化各引物延伸基因鏈。這時(shí)，dNTP底物，鎂離子的酶活性作用于退火的引物進(jìn)行延伸，反復(fù)進(jìn)行來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)基因鏈。之后，擴(kuò)增核酸和幽門螺旋桿菌23S rRNA基因特異性配對(duì)的HPC Qprob探針雜交結(jié)合，通過(guò)引起的熒光變化來(lái)檢測(cè)幽門螺旋桿菌的23S rRNA基因。利用全自動(dòng)核酸提純及熒光定量PCR分析系統(tǒng)（采用的儀器為全自動(dòng)基因分析儀GENECUBE，生產(chǎn)商為TOYOBO）檢測(cè)幽門螺旋桿菌的23S rRNA第2142或2143位點(diǎn)變異，能夠準(zhǔn)確確認(rèn)幽門螺旋桿菌及其耐藥變異，幫助臨床醫(yī)師決定根除Hp治療的最適三聯(lián)療法方案，臨床醫(yī)師據(jù)此可決定適合患者的藥物、劑量及經(jīng)濟(jì)的治療方案，為臨床合理用藥、個(gè)體化用藥和治療提供強(qiáng)有力的手段。

本發(fā)明有益效果：

（1）現(xiàn)有PCR反應(yīng)體系的量一般需要40μＬ，而本發(fā)明的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的量最低僅為13.2μＬ。

（2）本發(fā)明的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間大大縮短，變性、退火、延伸的50次循環(huán)最低僅需0.5個(gè)小時(shí)即可完成。

（3）現(xiàn)有的幽門螺旋桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒需要在-20℃條件下保存，而本發(fā)明的試劑盒在2~8℃條件下即可保存。

（4）本發(fā)明采用全封密的PCR擴(kuò)增，可防止攜帶污染等造成假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生。

總之，本發(fā)明的試劑盒及其檢測(cè)方法對(duì)幽門螺旋桿菌能夠快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地檢測(cè)幽門螺旋桿菌、幽門螺旋桿菌23S rRNA基因以及23S rRNA上第2142或2143位點(diǎn)變異。

附圖說(shuō)明

附圖1為幽門螺旋桿菌菌群陽(yáng)性及23S rRNA基因2142和2143位點(diǎn)無(wú)突變時(shí)的熒光定量PCR擴(kuò)增熔解曲線圖，橫坐標(biāo)是溫度，縱坐標(biāo)是熒光微分值；

附圖2為幽門螺旋桿菌菌群陽(yáng)性及23S rRNA基因2142位點(diǎn)有突變時(shí)的熒光定量PCR擴(kuò)增熔解曲線圖，橫坐標(biāo)是溫度，縱坐標(biāo)是熒光微分值；

附圖3為幽門螺旋桿菌菌群陽(yáng)性及23S rRNA基因2143位點(diǎn)有突變時(shí)的熒光定量PCR擴(kuò)增熔解曲線圖，橫坐標(biāo)是溫度，縱坐標(biāo)是熒光微分值；

附圖4為幽門螺旋桿菌菌群陰性時(shí)的熒光定量PCR擴(kuò)增熔解曲線圖，橫坐標(biāo)是溫度，縱坐標(biāo)是熒光微分值；

附圖5為內(nèi)部質(zhì)控品的熒光定量PCR擴(kuò)增熔解曲線圖，橫坐標(biāo)是溫度，縱坐標(biāo)是熒光微分值。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例：幽門螺旋桿菌及其耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法

該幽門螺旋桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒包括KOD DNA 聚合酶、引物HPC-F、引物HPC-R、特異性靶向熒光探針、陽(yáng)性參考品1、陽(yáng)性參考品2以及陽(yáng)性參考品3；

所述引物HPC-F為針對(duì)幽門螺旋桿菌23S rRNA基因設(shè)計(jì)的正向引物，該正向引物的序列為5’-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCC-3’；

所述引物HPC-R為針對(duì)幽門螺旋桿菌23S rRNA基因設(shè)計(jì)的反向引物，該反向引物的序列為5’-GGCTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3’；

所述特異性靶向熒光探針是以幽門螺旋桿菌23S rRNA野生型基因組為模板設(shè)計(jì)的探針，其堿基序列為5’- CAAGACGGAAAGACCC -3’， 熒光染料為氟硼二吡咯；

所述陽(yáng)性參考品1是以野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因?yàn)槟０宥O(shè)計(jì)的一段線性重組DNA序列，陽(yáng)性參考品1的序列為5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’ ，其中，帶有下劃線的堿基從左到右分別表示野生型幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2142和2143位點(diǎn)；

所述陽(yáng)性參考品2是以幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2142位點(diǎn)有突變?yōu)槟０宥O(shè)計(jì)的一段線性重組DNA序列，陽(yáng)性參考品2的序列為5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGGAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’，其中，帶有下劃線的堿基表示幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2142位點(diǎn)突變后的堿基；

所述陽(yáng)性參考品3是以幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2143位點(diǎn)有突變?yōu)槟０宥O(shè)計(jì)的一段線性重組DNA序列，陽(yáng)性參考品3的序列為5’-GTCGGTTAAATACCGACCTGCATGAATGGCGTAACGAGATGGGAGCTGTCTCAACCAGAGATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGCGCAGGATAGGTGGGAGGCTTTGAAGTAAGGGCTTTGGCTCTTATGGAGCCATCCTTGAGATACCACCCTTGAT-3’，其中，帶有下劃線的堿基表示幽門螺旋桿菌23S rRNA基因的2143位點(diǎn)突變后的堿基。

所述試劑盒還包括內(nèi)部質(zhì)控引物IC-F、內(nèi)部質(zhì)控引物IC-R、內(nèi)部質(zhì)控探針以及內(nèi)部質(zhì)控模板；

所述內(nèi)部質(zhì)控引物IC-F是針對(duì)Lagarosiphon madagascariensis的matK基因設(shè)計(jì)的正向引物，該正向引物的序列為5’-CCCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTC-3’；

所述內(nèi)部質(zhì)控引物IC-R是針對(duì)Lagarosiphon madagascariensis的matK基因設(shè)計(jì)的反向引物，該反向引物的序列為5’-CCCCATCCAGGATTGTAGAATTTGAATCAAG-3’；

所述內(nèi)部質(zhì)控探針是以Lagarosiphon madagascariensis的matK基因?yàn)槟０宥O(shè)計(jì)的探針，該探針的序列為5’-GATCTATTCATTCGATATTCC-3’；

所述內(nèi)部質(zhì)控模板為L(zhǎng)agarosiphon madagascariensis的matK基因的一個(gè)片段，內(nèi)部質(zhì)控模板的序列為5’-GCGGTTATTGTAGAAATTCCTTTCTCCCGTCCATTTTTTCTTGAAGAAAAAAAAGAAATACCAAAATATCAAAATTTACGATCTATTCATTCGATATTCCCTTTTTTAGAGGACAAATTTTTACATTTAAATTATGTGTCTGATATAGTAATACCTTATCCTATTCATCTCGAAATCTTGATTCAAATTCTACAATCCTGGAT-3’。

所述內(nèi)部質(zhì)控引物IC-F、內(nèi)部質(zhì)控引物HPC-R、內(nèi)部質(zhì)控探針以及內(nèi)部質(zhì)控模板用于驗(yàn)證所述試劑盒在檢測(cè)幽門螺旋桿菌耐藥基因突變時(shí)是否真實(shí)、有效，參見(jiàn)附圖5所示。

在實(shí)際生產(chǎn)中，所述幽門螺旋桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒可以做成包含下列組分的試劑盒：

（1）聚合酶試劑 [ KOD Mix ]：由KOD DNA 聚合酶和dNTP組成，規(guī)格為140μＬ×1支、140μＬ×2支、140μＬ×3支或140μＬ×6支；

（2）引物?探針試劑 [ HPC Mix ]：即由引物HPC-F、引物HPC-R以及特異性靶向熒光探針組成的混合試劑，規(guī)格為140μＬ×1支、140μＬ×2支、140μＬ×3支或140μＬ×6支；

（3）陽(yáng)性質(zhì)控品1 [ HPC PC1 ]：即為陽(yáng)性參考品1，規(guī)格為300μＬ×1支；

（4）陽(yáng)性質(zhì)控品2 [ HPC PC2 ]：即為陽(yáng)性參考品2和陽(yáng)性參考品3的混合物，規(guī)格為300μＬ×1支；

（5）陰性質(zhì)控品[ HPC NC ]：即為不含有DNA的緩沖液，規(guī)格為300μＬ×1支；

陽(yáng)性參考品1、陽(yáng)性參考品2、陽(yáng)性參考品3均是構(gòu)建到載體質(zhì)粒上保存。質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程如下：

引物設(shè)計(jì)——pcr擴(kuò)增——割膠回收DNA片段——構(gòu)建載體——轉(zhuǎn)化培養(yǎng)——陽(yáng)性克隆鑒定——37℃搖床培養(yǎng)——質(zhì)粒抽提——測(cè)序確認(rèn)堿基序列。

抽提后的質(zhì)粒再配制成所述陽(yáng)性質(zhì)控品1，配制方法如下：

（1）配制稀釋液：加入50%配方量的純化水→加入Tris-HCl緩沖液（pH7.6）→加入剩余的純化水（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀釋液；

（2）HP野生型質(zhì)粒預(yù)稀釋：加入50%配方量的所述稀釋液→加入HP野生型質(zhì)粒溶液→加入剩余的所述稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到X拷貝/微升HP野生型質(zhì)粒溶液（X代表質(zhì)粒濃度的具體數(shù)值）；

（3）得到陽(yáng)性質(zhì)控品1：加入50%配方量的稀釋液→加入X拷貝/微升HP野生型質(zhì)粒溶液→加入剩余的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到陽(yáng)性質(zhì)控品1。

抽提后的質(zhì)粒再配制成所述陽(yáng)性質(zhì)控品2，配制方法如下：

（1）配制稀釋液：加入50%配方量的純化水→加入Tris-HCl緩沖液（pH 7.6）→加入剩余的純化水（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得0.002mol/L的Tris-HCl（pH 7.6）稀釋液；

（2）HP質(zhì)粒（2142位點(diǎn)突變）預(yù)稀釋：加入50%配方量的稀釋液→加入HP質(zhì)粒（2142位點(diǎn)突變）溶液→加入剩余的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→X拷貝/微升HP質(zhì)粒（2142位點(diǎn)突變）溶液；

（3）HP質(zhì)粒（2143位點(diǎn)突變）預(yù)稀釋：加入50%配方量的稀釋液→加入HP質(zhì)粒（2143位點(diǎn)突變）溶液→加入剩余的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→X拷貝/微升HP質(zhì)粒（2143位點(diǎn)突變）溶液；

（4）得到陽(yáng)性質(zhì)控品2：加入50%配方量的稀釋液→加入X拷貝/微升HP質(zhì)粒（2142位點(diǎn)突變）溶液→加入X拷貝/微升HP質(zhì)粒（2143位點(diǎn)突變）溶液→加入剩余的稀釋液（渦旋震蕩3次，每次5秒）→得到陽(yáng)性質(zhì)控品2。

檢測(cè)方法包括以下步驟：

第一步，準(zhǔn)備目標(biāo)物，以目標(biāo)物作為檢測(cè)的對(duì)象，目標(biāo)物為不經(jīng)任何處理的被檢樣本或者為從被檢樣本中提取的幽門螺旋桿菌核酸，所述被檢樣本為人的胃粘膜組織，被檢樣本可直接上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。直接使用胃粘膜組織時(shí)，避免使用含血多的樣本。如果使用血液成分含量多，或者肝素含量多的樣本，請(qǐng)注意充分去除血液以及肝素成分。血液成分或肝素殘存的情況下，會(huì)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)有影響，不能正常檢測(cè)。需要保存樣本時(shí)，請(qǐng)保存在-80℃以下。使用長(zhǎng)期凍存的樣本時(shí)，務(wù)必恢復(fù)到室溫后再使用；

第二步，以所述目標(biāo)物為模板基因鏈，利用所述試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系為：

引物HPC-F 0.1μmol/L，0.52μL；

引物HPC-R 0.1μmol/L，0.52μL；

特異性靶向熒光探針 0.1μmol/L，0.4μL；

內(nèi)部質(zhì)控引物IC-F 0.1μmol/L，0.52μL；

內(nèi)部質(zhì)控引物IC-R 0.1μmol/L，0.52μL；

內(nèi)部質(zhì)控探針 0.1μmol/L，0.4μL；

內(nèi)部質(zhì)控模板 4ng/μL，1.8μL；

MgCl₂*6H₂O 0.35g/L，0.52μL；

dNTPs 0.02mM，0.4μL；

KOD DNA 聚合酶 0.02U/μL，0.4μL；

KOD buffer 3.2μL；

模板 4μL；

在上述熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中，在各組分的使用濃度不變的前提下，各組分的體積用量最多可為上述數(shù)值的2倍，即引物HPC-F的所用體積為1.04μL，引物HPC-R的所用體積為1.04μL，特異性靶向熒光探針的所用體積為0.8μL，內(nèi)部質(zhì)控引物IC-F的所用體積為1.04μL，內(nèi)部質(zhì)控引物IC-R的所用體積為1.04μL，內(nèi)部質(zhì)控探針的所用體積為0.8μL，內(nèi)部質(zhì)控模板的所用體積為3.6μL，MgCl₂*6H₂O的所用體積為1.04μL，dNTPs的所用體積為0.8μL，KOD DNA 聚合酶的所用體積為0.8μL，KOD buffer的所用體積為6.4μL，模板的所用體積為8μL。

所述熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)過(guò)程如下：

（1）94.0℃預(yù)變性30.0秒，

（2）97.0℃變性1.0秒，

（3）60.0℃退火3.0秒，

（4）63.0℃延伸 5.0秒，其中，步驟（2）~（4）循環(huán)50次。

第三步，用高分辨率熔解曲線法進(jìn)行檢出，檢出條件依次為：

（1）94.0 ℃，30.0秒，

（2）39.0 ℃，30.0秒，

（3）40.0~75.0℃，0.09℃/秒；

整個(gè)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)直接在全自動(dòng)基因分析儀GENECUBE（生產(chǎn)商為TOYOBO）上進(jìn)行。具體步驟為：將被檢樣本4μL、聚合酶試劑[KOD Mix]4μL、引物?探針試劑[HPC Mix]5.2μL混合后，調(diào)制成反應(yīng)液。專用吸管吸取反應(yīng)液到專用塑料毛細(xì)管中。進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。進(jìn)行檢出，測(cè)定波長(zhǎng)為510nm~550nm以及573nm~613nm的熒光值。測(cè)定的熒光值由專用分析軟件解析，轉(zhuǎn)換成表示熒光變化量的熒光微分值。解析熒光微分值，在顯示屏上顯示測(cè)定結(jié)果。

第四步，檢出結(jié)果通過(guò)陽(yáng)性判斷值來(lái)判斷，陽(yáng)性判斷值的三種結(jié)果的判斷依據(jù)為：

（1）幽門螺旋桿菌菌群陽(yáng)性及23S rRNA基因2142和2143位點(diǎn)無(wú)突變：熒光微分值≥10，并且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在50℃~60℃之間，參見(jiàn)附圖1所示；

（2）幽門螺旋桿菌菌群陽(yáng)性及23S rRNA基因2142或2143位點(diǎn)有突變：熒光微分值≥10，并且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42℃~50℃之間，參見(jiàn)附圖2和附圖3所示；

（3）幽門螺旋桿菌菌群陰性：無(wú)熒光微分值，內(nèi)部質(zhì)控?zé)晒馕⒎种怠?.0，且其熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42℃~68℃之間，參見(jiàn)附圖4所示；

所述熒光微分值是指對(duì)檢測(cè)到的目標(biāo)物的熒光強(qiáng)度隨溫度變化的值做微分求導(dǎo)，得到熒光微分值。

只有當(dāng)附圖5的熔解曲線中內(nèi)部質(zhì)控?zé)晒馕⒎种怠?.0，且其熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42℃~68℃之間時(shí)，表明整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)是正常、有效的，特別對(duì)于判斷結(jié)果為陰性時(shí)尤其重要。

上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 踏石生物科技（蘇州）有限公司

<120> 幽門螺旋桿菌耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

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<170> PATENTIN VERSION 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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